2019/11/25 16:50
阅读:900
分享:
免费下载
方案摘要:
方案详情:
应用优势
1)教学式系统展示LC系统扩散对mAb的SEC分离的影响。
2)指导用户根据所使用的LC系统和分析方法要求(包括分离度、灵敏度、重现性和可转换性)选择最佳的SEC色谱柱配置。
3)展示ACQUITY™ UPLC™ H-Class Bio和ACQUITY Arc™ Bio系统的SEC分离性能。
简介
过去,体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来,由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升,使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的,是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分离方法,LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱,使分离难度进一步增加。虽然使用粒径为亚2µm的SEC色谱柱能够提高效率,从而提高HMWS和LMWS的分析通量,但由于色谱柱硬件和填料的限制,这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时,通常因为SEC粒径为3µm 及以上,可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行,但存在一个经常被忽视的事实,即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积,导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。
结论
我们尝试系统性评估LC系统柱外扩散与SEC粒径、色谱柱内径和柱长在 mAb HMWS以及LMWS杂质分析中的相互影响。考虑到上述关系,我们开发了一套用于匹配沃特世UPLC和HPLC SEC色谱柱与首选用于SEC分离的三种沃特世LC系统的通用指南。
此外,这些数据表明,在某些SEC方法的稳定性测试中,柱外扩散的评估可能是一个重要变量。最后要注意的是,如果由于LC系统具有无法纠正的明显柱外扩散情况而阻碍了开发方法向其转换,则降低该方法的流速或增加色谱柱柱长可有效缓解其影响,且不会从根本上改变分离的选择性。 读者还可参阅本应用纪要的姊妹篇《评估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响》 (沃特世应用纪要,部件号:720006337ZH)。除了SEC方法开发建议外,该出版物还包括SEC和系统扩散的其它数据和理论讨论。
下载本篇解决方案:
更多
利用Xevo TQD定量测定基因毒性杂质
烷基磺酸,尤其是甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸,作为一类常用的烷化剂,在制药行业中常被用作烷基化试剂和催化剂,并在API的化学合成中用于纯化步骤。合成反应或再结晶步骤中任何残留醇的存在都可能导致形成磺酸的烷基酯。许多此类甲磺酸酯、苯磺酸酯或甲苯磺酸酯都被认为具有基因毒性,而其它酯类也可能存在基因毒性,因此需要在药物和药品中进行监测。 本研究展示了通过简便的仪器设置及方法开发的工具,在快速正负切换的模式下,提高Xevo TQD的灵敏度,来加快基因毒性杂质的分析。
制药/生物制药
2014/08/21
XBridge Premier X 色谱柱助力 SEC MALS 在治疗性蛋白药物,生物类似 药以及腺相关病毒中的分析表征
本应用文摘旨在分享SEC-MALS系统中配备XBridge Premier Protein、XBridge Premier GTx BEH SEC色谱柱,分析表征治疗性单抗mAbs、生物相似药和腺相关病毒粒子AAVs等多个关键质量属性。
制药/生物制药
2023/09/18
基于SYNAPT XS的全谱图分子成像系统:结合多种成像技术 获得全面分析结果
展示使用SYNAPT™ XS进行全谱图分子成像的互补特性,证明这款经过改良的完全集成式解决方案能为质谱成像客户带来的优势。
其他
2020/09/02
使用UPLC评估增加柱前系统体积对含有高有机相稀释剂的样品峰形的影响
理想情况下,在运行色谱方法时,样品稀释剂组分应尽可能接近方法起始条件。这样做的目的是最大程度减小由样品溶剂效应引起的谱带展宽和峰畸变,进而避免出现峰不对称性、峰分裂或数据不可用的情况。引起溶剂效应原因是稀释剂与流动相之间存在洗脱强度差异。当稀释剂的洗脱强度高于流动相时,峰展宽和峰形异常的情况通常会更加严重1-2。事实上,业内普遍认为,最好是将进样的样品溶解于起始流动相中。然而,给定样品的预处理常常需要将分析物溶解在与流动相组分相差很大的溶剂中。为了避免溶解度问题和峰形不佳的问题,许多方案都要求在预处理过程中挥干样品溶剂,然后将样品复溶于流动相中。然而,这个额外的步骤非常耗时,所需时间往往比HPLC分析的时间还要长1。一般而言,推荐的做法是避免使用比流动相更强的溶剂来溶解样品和标准品。这种做法基于如下假设:强于流动相的进样溶剂会干扰样品在柱头处的吸附,而采用大体积进样时尤其如此2。遗憾的是,这种做法在实践中可行性不佳,因为分析人员往往必须根据样品的溶解度来决定有机溶剂的含量,以确保样品能够完全溶解。对于扩散体积较大的传统LC系统,这种现象带来的问题较少,因为柱前样品/溶剂/流动相混合很充分,可以缓解溶剂效应造成的色谱峰问题。然而,对于现代的低分散U(H)PLC系统,如果以较大体积进样含有高有机相的样品,就会出现问题,并可能导致峰对称性变差或峰分裂。
其他
2020/09/02