您好，欢迎访问仪器信息网

搜全站

搜展位

德国赛多利斯集团

关注

已关注

钻石22年

已认证

粉丝量 0

400-805-0826

仪器信息网认证电话，请放心拨打

全部分类

首页

产品中心

分子互作研习社｜如何消除实验中的非特异性结合？

赛多利斯

2024/09/12 18:41

阅读：8

陈老师，空的传感器怎么和分析物有非特异性吸附了？

有多少信号呢？

和有固化物的信号差不多呢😭

很多科研人员在分子互作实验中，常常会遇到非特异性结合的问题，今天陈老师就跟大家聊一聊固液反应中普遍存在的非特异性结合。基于固液反应的检测方法有很多：如亲和层析、免疫标记技术（ELISA）、微阵列芯片技术、SPR、BLI等。本文所使用的数据均来自基于Octet®非标记分子互作分析系统的生物层干涉技术（BLI）固液反应技术。

什么是非特异性结合？

提到非特异性结合，有两个含义：一是固化物与分析物之间的结合，但是这种结合并不是我们期望的。另外一个是指不发生在分析物与固化物质之间的反应。今天我们讨论的是如何消除后者意义上的非特异性结合。而这种非特异性其中又包含了两层意思：

分析物直接与去除固化物的固相介质结合
分析物缓冲液中其他物质（杂质）与有固化物的固相结合

图1. a)分析物结合到空白传感器；b)分析物缓冲液的组分结合固化物

非特异性作用使如何产生的？

分析物与介质之间的静电作用：常用的介质（如海藻酸和葡聚糖）在特定的pH下会带有大量电荷。如果分析物带有相反电荷，就容易形成基于库仑力的静电作用。

分析物与介质之间的疏水作用：如果杂质或分析物是蛋白质或带有疏水基团的化合物，而基质也是蛋白质（比如链霉亲和素传感器），就可能形成基于疏水作用的非特异性吸附。

分析物与固化物之间的生物相似性：在基于捕获的固化反应中，分析物带有与固化蛋白相同的标签。比如，用带有His抗体的基质固化His标签的蛋白，但如果分析物中有相同的标签，就很难避免His标签的分析物直接与固相反应。

杂质的作用：在诸如血液、细胞裂解液等粗样品中，杂质产生的非特异性作用很普遍。一个典型的案例就是牛血清白蛋白（BSA）。作为一种常用的封闭试剂，由于来源和纯化工艺的不同，一些厂商提供的BSA可能会带有一定量的牛免疫球蛋白。

图2. 用proA传感器检测IgG，因为缓冲液中的BSA中含有牛免疫球蛋白，从而造成了很高的背景

如何减轻或者消除非特异性吸附？

solution 1

降低分析物浓度

这种情况适合于有固化ligand的传感器与分析物信号大大高于无ligand传感器，但是非特异性信号依旧明显。比如，1000nM和500nM的分析物浓度下有非特异性信号，而250nM没有，则把最高浓度改成250nM即可。

图3. 左图为高浓度结合曲线，右图为降低浓度后结合曲线。绿色为有固化传感器与分析物，黑色为同样分析物浓度下非特异性信号。

优点：不需要太多优化实验，操作简单。
缺点：使用条件有限。而且分析物浓度降低后，可能导致结合信号降低，可能需要延长结合时间或者提高固化ligand的信号。

solution 2

增加封闭步骤或优化分析缓冲液

这是去除非特异的主要方法。为什么将看似两种方法放在一起呢？因为通常在确认了最佳封闭试剂后，会将其添加到分析缓冲液中。例如，如果1%的酪蛋白封闭效果最好，一般分析缓冲液中也会含有1%的酪蛋白。

然而，优化缓冲液还包括增加盐离子浓度、加入去污剂、调节pH等，具体见下表。

去除非特异性封闭/缓冲液组分	适用的介质/分析物
tween20,triton X100，聚乙二醇等	疏水介质与蛋白，或者有聚合的小分子
Nacl,Kcl	带电荷介质与DNA等
carrier蛋白，比如BSA	疏水、带电荷介质与蛋白
酪蛋白，脱脂奶粉	疏水、带电荷介质与蛋白
生物素	链霉亲和素介质
无关his,Fc蛋白等	基于his,Fc标签抗抗体偶联介质
咪唑	Ni-NTA介质
pH调节	血清等粗样品

分析物缓冲液中一般加入tween20，浓度在0.02%—0.05%。

优点：成本低，可以通过实验设计一次性完成优化。
缺点：可能会影响特异性结合，比如特异性结合主要依赖静电作用，而非特异性也是静电作用。如果提高盐浓度，在降低非特异性的同时，特异性信号也降低了。因此，必须要用特异性信号与非特异性信号的比值来判断优化的效果。

下表显示了在不同封闭缓冲液中，特异性信号（有固化物传感器）与非特异性信号（无固化物传感器）比值。使用Ni-NTA固相，可以看到在非特异性低的情况下，0.2%酪蛋白的封闭效果最好。

图4展示了使用高浓度的盐离子去除非特异性吸附。作者检测CHO表达上清（粗样品）中的EPO，发现固相与空载表达上清有很强的非特异性。然而，加入500mM的NaCl后，非特异性显著降低。

图4. 数据来自于Development of a VHH-Based Erythropoietin Quantification Assay.Mol Biotechnol，DOI 10.1007/s12033-015-9860-7

solution 3

更换固相的基质或材料

首先需要明确在检测步骤前固相上的基质有几层。例如，在双抗夹心ELISA中，涉及到96孔板的材质和第一个抗体等膜层。如果第二个抗体如果直接和这些膜层结合，就会发生非特异性吸附。此时，可以更换第一个抗体或者第二个抗体，甚至更换96孔板的材质，以减轻非特异性吸附。

一些固相材料也可能由多层基质组成，例如某些固相基质主要是玻璃和氨基硅烷构成，这些材质上又镀有链霉亲和素或者海藻酸。如果与玻璃或者氨基硅烷有非特异性吸附，那么就只能用方法1、3、4去除非特异性吸附。如果与链霉亲和素结合，可以更换基于海藻酸基质的氨基偶联的芯片。

优点：可能从根本上去除非特异性吸附，并且保证特异性结合不受影响。
缺点：成本较大（比如SPR技术的金膜芯片），需要重新研发新介质或者购买新传感器，并且很多传感器介质是个固定的，很难改变。

solution 4

固化物和分析物对换
（如果固化物非特异性吸附）

即固化之前的分析物，检测固化物。

优点：不需要准备新的试剂或者耗材。
缺点：有些技术实现起来非常困难，比如基于微阵列的方法以及基于双抗夹心的方法。

solution 5

尽可能去除分析物中的杂质

比如，提高分析物的纯度、提高缓冲试剂的质量，或对粗样品进行离心等简单处理。

优点：可以顺便提高纯化和提取工艺。
缺点：耗时长、成本高，并且某些检测的初衷就是检测粗样品。

solution 6

计算扣除法

即设置非特异性对照，并从所有数据均扣减非特异性信号。虽然这种方法有点“取巧”，但以下三种情况下可以使用计算扣除法：

在特异性信号远大于非特异性信号的时，可以采用这个方法。

分析物浓度很高（比如μM蛋白浓度以上），且难以通过优化缓冲液和封闭方法去除非特异性信号的时候，可以尝试使用计算扣除法。

在实时检测反应中（比如SPR、BLI技术），如果特异性反应的结合解离特点与非特异性反应完全不一样的时候可以计算扣除，比如前者是快解离快结合，后者是慢结合慢解离的时候。

优点：不需进行实验优化。
缺点：比较主观，一般来说非特异性信号会影响特异性信号。因为生物样品的多样性，非特异性是不可避免的。然而，只要按照上面的方法，先弄清非特异性的种类，再进行针对性的合理优化，还是可以有效地消除非特异性结合。

Octet®非标记分子互作分析系统的优势

非标记Direct Binding是趋势，结果更准确

快速测定亲和力，更加定量化地表征分子互作

无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）

写入了美国药典，文章多，认可度广

万金油技术，可以用与检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子

多种实验方案，除了直接测试，还有竞争法，垂钓等

操作简便，耗材及维护成本低

《生物层干涉技术小分子应用文集》

下载文档

《生物层干涉技术小分子应用文集》详细介绍了生物层干涉（BLI）技术的原理，及其在小分子领域的多个应用场景，并对BLI技术应用于小分子研究的20余篇代表性文献进行了整理汇总：内容涵盖从防御机制到垂钓验证，再到小分子筛选、表征、优化等多个方面，全展示了BLI技术在小分子研究中的强大潜力和实践成果。

了解更多

-END-

即插即用超滤“神器”！抗体、递送载体和病毒全搞定

科研英雄，装备升级季正当时