使用杂化颗粒C18色谱柱和乙酸流动相进行肽的高载量研究

Waters

2013/08/13 17:49

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Matthew A. Lauber、Stephan M. Koza和Kenneth J. Fountain

沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德市)

应用优势

两种具备独特选择性的杂化颗粒色谱柱(BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈)。在使用最优浓度的HOAc调节流动相时，

BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈获得的目标肽峰比使用0.1% TFA时更窄，分离度也更高。利用这一特性，可以通过更少的步骤获得含有药用反离子的肽。BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈由细胞色素c的胰蛋白酶消化液进行质控测试。

沃特世解决方案

ACQUITY UPLC^® H-Class Bio 系统

XSelect™ CSH130 C₁₈, 5 µm

XBridge™ BEH130 C₁₈, 5 µm

MassPREP™ 肽混合物

关键词

反相(RP)，肽，乙酸(HOAc)，表面带电杂化颗粒(CSH)，CSH130 C₁₈，BEH130 C₁₈，制备型色谱，肽分离技

术(PST)

简介

经证实，肽在研究中是非常有用的治疗剂和标记物。通常，为了实现这些用途，会通过制备型反相(RP)色谱对肽进行纯化。在大多数情况下，纯化出来的肽必须具有高纯度。如果存在污染物，会干扰生物分析的结果。如果活性药物成分中存在污染物，后果将会非常严重。因此，需要较高的色谱分辨率来尽量减少与目标肽化学性质非常接近的共洗脱杂质。此外，还需要色谱柱填料具有卓越的载样量，确保实现最佳的通量和生产率。肽分离使用的流动相中通常包

含强离子对试剂，例如三氟乙酸(TFA)。但是，如果选用含有TFA的流动相，需要进行额外的制备步骤。由于三氟乙酸盐(TFA盐)固有的毒性，必须将其除去或置换¹。最好使用毒性较低的反离子，尤如乙酸盐。实际上，大部分肽药都是乙酸盐或含有乙酸的液体制剂^2-3。因此，尽可能用乙酸(HOAc)流动相替代TFA流动相，这种做法似乎更有优势。之前曾有研究表明，在使用HOAc流动相和等度反相色谱后，TFA溶液中的肽(例如粗制合成肽)^4-5大部分转化为乙酸盐形式⁶。同时，使用高浓度乙酸盐缓冲液通过简单的洗脱步骤进行梯度分离，可实现更彻底的盐形式转化。⁷总之，使用HOAc流动相可简化纯化过程，有利于通过更少的步骤获得所需肽和反离子。

本文研究了使用BEH C18和CSH™ C₁₈色谱柱进行制备型肽分离的过程。BEH C₁₈是一种有机硅C18固定相，基于亚乙基桥杂化颗粒(BEH)技术，并具有卓越的耐用性和pH稳定性。表面带电杂化颗粒(CSH) C₁₈则是BEH C₁₈的升级产品，其表面被修饰在酸性条件下带有微弱正电荷。以下数据证明了这两种固定相均适用于高上样量的肽分离，既可用于TFA调节的流动相，也可用于HOAc调节的流动相。并且，在高上样量下，BEH C₁₈和CSH C₁₈在使用经优化的HOAc流动相时获得的目标峰均比使用0.1% TFA时更窄。

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