使用先进的流式细胞术和活细胞分析进行CAR-T 细胞表型和功能表征

过去几年中，成功使用免疫疗法帮助抗击癌症的范围迅速扩大，许多疗法现已获批用于临床。其中嵌合抗原受体（CAR）T细胞的引入在该领域处于领先地位。CAR构建体旨在与肿瘤细胞上存在的特异性表面表位或抗原相互作用，一旦接近就能使T细胞杀死肿瘤细胞，同时不伤害健康细胞。当肿瘤细胞上的特定抗原可被识别时，CAR-T细胞就会显示出靶向作用，并且由于其来自于患者自身（称为自体疗法），因此没有排斥反应。

CD19靶向CAR-T细胞疗法，例如Kymriah®（Novarits）或Yescarta®（Kite/Gilead），已经在淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等常见的液体肿瘤治疗中取得临床成功。如图1所示，自体CAR-T材料的开发和扩增涉及多个阶段。在所有阶段，均需要对所产生的产品进行质量和功能评估，同时最大程度地缩短从最初捐赠到重新引入患者体内的时间。

图1. CAR-T流程图解

iQue® 高通量流式细胞仪作为一种高通量、多参数、低成本的细胞定量分析工具，为进一步提升CAR-T细胞的构建效率以及治疗反应等提供解决方案。

接下来，我们通过两个案例分享一下iQue® 3高通量流式细胞仪是如何助力CAR-T细胞表征的吧！

应用案例1
CD19-靶向CAR-T细胞的特异性杀伤特征

CAR-T细胞具备特异性杀伤功能。为了在体外证明这种特异性，首先将抗CD19 CAR转导的T细胞或供体匹配的模拟转导T细胞用于Incucyte® 免疫细胞杀伤试验。在收集图像的同时，分别于第2天、第4天和第7天取样，在iQue® 高通量流式细胞仪上利用iQue® 人类T细胞活化试剂盒和iQue®人类T细胞杀伤试剂盒评估了表型和功能，并通过iQue® 人类T细胞配套试剂盒量化细胞因子IL-2。这些试剂盒能对T细胞表面标志物和指示T细胞活化和肿瘤细胞杀伤的分泌蛋白进行量化。结果显示，当与抗原阳性的Ramos细胞结合时，CD8+细胞上的T细胞活化标志物CD69、CD25和PD-1（分别为图2A-C）迅速上调。该上调表现出一定的时间依赖性，在第7天观察到的水平最高，但CAR-T细胞密度之间几乎没有差异。在与抗原阴性的Jurkat细胞共培养或在有模拟转导的T细胞存在的情况下，所有3种活化标志物的表达均很低（<7%）。存在Ramos细胞的情况下，分泌的细胞因子IFNγ和IL-2（活化指标）的浓度在早期时间点增加，但到第7天有所下降，表明是瞬态响应。在含有CAR-T细胞的共培养物中，细胞杀伤力的指标——颗粒酶B的释放增加，但仅在抗原阳性的Ramos细胞存在时发生。对于所有分泌蛋白，随着CAR-T密度的增加，水平普遍有所增加。总的来说，这种完整的量化分析结果显示了抗CD19 CAR-T细胞明确的抗原特异性活化，这是由表面标志物和分泌蛋白与杀死表达抗原的肿瘤细胞的功能指标共同判定的。

图2. 抗-CD19 CAR-T的抗原特异性活化


应用案例2
抗原激发下CAR-T细胞的耗竭表征

重复暴露于肿瘤细胞抗原可导致CAR-T细胞耗竭。研究耗竭的CAR-T细胞的表型有助于提高我们对这种耗竭如何影响临床响应的持续时间的理解。为了在体外研究这个问题，通过不断用抗原阳性的Ramos细胞系激发抗CD19的CAR-T细胞诱导CAR-T细胞耗竭。每隔2-3天，持续10天，对CAR-T细胞进行计数，并用新鲜的Ramos细胞（1:1 T:E）重新刺激。第11天，对刺激的CAR-T细胞进行计数，并与Ramos细胞（1:1 T:E）接种到96孔板上。在与Ramos共培养和作为单一培养的情况下，接种一个新鲜批次的未耗竭CAR-T细胞进行比较。每天从检测板的所有孔中提取细胞因子样品（10 μL），72小时后，使用iQue®人类T细胞耗竭试剂盒对细胞和上清液进行量化。结果如图3所示。

图3. CD19+ Ramos细胞系激发抗-CD19的CAR-T细胞表现出明显的耗竭表型

细胞因子的分泌，包括IFNγ和TNFα，在含有耗竭的CAR-T和Ramos细胞共培养的孔中均很低（图3A和B）。相对而言，新鲜CAR-T细胞分泌的IFNγ和TNFα水平明显较高，48小时的峰值浓度分别为3.5±0.2 ng/mL和0.6±0.1 ng/mL。新鲜的CAR-T细胞在单一培养中产生的每种细胞因子的水平都很低。在有重复抗原激发的T细胞的孔中，这种细胞因子分泌的明显损失是其枯竭的一个明显标志。72小时后，LAG-3衰竭标志物的表达在激发的CAR-T细胞中高度升高，86±0.3%的CD4+细胞群对这种表型呈阳性，而新鲜刺激的CD4+CAR-T细胞仅有31±0.6%的表达（图3C）。CAR-T细胞单一培养有一小部分细胞群对LAG-3呈阳性（17±0.8%）。在共培养孵育中，也观察到耗竭CAR-T细胞杀伤靶细胞的能力有所下降（图3D）。非耗竭的CAR-T细胞能够比耗竭的CAR-T细胞更有效地减少Ramos细胞数量，从含有非耗竭的CAR-T细胞的孔中，iQue® 获得的数值平均为每sip 4606±463个细胞，而耗竭的CAR-T细胞为每sip 8483±688个细胞。T细胞杀伤靶细胞的能力下降是耗竭的另一个标志。综上，这种完整的量化结果显示了这些抗-CD19的CAR-T细胞有明显的抗原特异性驱动的耗竭特征。

Summary
眼明心亮的同学不难从两个案例看出，iQue® 高通量流式细胞仪不仅可以在极低的样品消耗量下准确定量检测相应的生物学指标，同时提供完善的配套试剂。例如，上述两个案例中提到的iQue®人类T细胞活化试剂盒、iQue®人类T细胞杀伤试剂盒、iQue®人类T细胞配套试剂盒量化细胞因子IL-2以及iQue®人类T细胞耗竭试剂盒（图4）。为大家提供了更优的工作效率和样品前处理体验。

图4. iQue® T细胞表型和功能表征试剂盒实验原理

细胞疗法的使用正在迅速发展，人们越来越关注提高用于临床的细胞生产效率。使用先进生物分析技术能够助力改善构建体的寿命、选择性，优化生产工艺以及安全性。iQue® 3高通量流式细胞仪为新一代CAR-T开发提供智能的解决方案。

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