种质资源研究技术方案—种子萌发率高通量检测与活力评估

种子活力是种子发芽和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力的总和（发芽和出苗期间的活性水平与行为），是种子品质的重要指标，具体包括吸涨后旺盛的代谢强度、出苗能力、抗逆性、发芽速度及同步性、幼苗发育与产量潜力。
种子萌发实验无疑是最为直接有效的种子活力检测方法。但一般的传统方法需要人工计数来测量幼苗和计算发芽率，工作量极大，也非常耗时。而基于彩色图像分析来识别发芽幼苗又存在很大误差。
同时，传统的萌发幼苗形态数据如胚根、胚轴长度等很大程度上只能作为基础数据使用，难以直接评估幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力。因此，基于现代植物表型组学研究和种子活力评估要求，在种子萌发实验中还需要实时监测各种表型数据，而不仅仅是传统表型所说的形态数据。
 

赫尔辛基大学的研究人员为了研究一种新的ABA响应泛素E3连接酶对拟南芥种子萌发活力的影响，设计了一个基于高通量叶绿素荧光成像分析的萌发实验。这一实验主要通过赫尔辛基大学国家植物表型研究设施（National Plant Phenotyping Infrastructure，NaPPI）中装备的PlantScreen植物表型成像分析系统完成的。
 

赫尔辛基大学装备的两套PlantScreen植物表型成像分析系统：
一套适用于50cm以下的小型植株，如拟南芥或作物幼苗等（上图）；
一套适用于120cm以下的大型植株，如小麦、玉米等（下图）
PlantScreen植物表型成像分析系统可以自动对植物样品进行连续培养和表型监测，非常适用于进行高通量的种子萌发实验。其配备的LED光照控温培养室能够模拟理想的光照与温度条件。自动传送系统可以按设置的序列自动让样品传送到成像室。
种子萌发率检测则是基于FluorCam叶绿素荧光成像技术。在种子未萌发时，子叶没有展开，也没有合成叶绿素，因此几乎不会被激发出叶绿素荧光。而一旦种子萌发，甚至在子叶没有展开时，系统内置的FluorCam叶绿素荧光成像模块就可以检测到种子的叶绿素荧光。测量得到的最大叶绿素荧光Fm能够非常有效地识别发芽的种子。专用的分析软件能够很容易地将未萌发种子和背景去除掉，从而使发芽率计算极为准确。

高通量叶绿素荧光成像分析工作流程；
a.播种、放置样品、成像测量、图像分析；b.最大叶绿素荧光Fm成像图的分析过程
叶绿素荧光成像分析后除了能获得准确的动态发芽率曲线，还可以同时获得一系列与植物光合能力、抗性相关的表型动态曲线，如叶绿素荧光参数、冠层面积等。叶绿素荧光参数，例如QY_max最大光化学效率（Fv/Fm，对各种胁迫极为敏感）、Effective QY实际光化学效率（量子产额）、NPQ非光化学淬灭（与光系统热耗散、光保护机制有关）、Rfd荧光衰减比率等可以反映植物光合能力和光系统抗逆能力。PlantScreen配备的热成像单元还可以提供冠层和叶片温度数据，反映植物蒸腾、水分利用状态以及病害等胁迫信息。这些指标已经广泛用于幼苗生长潜势、植株抗逆能力和生产潜力的评估，并得到了大量的验证。
同时热成像模块还测量了发芽幼苗的冠层温度，这与幼苗的蒸腾速率、水分利用能力密切相关。

左：发芽率动态曲线；
右：冠层投影面积、各项叶绿素荧光参数、冠层温度的动态曲线
因为各种原因，无法使用PlantScreen植物表型成像分析系统进行种子萌发活力实验的科学家，也可以选择PhenoTron作物种质资源监测鉴定平台。这一平台包括LED光照培养箱、FluorCam叶绿素荧光成像、种子形态分析、种子代谢强度测量、高光谱成像、热成像等仪器系统，可根据具体研究需要灵活组合、定制设计。

参考文献：
Pavicic M, et al. 2019. High throughput in vitro seed germination screen identifed new ABA responsive RING‑type ubiquitin E3 ligases in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 139: 563-575