一文带你看懂高效液相色谱仪HPLC

　　HPLC是上世纪六七十年代发展起来的新型分离分析技术，广泛应用在制药、化工、环境、食品等领域，各行业实验室均能看到大量HPLC身影。

　　HPLC系统由脱气机(内置、外置)、泵、自动(手动)进样器、柱温箱(选配)、检测器、数据处理系统等模块构成。

　　HPLC实验室仪器管理

　　针对每台仪器建立档案及标准操作规程SOP

　　每台HPLC档案需包括：品牌、产地、主体流路材质(兼容溶剂)、耐压范围、正相系统或反相系统(主要看泵密封圈材质)、对应维修工程师及应用工程师的电话。保证出现问题时快速联系获取解决方案，将仪器的损害尽可能的降低。

　　HPLC主体流路材质一般有不锈钢SST、钛Ti或MP35N(MP35N合金是一种无磁的镍钴铬钼合金)，普通液相系统无特殊说明一般为不锈钢系统，钛或MP35N多用于BioHPLC系统中，比不锈钢系统更耐腐蚀，和更好的生物兼容性。

　　针对每台仪器编写完整的操作规程，应涉及到电压、开关机顺序及注意事项，使用人在申用仪器时应注意仪器的情况，发现问题及时记录并上报。对仪器的使用和维护记录严格审核。

　　物料管理

　　所有进入液相色谱系统的溶剂均应是色谱纯，样品应经过相应的前处理，确保样品的洁净度，不会堵塞和污染系统。使用的进样小瓶规格要与自动进样器匹配，瓶子隔垫要与样品溶剂兼容。如需过滤，应选择与溶剂兼容的滤膜材质，避免滤膜溶胀或反应等结果导致样品污染或系统堵塞等问题。

　　相关规定

　　(1)仪器申用的规范化预约：有电子平台在电子平台上申请预约，没电子平台可制定手工或电子台账记录具体情况。

　　(2)制定并严格执行实验室管理规定。

　　(3)严格按照仪器SOP规定使用。

　　(4)完善使用记录的书写，执行复核审查。

　　(5)仪器的维护规程的制定与执行。

　　环境要求

　　仪器使用环境应无尘，通风良好，温度保持在(15-30)℃，室内相对湿度应在5%-85%范围内，仪器应平稳的放在试验台上，周围无强烈机械振动和电磁干扰源。电压应符合响应厂商的安装使用要求。

　　HPLC维护

　　目前各厂商生产制造的液相色谱仪主要分两类，一类是一体机，另一类是模块化分体机。一体机体积小巧、安装、移机便捷;分体机维修方便，各有优势。对于这两类液相系统总体维护是相似的。

　　液相色谱系统分为脱气机(包括内置和外置两种)、泵、自动进样器(手动进样阀)、柱温箱、检测器等功能模块。

　　1、脱气机的维护：

　　为避免脱气机污染：应严格过滤并定期更新溶剂，定期润洗脱气机溶剂通道，对于走水相的通道这点非常重要。使用有机溶剂充分的润洗所有通道(使用干净的溶剂瓶)，在使用水和乙腈或甲醇作为流动相时每周充分润洗脱气机通道一次。然而在色谱中反复出现鬼峰时，应及时调整润洗周期，并按下面的步骤进行相应的润洗。

　　在泵出口安装背压管，并调整压力至200-300bar

　　用20%的硝酸在常规流速下冲洗1小时(使用新鲜的HPLC级水)

　　用HPLC级水润洗通道知道PH测试为中性

　　再用HPLC级乙腈在常规流速下润洗2小时

　　用干净的溶剂瓶装上新配置的流动相并与脱气机连接

　　安装新的溶剂过滤器

　　拆除背压管并重新按照要求连接系统

　　平衡系统

　　有些品牌的液相色谱仪只有反相脱气包，当使用正相系统时，要求短接脱气机。有些品牌亦有正相脱气包，使用时应注意，避免溶剂对脱气包材质造成不可逆的损坏。

　　2、溶剂吸滤头维护

　　室温较高时，使用纯水相或有机相比例较低时，流动相应临用现配及时清洗吸滤头以防吸滤头堵塞。

　　定期检查溶剂过滤头，尤其是水及相似溶剂作为流动相时，细菌等微生物及其代谢产物容易沉淀堵塞滤头。所以定期更换溶剂，并在清洁溶剂瓶后重新装入新的溶剂，必要时，更换新的溶剂滤头。

　　3、泵的维护

　　泵的易损件主要为单向阀、过滤白头、柱塞杆、柱塞密封圈等，做好泵头的维护，反相系统使用缓冲盐时应使用seal wash清洗，如没有自动后密封清洗系统，可以手动清洗，当使用正相系统时选择适宜的溶剂清洗。

　　应注意有些品牌的后密封清洗系统的溶剂瓶是循环的，有些品牌是非循环利用的，对于循环式的后密封清洗系统应定期更换储液瓶中的溶剂，避免溶剂中缓冲盐浓度过高起不到清洗的作用，以及溶剂瓶中滋生微生物。对于非循环的溶剂瓶除了定期更换溶剂外还应注意，不要让溶剂瓶中的溶剂跑空。

　　如果要使用了高浓度盐类流动相(通常zui大不超过1moL/L)，在后密封清洗系统没有充分运行(大于5min)的情况下，严禁运行泵，否则将造成柱塞杆及柱塞密封的损坏。

　　泵的部件中有peek(聚醚醚酮)材质组件，在使用lv仿CHCL3，四氢fu喃THF，二甲基亚砜DMSO等溶剂时，peek材质的管线或其他部件会发生溶胀现象，建议更换耐受以上溶剂的不锈钢备件或钛或者MP35N等材质的备件。

　　4、Purge阀维护

　　不要用工具来拧紧purge阀，过紧可能会损坏密封垫，并且必须在系统压力为0时的情况打开或者关闭purge阀。

　　5、在线过滤器

　　purge中含有在线过滤器，当系统背压高时考虑更换新的在线过滤器滤芯。有些品牌是主动阀或者被动阀，需要更换阀中的过滤白头。

　　通常情况下，泵的柱塞密封垫由极高分子量聚乙烯(UHMW-PE)材料制成。当使用lv仿、三氯代苯、二氯甲烷、四氢fu喃或甲苯做溶剂时会对UHMW-PE密封垫造成化学损伤。在使用四氯化碳、二yi醚、yi醚、二异丙醚、酮类、甲苯、甲基环已胺及氯苯时还可能发生化学反应。不同制造商的密封垫材质有不同，有些是PTFE材质的还有石墨的。

　　6、自动进样器的维护

　　不同品牌的自动进样器结构有所差异，应详见厂商说明书做好维护。洗针液应定期更换，当使用内插管进样瓶时，应及时调整进样针高度，避免对硬件造成损伤，当出现进样体积重复性不好的情况时，排除仪器故障问题，由于进样瓶内负压造成的，对于高沸点难挥发的样品可选用欲开口进样隔垫。

　　定期检查进样针位置，防止进样时扎偏损坏硬件。

　　溶剂的选择：

　　所有不锈钢、钛合金、及宝石PCTFE聚三氟氯乙烯、PTFE聚四氟乙烯、peek聚醚醚酮等材质制造的部件都长期浸泡在溶剂中。

　　必须使用与管道材质匹配的标准试剂盒缓冲盐溶液。特别注意类似高粘度、低沸点、有紫外吸收(UV-VIS检测器)、高折射率(RID检测器)及可挥发溶剂(脱气机)

　　高浓度缓冲盐溶剂，通常zui过1moL/L，使用时应确认后密封清洗系统运行再正确的清洗溶剂上。

　　自动进样器大致分为两类不带温控的自动进样器和带温控的自动进样器，对于可进行温控的自动进样器要注意及时清理冷凝水，定期清洗样品盘避免进样针堵塞

　　针座漏液需要更换针座密封，针座堵了可以通过反冲的方式解决。

　　进样阀如漏液需更换进样阀转子密封等组件。

　　7、柱温箱的维护

　　一般没有需要特殊维护的地方

　　8、检测器的维护

　　检测器需要维护的部件主要是灯和流通池。定期检测灯能量，必要时更换灯。当结果谱图出现异常时确认是否是流通池污染导致的，及时清洗流通池。

　　常见问题及解决方案：

　　压力问题

　　1、压力低

　　(1)低粘度流动相 解决办法：使用Kozeny-Carmen或类似方程计算预期压力

　　(2)活塞密封垫泄漏 解决办法：检查是否存在漏液现象，必要时更换相关部件

　　(3)系统泄漏 解决办法：检查是否有漏液，拧紧或更换相关漏液部件

　　(4)系统中有气泡 解决办法：确保溶剂瓶或溶剂管线经过完全灌洗，且purging阀完全关闭，脱气机正常工作。

　　(5)溶剂过滤吸头、单向阀及管线等压力传感器之前的部件堵塞。解决办法：用分段排除法检查系统管路是否堵塞。

　　(6)泵流速故障 解决办法：用计量过的器皿判断泵流量是否准确，确认故障报修。

　　2、压力高

　　(1)高粘度流动相 解决办法：使用Kozeny-Carmen或类似方程计算预期压力

　　(2)泵流速故障 解决办法：用计量过的器皿判断泵流量是否准确，确认故障报修。

　　(3)压力传感器之后的管路堵塞、检测器流通池、自动进样器进样针或针座堵塞。解决办法：用分段排除法确定堵塞的位置，冲洗(反冲)或更换相关部件。

　　(4)保护柱或分析柱堵塞。解决办法：冲洗(反冲)或更换相保护柱或分析柱。

　　3、压力波动

　　(1)单向阀堵塞造成 解决办法：超声清洗单向阀

　　(2)管路中有气泡 解决办法：重新purge管路

　　二、基线问题

　　1、基线波动、基线漂移

　　(1)系统未平衡 解决办法：至少10倍柱体积平衡系统。注意室温是否稳定避免空调出风口直吹仪器。

　　(2)流通池中有气泡 解决办法:冲洗流通池

　　(3)保护柱被污染 解决办法：更换保护柱

　　(4)检测器污染 解决办法：按照厂商要求清洗流通池

　　(5)溶剂被污染 解决办法：更换溶剂

　　(6)检测器灯能量低 解决办法:更换相关灯

　　(7)梯度洗脱 解决办法：使用纯度更高的溶剂或选择其他波长，如还存此情况属正常现象

　　(8)系统泄漏 解决办法：检查泄漏位置，拧紧或更换泄漏处部件。

　　(9)温度波动 解决办法：使用柱温箱，如条件要求苛刻可使用柱前加热模块及柱后冷却模块。控制室温，避免空调出风口直吹仪器。

　　(10)色谱柱污染 解决办法：更换保护柱必要时更换分析柱

　　(11)泵未适当混合溶剂 解决办法;等度洗手动混合，在梯度洗脱时如仪器为低压系统确保比例阀正常工作，如仪器时高压系统确保泵流速精zhun混合器正常工作。

　　(12)溶剂过滤器堵塞 解决办法：超声(浸泡)清洗溶剂过滤器，应注意材质是否可以超声。

　　三、峰形问题

　　1、峰展宽

　　系统未平衡 解决办法：用至少10倍柱体积平衡系统

　　进样溶剂过强 解决办法：确保进样溶剂强度与流动相强度相当或更弱

　　进样体积过高 解决办法：减少进样体积

　　柱外体积过高 解决办法：减小样品浓度

　　温度波动 解决办法：使用柱温箱

　　保护柱污染或失效 解决办法：更换新的保护柱

　　分析柱污染或失效 解决办法：冲洗色谱柱必要时更换色谱柱

　　柱外体积过大样品扩散 解决办法：减小柱外体积

　　2、双峰

　　(1)色谱柱过旧，色谱柱填料有塌陷，柱校低 解决办法：更换色谱柱

　　(2)色谱柱污染 解决办法：冲洗色谱柱

　　3、倒峰

　　(1)溶剂被污染或进样溶剂紫外吸收比流动相低 解决办法：更换新配置的溶剂，第二种情况可以忽略

　　(2)检测器信号正负极设置反了，此时峰全部为负 解决办法：更改检测器设置

　　(3)RI检测器未平衡 按厂商要求平衡系统

　　4、平头峰

　　(1)检测器过载 解决办法：减小样品浓度

　　(2)检测器设置 解决办法：检查检测器衰减并重新校零

　　5、峰拖尾

　　(1)保护柱过旧 解决办法：更换保护柱

　　(2)色谱柱过载 解决办法：减小进样体积或减小进样浓度

　　(3)色谱柱柱校低 解决办法：更换色谱柱，对于有极性基团容易与流动相产生氢键易拖尾的化合物，可选择双重封端的色谱柱，或在不影响分析结果的情况下，加入扫尾剂，改善峰行。

　　(4)色谱柱污染 解决办法：冲洗甚至更换色谱柱

　　6、峰前沿

　　(1)溶剂效应 解决办法：更换进样溶剂确保进样溶剂强度与流动相相当或更弱

　　(2)色谱柱过载 解决办法：减小进样体积或浓度

　　7、峰面积重现性不好

　　(1)峰面积减小，样品降解解决办法：新配置样品，对温度敏感的生物样品应使用可控温的自动进样器

　　(2)峰面积过小，样品浓度过低，解决办法：增大样品浓度

　　(3)检测器设置，选择合适的检测波长

　　(4)进样量错误 解决办法：检查调整进样针高度确保进样量准确，计量泵正常工作

　　(5)样品粘度太大 解决办法：延长注射器的吸液时间

　　(6)检测器灯能量低 解决办法：更换灯

　　8、鬼峰

　　系统中存在污染 解决办法：排查溶剂、流动相、分析柱、保护柱、检测器、自动进样器、管路等，冲洗或更换被污染的试剂或原件。

　　保留时间漂移

　　系统未平衡好 解决办法：延长平衡时间

　　系统漏液 解决办法：检查漏液位置，拧紧或更换接头或管线

　　温度波动 解决办法：使用柱温箱，控制室温，避免空调直吹仪器

　　泵流量有误差 解决办法：联系报修

　　比例阀或混合器故障 解决办法：联系报修

　　HPLC是我们工作中重要的仪器之一，俗话说知己知彼百战不殆，我们充分了解了partner才能工作的更顺利，事半功倍。