疑似甲型H1N1确诊方法（国家流感中心实验室）

疑似甲型H1N1确诊须过四关

2009-05-05 03:17:24　来源: 新京报(北京)

      对于疑似甲型H1N1流感患者，通过何种手段才能最终确诊其感染了甲型H1N1流感病毒?

       昨日下午，北京市宣武区迎新街100号，记者实地探访了中国疾控中心病毒病所国家流感中心实验室，工作人员再现了如何从疑似患者呼吸道内获取标本并分离出病毒的基本片段，再通过特殊仪器下读出病毒的基因序列，最终与甲型H1N1流感病毒的基因序列图进行比照，从而得出患者是否染疫的全过程。

（昨日，中国疾控中心病毒病所国家流感中心实验室，工作人员正使用LABCONCO生物安全柜进行病毒标本中核酸液的提取。）

1运送    4℃恒温运送病毒标本

（地点：医院至流感网络实验室 ）

        用于追索病毒的标本来自疑似患者的呼吸道，一般是液体，即喉液或鼻液。每份液体标本需求量为200微克以上。

        据国家流感实验室工作人员李晓丹介绍，只有足够的标本量，才能保证分离到足够的活病毒和用于核酸检测的病毒基因片段。 

        为了保证病毒的活性，每份标本从患者的鼻部或咽部取出后，必须立即装进防漏、防爆、防雨的特殊密闭容器中。

         李晓丹说，容器内，要保证4摄氏度的恒温，“就像冰箱冷藏室”，一直从医院坚持到实验室。之后，经专人送进重重机关的P3实验室(生物防护三级实验室)。

2提取    提取病毒分装基因片段

（地点：生物防护三级实验室） 

        P3实验室曾经不止一次在抗击SARS和禽流感的战斗中崭露头角。防控流感大流行，及时发现甲型H1N1流感病毒的踪迹，P3实验室内的工作，仍是基础和关键。

        只有取得特定资格的工作人员，才能打开密码锁，进入P3实验室。 

        工作人员需依次穿过一更衣室、二更衣室、缓冲间和准备间4个房间，最终从头武装到脚。在装戴好头套、连衣裤的隔离服，口罩和脚套后，才能进入实验室开始工作。 

        随着深入，气压也一层层降了下来，实验室里的气压就只有50-60帕左右(比正常气压低很多)。只有这样，才能保证里面的风不会往外吹，里面的微生物和病毒，不会跑到实验室外。

        据李晓丹介绍，检测甲型H1N1流感病毒的工作，将从两方面同时开展：标本的一部分用于提取活病毒，留待培养研究。另一部分，则用于分离出病毒中的核酸液，也就是“饱含基因代码的片段”，需要50微克以上，分装入试管后，以备进一步的检测。

3检测    扩展基因代码方便对比

（地点：生物防护二级实验室(PCR实验室) ）

         试管中的基因片段随后将送进PCR实验室。 

        李晓丹说，PCR仪是核酸检测病毒的关键设备。最近几天，他们针对甲型H1N1流感开发的检测试剂盒，就将在这个环节发挥主要作用。 

        实验人员将试管内的一组基因片段放入检测试剂配置的反应液中，再置于PCR仪下，大概两个半小时左右，每个基因片段都被放大，生成了大小不一的核酸扩展物CDNA(基因片段扩展物)。 

        同时，另一部分通过反应液，被分装在PCR小试管内的核酸RNA(核糖核酸)，则可以在特制模板中，通过与目标病毒基因片段的定时定量比对，由实验人员读出结果：是否为甲型H1N1流感病毒。

        李晓丹说，为了确保检测结果的准确无误差，这个定时定量PCR检测结果，只作为整个甲型H1N1流感病毒追索结论的一个参考。

4确诊    电泳胶内筛显病毒“原形”

（地点：生物防护一级实验室(综合实验室) ）

         装有不同基因片段扩展物的微小试管被送进综合实验室，这里的关键设备是盛满了琼脂糖凝胶、两头插着正负电极的矩形电泳检测仪。

         利用移液器，实验人员将试管中微量的无色透明液体染色后，再放入充了电的胶“池”。 

         在电压牵引推动下，胶池的表面开始密集冒起小气泡，“那是病毒的基因扩展物在向另一个方向走，个头大的产物走得慢，越是个头小的产物走得越快。”李晓丹说，琼脂糖凝胶电泳仪就像一面筛子，把病毒中每个基因片段都以特定的“大”、“小”影像显现出来。

         当然，上述景象人的肉眼无法看到。实验人员让“胶池”充电40分钟，确保所有的扩展物都“运动”起来后，将“胶池”放进另一个特制的方形“铁柜”中，这其实是一部紫外线下工作的“照相机”———凝胶成像仪。

        成像仪内，紫外线灯发光，照射在凝胶上，然后对胶中染色发光的扩展物自动拍照，并输出在连接的电脑屏幕上。

       李晓丹介绍，电脑中还能同时调出甲型H1N1流感病毒基因序列图，在同一个位置上，受检病毒的数个基因片段扩展物大小与参照物完全相合，就能够最终判断，标本送检患者感染了甲型H1N1流感病毒。

       反之，排除感染可能。

        李晓丹说，从病毒标本送至实验室到最终检测出结果，约需4—6小时。 

（工作人员正在分析病毒标本。）

甲型H1N1病毒检测程序

       医生对疑似患者的鼻液或喉液取样

       送入流感网络实验室

      提取多个基因片段，对逐个基因片段进行扩展(放大)

      扩展物入胶染色，在紫外线灯下发光成像 

      与电脑中储存的目标病毒基因片段对比，同一位置上，大小是否完全一致 

      若一致则能够最终判断，标本送检患者感染了甲型H1N1流感病毒

（本组稿件采写/本报记者 魏铭言 本组稿件摄影/本报记者 王申）