比朗工程师讲解分子杂交仪基本原理及探针制备

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　　比朗高级工程师柳先生介绍分子杂交基本原理：1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA双螺旋结构学说。DNA这一线性的高分子化合物靠一些非共价键折迭形成三维空间构象。这些非共价键都是比较弱的键，易受外力的作用而断裂，导致空间构象的破坏，使有规则构型的DNA变成不规则的线团，此过程称为DNA变性。DNA变性时，维系双链的氢键也发生断裂而形成两条互补的单链DNA。引起核酸变性的因素有酸、碱、热、某些变性剂(如尿素、甲酰胺等)和某些有机溶剂都可引起DNA变性。

　　根据DNA变性的程度与温度的关系，可绘制融解曲线。变性的DNA达到总量1/2时的温度称为融解温度(Tm)。Tm值受溶液中离子的种类、离子强度、DNA中碱基组成的均一性以及G-C碱基对含量等因素的影响。变性的DNA两条互补单链，在适当重新缔合成双链的过程为DNA复性或退火。复性后两条单链又重新按照碱基互补的原则结合起来，形成双螺旋结构，其理化性质和部分生物活性恢复。两条DNA单链之间能否复性，并不取决于这两条链是否同源，而取决于它们的碱基序列是否互补。如果两条来源不同的DNA单链具有互补的碱基序列，也同样可以复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。

　　RNA的化学组成与DNA相似，也有碱基、戊糖和磷酸三种成分，所不同的是戊糖为核糖，碱基中尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)，其他三种碱基与DNA分子中的相同。分子杂交不仅可发生在两条DNA单链之间，而且也可发生在具有互补碱基的DNA和RNA片段之间，或RNA与RNA片段之间，即有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交3类。

　　分子杂交是在一定条件下以变性DNA或RNA单链作模板，另一DNA或RNA单股寡核苷酸与其碱基互补而生成杂交复合体的过程。

　　基因探针种类和选择：探针广义上是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子，例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记(同位素或非同位素标记)的核苷酸链。由于基因探针已与核酸样品中具有互补序列的核酸片段退火杂交。因此已广泛用于基因克隆筛选、酶切图谱制作、基因突变、DNA序列分析以及某些临床诊断等方面。

　　基因探针是分子杂交中用于样品特定的DNA或mRNA序列定位的关键物质。根据来源与性质不同已分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等5类。选择探针的原则是要有高度特异性，其次也需考虑制备探针难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。

　　一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。但自动合成仪合成的探针最适长度常有一个上限，约为50bp。以上希望能为您的工作带来受益!关注比朗分子杂交仪：http://www.canytec.info