液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素B1

    1.适用范围

　　本方法适用于出口茶叶中黄曲霉毒素B1含量的检验。

　　2.原理概要

　　样品用三氯甲烷提取，提取液经硅胶柱净化，净化后的提取液用三氟乙酸衍生，用配有荧光检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。

　　3.主要试剂和仪器

　　3.1.主要试剂：三氯甲烷、正己烷、苯、甲醇：紫外光谱级、乙腈：紫外光谱级、三氟乙酸、乙腈-水溶液(1+1)、三氯甲烷-甲醇溶液(95+5)、苯-乙腈溶液(98+2)、黄曲霉毒素B1标准品：纯度≥99%。

　　黄曲霉毒素B1标准溶液：准确称取适量的黄曲霉毒素B1标准品，以苯-乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成浓度为10μg/mL标准贮备液。根据需要，再配成适当浓度的标准工作溶液。

　　3.2.仪器

　　液相色谱仪，配有荧光检测器;

　　硅胶小柱：Waters Sep-pak Silica前处理小柱或相当的硅胶前处理小柱;

　　振荡器;

　　旋转蒸发器，配有100mL具尾管的圆底烧瓶;

　　微量注射器;

　　离心管：5mL具塞磨口;

　　粉碎机;

　　滤膜：有机系用，0.45μm;

　　微孔滤膜过滤器：有机系用，0.5μm。

　　4.试样的抽取与制备

　　4.1.检验批

　　以不超过2000件为一检验批。

　　同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格、等级等。

　　4.2.抽样数量

　　批量，件 最低抽样数，件

　　1 5 1

　　6～50 2

　　51～500 11

　　501～1000 16

　　1001～1500 19

　　1501～2000 20

　　4.3.抽样方法

　　从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取2.2规定的件数，逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上，用取样铲从每件中各取出有代表性的样品约500g。将所取样品充分混匀，用四分法或分样器逐步缩分出500g，装入洁净密封的样品筒内，加封后，标明标记，及时送实验室。

　　4.4.试样制备

　　将所取回样品全部磨碎，通过20目筛，混匀，均分成两份试样，装入洁净容器内，密封，标明标记。

　　4.5.试样保存

　　将试样于室温下保存。

　　注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

　　5.过程简述

　　5.1.提取

　　称取试样5.0g(精确到0.1g)置于100mL具塞锥形烧瓶中，加入15mL三氯甲烷，于振荡器上提取30min，然后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内，并用三氯甲烷洗涤滤渣，收集滤液至约20mL。

　　5.2.净化

　　用旋转蒸发器将上述滤液在50℃水浴中浓缩至约1mL，经0.45μm滤膜过滤后，注入硅胶小柱中。用2～4mL正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱，弃去流出液。然后用3～4mL三氯甲烷-甲醇溶液以每秒钟2滴的流速洗脱，收集洗脱液于离心管中。用氮气缓缓吹干，供衍生用。

　　5.3.衍生

　　5.3.1.试样

　　加200μL正己烷和50μL三氟乙酸于上述离心管中，盖紧磨口塞，超声振荡1min，静置10min，打开磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈-水溶液(1+1)定容至1.0mL，超声1min，用0.5μm滤膜过滤，滤液供液相色谱用。

　　5.3.2.标准工作溶液

　　取1.0mL标准工作溶液，用氮气缓缓吹干，按5.3.1步骤操作。

　　5.4.测定

　　5.4.1.色谱条件

　　色谱柱：NOVA PAKc18，300mm×3.9mm(内径);

　　流动相：甲醇-水溶液(42+58);

　　流速：0.8mL/min;

　　荧光检测器：激发波长375 nm，发射波长425 nm;

　　色谱柱温度：室温。

　　5.4.2.测定

　　根据样液中黄曲霉毒素B1的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素B1衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参**样测定。在上述色谱条件下，黄曲霉毒素B1衍生物保留时间约为8min。

　　5.4.3.空白试验

　　除不加试样外，按上述测定步骤进行。

　　6.结果计算

　　用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒素B1的含量：

　　X= A·cs

　　As·c

　　式中：X -- 试样中黄曲霉毒素B1的含量，mg/kg;

　　A -- 样液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰面积，mm2;

　　cs -- 标准工作溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，μg/mL;

　　As -- 标准工作溶液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰面积，mm2;

　　c -- 最终样液所代表试样的浓度，g/mL。

　　注：计算结果需扣除空白值。

　　7.低限和回收率测定

　　7.1.低限

　　本方法的测定低限为0.001mg/kg。

　　7.2.回收率

　　回收率的实验数据：黄曲霉毒素B1的添加浓度在0.001～0.5mg/kg范围内，回收率为89.1%～104.9%。