人III型胶原蛋白（Collagen III）ELISA试剂盒

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人 Collagen III 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 Collagen III与单抗结合，加入生物素化的抗人Collagen III，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液，在450nm处测OD值，Collagen III浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Collagen III浓度。 试剂盒组成（2-8℃保存） 酶标板（Coated Wells） 96孔 酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate） 12ml 10×标本稀释液（Sample Buffer） 12ml 20×浓缩洗涤液（Wash Buffer） 50ml 标准品（Standards）：100ng/ml 1瓶 底物工作液（TMB Solution） 12ml 第一抗体工作液（Biotinylated Antibody） 12ml 终止液（Stop Solution） 12ml 准备试剂与收集血样 1. 收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。 2. 标准品液配制：设标准管7管，每管加入标本稀释液300ul。在第一管中加入100ng/ml的标准品溶液300ul混匀后用加样器吸出300ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第六管中吸出300ul弃去。第七管为空白对照。加上原液管总共八管。 3. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。 4. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水） 检测程序 1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。 2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。 3. 每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。 4. 洗板：同前。 5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。 6. 洗板：同前。 7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。 8. 每孔加入100ul终止液混匀。 9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。 结果计算与判断 1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。 2. 以标准品100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0 ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。 3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应Collagen III含量。 试剂盒性能 1. 灵敏度：最小的Collagen III 检测浓度小于1ng/ml。 2. 特异性：可同时检测重组或天然的人Collagen III。不与人其它细胞因子有交叉反应。 3. 重复性：板内、板见变异系数均小于10％。 注意事项 1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。 2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。 3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。 4. 本试剂盒宜置4oC冰箱保存。 5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！