CAR-T 细胞进行表型和功能表征

TCR-T，CAR-T等细胞治疗是目前很有前途的肿瘤疗法，是将患者自身的T细胞进行改造得来，但是狡猾的肿瘤细胞不会束手就擒，T细胞在杀伤肿瘤细胞过程中会衰竭，杀伤能力大大减弱。最新的一篇《Nature》文章通过改造T细胞的基因，对T细胞充能，使其具备持续杀伤肿瘤细胞的能力，而且击杀效率更高[1]！

来自Gladstone–UCSF基因免疫学研究所的科研人员，通过CRISPR基因编辑方法发现了一个RASA2基因可以使得T细胞在多种免疫抑制剂的情况下依然能保持增殖，RASA2是一种RASgtpase激活蛋白(RasGAP)，也是人类T细胞的信号检查点，在急性T细胞受体刺激时下调。



这篇文章用的主流技术就是Incucyte® 实时活细胞分析系统，对T细胞体外杀伤活性做了全面分析：

1 在免疫抑制下能不能杀

2 低靶点表达量下能不能杀

3 能杀多久

4 TCR-T和CAR-T能不能都杀

T细胞“充能”基因筛选方法

将CRISPR基因编辑后的T细胞用CFSE染色，加入各种免疫抑制剂或者Treg细胞（一种可以负调节T细胞活性的细胞），通过FACS筛选能提高T细胞增殖活性的基因，发现RASA2敲除的T细胞在所有免疫制剂存在下仍具有增殖活性。Sartorius的iQue® 高通量流式细胞仪（点击查看产品手册）非常适合这个筛选工作。

左图：用FACS测试，低CFSE信号的细胞群百分比越高，则增殖（Dividing）活性越高。右图：RASA2敲除的T细胞，在诸如Adenosine等免疫抑制剂存在下具有更多的CFSE低信号的细胞群，说明其仍居有良好的增殖活性。

敲除RASA2的T细胞
在免疫抑制条件下仍有杀伤活性

为了验证敲除RASA2基因的T细胞活性，作者构建了CD19阳性和NY-ESO- 1阳性的肿瘤细胞，目前T细胞治疗手段主要是TCR-T和CAR-T，作者同时构建了针对CD19和NY-ESO-1的CAR（嵌合抗原受体）和TCR（T细胞受体），并用Incucyte® 测试了TCR-T和CAR-T在各种免疫抑制剂和Treg细胞存在下的杀伤活性。

针对NY-ESO-1的TCR-T在Treg细胞存在下对肿瘤细胞的杀伤作用：用Incucyte® 实时检测肿瘤细胞A375-RFP+细胞数量。对照组在Treg细胞存在情况下对肿瘤细胞杀伤作用减弱，而RASA2 KO细胞不受Treg细胞影响。

TCR-T对NY-ESO- 1阳性的肿瘤细胞的杀伤作用：RASA2敲除的T细胞在各种免疫抑制剂下的杀伤作用比对照强。Incucyte® 实时检测A375-RFP+细胞数量。

敲除RASA2的T细胞
能增加杀伤活性

作者构建了不同CD19+表达水平的Nalm6肿瘤细胞，并将anti-CD19的CAR基因转染到RASA2敲除的T细胞建立针对CD19的CAR-T细胞疗法。继续用Incucyte® 检测CAR-T的细胞杀伤活性，发现RASA2 KO的T细胞通过提高对靶点表达量敏感度来增加杀伤作用。

不同效靶比，不同CD19表达量的肿瘤细胞的杀伤作用发现，RASA2敲除的T细胞对CD19表达量很低的肿瘤细胞具有良好的杀伤作用。用Incucyte® 检测和计算死细胞染料Annexin V的荧光面积。


敲除RASA2的T细胞
具有持续杀伤活性

体外细胞杀伤往往只有几天时间，为了检测T细胞的持续杀伤效果，作者进行了6轮杀伤，每次杀伤持续72小时。

左图：TCR-T细胞杀伤实验发现即使在第六轮（Last Stim），与对照相比，RASA2 KO的T细胞杀伤作用依然明显。
右图：CAR-T细胞杀伤实验发现即使在第六轮（Last Stim），与对照相比，RASA2 KO的T细胞杀伤作用依然明显。

CAR-T细胞杀伤实验发现即使在第六轮（Last Stim），与对照相比，RASA2 KO的T细胞杀伤作用依然明显。

‍本文用Incucyte® 做了包括TCR-T，CAR-T以及持续杀伤各种细胞杀伤实验，为什么选用Incucyte® 呢？‍


培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害；这篇文章最长做了共计18天的六轮杀伤实验，每隔2-3小时自动拍摄。

6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高；这篇文章有各种免疫抑制剂、效靶比等实验组，Incucyte® 一次可以完成所有实验组实验。

高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；本文主要用到荧光计数并归一到第一时间点等功能。

大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol。本文用了配套的Annexin V试剂。

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-参考文献-

RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function.Nature 2022