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干货分享|GlycanPac AXH分析人促红细胞生成素(EPO)的N糖

赛默飞色谱与质谱

2024/06/05 14:47

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干货分享|GlycanPac AXH分析人促红细胞生成素(EPO)的N糖

原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国

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史俊霞


糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰,唾液酸作为“桥梁”分子附着在聚糖的远端,唾液酸化聚糖表现出广泛的结构多样性,这使他们在不同的生命过程中具有丰富的生物学功能,包括发育、体细胞重编辑和癌症进展。


蛋白药物中,唾液酸对糖蛋白的稳定性和3D构象很重要,并且具有关键性的功能作用。重组人促红细胞生成素(EPO)广泛应用于治疗肾性贫血以及 肿瘤等各种慢性疾病所伴发的贫血。该药物 是一种单链的酸性糖蛋白,分子量为 32000-39000Dar,EPO 的糖基包括 3 个 N2 糖 链(分别位于 Asp 24,Asp 38,Asp 83)和一个 O 糖链(位 于 Ser126)。他们的主要成分是甘露糖,岩藻糖和唾液酸等 [1]。其中,唾液酸在维持 EPO 分子的酸性,阻断细胞表面半乳糖受 体结合,防止 EPO 失活等方面有重要作用 [2]。阴离子交换-亲水相互作用的混合模式GlycanPac AXH柱子,既能将糖链按照唾液酸的数目进行分组,又能根据糖的羟基结构差异进行分离。创新性的解决高唾液酸蛋白糖型分离难题[3] [4]。方案如下:


样品制备


本次样品使用PNG酶酶切后,对比了经典的还原酶切和非还原酶切后使用2AB标记的N-糖链的分离情况,在整个样品制备过程中,过量的标记试剂会干扰糖链,特别是低唾液酸糖链的出峰,所以使用了Hypersep Aminopropyl的氨基小柱进行净化处理。该氨基小柱可以高效地除掉过量的标记试剂,得到优异的糖型分离结果。


GlycanPac AXH UHPLC色谱柱VS GlycanPac AXH HPLC色谱柱分析结果


UHPLC色谱柱更小的粒径能够得到更多的组分信息,特别是高唾液酸含量的EPO N糖,如图(1)和图(2)所示,图(3)和图(4)所示,无论是非还原酶切和还原酶切的样品,Glypac AXH 1.9 μm的UHPLC色谱柱能够将组内的N糖分离的更好,远超过HPLC的结果,两根柱子都可以将N糖分成5组。

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GlycanPac AXH色谱柱下,非还原酶切VS还原酶切重复性对比结果


在多次平行实验过程中,如图(5)和图(6)所示,发现非还原酶切的重现性优于还原 酶切的重现性。

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总    结


阴离子交换-亲水相互作用混合模式的GlycanPac AXH的UHPLC色谱柱,解决了高唾液酸样品在亲水相互作用模式下,分离度不够,不同个数唾液酸修饰的糖链定性难题。对于高唾液酸蛋白分析提供了新的选择。




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引用文献:

[1] D avis J M , A rakaw a T, Strick land T W , et al. Biochemistry, 1987, 26: 2633—2638

[2] Dongm i C, M yungsoo K, Tongsei A. J. Chromatograph. B, 1996, 687: 189—199

[3] 李响, 中国新药杂志,2024,33(6)

[4] GlycanPac AXH-1 Columns Product Manual

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