一种分析土壤中咖啡酸含量的新方法

随着树龄的老化，果园更新是果园经营的重要任务之一，由于受土地等因子的限制，在更新的果园中，特别在传统的苹果产区，存在新建果园的连作（重茬），进而面临连作障碍的发生。连作障碍具有普遍性，是生产中的一大难题，给果农造成巨大的经济损失，严重制约了果树生产的可持续发展[1]。苹果园连作障碍原因复杂，其中，连作果园土壤中由上茬根系分泌和上茬残根腐解产生的酚酸类物质是引起连作障碍的重要原因之一[2-3]。早期研究发现，苹果根产生的根皮素、根皮苷和苦杏苷等酚酸类物质，能够强烈抑制苹果幼苗的生长[4] 。孙海兵等[5]研究发现根皮苷、焦性没食子酸和绿原酸是环渤海湾地区连作苹果园土壤中含量显著变化的酚酸类物质，可能是促使苹果园出现连作障碍的关键的酚酸类物质。张淑香等[6]研究认为，酚酸类物质是根系分泌物中的主要毒性物质，并且是造成连作障碍的重要因子。张江红等[3]研究认为，苹果幼苗分泌物中的酚酸类物质主要有间苯三酚、根皮素和根皮苷，占分泌量的 80% 以上，苹果根系浸提液中的酚酸类物质是苹果园土壤中自毒物质的主要来源。植物通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径释放出的酚酸类物质进入土壤中[7-9]，可直接影响土壤养分状况，还可通过土壤微生物活性和病虫害而间接地影响植物生长，从而导致连作障碍[10-12]。因此，建立一种简便、快速和高效测定连作苹果园土壤酚酸含量的新方法，对推进苹果

园连作障碍的研究具有重要意义。【前人研究进展】土壤酚酸提取方法主要有NaOH 溶液提取法[13]和二氯甲烷有机溶剂提取法[3]。Hartley and Buchan[13] 研究发现，利用 1 mol·L-1NaOH 溶液能够对土壤中的对羟基苯甲酸、丁香酸、肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸类

物质进行提取，提取时间约 15 h，提取液经离心调pH 后的上清液就可直接进行 HPLC 检测。张江红[3]利用二氯甲烷代替氯仿作为提取溶剂对果园土壤中的酚酸类物质进行提取，称取 100 g 风干土样，加入200 mL 二氯甲烷，振荡过夜后，过 0.45 μm 滤膜，34℃减压浓缩近干，加入 1 mL 甲醇复溶，过 0.22 μm 有机相滤膜，待 HPLC 分析，但这些方法都存在提取效率低、溶剂消耗量大、提取周期长、能源消耗大等等缺点。高效液相色谱法具有分析时间短、结果准确可靠等特点，近年来得到了迅速发展。Haghi 等[14]利用 HPLC 方法分离鉴定了植物材料中没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸和间羟基苯甲酸 4 种酚酸的含量。Podsedek 等[15]检测到苹果果实中含有绿原酸、儿茶酚、槲皮素和根皮苷。【本研究切入点】到目前为止，用加速溶剂萃取法提取土壤酚酸类物质的研究未见报道。加速溶剂提取又称快速溶剂提取，是一种从固体和半固体基质中提取分析物的新的样品萃取技术[16]。与以往的提取方法相比，加速溶剂提取法可以大幅缩短提取时间，并减少溶剂的消耗量，降低成本，已在土壤、蔬菜、水果及生物样品残留农药提取中得到广泛应用[17-18]。已有学者将这项技术应用于植物药物定量和定性分析中样品的前处理[19-20]。酚酸类物质种类多，结构极为相近，分离条件的优化非常重要。本试验通过更改流动相 pH 和流动相梯度，使 14 种酚酸能够达到基线分离，拟建立能够同时检测 14 种酚酸的 HPLC 分离鉴定方法。【拟解决的关键问题】以苹果特征酚酸类物质根皮苷为例，探讨 ASE-HPLC 法提取和测定酚酸类物质的最佳条件，建立一种快速、高效测定作苹果园土壤酚酸类物质种类和含量的分析方法，为苹果园连作障碍防治提供依据。

使用加速溶剂提取法提取土壤酚酸，操作简单快捷，提取时间短，提取率较高。提取土壤酚酸类物质的最佳工艺条件为：先以无水乙醇为萃取溶剂，再以甲醇为萃取溶剂，提取温度为 120℃，压强为10.3 MPa，循环 2 次（无水乙醇和甲醇各一次循环），每次静态提取时间为 5 min，吹扫体积为 60%，吹扫时间为 90 s。HPLC 色谱条件为：流动相组分为乙腈和水（用乙酸调节 pH 2.6），柱温 30℃，流速 0.5 mL·min-1，进样量 5 μL。采用 A、B 双泵系统，梯度洗脱，0—35 min，乙腈从 5%提高到 35%，35—40 min，乙腈保持 35%， 40—42 min，乙腈从 35%下降到 5%。每个分析周期结束后基线平稳 10 min 后进样，以去除干扰成分，保证分析结果的稳定性和重复性。方法回收率在 83%—98%之间，检测限为1.3×10-4—2.5×10-2 μg·mL-1，且重现性好，具有推广应用价值。因此，ASE-HPLC 法是一种简便、快速和高效测定土壤酚酸含量的新方法。