用高分辨率溶解数据的内部标准校正杂合子检测

2010-12-20 09:29

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资料摘要：

摘要：背景：用于基因分型的高分辨率熔解曲线技术既简单又有效。在以熔解为基础的方法中，探针法是基因分型的黄金标准，可以将等位基因与目标的匹配完全区分开。小片段基因分型法是代替探针的基因分型法。异源双链核酸分子的存在使得检测纯合子变得容易，其熔解峰的形状有明显的改变。纯合子G/C或A/T的基因分型比较困难，因为其等位基因的Tm值相似。这些碱基对改变的纯合子用小片段法很难区分。样品间的温度、buffer和体积的变化限制纯合子的分离。不管仪器是多么精确，用户操作的变化是需要注意的，减少这种变化的方法可以改进小片段基因分型。利用内部特定反应的标准可以克服这些限制。方法：合成校准的核苷酸，与其互补链的浓度相同。用普通PCR仪进行PCR反应，反应时有LC Green和内标的存在。PCR反应之后，将其放入LightSanner中，扫描55℃-97℃范围内的数据。标准品熔解的特征是成一条线的，用于转换每个样品的荧光数据。测序之后确认基因型。我们通过测量每个样品的峰形与基因型一致的平均Tm值的距离，评估较正之前和之后纯合子基因分型的错误率。当样品的Tm值与不正确分组平均Tm值相近时，可以观测到错误。如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn

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数字PCR，LunaProbesTM和MAAB相结合可以检测到低于0.01%的等位基因的突变

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低水平突变的检测促使了许多新方法的发展。我们结合现有的三个技术：数字PCR，非标记探针法和MAAB（突变等位基因的偏向性扩增）（见图1）。数字PCR（Vogelstein and Kinzler，1999）需要许多重复的样本使模板稀释至约1拷贝/反应。将原始的数字PCR进行一些改进后可以进行高分辨溶解曲线分析（HRM），要求模板稀释为5个拷贝/反应 (McKinney, 2007)。这表明，如果存在突变的等位基因，一个反应中至少包括20%的等位基因并且可以检测到异源双链的存在。通常数字PCR检测的灵敏度约为2%。并且灵敏度是可以增加的，这主要取决于重复检测的数量。非标记探针法在PCR反应中加入3’端封闭的非标记寡核苷酸（Zhou，2005）。在使用HRM仪器时除了进行扫描之外，非标记探针增加了基因分型的功能（见图2）。非标记探针的灵敏度大约在5%（Wall，2007）。MAAB利用非标记探针增加了稳定性，探针与野生型等位基因完全匹配，和突变的等位基因不完全匹配，使突变的等位基因得到优势扩增。MAAB的灵敏度可以低于1%（McKinney，2009）。本实验中，我们结合这三种方法来增加HRM的灵敏性和有效性。如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn

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