IBA-Tet启动子Strep-tag II/6xHistidine-tag双标记表达载体

特点和优点：
• 以pASK-IBA载体在大肠杆菌中高水平表达
• 由于tet启动子而使表达受到紧密调控
• 增加细胞毒性基因的稳定性
• 通用的克隆策略，只需一个限制性内切酶
• N-端或C-端Strep-tag II融合
• N-端或C-端6xHistidine-tag融合
• Strep-tag II/6xHistidine-tag双标记载体
• 胞液或外周胞质中表达
• 无水四环素（anhydrotetracycline，AHT）诱导表达
• 氨卞青霉素或氯霉素抗性

原理和特性：
　　pASK-IBA载体与受紧密调控的tet启动子一起工作。tet抑制子在pASK-IBA质粒上编码，并分别从beta-内酰胺酶启动子或氯霉素乙酰基转移酶启动子组成型表达。这种特殊的安排保证了抑制分子和质粒拷贝数之间平衡的化学计量。在低浓度无水四环素的有效化学诱导下，外源基因表达受到的严格抑制才得以解除。与lac启动子（有漏洞、易受分解代谢产物（cAMP水平，代谢状态）的抑制以及受染色体编码的抑制分子的影响）相比，tetA启动子/操纵子受到紧密调控，不与任何细胞调节机制或遗传背景有功能上的偶联。
　　因此，无需特殊大肠杆菌菌株或额外质粒，多种培养基和培养条件下都可以应用。例如，葡萄糖基础培养基甚至XL 1-Blue菌株（携带四环素抗性基因的一个附加拷贝），也可用于表达。pASK-IBA表达系统在发酵等多种条件下非常稳定，操作方便。
　　细胞质pASK-IBA载体现以“plus”版本提供。这种新版本包含改良的翻译起始位点以增加一级蛋白质产量，而“plus”载体（如pASK-IBA3plus）的其余序列与其“非plus”前体（如pASK-IBA3）相同。“非plus”版载体从现在开始仅按需供应。
　　载体的更多元件包括一个前后串联的核糖体结合位点（RBS），保证翻译的有效起始；脂蛋白基因的强终止子，以避免通读；噬菌体f1的基因间区域，以提供一种制备单链DNA的方法；以及一个beta-内酰胺酶或氯霉素乙酰基转移酶基因*。这些载体均不介导抗四环素抗性。

*使用带beta-内酰胺酶抗性基因的克隆载体可能会有某些局限性，因为氨苄青霉素在细菌培养基里降解的相当快。因此，我们现在以氯霉素抗性取代氨苄青霉素抗性供应Strep-tag II载体pASK-IBA2C至pASK-IBA7C。

参考文献:
Skerra, A. (1994). Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli. Gene, 151, 131-135.

　　以下大肠杆菌菌株已与pASK-IBA载体一起成功用于Tet表达：JM83, WK6, B, BL21, MG1655, W3110, BL21(DE3), BLR(DE3), XL1-Blue, BL21-CodonPlusTM-RIL
　　对于分泌型蛋白，我们推荐JM83。对于胞质表达我们推荐大肠杆菌B菌株，因为它们缺乏离子蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，后两者能在纯化过程中降解蛋白质（Grodberg and Dunn, 1988, J.Bacteriol. 170, 1245）。
请注意我们不知道有与Tet表达系统不兼容的大肠杆菌菌株。

无水四环素：tetA启动子诱导剂
　　Strep-tag/Strep-Tactin 过度表达系统的大肠杆菌表达框受tetA启动子/操纵子和抑制子的转录调控。启动子被低浓度无水四环素（AHT）诱导,既节省费用也使AHT的抗菌影响降到最低。Degenkolb 等 (1991) 研究表明，AHT 对tet抑制子的结合比四环素对tet抑制子的结合紧密35倍。
参考文献:
Degenkolb J, Takahashi M, Ellestad GA, Hillen W, 1991:Antimicrob. Agents Chemother. 35, No 8, 1591-1595 Structural requirements of tetracycline-Tet repressor interaction: Determination of equilibrium binding constants for tetracycline analogues with the Tet repressor.

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