氮吹仪在新鲜牡蛎中碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定中的应用

一、实验原理

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg²⁺对该酶的活力有显著的激活使用。

为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：

（1）选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。

（2）用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀完全，然后方可时行离心分离。

（3）有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，最好立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。

（4）在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。

     酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/L Mg²⁺）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯（ pNP）在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD_4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L  Mg²⁺的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。

蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法，详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。

二、实验用品

(一)器材

    (1) 髙速组织捣粹机和玻璃匀浆器。

    (2) 离心机。

    (3) 超级恒温水浴锅。

    (4) 酸度计。

    (5) 722分光光度计。

    (6)天平、台秤。

    (7)透析袋。

    (8)磁力搅拌器。

    (9)冰箱。

    (10)秒表。

    (11)50µL微量进样器。

（二）试剂

     (1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris^.HCL PH7.5缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷1.214g，NaCl5.8g，溶于蒸馏水中，加入80ml 0.1mol/L HCL，用蒸馏水定容到1000ml。

     (2)正丁醇（分析纯）。

     (3) 硫酸铵(分析纯)。

     (4) 0.5% NaCl：称取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸馏水中。

     (5) 0.1 mol/L Na₂C〇₃-NaHC〇₃  pH 10.1 缓冲液:分别取(A)液 70mL，（B)液30ml混匀，用酸度计准确调节pH 10.1。

         (A) 0.1 mol/L Na₂C〇₃溶液：取 28.6 g Na₂C〇₃^.10H₂0溶于1000 mL蒸馏水中 。    

         (B) 0.1 mol/L NaHC〇₃ 溶液：取 8.4 g NaHC〇₃ 溶于1000 mL蒸馏水中。

     (6) 0.5 mol/L醋酸镁溶液：称取醋酸镁107.25 g溶于蒸馏水中，稀释成1000ml。

     (7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液：称取醋酸钠8.2 g溶于蒸馏水中,稀释至1000 ml。

     (8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液：取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000 mL。

    (9) PH8.8 Tris.HCl缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g，用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml，即为0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL，加蒸馏水约800ml，再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL，混勻后用1 %醋酸调节pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。

    (10) 丙酮(分析纯)。

    (11) 95%乙醇(分析纯)。

    (12) 20 mmol/L Mgcl₂：称取 1.904 g Mgcl₂溶于1000ml蒸馏水中。

    (13) 0.1 mol/L NaOH：称取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸馏水中。

    (14)  20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠（pNPP):称取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸馏水中。

    (15) 底物溶液(5mmol/L pNPP)：按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2：0.50:.28。

    (16)0.5µmol/mL对硝基苯酚（pNP=141.1)溶液:精确称取17.64mg对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250 mL。