基于 Orbitrap Fusion Lumos 平台的简单快速抗体药物天冬氨酸异构化解析

    进入临床实验和正在研发的单抗药物日趋增加，对于单抗药物的安全性和有效性评价的测试也越发重要。与小分子药物相比，单抗药物更易在生产、运输和储存的过程中，发生各种翻译后修饰的变化，比如单抗中甲硫氨酸和酪氨酸氧化，天冬酰胺脱酰胺化，天冬氨酸异构化等都会影响药物分子的稳定性，同时影响蛋白的结构和功能。因此，对各种翻译后修饰的质控分析也提出了更高要求。目前使用 LC-MS/MS 在线分析质谱技术，在常规的肽图分析中，可以同时对多种翻译后修饰进行定性和定量分析，比如甲硫氨酸氧化、N 糖基化、天冬酰胺脱酰胺化，但对于天冬氨酸异构化我们关注的都比较少，本文我们为大家提供更加完整的天冬氨酸异构化解决方案，有助于单抗药物的精细质控分析。
    天冬氨酸（D）异构化是一种自发性的非酶翻译后修饰，发生异构化后的天冬氨酸（isoAsp）,在蛋白骨架中插入了一个亚甲基，也就是同时天冬氨酸侧链减少了一个亚甲基，如图 1 所示，因此引起蛋白结构的变化，从而引起蛋白功能的变化。抗体 CDR 区域中天冬氨酸异构化已被证实会降低受体结合效率，影响最终的药效。位于铰链结构区域，或者位于 DG/DS（G为甘氨酸，S为丝氨酸）区域的天冬氨酸易发生异构化。同时在弱酸性溶液中，会增加天冬氨酸异构化的水平。在天冬酰胺（N）发生脱酰胺化时，会伴随带来天冬氨酸异构化，并且异构化的水平和非异构化的水平基本在 3:1 的比例，一般包含 NG 区域和 PENNY（P为脯氨酸，E为谷氨酸，Y 为酪氨酸）区域的天冬酰胺易发生脱酰胺化，并带来天冬氨酸异构化。由于异构化本身不会引起分子量和电荷的变化，因此大大增加分析的难度。在完整蛋白的水平上，可以使用离子交换和亲和色谱进行天冬氨酸异构化分析，不过对于低丰度的异构化水平就无法准确确定，因此，我们需要在肽段水平上进行天冬氨酸异构化的分析，当使用反相色谱（RP）进行分析时，一般异构化的肽段会优先于未异构化的肽段被洗脱下来，不过在受到柱子填料和流动相添加离子对试剂等因素影响时，同样会出现晚于未异构化肽段流出的现象。目前，在常用的碰撞诱导激活解离（CID）和高能碎裂（HCD）进行二级碎裂时，无法通过碎片离子进行天冬氨酸异构化的确认。ETD作为一种补充碎裂方式，尤其在进行长肽段，翻译后修饰肽段和完整蛋白水平分析时，可以提供与 CID/HCD 互补以及 ETD 特征性的碎片离子，从而准确的确定氨基酸序列以及翻译后修饰位点的信息。本篇中使用电子转移解离（ETD）时，包含天冬氨酸异构化的碎片会产生相应的特征质量增加，如图2所示，因此可以准确的判断天冬氨酸异构化的位点。

    本文基于最新的三合一超高分辨质谱Orbitrap Fusion Lumos分析平台,采用ETD碎裂方式，建立了天冬氨酸异构化质谱解析方法，为单抗药物的准确、快速、精细解析提供了可靠的分析手段，尤其当一些药物质控分析中出现异常电荷异质性或药物异常降解时，可以进行肽图水平的精确质谱分析。