金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒

TRANSIA® PLATE葡萄球菌肠毒素检测试剂盒
产品编号：ST0796

产品用途
TRANSIA® PLATE金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒用于检测在食品样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A,B,C,D,E。
标注：此TRANSIA® PLATE金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒只能用于定性检测，不能用于定量检测。
原理
TRANSIA® PLATE金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒采用三明治酶免疫分析方法（酶联免疫吸附）。反应载体是微孔板中包被针对金黄色葡萄球菌肠毒素的特异性抗体。
材料
配套试剂
1 x 96孔微孔板 (12×8格式)
1 x 微孔板盖
瓶1: 阴性质控: 即用型溶液-1 × 4 mL
瓶2: 阳性质控: 葡萄球菌肠毒素A -50X -1 × 0.8 mL (注意: 戴手套操作)
瓶3: 洗涤缓冲液-20X - 2 ×60 mL
瓶4: 酶标记物：葡萄球菌肠毒素抗体与过氧化氢酶混合剂–即用型溶液-1 ×15 mL
瓶5: 底物：过氧化脲-1×10 mL
瓶6: 发色剂：TMB-1 ×10 mL
瓶7: 反应终止液：H2SO4-即用型溶液-1 ×10 mL
储存条件
试剂存放在2-8℃条件下。
安全
为避免所有样品和提取物被污染和人中毒，需穿戴实验服和手套，勿食。
瓶2: 阳性质控: 金黄色葡萄球菌肠毒素A，一旦皮肤和眼睛与试剂接触，立即用大量自来水冲洗。
所有与金黄色葡萄球菌肠毒素有关的材料和试剂都要按实验规定处理。

所需仪器但试剂盒中不提供
样品试剂制备
•天平 •量筒和烧瓶
•匀浆机或搅拌器 •手套
•离心机≧3 000 - 3 500 g 、离心管 •Whatman 1号滤纸或其他相当滤纸
•磁力搅拌器 • pH计或pH试纸
•塑料容器(≧100 mL) •聚丙烯管
葡萄球菌培养
•塑料试管-5 mL •过滤器-0.2 µm
高盐高糖产品透析浓缩
•透析袋 •透析夹
金黄色葡萄球菌肠毒素鉴定
•涡旋振荡器 (art. no: ST0712) •塑料洗瓶或洗板机
•吸水纸 •振荡器（600 rmp）
•移液器100-1000μL •Eppendorf 多道移液器 (5 ×2.5 mL 吸头)
•计数板(450 nm)
所需试剂但试剂盒中不提供
样品和试剂制备
•蒸馏水
•提取缓冲液（可选）
Na2HPO4 2H2O 35.6 g
KH2PO4 6.8 g
H2O 1 L
•pH调试剂
NaOH (6N)
HCl (6N)
•生肉提取试剂盒 (art. no: AK 0220)
透析浓缩
•聚乙二醇 MW>17 000
葡萄球菌表面培养
•脑心浸出液肉汤
•去补兔子血清 (art. no: AK0224)
法国官方方法检测乳制品
•去补兔子血清 (art. no: AK0224)
实验过程
试剂制备
•注意：保证试剂回至室温(18-25℃)。使用前提前一小时取出试剂盒。
•所有试剂和样品提前准备。
•使用前用手或漩涡振荡器摇匀各个试管。
提取缓冲液的制备
将35.6 g Na2HPO4•2H2O和6.8 g KH2PO4溶解于1 L蒸馏水中 。
每份样品需要20-40 mL缓冲液。
调整pH值
注意：使用HCl和NaOH时穿戴手套和实验服。
NaOH [6N]: 将240 g NaOH溶解于0.8 L蒸馏水中，加蒸馏水至1L。
HCl [6N]: 将500 mL 37%HCl [12N]溶于500 mL蒸馏水中。（注意: 将酸加入蒸馏水中。）
用HCI (1N)和NaOH (1N)将溶液调至所需pH值。
生肉提取试剂制备
将每个试剂瓶加入400 μL蒸馏水，分装成20 μL/瓶。
储存在-15～-30℃条件下。
去补兔子血清配制
试剂为分装即用型，分装成100 μL/瓶。
透析浓缩试剂和材料制备
按照厂家说明书对透析袋进行预处理。
将30 g聚乙二醇溶解于100 mL蒸馏水中，轻微加热。
稀释洗涤缓冲液20倍。
缓冲液要提前或者在孵育阶段就开始稀释，参照检测过程步骤3。
•按照1：20的比例用蒸馏水稀释洗涤缓冲液。60 mL洗涤液加1140 mL蒸馏水。
•混合并加至洗涤设备。
•2-8℃下洗涤缓冲液保质期3个月。
阳性质控稀释
为了避免因吸取阳性质控不足而造成的误差，需要准备比试验需求更多的阳性质控。
每步试验都需准备新的阳性质控。
•按照1：50的比例用蒸馏水稀释阳性质控（40 μL阳性质控加2 mL蒸馏水），混合均匀。
发色剂和底物混合液
发色剂和底物混合液不稳定，不能提前配制。
参照检测过程步骤6。
将60 μL发色剂和60 μL底物混合。
样品制备
为了保证高的提取率，对食品有特别规定。如制品、巧克力、熏肉、鱼肉、生肉、熟猪肉、海产品、液态和灌装菌类和高盐高糖类样品。
提取液也可以用透析来浓缩。提取液在-15到-20℃下可以存放一个月（乳制品可放置1周）。
注意：精确的pH值酶联免疫测定是非常重要的，以此可以确保结果的准确性。
重要：根据法国官方方法(DGAL/SDSSA/SDRRCC/N2005-8194, July 27 2005)和欧洲筛选方法，乳制品必须进行透析浓缩。
根据法官方方法，做酶联免疫吸附试验前浓缩的提取物需进行去补兔子血清处理。
实验步骤
1. 将25 g食物样品中加入25 mL提取缓冲液用混合器混合均匀，如果过于粘稠，加入提取缓冲液或蒸馏水。
2. 将悬浊液室温下(18-25℃)放置30分钟以便毒素扩散。
3. 离心分离（15分钟，3000 g）或过滤残渣。
4. 取上清液。
5. 调pH值至7.0-7.5。
6. 如果有沉淀，进行再次离心分离取上清液。
7. 取100 μL上清进行试验。
液态和罐装菌类
罐装菌类中肠毒素的检测需要用罐中液体。
酶联免疫测定可以直接用罐中液体不需要提取。测定前确保pH值在7.0-7.5之间。
生肉、熟猪肉和海产品
按照一般步骤1-6用蒸馏水提取，提取缓冲液提取容易有胶体形成。
为了防止假阳性结果，要对生肉进行提取。
按照一般步骤6在室温下提取。
1. 调pH值至7.0-7.5。
2. 加1 mL提取液加入20 μL生肉提取液solution 1。
3. 均质。
4. 室温孵育10分钟 (18-25℃)。
5. 加入20 μL生肉提取液solution2。
6. 均质。
7. 室温孵育10分钟。
8. 调pH值至7.0-7.5
9. 取100 μl滤液进行检测
样品制备流程(18-25℃)
25 g 样品加入 25 mL提取缓冲液或蒸馏水









干燥样品
按照一般步骤取25 g样品加入蒸馏水进行提取。
高盐高糖类样品(>5%)
根据产品种类选择合适的提取步骤，用分子截留量6-8000 Da透析柱进行过夜透析。
乳制品、巧克力、熏肉和鱼肉
1. 取25 g样品加40 mL蒸馏水或提取缓冲液匀浆。
2. 加10mL蒸馏水或提取缓冲液冲洗管壁。
3. 将悬浊液室温下(18-25℃)放置30分钟以便毒素扩散。
4. 调pH值至3.5 ± 0.5。
5. 离心分离（15分钟，≧3500 g，2-8℃）。
6. 取上清。去掉上清上的脂肪层，注意不要留下残渣。
7. 调pH值至7.0-7.5。
8. 离心分离（15分钟，≧3500 g，2-8℃）。
9. 取上清。
10. 调pH值至7.0-7.5。
11. 取100 μL提取液进行试验。


金黄色葡萄球菌培养
1. 37℃用10mL脑心浸出液肉汤培养金黄色葡萄球菌24小时。
2. 3000 g离心分离10分钟。
3. 过滤取上清。
4. 用脑心浸出液肉汤按1：10比例稀释上清液（100 μL上清液加900 μL脑心浸出液肉汤）。
5. 取900 μL稀释液于试管中，加入100 μL去补兔子血清。
6. 取900 μL灭菌的脑心浸出液肉汤加入100 μL去补兔子血清配制阴性质控。
7. 均质。
8. 室温下（18-25℃）孵育样品和阴性质控30分钟。
9. 调pH值至7.0-7.5。
10. 取100 μL样品进行试验测定。
透析浓缩
目的是将溶液浓缩10倍。
注意：处理透析袋时要佩戴手套。
1. 将样品分装到透析袋中并将各个透析袋两端打结或用止水夹夹住。
2. 2-8℃下将透析袋放入30%聚乙二醇透析过夜。
3. 将透析袋从聚乙二醇中取出，轻轻用蒸馏水冲洗取出剩余的聚乙二醇。
4. 将透析袋一端打开，用移液器取出袋中样品。如果样品太粘，在吸取之前加入少许提取液或磷酸缓冲液震荡几次。随后加入少许提取液清洗残留在透析袋壁上的样品溶液。最终加提取液或磷酸缓冲液至4 mL。
5. 调pH值至7.0-7.5
6. 取100 μL提取液进行试验。






检测过程
所有的试剂和样品都准备好放在室温下以便随时使用。试剂瓶使用之前要进行摇匀。不要混用不同批号的试剂。
洗涤非常重要。
孵育要在震荡中进行（大约600 rpm）。
使用前要把微孔板盖子擦干净。
1. 将相应数量的微孔板条插到微孔板架上：2个用于阴性质控（1个阴性质控用于表 面培养），1个用于阳性质控，1个用于样品。将未使用的微孔板条放入含有干燥剂的袋中密封。在记录本上记录下样本的位置。
2. 100 μL阳性质控、阴性质控和样品分别加到标记好的孔中。表面培养按照步骤6进行，使用阴性质控，盖上盖子培养。
3. 室温下震荡孵育30分钟，准备好洗涤缓冲液，参照试剂配制。
4. 将微孔液体倒出，向孔中加入洗涤缓冲液，保持5-10秒，倒出洗涤液，在桌上放 置的吸水纸上多次拍打（孔向下），用于充分倒去微孔中液体。重复洗涤4次。
5. 加入100 μL酶标记物至各孔中，小心不要让枪头碰到边缘。混匀，盖上盖子。
6. 室温下震荡孵育30分钟，在孵育结束之前准备好发色剂和底物混合液，参照试剂配制。
7. 将微孔液体倒出，向微孔中加入洗涤缓冲液，保持5-10秒，倒出洗涤液，在桌上放置的吸水纸上多次拍打（孔向下），用于充分倒去微孔中液体。重复洗涤4次。
8. 各孔中加入100 μL发色剂和底物混合液，丢弃剩余的混合液。发色剂和底物也可 以事先不混合，分别向微孔中加入50 μL。
9. 室温下震荡孵育30分钟。
10. 往每个微孔中加入100 μl反应停止液，与加底物的步骤相同。混合反应液确保染色成功，反应液由蓝色会变成黄色。
11. 在450 nm条件下以空气为空白，测量吸光度值。









结果分析
实验确认
阳性质控的吸光值要至少不低于0.50。
阴性质控的吸光值不高于0.50。
如果质控结果达不到上述要求，则测定结果无效。
食品提取物阈值
阈值=阴性质控吸光值平均值+0.20
T=(NC1+NC2)/2+0.20
表面培养阈值
阈值=无菌培养基阴性质控吸光值+0.10
T=NC+0.10
阳性结果
如果样品吸光值不低于阈值，则结果显示阳性。
阴性结果
如果样品吸光值低于T-0.05，则结果显示阴性。
假阳性结果
如果样品吸光值介于T-0.05和T之间，则结果显示假阳性，需要再进行透析浓缩重新测定。
注意：根据法国官方方法和欧洲筛选方法，乳制品中结果出现假阳性认为是阴性结果。
阳性结果确认
阳性结果不要确认样品分离出的金黄色葡萄球菌的产肠毒素的特征。参照金黄色葡萄球菌肠毒素的表面培养。
需要注意的是在加热或物理处理过程中造成细菌死亡，但肠毒素依然存在于样品中。也就是说样品可能对肠毒素显示阳性，但对金黄色葡萄球菌可能显示阴性。
功能特征
检测限
对于人工样品（乳制品或生肉）可以检测到每克样品中0.25-1 ng肠毒素。
榨出物透析浓缩后可以检测到每克乳酪中0.1 ng肠毒素。
对于混合物样品不能定量的测定肠毒素含量。
特异性
用于检测在食品中葡萄球菌肠毒素A,B,C,D,E。
样品中具有相似性质的物质，如由S. aureus分泌的蛋白质A、内源过氧化物酶和其他内源性物质都可能对结果产生交叉影响。