细胞破碎方法与PhD高压均质机

细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 一、细胞破碎阻力 细菌 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。大肠杆菌(E. coli)属于细菌。 酵母菌 酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 真菌 霉菌的细胞壁主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层主要是蛋白质，最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 植物细胞 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网络系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网络之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 二、细胞破碎技术 目前世界上有多种细胞破碎方法，以适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。在此重点介绍机械法中的高压均质破碎法。 高压均质破碎法（homogenization）：在欧美、中国、日本、韩国等多个国家，高压均质机是常用的细胞破碎设备。美国PhD高压均质机，其结构由电机驱动泵体，进而在均质阀体内生成压力。细胞浆液通过止回阀进入均质阀体内，在高压下迫使其在均质阀的小孔中高速冲出，且由于瞬间减压和高速冲击，使细胞同时受到高的液相剪切效用、空穴效用、撞击效用而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过高压均质机或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，PhD同时采用内置式冷却和外部冷却的方式，使出料最低温度能控制在0-10℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于大肠杆菌，用美国PhD高压均质机，在15,000psi(1,035bar)，均质一次即可达用用户要求;对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用均质压力在25,000psi(1,720bar)的情况下均质。