有效药物与疫苗是防控新冠疫情的制胜武器。疫情发生以来，国内外多家科研机构和制药公司兵分多路，与时间赛跑，全力以赴开发有效抗病毒药物与疫苗。
贝克曼库尔特生命科学事业部作为一家以“服务健康中国2030”为愿景的公司，一直关注疫情发展，全力支持前线的同时，旗下的多款产品助力新冠治疗药物与疫苗研发，如之前提到的Biomek自动化工作站、Vi-Cell系列细胞计数和活力分析仪（请参考《浅谈加速新冠治疗药物与疫苗研发的两种途径》）。而离心技术作为生命科学领域的一项基础技术，贯穿整个药物与疫苗研发、生产、质控的过程。贝克曼离心机全线产品满足新冠病毒药物与疫苗研发中对于仪器的需求，并提供技术支持与保障。
我国目前新冠疫苗的研发按照灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体活疫苗、核酸疫苗五条技术方向稳步推进。不同类型的疫苗各有其优缺点，在研发上也各具特点。
图1：新冠疫苗研发路径
灭活疫苗
灭活疫苗是一种经典的疫苗形式，是指病原微生物经培养、增殖，用理化方法灭活后制成的疫苗。目前我国两款新冠病毒灭活疫苗获得国家药品监督管理局许可，启动临床试验，分别由国药集团中国生物武汉生物制品研究所、北京科兴中维生物技术有限公司开发。制备灭活疫苗的工艺流程包括病毒培养、灭活病毒、纯化病毒、加入佐剂等几个关键环节。一般通过动物器官培养、鸡胚培养或细胞培养来得到病毒样品。收获病毒颗粒后进行灭活，并进行纯化精制，从而获得高纯度的目标病毒。
图2：基于细胞培养的灭活疫苗典型开发流程
贝克曼离心机产品线提供了一系列高性能的离心机和转头,以便研究人员选择符合其疫苗生产相关步骤需求的离心系统。基于细胞与鸡胚的疫苗生产流程中，Avanti JXN-26智能型高效离心机可配备最大容量为6 升的JLA-8.1000定角转头与连续流转头，满足大体积样品的分离与更高的离心效率。病毒经灭活、过滤富集后，借助超速区带离心 - 在蔗糖溶液中按照颗粒的大小和形状可将病毒与其他颗粒分离。回收的病毒颗粒可使用去垢剂溶解和分离外膜，然后再次借助离心分离进行澄清和去除杂质。
Optima XPN超速离心机配合Type45 Ti定角转头、SW-32 Ti水平转头以及Ti-15区带转头可轻松胜任反复的离心需求保证对样品颗粒进行快速高效的分离纯化，以用于后续疫苗制剂的生产。
图3：Avanti JXN-26高效离心机及6升大容量定角转头
重组蛋白疫苗
重组蛋白疫苗是指体外表达新冠病毒的S蛋白，提纯制成疫苗，然后诱导机体产生抗新冠病毒抗原表位的抗体，从而阻止病毒侵染细胞或中和杀死病毒。在借助体外表达系统如哺乳动物细胞、大肠杆菌等表达S蛋白时，大量细胞的收集同样必不可少，同样是贝克曼Avanti JXN-26智能型高效离心机可以大展身手的重要步骤之一。
腺病毒载体疫苗与流感病毒载体疫苗
腺病毒载体疫苗与流感病毒载体疫苗都是病毒载体疫苗，以改造过的腺病毒或流感病毒为载体，搭载新冠病毒的S基因进入体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆，从而达到将病毒“拒之门外“的效果。目前由军事科学院军事医学研究院陈薇院士和康希诺生物联合研发的全球首个重组新冠病毒疫苗已于进入二期临床试验。小贝在之前的推文中也讲到，由于病毒颗粒沉降系数较小，需要使用超速离心技术来进行分离（请参考《病毒分离需要什么样的离心机》）。
核酸疫苗
核酸疫苗包括mRNA疫苗和DNA疫苗，是将编码病毒蛋白的遗传物质注入人体内，利用人体细胞合成目标蛋白来诱发相应免疫力。由于裸露的核酸物质直接进入体内会被降解，通常利用载体将其注入体内，脂质纳米粒（LNPs）载体是核酸疫苗常用的载体之一。在药物制备中，使用超速离心技术去除游离药物、进行产物浓缩、测定药物包封率已基本成为以LNPs为载体的核酸疫苗制备的常规流程。
贝克曼针对疫苗研制提供了一系列离心解决方案，从疫苗的研发、生产到质控的整个过程满足对于仪器的需求。
Avanti JXN-26为病毒培养中细胞的收集提供更大的容量、更快的速度、更好的温度控制、更稳定的真空系统和更加简单易用的界面，帮助研究人员实现更好的高通量分离。而作为病毒分离专家的Optima X系列以其安全可靠、操作方便、专业设计、卓越性能满足高效分离纯化病毒的需求，成为病毒载体分离的品质之选。
图4：用于疫苗生产的离心机和转头推荐
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自1947年第一台商用超速离心机发明以来，贝克曼库尔特离心技术已有70多年的历史。早在19世纪60年代，已有许多用户使用贝克曼离心机成功分离了多种病毒颗粒。截至现在，贝克曼超离已帮助客户分离纯化得到流感病毒、肝炎病毒、腺病毒、慢病毒等多种几乎覆盖所有类型的病毒样品。贝克曼庞大的用户群体已为研究人员储存发表了数以万计的病毒分离方法与文献，助力病毒研究的同时，也使贝克曼离心机成为了当之无愧的病毒分离专家。
*本产品仅用于科研，不用于临床诊断。
经过小贝上一期的推送，相信大家已经了解到了离心技术尤其是超速离心技术在新冠疫苗研发中的重要性。大家可能有所不知，我们熟悉的超速离心技术还有一位“孪生兄弟”——分析型超速离心技术（Analytical Ultracentrigation，AUC）。1925年瑞典科学家Svedberg发明这一技术，并于第二年制造出第一台分析型超速离心机。经过近百年的应用与发展，目前分析型超速离心技术已广泛应用于生命科学与生物制药领域（想进一步了解这一技术的朋友请移步→AUC技术简介）。
随着新冠疫情逐渐平稳，新冠战役已经进入了下半程——新冠疫苗与药物的研发，其中AUC充分发挥其“可直接检测溶液中样品状态”等优势，在小分子药物筛选、分子机制的研究以及抗体与疫苗的质控中均发挥了重要作用。
@站酷海洛
AUC助力新冠病毒蛋白结构解析
蛋白质的结构很大程度上决定了它的性质与功能，了解新冠病毒S蛋白聚集状态、三维结构以及其与其他蛋白的相互作用，将为新药研发人员对小分子药物的设计与筛选、单克隆抗体与疫苗的研发提供重要帮助。厦门大学研究团队使用分析型超速离心技术（AUC）表征了S蛋白不同状态下的溶液中聚集状态，证明S蛋白以三聚体形式存在于溶液中，并在此基础上解析得到S蛋白三聚体的冷冻电镜结构，为小分子药物筛选与疫苗研制提供了坚实的结构基础。
AUC助力新冠治疗药物筛选
疫情发生以来，研究人员一直致力于寻找有效的病毒抑制剂。新冠病毒中的主要蛋白酶Mpro是一个非常重要的潜在药物靶点，对于抑制病毒复制起着关键作用。德国科研团队与中国长春吉大天元化学技术股份有限公司共同对这一蛋白酶结构展开了研究，研究成果发表在顶级学术期刊《Science》杂志上。他们使用AUC检测不同浓度下Mpro的聚集状态，发现其在溶液中存在单体-二聚体的平衡状态。另外，他们解析得到了新冠病毒Mpro的二聚体晶体结构，并依据其三维结构开发了一种α-酮酰胺抑制剂作为SARS-CoV-2 Mpro的有效抑制剂，帮助推动相应治疗方法的形成。
AUC技术表征抗体药物
在新冠药物的研究中，除了“老药新用“、筛选抗病毒药物的基本思路之外，单克隆抗体等大分子生物药的研发也是应急攻关的热点。相比于小分子药物，单克隆抗体药物机理清晰，特异性强，副作用较低。与此同时，如果抗体药物质量不佳注射到人体后将起不到相应的治疗作用，这使抗体药物的质控显得尤为重要。
目前君实生物、礼来、信达等多家生物制药公司已加入新冠病毒抗体药物研发大军。在抗体药物质控中，Optima AUC分析型超速离心机提供了独一无二的在溶液中检测蛋白性质的系统，可直接分析溶液中抗体的异质性，不需要标准品与基质，更准确表征真实生理状态下的抗体药物，加速药物开发、制剂筛选与质量控制。同时，分析型超速离心技术还可以用来检测抗体偶联药物（ADC）的结合效率以及纳米粒子药物复合体的包装和融合。
疫苗质控中的AUC
除了筛选有效药物之外，疫苗的研发也是为防控新冠疫情主攻的方向之一，我国也展开了灭活疫苗、核酸疫苗、重组疫苗等多条技术路线的研发。在疫苗的质控中，AUC可以用于表征产品在最终溶液中的特性以及批次一致性。厦门大学研究团队此前使用AUC技术检测了VLP病毒样颗粒HEV疫苗的体外组装过程。另外利用AUC技术分析表征了HPV疫苗在溶液中状态以及批次间一致性。
总而言之，无论是小分子药物的筛选、抗体药物的研发与质控以及新冠疫苗的研究都少不了分析型超速离心机（AUC）的身影。除此之外，AUC还可用于病毒载体质控、检测蛋白间相互作用等研究中。
参考文献：
1.Li T, Zheng Q, Yu H, et al. Characterization of the SARS-CoV-2 Spike in an Early Prefusion Conformation[J]. bioRxiv, 2020.
2.Zhang L, Lin D, Sun X, et al. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved α-ketoamide inhibitors[J]. Science, 2020, 368(6489): 409-412.
3.Yang C, Pan H, Wei M, et al. Hepatitis E virus capsid protein assembles in 4M urea in the presence of salts[J]. Protein Science, 2013, 22(3): 314-326.
4.Pan H, Li Z, Wang J, et al. Bacterially expressed human papillomavirus type 6 and 11 bivalent vaccine: characterization, antigenicity and immunogenicity[J]. Vaccine, 2017, 35(24): 3222-3231.
*本产品仅用于科研，不用于临床诊断。
离心瓶是一种使用频率非常高的离心耗材，相比于常规的离心管具有更大的容量，更好的密封性，可操作性也更强。
但离心瓶各部分材质不同，需要选择合适的清洗和灭菌处理方式，保证离心过程的安全稳定以及离心瓶使用寿命最大化：
使用低浓度的洗涤剂浸泡（家用洗涤剂稀释10倍，浸泡不超过10分钟），使用软毛刷子避免对离心瓶造成划伤。
聚丙烯（PP）材质瓶身可以进行高温高压灭菌或酒精浸泡处理。
聚碳酸酯 （PC）材质瓶身不能进行高温高压处理，会严重影响使用寿命，也不耐受酒精，建议使用冷消毒的方式。
聚丙乙烯（PS）离心瓶盖子与橡胶密封圈推荐使用70%的酒精来进行灭菌处理。
聚丙烯（PP）内塞可以进行高温高压灭菌和酒精浸泡处理，但是要注意和瓶身分开处理。
所有离心瓶的组件都不可以使用紫外或伽马射线来进行无菌处理。
离心瓶的清洗与灭菌过程相对繁琐，对离心机使用者来说是额外的工作量，稍有不慎就会导致离心瓶的损坏，丢失样品，损坏机器，影响工作效率。安全、高效的工作流程对您的工作而言与质量样本一样重要。现在，贝克曼库尔特推出了离心瓶样品收集袋，减少非核心离心步骤 (例如额外的旋转，瓶清洁，刮瓶以及增加的冷冻/融化裂解时间) 同时收获高质量的样品。
样品收集袋采用医用级聚醚型聚氨酯（Polyetherurethane）材质，可选择无菌包装，符合USP 23 Class VI规范，适用于细胞、细菌、真菌
单向密封/阀门可减少液体溢出，从而减少人员接触生物制剂的风险 提高了生物相容性，可加热密封，降低样品污染风险 防止样品收集和清洗过程中对离心瓶的损伤，延长离心瓶的使用寿命 优化工作流程和应用 可装载样品放入超低温冰箱，灵活使用，节省冷冻室空间
可将收集袋放入离心瓶内作为内衬，方便离心样品的准备、收集和储存；同时，易于从瓶子中取出，告别繁琐的离心瓶清洗灭菌流程
近年来，基因编辑技术取得了重大突破，细胞治疗和基因治疗成为了许多以前无法治疗或难以治疗的疾病的治疗手段。而腺相关病毒（AAV）载体是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一，其应用潜力已经在大量的临床和非临床实验中得到验证。这一期小贝将分析如何分离得到高纯度的AAV病毒颗粒。
什么是腺相关病毒？
腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科，单链DNA病毒，通常需要在辅助病毒（如：腺病毒、单纯疱疹病毒等）的辅助下才能发生产毒性感染，生成子代AAV。AAV具有安全性好、特异性强、递送效率高、长期有效等特点，已被广泛应用于基因治疗领域，在已获批准的基因治疗产品中已经证实了这些优点。
AAV载体生产后有哪些杂质？
目前，主要有三类生产重组AAV的方式，分别位三质粒共转染、稳定细胞株生产以及杆状病毒感染。三种生产方式得到的重组AAV颗粒都需要进一步纯化，去除工艺相关杂质和产品相关杂质。工艺相关杂质来源于制造过程例如细胞基质、细胞培养和发酵培养基组分等。产品相关杂质是指与其本身性质非常类似的杂质，例如空壳等包装缺陷的病毒、聚集体、降解产物等。无论是哪种生产方式，得到的重组AAV颗粒中通常都会包含没有装载核酸的空衣壳。这可能是由于组成AAV衣壳的三种结构蛋白在细胞内的比例波动较大，而且特定的衣壳蛋白的翻译后修饰可能会有所差异，这些复杂性促进了形成缺陷病毒的概率。
其中，空壳病毒的存在被认为是有害的，因为它们是不必要的潜在抗原物质的来源，可能诱导或提高衣壳触发的抗AAV先天和适应性免疫反应，因此在生产过程中去除空衣壳以及量化AAV制剂中空壳率的能力是任何AAV生产过程的关键要求。
完整的AAV衣壳和相关的衣壳杂质
如何分离纯化AAV病毒载体？
1
病毒颗粒的收集与浓缩
AAV病毒样品同时存在与细胞与培养上清中，为获得更好收率，可以将细胞和培养上清都收集下来；
收集连同培养基的细胞，使用Avanti J-15R离心机，200 ×g离心3分钟，分别收集培养基上清和细胞沉淀，将上清另外存放，并用PBS重悬细胞；
反复冻融或超声破碎将细胞裂解后离心，使用Avanti JXN-26高效离心机，10,000 ×g离心去除细胞碎片，收集细胞裂解上清；
PEG 8000沉淀上清中的病毒，并用0.45 µm过滤器过滤，得到包含病毒颗粒的滤液用于后续纯化。
2
AAV病毒的纯化
分别配置15%、25%、40%、60%碘克沙醇溶液，然后将新鲜配置的不同梯度的溶液铺至超离管内；（每次使用均需新鲜配置，同时铺两个梯度溶液）；
将收集得到的包含AAV病毒颗粒的上清液分别加至超离管中，加满后封口；
将超离管放置于贝克曼Type 70 Ti角转子中，然后将载有样品的转子置于超速离心机Optima XPN-100超速离心机中；69,000 rpm离心1h；(根据样品量也可选择SW 32Ti或SW 41Ti水平转子)；
离心结束后，全颗粒AAV病毒样品在40%-60%之间，穿刺取样小心将样品取出。取出时注意，40%梯度液上方白色条带为空壳样品、蛋白等杂质，为保证分离效果不要吸到此部分溶液；
碘克沙醇密度梯度分离AAV病毒样品
将纯化得到的病毒样品进行超滤或透析，脱盐处理后即可得到AAV病毒颗粒；
为得到高纯度样品，可进行第二次的碘克沙醇密度梯度离心，进一步去除AAV空颗粒与细胞碎片。在第二次离心时，可使用30%、40%、60%的碘克沙醇溶液进行分离。
如何检测AAV病毒载体空壳率？
目前有多种方法检测空壳率，包括电子显微镜、qPCR/ELISA、光密度法等，但是这些方法都不能准确定量。
分析型超速离心技术（AUC）依据空壳病毒与全病毒颗粒沉降系数的不同，可以精确测定产物种AAV病毒载体的空壳率，同时可以检测中间产物、病毒载体碎片、基因组碎片、病毒聚集体等。AUC已成为检测AAV病毒载体空壳率的“金标准”，被业内人士广泛认可。
AUC检测病毒载体空壳率
参考文献：
1. Crosson SM, Dib P, Smith JK, Zolotukhin S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018;10:1‐7. Published 2018 May 8. doi:10.1016/j.omtm.2018.05.001
2. 李永红, 毕华, 秦玺, 饶春明. 基因治疗产品的质量控制分析方法及研究进展. 药物分析杂志, 2020, 40(1): 4-12. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2020.01.01.
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