如何提高关键蛋白质样品的回收率

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引言 

生物药样品通常由含有细胞碎片或蛋白质聚体等不溶性颗粒的原料制成，因此在分析之前需要进行固液分离以保护分析仪器。由于离心分离需要固相和液相之间存在密度差异，所以最好的方式是进行样品过滤，让膜过滤器提供绝对的颗粒截留。但是滤膜会吸附蛋白质等分析物，从而影响后续分析的结果。因此，选择具有最小蛋白质吸附的滤膜至关重要。吸附不仅取决于膜类型，还受到pH和表面电荷等样品和蛋白质特性，以及特定处理步骤的影响。我们选择了四种典型的针头滤器，并在各种样品条件下，测定了包含两种不同抗体在内的四种模型蛋白质的回收率，以满足众多生物、生物技术和生物制药应用的要求。


材料和方法

使用四种模型蛋白质研究滤膜的蛋白质吸附（表1）。

表1

建立了具有 120 个测试的裂区实验 | 最优设计，其中包含四个数值和两个分类因素（表2）；通过混合线性二次模型研究针头滤器不同膜的蛋白质吸附性。

表2


结果与讨论

统计实验设计（DoE）用于测定四种模型蛋白结合情况与四种不同类型针头滤器滤膜（均具有0.2 μm的孔径）的结合，通常用于样品制备，例如工艺过程中控制。醋酸纤维素（CA）膜（Minisart®，表3）的最高蛋白质回收率 > 98 %，并未显著高于于聚醚砜（PES）膜（Minisart® High Flow）的平均回收率（双侧t检验具有 0.05 的显著性水平）。此外，与尼龙和聚偏二氟乙烯膜相比，两种膜均显示出低 3 至 8 倍的标准偏差，这表明：即使对于不同的样品条件和靶蛋白质，这些膜也能实现高回收率（表2）。

表3  0.2 μm孔径过滤器的特性以及过滤后与膜类型相关的平均蛋白质回收率。

在分析 DoE 时，样品量，尤其是蛋白质浓度对蛋白质回收率的影响最大，且随着浓度和体积的增加而增加（图1）。在这一模型中，给定的表面将结合一定数量的蛋白质，因此（相对）回收率随样品量和浓度的增加而增加。因此，大体积和高浓度可以减少使用针头滤器进行样品制备过程中产品损失的百分比。

图1 使用基于膜的针头滤器的平均蛋白质回收率。在电导率为 32.5mS cm-1，pH 为 6.5 条件下，使用醋酸纤维素（A）、聚醚砜（B）、尼龙（C）和聚偏二氟乙烯（D）膜，对蛋白质 RFP、mAb1、mAb2 和 RuBisCO 的回收率进行平均。

膜类型也会产生相关影响，与尼龙或聚偏二氟乙烯（PVDF）制成的膜相比，由CA或PES制成的膜表现出明显更少的蛋白质吸附（回收率 > 95 %），尤其适用于低浓度和样品量（PVDF）制成的膜相比（回收率 < 75 %）（图1）。因此，如果靶蛋白稀缺，由CA或PES构成的膜可以帮助降低样品制备过程中的产品损失。pH效应很大程度上取决于蛋白质。


结论

大多数样品处理或制备都会导致产品损失，但是通过选择适当的滤膜，可在样品制备过程中，在广泛的条件内实现很小的产品损失。例如，使用Minisart® NML（CA）或 Minisart® High Flow（PES）滤膜可回收约 90 %的产品。还可以通过微调单个产品的样品条件来进一步提高产品回收率，例如选择适当的 pH 值。相比之下，如果蛋白质结合有利于样品制备，则可以使用尼龙膜，例如Minisart® NY。

Minisart® 针头滤器

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