二氧化碳培养箱做破骨细胞的传代、冻存与复苏

一、实验动物：
成年SPF级雄性SD大鼠1只， 体重250g。

二、实验方法及步骤
1、外周血单个核细胞分离
（1）标本采集：取SPF 成年 SD 大鼠 1 只，3％戊巴比妥钠，按动物体重0.15 ml/100g，腹腔注射麻醉。无菌操作下腹主动脉采血6 ml，注入肝素抗凝管中。
（2）单个核细胞分离：采用密度梯度离心法， 向采集的血样标本内加入等量的PBS，取4支15ml离心管，分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml，再缓缓向各离心管内加入上述含PBS血样各3ml，然后以2000r／min，水平离心20min，取出后在絮状层小心吸取单个核细胞，分别收集到2支离心管中，PBS清洗2次，备作重悬培养。
2、破骨细胞的诱导培养
将分离纯化的大鼠周围血单个核细胞，用含10％FBS、50ng／mlRANKL、20ng ／mlM－CSF、100U／ml青霉素、100U／ml链霉素的 α－MEM培养液重悬，调整细胞密度为1×105个／ml。再将配制好的细胞悬液接种到6孔培养板与直径35 mm培养皿中。直径35mm培养皿用于活细胞工作站动态跟踪成像，6孔培养板置 于二氧化碳培养箱内，在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下连续培养，用上述含RANKL、M－CSF的α-MEM 培养液换液，每3日1次。同时对整个培养过程作相差显微镜观察与活细胞成像，培养14 d作抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。
3、破骨细胞的传代
大鼠周围血单个核细胞经RANKL、M－CSF 诱导培养2周，形成大量贴壁的多核破骨细胞后，从二氧化碳培养箱中取出，将培养液吸净，加入37 ℃预温的D－Hank＇s液，冲洗2次，再滴加足0.25％胰蛋白酶液，使其覆盖整个底面，置于37 ℃培养箱中消化5min后取出，震荡1min左右，在倒置相差显微镜下观察，当大部分细胞收缩悬起后，加入α－MEM完全培养液终止消化，用吸管反复抽吸吹打，将细胞混匀后移入15ml离心管，2000r／min，离心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF的α－MEM完全培养液重悬细胞， 调整浓度至1×105个／ml，接种细胞至6孔培养板与直径35mm 培养皿中。同时对消化与贴壁过程作活细胞成像观察，3d后作TRAP染色。
4、破骨细胞的冻存
按破骨细胞传代方法，将诱导培养的破骨细胞制成细胞悬液，2000r／min，离心5min，去上清，用DMSO、FBS、α－MEM 按1∶2∶7 比例配制的冻存液，重悬细胞，调整细胞浓度至5×106个／ml，加入冻存管，每支1.5ml，用冻存罐在温度为－80℃冰箱中放置24h，再移至－196 ℃液氮中冻存。
5、破骨细胞的复苏
从液氮中取出冻存的破骨细胞，迅速在 37 ℃水浴中震荡融解，将融解的细胞悬液加入15ml离心管中，再加6ml α－MEM完全培养液，混匀，2000r／min，离心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF 的α －MEM完全培养液，按1×105个／ ml的细胞浓度重悬后，分别接种到6孔培养板与直径35mm培养皿中。同时对接种后的贴壁过程作活细胞成像观察，3d后作TRAP染色。
色，取出后去离子水冲洗，晾干，倒置显微镜下观察，DP-72 数字成像系统采集图像。