【Ingenza案例】当“连续流技术”遇上“生物催化”：高效生产手性氨基酸

【背景介绍】

生物催化是一种利用酶或者生物有机体做为催化剂进行化学转化的技术，由于其作用条件绿色、温和，并且对反应底物具有高效的选择性，因此在有机合成特别是手性分子的合成中具有独特的优势，是近年来绿色有机化学合成技术研究的热点之一。

 生物催化为什么可以如此高效的实现反应的立体选择性的呢？这与生物催化反应的本质有关。我们都知道，酶的化学本质是蛋白质，而蛋白质是具有一定构象的。因此，在生物反应中，首先需要酶与小分子底物结合，而这则需要小分子的底物与酶提供的催化位点的构象十分吻合。这就好像是一把“钥匙”配一把“锁”一样，符合催化位点结构的底物就可以进入到酶的催化口袋中，就像钥匙开启了一把锁一样，催化反应就会启动。而结构不匹配的底物就像是一把错误的钥匙，无法被酶催化。而当参与反应的多种底物均与酶结合后，由于酶限制了这些底物的相对空间位置，因此这些底物只能按照特定的空间方向进行反应。这就体现了酶催化化学反应中的立体选择性。

 酶催化反应一般通过拆分法或者转化法得到光学纯的化合物。拆分法(Biocatalytic Resolution)是利用酶对于外消旋体中一对对映构识别结合能力不同进行拆分的（如图1a）。比方说在非天然氨基酸（UAAs）的合成中，氨基酸根据α-碳原子的手性不同，分为D-氨基酸和L-氨基酸。氨基酸消旋体（D:L=50:50）是很易制得的，可通过D-氨基酸氧化酶从消旋体拆分出其中的非天然L-氨基酸。因为D-氨基酸氧化酶只能识别D-氨基酸，将其氧化为α-酮酸，而不能与L-氨基酸发生反应。因此，通过D-氨基酸氧化酶的选择性拆分，就将氨基酸的外消旋混合物转化为酮酸和L-氨基酸的混合物，而这种混合物相较于一对异构体往往是更易于分离的。即通过这样的方式，将非天然的L-氨基酸从消旋体中拆分出来（如图1a）。

图1. 生物催化反应获得手性异构体的三种方法：a) 拆分法、 b)不对称拆分法和 c)转化法.

而拆分法分离得到的光学纯异构体往往最高也只具有50%的收率，而另外50%往往被转化成其他副产物（α-酮酸）被浪费掉了，如果我们建立一种从副产物重新回到消旋体的一种策略，即实现了对异构体的动态动力学拆分（Dynamic Kinetic Resolution, DKR），可以有效的把拆分的理论产率提高到100%。比方说在D-氨基酸氧化酶对氨基酸的拆分中，所产生的酮酸可以在钯/碳的催化下被甲酸铵还原形成DL-氨基酸^[2]。而其中的D-氨基酸可以继续被D-氨基酸氧化酶选择性的氧化生成酮酸，这样形成的循环，就可以把消旋化合物全部转化为光学纯的L-氨基酸异构体（如图1b所示）。

 通过酶催化转化（Biotransformation）的方法得到光学纯的化合物也是一种常用的方法。该方法是利用酶对于潜手性底物（achiral substrate）的不对称催化从而得到的光学纯异构体。例如在非天然氨基酸的合成中，转化法的应用也很常见。酮酸就是一种合成非天然氨基酸的潜手性底物，L-氨基酸酸可以通过对酮酸的不对称转氨化制备而得（如图1c所示）。比方说L-高丙氨酸可以通过2-氧代丁酸和苄胺为起始原料，在ω-转氨酶的不对称催化下合成，引入己烷作为反应溶剂形成双相体系可减少苯甲醛对酶的活性抑制，该反应产率96%，e.e. >99%^[3]。

生物催化由于其高效的选择性，在不对称催化合成领域具有很大的价值。但由于其较长的反应停留时间与多相反应的特点，限制了其在连续流反应中的应用。而Coflore ATR搅拌器，作为一种动态混合搅拌器，依靠搅拌器元件和反应器本体的机械振动进行混合，不借助流体速度，就可以提供非常高效的混合效率，可以有效的解决连续流反应中反应时间长又存在固体的问题，进而有效地应用于酶催化反应中。

 【连续流方案】

工业生物技术专家Ingenza在Roslin的生物中心与AM technology公司合作将连续流技术运用于生物催化反应，实现了对手性氨基酸的高效大规模的合成。相关成果发表在Org. Process Res. Dev.（dx.doi.org/10.1021/op2003612）杂志上。

D-氨基酸氧化酶拆分氨基酸是一个三相反应（如图1a所示），需要向丙氨酸溶液（液相）中，通入氧气（气相）氧化FAD辅酶循环，D-氨基酸氧化酶的全细胞冻干粉在反应体系中又是一个固体（固相）。并且这个反应需要充分搅拌几个小时才可以完成。由此看来，Coflore ATR连续反应器是适合于进行此类反应的。该反应在1 mol/L的底物浓度条件下进行（相当于丙氨酸89.09 g/L）。首先将丙氨酸和酶悬浊液预混，再泵入ATR反应器中，接着再将氧气鼓入反应管中（大规模反应中则使用多个反应管，氧气则根据比例在反应流的不同阶段鼓入，反应装置如图2所示），保持2Hz的反应振速，考察了连续流反应的生物转化反应速率，并与釜式反应的效果进行了对比。

图2. Coflore ATR反应器的混合原理、装置以及气液混合图. 图片来源：Org. Process Res. Dev.

釜式反应进行三相反应，其反应的效果往往和气体的传质效率有很大的关系。比方说在此例反应中，转速和反应体积对反应的结果非常大。转速加快，氧气的传质效率高，反应的速度也会明显加快。而当反应的规模增大时，反应液的高度会有明显的变化，会改变釜式反应中气液分布降低其混合效率，进而使反应速度大大的降低，并且反应中酶的降解导致的反应活性降低也是不容忽视的（可能与产生的双氧水的蛋白毒性有关，如图3所示）。因此，釜式反应很难放大，这极大降低了其应用价值。

图3. 釜式反应中转速与规模对于反应速率的影响. 图片来源：Org. Process Res. Dev.

而Coflore ATR 反应器是通过增加管道长度来扩大反应规模，这不会改变混合两相中的气液分布。又因其高效的搅拌混合效率，使得在同等1L的反应规模下，连续流是釜式反应速率的三倍，当增大到10L反应时，连续流反应的速率基本上不发生改变，并且节约了70%的氧气（如图4所示）。而且相对于普通的静态混流反应器而言，Coflore ATR 反应器保持了在长时间反应进程中一个很好的压力降，并且避免了物料的堆积和堵塞，其对于反应物的高混合效率依旧是其他类型反应器无法比拟的。

图4. 大规模反应对于连续流反应和釜式反应效果的影响. 图片来源：Org. Process Res. Dev.

【实验结论】

1.     D-氨基酸氧化酶拆分氨基酸，其反应速率与氧的吸收速率有很大关系，Coflore ATR 反应器解决了传统釜式反应中混合效率低和保持气液分布的均匀性的难题。行而有效的扩大了反应规模。

2.     生物催化中酶的固体特性限制了其在连续流技术的使用，Coflore ATR 反应器高效的动态横向混合使得全细胞催化与连续流技术在工业生产中的联用成为可能。其避免了活细胞等有机体在设备中的堵塞问题，并提高了反应规模和反应速度。

3.     生物催化与连续流技术的联合应用有助于降低工业生产中设备成本、操作成本和催化剂消耗，加快生产速度，具有深远而富有前景的应用意义。

【参考文献】

[1] dx.doi.org/10.1021/op2003612 | Org. Process Res. Dev. 2012, 16, 1013?1016

[2] US20080153137

[3] Biotechnol. Lett. 2009, 31, 1595-1599

深圳市一正科技有限公司，作为荷兰Chemtrix公司（微通道反应器）、英国AM公司（连续搅拌多级反应器、催化加氢系统）、英国NiTech公司（连续结晶仪、连续合成仪）在中国区的代理商和技术服务商，为广大高校和企业提供连续合成、在线萃取、连续结晶、在线过滤干燥、在线分析等整套连续工艺解决方案。

公司与复旦大学、南京大学、中山大学、华东理工大学、南京工业大学、浙江工业大学、河北工业大学等高校研究机构合作成立微通道连续流化学联合实验室，致力于推动连续流工艺在有机合成、精细化工、制药行业、能源材料、食品饮料等领域的应用，合作实验室可以为客户的传统间歇釜式工艺在连续流工艺上的转变提供工艺验证、连续流工艺开发工作，促进制药及精细化工企业由传统间歇工艺向绿色、安全、快速、经济的连续工艺转变。

公司与荷兰Chemtrix B.V.在浙江台州、江苏南京合作组建了连续流微通道工业化应用技术中心（以下简称“工业化技术中心”），旨在打造集连续流微通道工艺开发、中试试验、工业化验证、技术交流于一体的综合性连续流微通道应用技术服务中心，以为广大生物医药企业、化工类企业提供专业、完善的智能化连续流工艺整套系统解决方案及技术服务方案。