生物层干涉技术应用文集

中药的有效成分是其药理作用的基础，运用现代科学技术和手段研究、揭示中药的多成分、多分子效应机制，是当今中药学研究和发展的基本方向。通过研究中药有效成分与生物大分子之间的关系，有助于中药药理作用机制的研究和药物筛选，更有利于疾病的检测预防和靶向治疗。近年来，基于生物层干涉技术（Biolayer Interferometry，BLI）的Octet®非标记分子互作分析系统在中药调节信号通路传导、中药靶向治疗等方面的应用有了快速的发展[1]。

➤ 中药有效成分靶点互作研究 [2]
南京中医药大学

通过亲和层析筛选与人参皂苷主要成分相互作用的蛋白，鉴定出14-3-3ζ蛋白为人参皂苷在脑组织中的潜在靶点。使用Octet®鉴定了20(S)- prototopanaxadiol (PPD，人参皂苷的代谢物)与14-3-3ζ 蛋白的直接相互作用（图1）。14-3-3ζ蛋白-PPD复合物的共晶体结构表明，14-3-3ζ蛋白的R56、R127和Y128氨基酸残基参与与PPD互作，其中任何一个残基突变都会导致PPD与14-3-3ζ蛋白的亲和力显著降低。该研究结果有助于更好地了解人参调节神经元活性的作用机制，为基于人参皂苷结构开发与14-3-3ζ结合的小分子化合物奠定基础。

图1. 上半部分为中药新靶点发现与鉴定的技术路线：BLI（Octet®）主要用于鉴定靶点（14-3-3 ζ蛋白）与人参皂苷的结合；下半部分表格为靶点突变体与人参皂苷的亲和力测定。

➤ 用靶点垂钓有效成分[3]
西南医科大学

BLI生物层干涉技术与高分辨质谱联合使用，并以Aβ作为诱饵来垂钓中药开心散（由远志、人参、茯苓和石菖蒲这4味中药组成）中可以与Aβ相互结合的潜在小分子抑制剂。

1. 将Aβ结合在Octet®传感器上，然后将开心散提取液与传感器上的Aβ进行结合并解离；

2. 将收集到的解离液应用高分辨质谱进行分析并鉴定，发现去氢土莫酸（DTA）、猪苓酸C（PPAC）和土莫酸（TA）三个化合物与Aβ有着最强的结合力；

3. 通过色谱分离制备出这三个化合物后，然后在AD的细胞和线虫模型上对这些化合物的抑制Aβ纤维形成的活性进行了评价；

4. 研究发现，这些化合物在体内外均有很好的抑制Aβ纤维形成的活性（图2）：

图2. 纯化的TA与Aβ的亲和力检测

➤ 天然产物构效关系研究[4]
中国药科大学

CDC37是一种新的肿瘤治疗靶点，天然产物雷公藤红素（celastrol）能够很好的抑制该靶点活性。现在从celastrol的基本结构（三萜）出发，合成了一系列化合物，用Octet®测定了所有化合物与药物靶点CDC37相互作用。

1#化合物替换了A环的酮基，11#化合物改变了A环的羟基极性，BLI亲和力测试发现，1#的亲和力为90 μM，而11#化合物则无法与蛋白结合。说明A环的羟基极性对保持其活性是非常重要的（图3）。

图3. 左边为Octet® Red 96测定的Celastrol衍生物与CDC37的亲和力，右边为根据BLI结果得出的化合物构效关系

➤ 天然化合物库筛选和小分子竞争实验[5]
澳门科技大学

基于分子对接并结合Octet®互作仪在天然化合物中筛选潜在SARS-CoV-2抑制剂。一些天然化合物抑制SARS-CoV-2诱导的Vero E6细胞的病变效应和斑块形成，使其丧失明显的动物毒性并具有SARS-CoV-2假病毒突变体（D614G、N501Y、N439K和Y453F）的抗病毒效果。通过Octet®还发现，一些天然产物，比如EGCG、Bkc和Ibvc还与ACE2受体结合，体现与RBD和ACE2双重结合。Octet®还可以进行小分子之间的竞争实验，对小分子在蛋白靶点上的结合位点进行分组（图4）。

与RBD结合的一系列天然化合物

图4. Octet®小分子竞争实验:绿色为相互不竞争，红色为相互竞争



BLI 技术在中药开发及研究领域的应用优势：

节约样品：只需要μg级的蛋白量和μM级的小分子量；

避免损失：没有复杂的流路系统，也没有泵和进样系统，减少样品的损失；

经济高效：实验后还可将剩余样品进行回收，减少了前期纯化样品的工作量；

快速便捷：耗时短，同时可以检测多种样品，实时监控检测结果，在前期中药筛选阶段，可以提高效率，节约宝贵时间。

BLI 技术被广泛应用于中药研究中，成为中药分子机制研究的主流技术，为中医药走向世界提供有力的支持与保障。

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-参考文献-

《生物膜干涉技术在中药研究的应用》. 中国商品学会第五届全国中药商品学术大会

Identification and confirmation of 14-3-3 ζ as a novel target of ginsenosides in brain tissues,Journal of Ginseng Research,2020,1226-8453

High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLCLDAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2021.

Betulinic acid acetate, an antiproliferative natural product, suppresses client proteins of heat shock protein pathways through a CDC37-binding mechanism。RSC Adv., 2016, 6, 42537

Identification of natural compounds as SARS-CoV-2 entry inhibitors by molecular docking-based virtual screening with bio-layer interferometry. Pharmacological Research 172 (2021) 105820