SPEX高通量组织研磨仪- Real-Time Taqman PCR方法在动物组织样品中提取RNA/cDNA和基因组DNA的应用

1、样品采集、制备和组织研磨

采集新鲜动物组织样本，修剪至约50-100mg湿重，在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃低温冰箱中。样品来自于人、狗、猫、老鼠、牛、马，还有鱼和蛤（见表1所示）。在提取DNA或RNA之前，将这些冷冻后的组织，放入深孔板中，并将深孔板放置在干冰上冷冻。每个孔中放入两颗4m钢珠(SPEX货号2150) ，再加入500mL缓冲液(应用生物系统核酸纯化裂解缓冲液)。用深孔板盖板密封，在高通量组织研磨仪上以每分钟1000次的速度研磨2min。4℃环境下培养30min后，用裂解液提取gDNA或总RNA。使用高通量组织研磨仪优化后，再使用6700全自动核酸工作站进行实时PCR，提取到的RNA或DNA的组织量在10到20mg之间。

2、采用Real-Time Taqman PCR技术对提取的RNA/cDNA和基因组DNA进行质量控制

为评价提取的RNA的质量，采用Invitrogen产品合成互补DNA (cDNA)：200 units of SuperScript III, 600 ng of random hexadeoxyribonucleotide (pd(N)6) primer (random hexameter priner), 10 U RnaseOut (Rnase inhibitor), and 1 mM dNTPs in a final volume of 40 L.

逆转录反应在50℃下进行50min，加入60微升水，加热5min至95℃，在冰上冷却，终止反应。根据内源性对照TaqMan PCR系统从一定数量的组织中获得的CT值判断cDNA的质量。值高于一定阈值的样品表明样品质量受损，总RNA降解，需要重新提取备用样品。为了评估cDNA的质量，我们通常使用的TaqMan PCR系统，目标是物种特异性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)或核糖体基因(如18S rRNA或ITS-2)。

为了评估提取的基因组DNA的质量，开发了针对单个拷贝基因的物种特异性TaqMan PCR系统，以定量基因组当量和细胞数量。表1概述了用于gDNA质量控制的TaqMan系统。使用针对单个复制基因的TaqMan PCR系统，根据CT值判断一定数量组织的gDNA质量。值高于某一阈值的样本表明DNA已经降解，需要重新提取备用样本。GAPDH TaqMan系统可以用来靶向单拷贝GAPDH伪基因。

每个Real-Time TaqMan每个引物的PCR反应包含400nM，80nM的TaqMan探针和市场上买到的PCR试剂(TaqMan一般性PCR试剂：Applied Biosystems)包含10mM Tris-HCl (pH值8.3)，50 mM KCl，MgCl₂ 2.5mM，2.5mM三磷酸脱氧核苷酸，0.625 U AmpliTaq Gold DNA polymerase per reaction, 0.25 U AmpErase UNG per reaction and 5μL of the diluted cDNA sample or the gDNA in a final volume of 25 μL.样品置于96孔板中，在自动荧光仪(ABI PRISM 7700序列检测系统，Applied Biosystems)中扩增。扩增条件为50℃时为2 min, 95℃时为10 min, 95℃时为40个15s，60℃时为60 s循环。

图1

3、结论

图2

使用SPEX高通量组织研磨仪研磨动物组织，可以快速高通量的完成样品制备，且核酸提取量高、提取的核酸质量好。