ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱

在本应用纪要中，我们使用同一多农药残留分析工作流程分析了多种水果和蔬菜样品。使用Waters Xevo TQ-S micro通用离子源，在同一串联四极杆MS仪器上即可完成LC和GC分析，切换色谱入口仅需不到30 min。本文将以针对农药分析的SANTE指南(11945/2015)要求5为标准，着重介绍LC和GC分析在灵敏度、重现性和线性方面的性能。

本应用纪要介绍了一种在鉴定和定量变压器油产品中的呋喃和苯并三唑(钝化剂)时提高样品通量的方法，该方法具有如下优势： 通过缩短运行时间减少溶剂用量。 灵敏度、选择性和稳定性比现有方法更出色。

本文介绍的全新UPLC方法，仅需HPLC方法一半的分析时间。此外，我们还改进了SPE方法。之前的方案使用三氟乙酸，这种全氟化合物具有毒性，而且是一种持久性有机污染物，新的SPE方案则使用甲酸作为SPE洗脱液的酸性改性剂。

使用配备ACQUITY QDa检测器的ACQUITY UPLCH-Class系统检测纺织品中的分散染料和偶氮染料。ACQUITY QDa检测器是一款经过专门设计的质谱检测器，可作为色谱分离系统的完美补充。与传统的质谱仪相比，ACQUITY QDa检测器除了具有传统质谱仪的特点之外，它还具有体积小、易于使用和维护等特点，可对UV无响应的化合物以及光学检测不适用或是无法确定的化合物进行定量分析。

防晒剂能够防止或减轻由于紫外线辐射而造成的皮肤损害，被广泛用于各类化妆品中。我国2015年版《化妆品安全技术规范》规定了防晒化妆品中能够添加的27项准用防晒剂。有机防晒剂的防晒能力大多强于无机防晒剂，但是对皮肤有刺激作用、导致皮肤过敏等。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确规定了各类有机防晒剂的使用限值。国家食药总局发布的《化妆品安全技术规范》(2015年版)1中提供了同时检测苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的方法。但由于原方法中存在部分化合物分离度差等问题，如方法一中苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离不好；方法二需要分组，检测效率较低。因此，为了改善这些方法中的不足，我们做了本方案的方法开发。 本方案在Waters ACQUITY UPLC H-Class系统上，开发了2015版《化妆品安全 技术规范》中对应的15种防晒剂的分离度方案，15种防晒剂及标品中含有的同分异构体实现了完全分离，尤其是显著改善了苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离。同时方法不再需要THF作为流动相，对液相系统更加友好，更加环保。重现性结果、加标回收率考察显示，绝大部分都在90-100%。

防晒剂能够防止或减轻由于紫外线辐射而造成的皮肤损害，被广泛用于各类化妆品中。我国2015年版《化妆品安全技术规范》规定了防晒化妆品中能够添加的27项准用防晒剂。有机防晒剂的防晒能力大多强于无机防晒剂，但是对皮肤有刺激作用、导致皮肤过敏等。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确规定了各类有机防晒剂的使用限值。国家食药总局发布的《化妆品安全技术规范》(2015年版)1中提供了同时检测苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的方法。但由于原方法中存在部分化合物分离度差等问题，如方法一中苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离不好；方法二需要分组，检测效率较低。因此，为了改善这些方法中的不足，我们做了本方案的方法开发。 本方案在Waters ACQUITY UPLC H-Class系统上，开发了2015版《化妆品安全 技术规范》中对应的15种防晒剂的分离度方案，15种防晒剂及标品中含有的同分异构体实现了完全分离，尤其是显著改善了苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离。同时方法不再需要THF作为流动相，对液相系统更加友好，更加环保。重现性结果、加标回收率考察显示，绝大部分都在90-100%。

防晒剂能够防止或减轻由于紫外线辐射而造成的皮肤损害，被广泛用于各类化妆品中。我国2015年版《化妆品安全技术规范》规定了防晒化妆品中能够添加的27项准用防晒剂。有机防晒剂的防晒能力大多强于无机防晒剂，但是对皮肤有刺激作用、导致皮肤过敏等。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确规定了各类有机防晒剂的使用限值。国家食药总局发布的《化妆品安全技术规范》(2015年版)1中提供了同时检测苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的方法。但由于原方法中存在部分化合物分离度差等问题，如方法一中苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离不好；方法二需要分组，检测效率较低。因此，为了改善这些方法中的不足，我们做了本方案的方法开发。 本方案在Waters ACQUITY UPLC H-Class系统上，开发了2015版《化妆品安全 技术规范》中对应的15种防晒剂的分离度方案，15种防晒剂及标品中含有的同分异构体实现了完全分离，尤其是显著改善了苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离。同时方法不再需要THF作为流动相，对液相系统更加友好，更加环保。重现性结果、加标回收率考察显示，绝大部分都在90-100%。

防晒剂能够防止或减轻由于紫外线辐射而造成的皮肤损害，被广泛用于各类化妆品中。我国2015年版《化妆品安全技术规范》规定了防晒化妆品中能够添加的27项准用防晒剂。有机防晒剂的防晒能力大多强于无机防晒剂，但是对皮肤有刺激作用、导致皮肤过敏等。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确规定了各类有机防晒剂的使用限值。国家食药总局发布的《化妆品安全技术规范》(2015年版)1中提供了同时检测苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的方法。但由于原方法中存在部分化合物分离度差等问题，如方法一中苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离不好；方法二需要分组，检测效率较低。因此，为了改善这些方法中的不足，我们做了本方案的方法开发。 本方案在Waters ACQUITY UPLC H-Class系统上，开发了2015版《化妆品安全 技术规范》中对应的15种防晒剂的分离度方案，15种防晒剂及标品中含有的同分异构体实现了完全分离，尤其是显著改善了苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离。同时方法不再需要THF作为流动相，对液相系统更加友好，更加环保。重现性结果、加标回收率考察显示，绝大部分都在90-100%。

防晒剂能够防止或减轻由于紫外线辐射而造成的皮肤损害，被广泛用于各类化妆品中。我国2015年版《化妆品安全技术规范》规定了防晒化妆品中能够添加的27项准用防晒剂。有机防晒剂的防晒能力大多强于无机防晒剂，但是对皮肤有刺激作用、导致皮肤过敏等。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确规定了各类有机防晒剂的使用限值。国家食药总局发布的《化妆品安全技术规范》(2015年版)1中提供了同时检测苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的方法。但由于原方法中存在部分化合物分离度差等问题，如方法一中苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离不好；方法二需要分组，检测效率较低。因此，为了改善这些方法中的不足，我们做了本方案的方法开发。 本方案在Waters ACQUITY UPLC H-Class系统上，开发了2015版《化妆品安全 技术规范》中对应的15种防晒剂的分离度方案，15种防晒剂及标品中含有的同分异构体实现了完全分离，尤其是显著改善了苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离。同时方法不再需要THF作为流动相，对液相系统更加友好，更加环保。重现性结果、加标回收率考察显示，绝大部分都在90-100%。

防晒剂能够防止或减轻由于紫外线辐射而造成的皮肤损害，被广泛用于各类化妆品中。我国2015年版《化妆品安全技术规范》规定了防晒化妆品中能够添加的27项准用防晒剂。有机防晒剂的防晒能力大多强于无机防晒剂，但是对皮肤有刺激作用、导致皮肤过敏等。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确规定了各类有机防晒剂的使用限值。国家食药总局发布的《化妆品安全技术规范》(2015年版)1中提供了同时检测苯基苯并咪唑磺酸等15种防晒剂的方法。但由于原方法中存在部分化合物分离度差等问题，如方法一中苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离不好；方法二需要分组，检测效率较低。因此，为了改善这些方法中的不足，我们做了本方案的方法开发。 本方案在Waters ACQUITY UPLC H-Class系统上，开发了2015版《化妆品安全 技术规范》中对应的15种防晒剂的分离度方案，15种防晒剂及标品中含有的同分异构体实现了完全分离，尤其是显著改善了苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸的分离。同时方法不再需要THF作为流动相，对液相系统更加友好，更加环保。重现性结果、加标回收率考察显示，绝大部分都在90-100%。

证明Waters ACQUITY UPLC H-Class与PDA(光电二极管阵列检测器)和ACQUITY QDa质谱检测器联用能够在清洁验证中实现可靠确证，并对紫外吸收能力较差或不含发色团的化合物进行高专属性且高灵敏度的定量分析。配合使用业内领先的CDS软件Empower执行控制时，此解决方案能够有效满足严格监管环境的要求，尤其适用于对数据完整性、SOP遵从性以及合规管理 有较高要求的领域。

1）色谱方法具有出色的分析选择性，可以分离同分异构体 2）分析运行时间短(<10 min) 3）峰检测的可信度高 4）灵活性更高，系统可用于其它分析

盐梯度下阳离子交换色谱的方法开发参数。 由于蛋白质治疗药物（包括单克隆抗体(mAb)）的电荷异质性可能会影响生物治疗药物的生物活性、安全性和稳定性，所以需要对这种电荷异质性进行表征和监测1。离子交换色谱(IEX)一直被广泛应用于蛋白质电荷异构体的纯化、表征和常规监测分析。由于mAb的等电点(pI)相对较高，与阴离子交换色谱分离相比，阳离子交换色谱(CEX)更适合用于mAb电荷异构体的表征分析。本应用纪要介绍了开发CEX固定pH盐梯度方法时需要考虑的因素。其它与使用pH梯度有关的信息请参阅单独的沃特世应用纪要2。 借助沃特世高分离度强阳离子交换色谱柱（即BioResolve SCX mAb）和 Waters AutoBlend Plus技术，可以高效实现盐梯度方法开发，得到可重现、稳定的分离。

本白皮书介绍了一套协同性的系统方案，方案采用UPLC仪器、亚2μm填料的色谱柱以及Empower3软件，为用户提供了一套精简的方法开发方案。该系统方案采用ACQUITY UPLC H-Class PLUS 系统和ACQUITY QDa质谱检测器，其中ACQUITY UPLC H-Class系统配备了带有溶剂选择阀、色谱柱管理器和低扩散检测器(例如ACQUITY UPLC PDA检测器)的四元泵。将该系统与亚2μm色谱柱和Empower3软件相结合，是研究人员针对多种化合物进行系统方法开发的一种有效途径。

本研究旨在评估将ACQUITY QDa质谱检测器应用于亚基分析的适用性。曲妥珠单抗是一种IgG1抗体，可以被二硫苏糖醇(DTT)还原为大约25 kDa的轻链和大约50 kDa的重链肽段。采用MassLynx软件进行数据采集，能够通过MaxEnt1去卷积算法解析复杂的谱图，以便测定各个亚基的分子量。IdeS酶解和还原可产生三种肽段，每种肽段约25 kDa。由于IdeS酶解会使得抗体铰链区的单个位点处发生专属性的高效裂解，因此它成为了治疗性mAb的常用表征工具之一，而在本例中，我们将其作为监测主要糖型的一种替代方法。

本应用纪要旨在证明ACQUITY QDa质谱检测器为检测宽分子量范围的肽(尤其是生物治疗药物的肽图分析)提供了一种经济有效的简单解决方案，并且该质谱检测功能完全兼容基于光学检测的传统LC肽监测分析(使用TFA或甲酸(FA))。为此，我们采用监测曲妥珠单抗(一种治疗性单克隆抗体(mAb))肽图的一种现有方法，并应用ACQUITY QDa质谱检测器开展了此次研究。

本文将重点介绍两个独特的LC/MS系统应用方案：完整蛋白质谱分析和肽图分析，用于人源化单克隆抗体（mAb）的确证，检测单抗的细微变化。每一个应用方案都包括整体的工作流程的介绍。 此工作流程具有如下特点：将沃特世的系统方案无缝地整合在一起，包括能够同时提升分离度、灵敏度和分析速度的超高效液相色谱（UPLC®），专用色谱柱，提供灵敏且精确质量的MS，MSE和MS/MS检测的Xevo QTof MS系统和行业领先的生物制药信息学软件。将上述方案在此工作流程中联合使用可极大地提高实验室效率。

理想情况下，在运行色谱方法时，样品稀释剂组分应尽可能接近方法起始条件。这样做的目的是最大程度减小由样品溶剂效应引起的谱带展宽和峰畸变，进而避免出现峰不对称性、峰分裂或数据不可用的情况。引起溶剂效应原因是稀释剂与流动相之间存在洗脱强度差异。当稀释剂的洗脱强度高于流动相时，峰展宽和峰形异常的情况通常会更加严重1-2。事实上，业内普遍认为，最好是将进样的样品溶解于起始流动相中。然而，给定样品的预处理常常需要将分析物溶解在与流动相组分相差很大的溶剂中。为了避免溶解度问题和峰形不佳的问题，许多方案都要求在预处理过程中挥干样品溶剂，然后将样品复溶于流动相中。然而，这个额外的步骤非常耗时，所需时间往往比HPLC分析的时间还要长1。一般而言，推荐的做法是避免使用比流动相更强的溶剂来溶解样品和标准品。这种做法基于如下假设：强于流动相的进样溶剂会干扰样品在柱头处的吸附，而采用大体积进样时尤其如此2。遗憾的是，这种做法在实践中可行性不佳，因为分析人员往往必须根据样品的溶解度来决定有机溶剂的含量，以确保样品能够完全溶解。对于扩散体积较大的传统LC系统，这种现象带来的问题较少，因为柱前样品/溶剂/流动相混合很充分，可以缓解溶剂效应造成的色谱峰问题。然而，对于现代的低分散U(H)PLC系统，如果以较大体积进样含有高有机相的样品，就会出现问题，并可能导致峰对称性变差或峰分裂。

采用全新二元配置的Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS二元系统是对现有ACQUITY UPLC H-Class PLUS四元系统的补充。 该系统具有二元溶剂管理功能，拥有与四元系统相同的低扩散性和稳定性，采用0.005 in/0.127 mm管路，最高可支持15,000 psi的工 作背压。系统由二元溶剂管理器、流通针式样品管理器以及带主动预加热功能的色谱柱管理选件组成，用户可选配单色谱柱柱温箱或 最多可加热/冷却6根色谱柱的色谱柱管理器。

结合质谱和UV光谱分析，可以在单次运行中同时实现峰追踪和共流出峰的鉴定与ACQUITY UPLC H-Class四元系统结合的灵活软件可通过Auto?Blend Plus调节流动相pH值。此软件可在同一个工作流程中分析UV和质谱数据，从而简化数据分析过程

沃特世系列产品和服务以其业界一流的技术，帮助烟草检测实验室从容应对各种分析挑战。我们的分析解决方案拥有超高灵敏度、选择性、重现性和通用性，可轻松鉴定多种化学物质，同时能够满足合规性要求、降低运营成本并提升分析效率。

使用本方法得到的定量限为0.1 mg/L，灵敏度较气相方法提高了两个数量级。样品提取不需要浓缩，甚至可以稀释提取液以降低噪声干扰。

在本应用纪要中，使用配备ACQUITY QDa检测器的ACQUITY UPLC H-Class系统对营养保健品和饮料样品中的12种水溶性维生素(WSV)进行了分析。

-使用经认证的QuEChERS方法对橙汁进行快速萃取 -无需进一步的样品制备，7分钟内实现UPLC?/MS/MS检测分析 -为LC/UV分析提供直接的SPE净化步骤 -使用UPLC/MS/MS达到亚ppb水平的检测限 -使用LC/UV达到较低ppb水平的检测限

-使用经认证的QuEChERS方法对橙汁进行快速萃取 -无需进一步的样品制备，7分钟内实现UPLC?/MS/MS检测分析 -为LC/UV分析提供直接的SPE净化步骤 -使用UPLC/MS/MS达到亚ppb水平的检测限 -使用LC/UV达到较低ppb水平的检测限

-使用经认证的QuEChERS方法对橙汁进行快速萃取 -无需进一步的样品制备，7分钟内实现UPLC?/MS/MS检测分析 -为LC/UV分析提供直接的SPE净化步骤 -使用UPLC/MS/MS达到亚ppb水平的检测限 -使用LC/UV达到较低ppb水平的检测限

-使用经认证的QuEChERS方法对橙汁进行快速萃取 -无需进一步的样品制备，7分钟内实现UPLC?/MS/MS检测分析 -为LC/UV分析提供直接的SPE净化步骤 -使用UPLC/MS/MS达到亚ppb水平的检测限 -使用LC/UV达到较低ppb水平的检测限

本文建立了青霉素类(青霉素，阿莫西林，氨苄西林，苯唑西林)，四环素类(四环素，金霉素，土霉素)，喹诺酮类(左氧氟沙星，环丙沙星，诺氟沙星)，磺胺类(磺胺吡啶，磺胺嘧啶，磺胺噻唑，磺胺二甲嘧啶)，头孢类(头孢噻肟，头孢噻吩)，林可霉素和氯霉素，共7类18种抗生素在人血清中的前处理和LC-MS/MS分析检测方法。