通过温度内标提高高分辨熔解曲线中纯合子检测的灵敏度

2010-12-14 10:06

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资料摘要：

应用高分辨率熔解曲线技术进行基因分型不仅简单而且有效。基于熔解曲线的分析方法中，探针法是进行基因分型的金标准，能够全面的检测匹配的目的等位基因。小片段扩增法是一种不需要设计探针进行基因分型的方法。由于异源双链的存在，杂合子很容易检测，而这很大程度上改变熔解转化的峰形。纯合子基因分型中G/C或A/T的改变是最难检测的，因为它们的等位基因有相似的Tm值。那些称为中性纯合子的碱基对使用小片段法是很难区分。此外，纯合子难区分也受样品与样品间温度的变化，缓冲液和体积的限制。无论多么精确的仪器，相关的变化可能是显著的，所以需要一种方法来减少这种变化并且改善小片段基因分型。而使用特异性内标就可以克服这些限制

利用LightScanner上的高分辨熔解曲线进行DNA甲基化位点检测的灵敏性

高分辨熔解曲线突变检测

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低水平突变的检测促使了许多新方法的发展。我们结合现有的三个技术：数字PCR，非标记探针法和MAAB（突变等位基因的偏向性扩增）（见图1）。数字PCR（Vogelstein and Kinzler，1999）需要许多重复的样本使模板稀释至约1拷贝/反应。将原始的数字PCR进行一些改进后可以进行高分辨溶解曲线分析（HRM），要求模板稀释为5个拷贝/反应 (McKinney, 2007)。这表明，如果存在突变的等位基因，一个反应中至少包括20%的等位基因并且可以检测到异源双链的存在。通常数字PCR检测的灵敏度约为2%。并且灵敏度是可以增加的，这主要取决于重复检测的数量。非标记探针法在PCR反应中加入3’端封闭的非标记寡核苷酸（Zhou，2005）。在使用HRM仪器时除了进行扫描之外，非标记探针增加了基因分型的功能（见图2）。非标记探针的灵敏度大约在5%（Wall，2007）。MAAB利用非标记探针增加了稳定性，探针与野生型等位基因完全匹配，和突变的等位基因不完全匹配，使突变的等位基因得到优势扩增。MAAB的灵敏度可以低于1%（McKinney，2009）。本实验中，我们结合这三种方法来增加HRM的灵敏性和有效性。如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn

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