上海瞬渺-基于空间光调制技术的光片显微镜技术简介

                              基于空间光调制技术的光片显微镜技术简介

传统的光场荧光显微镜通过物镜将激发光聚焦，同时收集样品的荧光信号成像。虽然焦平面上的光最强，但其上下的样品也会被照亮，导致以下局限性：

（1）引入额外的光毒性，影响样品生物活性，甚至造成细胞死亡；

（2）成像焦平面以外的干扰信号进入图像，导致图像分辨率和反差降低。

光片显微镜与传统显微镜的不同在于激发光的照明方式。它的照明光是一张与成像面平行的薄薄的“光片”，只有焦平面的样品被照亮，而其上下的样品不受影响。这就是所谓的”光片”名称的由来。

产生光片最简单的方法是在光路中引入一个圆柱形透镜。通过该透镜的光，宽度维持不变，但在高度上被压缩成平面，然后通过照明物镜，这种光片最大的问题是照明不均匀，光强会沿着传播方向逐渐减弱。所以这种方法已经不再使用。而通过空间光调制器SLM控制光束来产生光片的方法就被广泛采用了。比如用空间光调制器产生0阶贝塞尔光束和一个互补光束，可以消除贝塞尔光束的旁瓣的干扰，提高贝塞尔光束光片显微镜的轴向分辨率(注1），并且结合扫描振镜可以扩展视场（FOV）从12um到200um（注2）。

晶格光片显微镜（Lattice Light-Sheet Microscopy）则是通过使用空间光调制器（SLM），让照明物镜发出的激发光形成并行排列的多束贝塞尔光束，并在贝赛尔光束上形成晶格，扫描装置对晶格结构进行抖动，以创建一个平滑的激光片层。通过产生长而薄的光片来实现亚细胞分辨率，  大大加快了成像速度（可达200fps），同时实现光束的倍增和激发。实现了150 nm空间分辨率的超分辨成像，减小光毒性，增加有效视野，克服了高斯光束（有限的光学层切、有限的视场范围）和贝塞尔光束（强环、激发离焦荧光）产生的光片的局限。（如图1，2所示）

图1：传统的（高斯）激光片层显微镜将荧光激发与检测分成两个独立的光路，能够通过仅激发来自对

焦平面的荧光来产生一个固有的光学切片。

图2：晶格光片显微镜通过产生长而薄的激光片层来实现亚细胞分辨率，克服了高斯光束（有限的光学

切片及观察视野）和贝塞尔光束（强环，激发非焦平面荧光）的局限。

德国Holoeye的相位空间光调制器（上海瞬渺光电代理）以其超高的光利用率及优良的品质，被德国蔡司光学选中，用于其最新上市的晶格光片7显微镜（ ZEISS Lattice Lightsheet 7 microscope），图3就是采用了Holoeye的空间光调制器的蔡司光学的晶格光片7显微镜的光路示意图。

                                                              图3：蔡司光学的晶格光片7显微镜的光路示意图

                               图4：蔡司光学的晶格光片7显微镜下的人工诱导多能干细胞的独特的亚细胞结构

                总结与展望

空间光调制器它可以调节光波的相位、振幅和偏振状态，从而实现对光场的精确控制，所以在激光片层荧光显微镜中的应用前景广阔。它可以提高成像分辨率和光学控制能力，并且在光学显微镜成像技术中有着广泛的应用前景，为科学研究和生物医学领域的进展提供更多的可能性。比如中科院西安光机所姚保利和于湘华老师的团队，他们就应用Holoeye的SLM在光片荧光显微镜方面做了很多研究工作，比如用SLM产生多聚焦平移高斯光束阵列来扩展显微镜视场等等。                  

　深度开发挖掘空间光调制器在光片显微成像技术方面的应用，需要产学研各界联合努力，如对空间光调制器控制激光器光束产生多束贝塞尔光束的控制代码及互补光束的算法等方面应用的技术问题感兴趣，欢迎和我们联系沟通。联系方式：saleschina@rayscience.com. Tel: 021-34635258.

参考文献

注1：Jia H, Yu X, Yang Y, et al.

Axial resolution enhancement of light-sheet microscopy by double scanning of Bessel beam and its complementary beam. J. Biophotonics. 2019;12:

e201800094. https://doi.org/10.1002/jbio.201800094

注2：Liu C, Bai C, Yu X, Yan S, Zhou Y, Li X, Min J, Yang Y, Dan D, Yao B. Extended field of view of light-sheet fluorescence microscopy by scanning multiple focus-shifted Gaussian beam arrays. Opt Express. 2021 Feb 15;29(4):6158-6168. https://doi.org/10.1364/OE.418707