针对宠物皮肤致病菌抗菌肽的筛选及体外活性检测

宠物犬、 猫混合皮肤病临床发病率较高， 临床上治疗难度较大， 而且极易复发， 抗生素治疗易产生耐药性。 抗菌肽相对于抗生素， 它具有高效的、 广谱的抗细菌活真菌、 病毒、 原虫等一系列活性， 更加具有无残留、 效价高、 无毒害作用、不易产生耐药性等优点。 并且肽合成简便、 价格低、 热稳定性好、 抗菌机理独特，因此近年来受到越来越多的关注， 为解决当今细菌性疾病之危害带来了希望。通过抑菌圈、 最小抑菌浓度、 最小杀菌浓度及杀菌曲线评价抗菌肽的抗菌活性， 从而筛选出针对宠物皮肤致病菌具有高抗菌、 抗寄生虫活性， 能够快速杀死菌株作用的活性肽， 为研究理化性质与筛选临床有效抗菌药物提供依据。

1.1 材料
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S.aureus ATCC29213、 USA300） ；大肠埃希氏菌（Escherichia coli， E. coli ATCC25922、 E. coli BL21） ； 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC27853） ； 白色念珠菌（Canidia albicans， C.albicans ATCC10231） 。

1.1.2 多肽
人工合成的生物活性肽： 生物固相合成， P1、P2、 KL-7、 RR-9、 RI-12、 JH-18、 C-P2-5、 SI-15、 KH-11、 C-RR-9， 纯度为 95%以上。

1.1.3 主要试剂与材料
牛肉膏、 胰蛋白胨（OXOID） 、 酵母蛋白提取物（OXOID） 、 氨苄青霉素、KCl、 琼脂粉、 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O、 KH 2 PO 4 、 氯化钠（分析纯， 北京化工） 、 96孔平底细胞培养板、 离心管、 试管、 烧杯、 锥形瓶、 玻璃棒、 玻璃培养皿、 滤纸、涂布棒、 0.22 μm 微孔滤膜 。

1.1.4 主要试剂的配置

1.2 方法

1.2.1 纸片扩散法药敏实验

金黄色葡萄球菌与大肠杆菌做为测试菌， 并采用抑菌圈测定法检测各合成肽的抑菌活性， 以抑菌圈为指标， 测量抑菌圈大小。

（1） 药敏片的制备

用 6 mm 打孔器制备滤纸片， 高压蒸汽灭菌或紫外照射灭菌后备用。 分别取合成多肽各 0.01 g 分别溶于1 mL无菌蒸馏水中。滤纸片分别在50 μL多肽溶液、PBS 溶液、 无菌蒸馏水中浸泡 2 小时后， 晾干， 置于 4 ℃ 冰箱备用。

（2） 菌悬液的制备

本试验检测多肽对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌的药敏活性。 将活化的受试菌株接种于 LB 液体培养基中， 37 ℃气浴恒温振荡器中振荡培养 12 小时。 将测试菌液 LB 液体培养基稀释， 浓度至 1×10 6 cfu/mL， 备用。

（3） 涂板培养

对制备好的 LB 固体无菌培养基分别进行编号， 分别取 100 μL 各受试菌悬液， 均匀涂布于固体 LB 平皿上， 自然晾干 5 min 并标记。 将各多肽、 AMP、 无菌蒸馏水药敏片分别放置于涂布好的细菌平板表面， 倒置培养过夜培养于 37 ℃生化培养箱中， 通过抑菌圈大小判定各药物对试验菌株是否具有抗性， 筛选出有抗菌活性的多肽， 进一步进行活性检测。