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实时活细胞分析技术在神经科学研究中的应用

2022/07/20 17:44

阅读:183

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应用领域:
生物产业
发布时间:
2022/07/20
检测样品:
其他
检测项目:
表征
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方案摘要:

Incucyte® 神经元分析是一套综合的解决方案,由仪器、软件和试剂组成,可对复杂的神经元活动进行前所未有的评估,深入了解神经元细胞模型的功能。除了研究神经元的活性和结构,对于神经元之间信息传递的最重要方式——动作电位,Incucyte® 也有完整的解决方案,我们会继续为大家分享对应的内容的。下载白皮书《实时活细胞分析技术在神经科学研究中的应用》,了解创新型神经科研细胞分析方案。

产品配置单:

分析仪器

赛多利斯 Incucyte® S3 活细胞分析仪

型号: Incucyte S3

产地: 美国

品牌: 赛多利斯

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赛多利斯 Incucyte® SX5 活细胞分析仪

型号: Incucyte SX5

产地: 美国

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方案详情:

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人的大脑中有数百亿的神经元,它是神经系统最基本的结构和功能单位。神经元分为胞体和突起(Neurite)两部分,突起进一步分为轴突和树突。神经元通过突起与其他神经元的树突和轴突形成突触来进行信息传递(上图),与药物研发、退行性病变、神经损伤再生和神经元分化等息息相关。

为什么对神经元活动的动态评估很重要?

传统检测神经元的方法存在一些局限:
- 在神经元成熟的整个过程中分析单个终点(比如免疫组化),不但无法进行重复的动力学评估,而且需要进行固定、染色、漂洗、采集和分析图片,步骤繁琐;
- 也无法与生理相关环境结合获取全面信息;
- 无法确认细胞形态、空间分辨率或评估功能的连接性;
- 只能测定有限数量的细胞,无法模拟真实的网络环境。


Incucyte®提供创新型分析方案,实现长时程、实时、连续的定量监测

Incucyte® 实时活细胞分析系统可以置于细胞培养箱内,长时程自动采集相差和荧光图片,配合专门开发的NeuroTrack软件模块可以自动地完成图片的定量分析,获得突起长度(Neurite length)和分支(Branch points)等反应神经元结构变化的指标。Incucyte® 的载物台里可以同时检测6个96孔板,满足高通量实验需求。不同的用户可以通过局域网在办公室内对各自的实验进行检测设置、图片预览或定量分析,不需要频繁出入细胞间(下图)。

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究竟有何过人之处?下面就来深入了解一下具体的应用吧!



1. 利用实时的相差成像来追踪不同类型神经元突起的生长

将iPSC来源的神经元iCell、原代大鼠皮层神经元和Neuro-2A神经元接种到96孔板里,采集间隔为2-6 h,共检测150 h。下图展示了大鼠皮层神经元在接种后第0、3和5天的相差图片,可以看到神经元形态很清晰,随培养时间的延长神经元胞体的数量没有明显改变,但突起的长度和分支显著增加。NeuroTrack可以很准确地识别和定量神经元的突起和胞体,识别的神经突起以黄线圈描,神经元胞体以蓝色填充表示。右图分别展示了三种神经元随培养时间延长其神经突起和分支的时间动力学曲线,都呈上升趋势。

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原代、iPSC来源和神经元细胞系的相差图片和定量分析结果



2. 记录将人多能干细胞诱导分化为感觉神经元的过程

Nickolls等人发现在人多能干细胞内转录过表达NGN2-BRN3A后可以有效诱导其分化为感觉神经元⑴。向培养的人多能干细胞培养体系中加入doxycycline刺激NGN2-BRN3A转录表达,使用Incucyte® 记录了加药后第2-5天细胞形态的变化过程。从视频里我们可以看到神经突起在不断的伸长,慢慢形成神经网络,多能干细胞样的形态逐渐消失变成较大的、圆形神经元胞体。



3. 使用细胞膜完整性指示剂CytoTox表征谷氨酸诱导的神经元毒性

将大鼠前脑原代神经元接种在96孔板中,向培养体系中加入333 μM谷氨酸Glutamate,同时加入Cytotox Red和不同浓度梯度的NMDA受体的拮抗剂MK801,间隔6h采集相差和红光通道图片,共检测78h。利用标准软件识别和定量每个孔里每个时间点采集的图片里带红色荧光即已死亡的神经元数量,以采集的时间点为横坐标得到每个孔里死亡的神经元数量随时间的动力学曲线图。从96孔透视图里可以很直观地看到各组曲线的差异,且相同加药组孔间的一致性很高(n=5或8),说明检测的重复性很好。

从下左、中图可以看到只加入333 μM谷氨酸组与其他组相比死亡的细胞数更多,说明谷氨酸的兴奋性毒性使原代神经元死亡。而加入谷氨酸NMDA受体的拮抗剂MK801后,可以剂量依赖性降低谷氨酸的兴奋性毒性作用,说明谷氨酸介导的兴奋性毒性作用与其NMDA受体有关。不同浓度梯度的MK801本身不会对神经元产生毒性作用(下中图)。以MK801浓度的对数值为横坐标,以MK801作用24h后死亡的神经元数量为纵坐标生成剂量效应曲线,利用Incucyte® 的软件对其进行拟合得到MK801作用24h时的IC50=14 nM(右下图)。

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使用Incucyte® Cytotox Red评估谷氨酸诱导的神经元毒性



4. 使用神经元标记试剂NeuroLight和Annexin V表征神经元-胶质共培养体系中神经元的活性和结构

胶质细胞对神经元有支持和保护功能,下面分享一个神经元和胶质细胞共培养的应用案例。实验时先接种大鼠前脑神经元,加入红色NeuroLight试剂孵育4h以特异性地标记神经元,然后向体系中加入胶质细胞进行共培养,采集间隔为6h,共检测13天。从图E的上图可以看到体外培养9天后原代神经元的胞体和突起均带有红色荧光信号,NeuroTrack准确地圈描出神经元的突起(蓝线)和胞体(绿色填充),定量的结果显示神经元接种后神经突起的长度随着培养时间的延长而增加(图A)。

在第9天向该共培养体系中加入凋亡指示试剂Annexin V和不同浓度梯度的谷氨酸后,神经元突起的长度开始减少且呈浓度依赖性(下图A和B),24h时突起长度下降最明显,且在接下来的近90h的检测周期内一直没有回复。研究同时定量了凋亡指示剂Annexin V即绿色荧光信号的汇合度,也呈剂量依赖性,且对谷氨酸更敏感,4.11μM的谷氨酸也有明显的促凋亡作用。加药后8h谷氨酸的促凋亡作用最强(见图E的绿色和黄色信号),之后信号开始下降,说明神经元开始恢复,70h后加药组凋亡信号与溶剂组一致(见图C)。比较两个指标结果,我们可以发现谷氨酸对神经元的促凋亡作用是可逆的,但对神经元结构即突起长度的影响较持久。神经元虽然是大脑内最小的结构单元,但其对外界刺激的应答是多样性的。

D图将24h时神经元突起长度和8h时Annexin V对应的剂量效应曲线合并到一起,横轴是谷氨酸浓度的对数值,前者随浓度下降,后者随浓度增加。软件根据剂量效应曲线拟合出谷氨酸在对应时间点的IC50=16μM和EC50=21μM。

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原代神经元-胶质共培养体系双重检测可以同时表征神经元活性和结构



Summary

本文分享了Incucyte®、NeuroTrack软件模块和无干扰试剂组合方案在神经元单重和共培养体系中的应用,通过实时采集和分析图片可以同时获得反应神经元活性和结构的相关指标,可以导出图片、视频、定量曲线、IC50和EC50值。长时程动态检测可以获得更加准确和丰富的信息比如药物什么时候起效、什么时候效应最强以及这种效应是可逆还是持久的等信息,这些是传统终点检测方法很难做到的。

总而言之,Incucyte® 神经元分析是一套综合的解决方案,由仪器、软件和试剂组成,可对复杂的神经元活动进行前所未有的评估,深入了解神经元细胞模型的功能。

除了研究神经元的活性和结构,对于神经元之间信息传递的最重要方式——动作电位,Incucyte® 也有完整的解决方案,我们会继续为大家分享对应的内容的。



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下载白皮书《实时活细胞分析技术在神经科学研究中的应用》,了解创新型神经科研细胞分析方案。

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-参考文献-

⑴ Nickolls AR, Lee MM, Espinoza DF, Szczot M, Lam RM, Wang Q, Beers J, Zou J, Nguyen MQ, Solinski HJ, AlJanahi AA, Johnson KR, Ward ME, Chesler AT, Bönnemann CG. Transcriptional Programming of Human Mechanosensory Neuron Subtypes from Pluripotent Stem Cells. Cell Rep. 2020 Jan 21;30(3):932-946.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.062. PMID: 31968264; PMCID: PMC7059559.


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