胚胎聚集针

目的介绍四倍体胚胎补偿法制备ES小鼠技术的操作环节,加快该技术的推广应用。方法综合分析近几年来国内外在小鼠四倍体胚胎与ES细胞嵌合的研究成果,

如何运用BLS细胞融合仪及胚胎聚集针创建胚胎 注射器内吸入培养基，在35mm组织培养板上微滴（大致直径3mm）点样成若干行（列）。向培养板内小心注入石蜡油使其覆盖整板，注意不要使石蜡油直接倾倒在微滴上。石蜡油很容易越过这些微滴。石蜡油的量要完全覆盖这些微滴。使用配件按照说明操作，制作凹陷。 37度，5%CO2条件下孵育培养板几小时，目的是让培养基在液滴内达到平衡。这一步可以在形成凹陷的步骤之前进行。 实验前准备好待聚集的细胞，组织或胚胎，不要将它们长时间暴露在室温下或脱离最适培养条件时间过长。通过在组织培养板盖上加入几滴M2培养基和Tyrode’s酸溶液来去除卵透明带。将组织培养板的培养区域表面如此处理后，胚胎将本能的黏附在表面—因此我们需要使用盖。确认所有培养基溶液和酸液都接近室温。将胚胎放置在一滴M2培养基上。取尽可能少的内含10-20个胚胎的培养基，并移到一滴酸液上。重复这个步骤并将胚胎移到新的一滴酸液上。让胚胎在吸头内保持上下移动，观察卵透明带是如何溶解的。迅速将胚胎移入M2培养基。用几滴培养基溶液洗涤并移入刚才制成的凹陷中。 胚胎培养条件是聚集产量的一个重要因素，因为胚胎要培养过夜，如果是四倍体胚胎在移入母体前需要培养48小时。在培养的每个细节都必须小心操作控制。这包括温度，大气，培养基，室温操作时间及矿物油质量。

胚胎显微操作-胚胎分割 (一)概况 胚胎分割是通过对胚胎进行显微操作，人工制造同卵双生或同卵多生的技术，它是扩大胚胎来源的一条重要途径，其理论依据是早期胚胎的每一个卵裂球都具有独立发育成个体的全能性。 本世纪三十年代，Pinrus等首次证明兔2细胞胚的单个卵裂球在体内可发育成体积较小的胚泡。之后，Tarkowski等人的实验胚胎学研究成果进一步证明了哺乳动物2细胞胚的每一个卵裂球都具有发育成正常胎儿的全能性。七十年代以来，随着胚胎培养和移植技术的发展和完善，哺乳动物胚胎分割取得了突破性进展。Mullen等于1970年二分2细胞期鼠胚，通过体外培养及移植等程序，获得了小鼠同卵双生后代。Willadsen于1979年通过分离早期胚胎的卵裂球，成功地获得了绵羊的同卵双生后代。国内张涌等通过分割小鼠、山羊早期胚胎，均获得了同卵双生后代。进一步研究表明，四分胚，八分胚也可以发育成新个体。窦忠英等将7日龄的牛胚胎一分为四，实现了同卵三生。值得说明的是，随着胚胎分割次数的增多，分割胚的发育能力明显降低，这可能与胞质的不断减少有关。 (二)分割方法 胚胎分割方法主要有显微操作仪分割和徒手分割两种。