奶酪的微波辅助氨基酸水解

奶酪的成熟涉及多种生化变化，例如脂肪水解、乳糖发酵和蛋白质降解。这些过程极大地影响了奶酪的质地、味道和香气。更具体地说，氨基酸的含量和特性会影响整个老化过程的奶酪风味。食物中的氨基酸既是游离的未结合分子，也是通过肽键结合在一起的氨基酸残基，从而产生乳制品中存在的各种蛋白质。为了全面评估奶酪在整个成熟过程中的氨基酸含量，需要对氨基酸组成进行准确评估。为此，必须水解蛋白质，有效地释放氨基酸残基，然后可以在水解产物中对其进行定量检测。

传统上，蛋白质在酸性或碱性条件下分别用 6 N HCl 或 4 N NaOH 在密封容器中 110 °C 处理18至24小时进行化学水解，时间、温度和试剂等因素会影响水解反应的准确性和精密度，从而影响氨基酸定量。总之，氨基酸分析是一项昂贵、棘手且耗时的实验室程序。通常，水解反应代表着这个过程的反应速度受到限制；减少有机反应的反应时间，另一种方法是用微波能代替常规加热。与传统的加热方法相比，微波可以在更高的温度和更短的反应时间内成功地促进蛋白质水解反应。CEM 的 Discover® 2.0 微 波反应器可以为实验室提供工具，以高效、可重复和安全的方式。

材料与方法

试剂与样品

所有试剂均购自商业供应商，水解溶液在使用前新鲜制备。从当地的商店收集奶酪样品，在食品加工机中均质化，并在 4°C 下储存直至分析。使用分析天平等分每个样品的 300mg 部分，用于其指定的水解反应。水解产物的氨基酸含量通过柱前衍生化，然后进行 UPLC 进样和 260nm处的 PDA 检测来确定。Waters AccQ-Tag™ Ultra Derivatization 试剂盒用于水解产物的 LC- PDA 分析。所有样品一式三份进行分析。

传统的氨基酸水解方法

在玻璃小瓶中加入 300mg 样品，然后加入 2.5mL 含 3% (w/v) 苯酚溶液的 6 N HCl。然后用 N 2 吹扫反应瓶并迅速密封。重复此过程，直到所有样品都准备好放入 110°C 烘箱中20小时。完成后，将样品从烘箱中取出并在衍生前冷却至室温。

Discover 2.0 水解方法

反应设置：将 300mg 样品部分添加到配备有搅拌棒的 35-mL Pyrex 容器中。然后向每个微波反应容器中加入体积为 5mL 的 6 N HCl w/3% 苯酚。

容器用 N2 吹扫5分钟，用 Teflon® 内衬硅胶盖快速密封，然后放置在自动进样器架中，以便自动放置在 Discover 2.0 腔中。 

方法编程：一步动态法，在 Discover2.0 系统中为奶酪的氨基酸水解编程。 

使用以下的方法参数： 

酸水解

容器类型：Pyrex

控制方式: Dynamic动态 

温度: 165 °C 

时间：20-min

压力: 300 PSI 

功率: 300 W 

搅拌: 高

分析样品准备

所有水解产物溶液通过 0.2µm PTFE 过滤器并用 6 M NaOH 中和，为 AccQ-Tag 衍生化做准备。将来自 Waters AccQ-Tag Ultra Derivatization 试剂盒的 70µL 硼酸盐缓冲液添加到新的回收瓶中。加入 10µL 中和样品，将小瓶盖上盖子并涡旋。然后，将 20µL 从 试剂盒中制备的衍生化试剂添加到每个样品反应中。将反应混合物涡旋10秒，然后在 55 °C 下加热10分钟，然后进行分析。

分析

将 5µL 体积的每个衍生反应注入与 Waters PDA 检测 器相连的Waters Acquity H-Class UPLC。使用 Waters AccQ-Tag Ultra C18 色谱柱（1.7µm，2.1 x 100mm）以 0.25mL/min 的流速进行分离。柱温为 45°C。洗脱梯度如表1所示。流动相为A：在 MilliQ 水中稀释10倍的 Waters AccQ-Tag Eluent A 和 B：Waters AccQ-Tag Eluent B。为了确定每种氨基酸的氨基酸浓度，Waters Amino 酸标准（沃特世公司，部件号 WAT088122）是在 5、10、25、50 和 100pmol/µL 的浓度下衍生。

参考文献

AccQ-Tag™ is a trademark of Waters Corporation. Teflon®isa registered trademark and a brand name owned by Chemours (formally DuPont). 

Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576. 

Davidson, I. Methods Mol. Biol. 2003, 211, 111-22. 

Han, K.; Richard, C.; Biserte, G. Int. J. Biol. Chem. 1983, 15, 875-884. 

Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.