固定化蛋白质分子

研究背景Nature：清北团队合作发现CRISPR免疫增效子，建立Cas9核酸酶生长进化模型CRISPR-Cas系统是一种强大的基因编辑工具，但Cas9核酸酶活性仍需提高。现有的方法存在着种种局限性，例如优化序列可能破坏结构、改变表达方式可能导致副作用、使用辅助蛋白会增加复杂性等。因此，开发新的方法来增强Cas9核酸酶的活性仍是CRISPR-Cas系统研究中的一个重要课题。2024年5月29日，来自清华大学和北京大学的研究团队在Nature上合作发表了题为：Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity的研究论文研究团队通过生物信息学分析、结构生长轨迹分析、生化实验、冷冻电镜解析和大肠杆菌抗噬菌体实验等手段，发现了一类新型CRISPR免疫增效子PcrIIC1，可以显著增强Cas9核酸酶的活性。研究团队还建立了Cas9核酸酶生长进化模型，揭示了Cas9蛋白结构和功能的演变规律，并阐明了PcrIIC1增强Cas9活性的分子机制。这项研究为我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，以及开发基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具奠定了基础。研究思路通过生物信息学分析，研究团队观察到一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs），显著富集存在于较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中，并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程。图1. 结构生长轨迹分析方法（左）和II-C型Cas9的生长轨迹图（右）通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明，来自金黄色细菌属（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域，以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用，2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。图2. 冷冻电镜分析CbCas9和PcrIIC1结合的三个阶段蛋白质与核酸的分子互作实验表明，与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。研究利用溶液中标记的分子互作方式获得亲和力，得出与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合（图3a）进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。图3. PcrIIC1增强CbCas9的DNA结合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和错配容忍 (e) 能力最后，为了检验CRISPR免疫增效子PcrIIC1对CbCas9抗噬菌体免疫能力的影响，研究人员在大肠杆菌中进行了抗噬菌体实验。以上结果说明CbCas9-PcrIIC1复合体的形成对整个CRISPR-Cas系统的免疫增强至关重要。图4. PcrIIC1显著增强了CbCas9系统的细菌免疫活性FIDA如何更好复现Nature蛋白与核酸互作发文思路流体动力分散技术（FIDA）通过第一性物理原理直接获取分子的绝对流体动力学半径（Rh），通过追踪分子微妙的变化来表征生物分子的行为、特征以及功能。Fida Neo分子互作仪涵盖亲和力表征、亲和动力学表征、分子质量表征三大功能，一次实验即可获得互作与分子质控的数据，让互作的数据有“法”可依。FIDA技术无需固定、无需加热，甚至无需标记，可兼容所有缓冲液，是对现有分子互作技术是一次不一样的升级。FIDA技术可用于CbCas9-PcrIIC1复合物冷冻电镜前样品质控，CbCas9-PcrIC1复合物与DNA的亲和力实验以及动力学实验，以及CRISPR- cas以及核酸复合物的大小和定量表征等方面，具体如下:FIDA多维蛋白复合体表征，快速无稀释优化冷冻电镜样品，丰富您的蛋白质表征数据。FIDA所获得的Rh为绝对的粒径大小，可以直接与后期的电镜数据做比较。此外FIDA内置的 PDB 关联程序，可以将实际获得的 Rh 与数据库中的结构信息进行比较，有助于结构的精细解析。FIDA技术单次运行只需要40 nL 蛋白质在 4 分钟内获得的完整蛋白质 QC 图，包括冷冻电镜样品QC的关键参数表征，例如多分散性指数（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（Rh）等指标，FIDA是一种非常有效的支持所有生物物理学和结构生物学的基本工具。图5. FIDA单次测试的得到8个蛋白表征数据冷冻电镜应用：FIDA：4分钟给您无稀释的冷冻电镜样品优化解决方案FIDA和本篇研究中应用的分子互作技术都是一种在溶液状态下通过荧光分子标记表征分子互作的技术。对于蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现蛋白与蛋白或蛋白与核酸互作的真实情况。FIDA 可以使用含盐和洗涤剂的缓冲液条件，具有不同环境中（类体内环境）进行测试的灵活性。这使得研究者能够分析不受缓冲液成分限制的核苷酸，以确保其数据的准确性和可靠性。FIDA 这种在溶液内检测分子互作技术，是理想的结合能力检测，因为它不依赖于潜在的阻碍性表面固定，不受结合域空间方向影响的表征。图6. FIDA实验原理示意图FIDA不仅可以表征互作亲和力，也同时无标记检测CRISPR核酸酶与gDNA相互作用的热力学、亲和力、和结合动力学，全面表征蛋白与核酸互作。FIDA不仅可以完成本研究中得到的CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合亲和力，还可在无标记下表征蛋白与核酸的热力学参数与结合动力学，甚至表征结合时蛋白构象变化与获得有关基因编辑过程的分子细节的定量表征。FIDA技术可以处理带负电荷分析物和带正电荷配体，使利用FIDA能够深入了解CRISPR- cas组分之间的结合相互作用，并以更高的准确性和效率表征和优化CRISPR系统。FIDA是一种序列无关的技术-不需要事先了解序列。FIDA的序列独立性质可对未知或未表征的基因组区域进行研究，同时简化工作流程。图7.(A) FIDA实验示意图。ReporterRNA用于识别RNP的大小和饱和点(上)，用其报告RNP结构作为竞争分析的起点(下) (B)正向结合(上)和反向滴定(下)期间获得的原始FIDA数据 本研究在分子层面直观的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。首次发现了一类新型的CRISPR免疫增效子可以通过二聚化Cas9效应器提升Cas9活性，这些结果不仅有助于我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，还为未来基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具的开发奠定了基础。FIDA对于蛋白质复合体的多维表征和对蛋白与核酸互作亲和力与动力学的的检测，不依赖于分子量变化，样本用量少（仅需40nL），是一种在溶液状态下且不受缓冲液成分影响的多维表征技术。对于在本研究中相似的蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现互作的真实情况。

前文回顾（点击查看）：蛋白质测序技术发展漫谈（上篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（中篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（下篇）前面描述了目前成熟的蛋白质测序方法，并对最流行的基于质谱的蛋白质测序方法进行了综述。非质谱依赖的蛋白质测序手段，除了几十年前发展的基于Edman降解法通过气相或液相色谱测序的方法，最近热门领域的方法主要包括基于荧光或纳米孔的单分子蛋白质测序，代表了未来的发展方向。基于纳米孔单分子蛋白质测序方法纳米孔测序（nanopore sequencing）法是借助电泳驱动力使待测单个分子逐一通过纳米孔，通过检测纳米孔截面的电流变化来实现对序列的测定。纳米孔测序最初在1996年被提出，通过膜通道检测多核苷酸序列，也就是单分子DNA的测序[1]。随着使用纳米孔对单分子DNA测序技术的逐渐成熟[2-5]，纳米孔技术也被应用在单分子蛋白质的鉴定上。对于DNA来说，其二级结构和电荷相对比较一致，它的聚合物比较容易处理，而且仅由四种碱基组成，单分子DNA测序比较简单。相比之下，蛋白质分子由20种氨基酸组成，并且蛋白的电荷和疏水性多变，还存在大量的二级和三级结构，因此基于纳米孔技术对蛋白质的鉴定要比DNA困难很多[6]。当前的基于纳米孔对蛋白质分析的主要探索方向是通过寡核苷酸适配子或抗体等亲和分子对纳米孔进行功能化，当蛋白质或肽段分子通过纳米孔时，由于不同氨基酸在纳米孔附近的结合或通过会引起不同幅度的电流变化，基于这些变化就可以确定氨基酸的种类，从而逐个得到所测蛋白质或肽段的序列信息（图1）。图 1 借助纳米孔的横向电流检测单分子蛋白质[2]牛津大学的Hagan Bayley[7]团队将单个α-血溶素蛋白孔插入两侧带有电极的膜中，磷酸化的蛋白质在DNA寡核苷酸的牵引下展开，并穿过纳米孔，通过记录纳米孔的电流变化区分出了202个磷酸化蛋白质的4种不同亚型，但无法鉴定蛋白质的一级结构。Francesco[8]团队将蛋白质或氨基酸吸附在金纳米星上，并施加电等离子体力将粒子推进并约束在金纳米孔内，利用金纳米星与金纳米孔壁之间的单个热点，实现了单分子表面增强拉曼散射（SERS）探测，用于检测氨基酸，并且可以分辨仅含有两个不同氨基酸的单个多肽分子抗利尿激素和催产素。Cao等[9]通过单个定点突变，在具有锥形识别位点的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）的纳米孔内腔中引入了甲硫氨酸，从而将该反应有目的的移植到了MspA纳米孔最尖锐的识别位点，并观测到了相应的单分子反应信号。该纳米孔可以引入更多的离子电流，从而放大检测信号，其狭窄的识别位点则提供了更高的空间分辨率，大大削弱了周围氨基酸的干扰，从而拓宽生物纳米孔的单分子检测功能，有望推进基于孔道的单分子蛋白质测序研究。Ouldali[10]研究团队研发出了一种新型气溶素纳米孔，此纳米孔借助将氨基酸附着在聚阳离子载体上，使氨基酸在纳米孔上停留时间变长，并检测其通过纳米孔时电流的变化，最终可识别出组成蛋白质的15种氨基酸，也能检测到组成蛋白质的其余5种氨基酸的电流变化，但是无法对其进行区分。虽然只是对氨基酸进行识别，但作者设想通过对蛋白或者肽段末端氨基酸逐个降解，利用纳米孔技术鉴定从末端释放出来的氨基酸，从而对蛋白质或肽段序列进行测定。Zhao[11]等将一对金属电极分隔在约2nm的孔洞旁，当氨基酸线性穿过这种纳米孔的时候，每一个氨基酸都会完成一个回路，并反馈出相应的电信号，常见的20种氨基酸在通过纳米孔时都可以产生电信号。有的氨基酸需通过大约50种不同信号特征被鉴定，但绝大多数的氨基酸仅需要不到10个信号特征被鉴别。这种方法不仅能够高可信度的鉴定氨基酸，还能区分翻译后修饰的氨基酸（肌氨酸）及其前体（甘氨酸）、区分同分异构体的亮氨酸与异亮氨酸、区分对应对映异构体的氨基酸镜像分子L-天冬酰胺和D-天冬酰胺。此技术被应用于对两条由四个氨基酸组成的短肽（GGGG 和GGLL）进行测序，单分子短肽穿过纳米孔，孔道两边电极记录每个氨基酸通过时产生的电信号，通过测序算法，识别代表不同氨基酸的特征信号，从而得到短肽的序列。基于纳米孔单分子蛋白测序目前还属于初步发展阶段，除了需要根据电信号准确区分组成蛋白质的氨基酸以外，另一个关键是设计可一次拉动一个蛋白质或氨基酸穿过纳米孔的“马达”。为了让蛋白质或肽段顺利穿过纳米孔，研究者们在蛋白质一端添加了一串带有负电的氨基酸或者一段短DNA，用氨基酸或DNA链拉动蛋白质，可以使一些蛋白质打开折叠并顺利穿过纳米孔，但另一些复杂折叠的蛋白需要更多拉力，于是研究者在引导序列上添加了可以打开折叠的ClpX的识别位点[12]。这个系统能够将简单折叠的目标蛋白牵引过纳米孔，但对于折叠非常紧密的蛋白质仍要使用变性剂来打开折叠。基于纳米孔技术对单分子肽段或蛋白质测序目前还停留在对氨基酸鉴定和对短肽的区分阶段，还不能实际应用于对蛋白质的测序。虽然纳米孔测序具有高通量、对样品需求量少的优点，但是现有的纳米孔过大，失去了对氨基酸的区分能力，同时蛋白质分子通过孔道过快，加大了对信号读取难度；其次由于需要将蛋白的三级和二级结构破坏掉，纳米孔道需要能够耐受非常苛刻的化学和力学条件；第三，由于蛋白带电不均匀，控制其穿孔的速率也非常困难。所以目前的方法还不能准确的测得蛋白质的序列，基于纳米孔的单分子蛋白质测序技术还有很大的发展空间。基于荧光的单分子蛋白质测序方法基于荧光的单分子蛋白质测序同纳米孔测序一样，都可以对极少量蛋白质样品进行检测，其原理是先将蛋白质酶解成肽段，对肽段中特定氨基酸选择性标记不同的荧光基团[13]，对不同氨基酸上的荧光进行观察，从而确定肽段部分氨基酸序列，再将这些序列与蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白（图2）。图 2 基于荧光的单分子蛋白测序流程[14]。Ginkel[15] 和Yao [16]都利用ClpXP蛋白酶辅助对肽段进行选择性荧光标记，可对序列中的赖氨酸和半胱氨酸进行标记，通过Förster共振能量转移依次读出被标记的肽段的氨基酸的信号。Swaminathan[14] 将蛋白质酶解成肽段，再将肽段固载到玻璃片上[17]，使用特定荧光基团分别对肽段中的赖氨酸和半胱氨酸选择性标记，通过Edman降解技术对固载的肽段进行降解，每次降解后都使用全内反射荧光（TIPF）显微镜进行观测。如果被标记的赖氨酸和半胱氨酸在Edman降解中从肽段N端释放出来，被标记的以上两种氨基酸的位置就会被检测到。同时还发展了用于监测单个肽荧光强度的图像处理算法，并对误差源进行分类和建模，可以测得序列中部分氨基酸的信息。将测得的部分序列与参考蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白，通过与蛋白质组序列比对，可以鉴定到在人源蛋白质组中的绝大多数蛋白质。基于荧光单分子蛋白测序技术主要有三方面难点，一方面在于目前仅能对赖氨酸和半胱氨酸等几种氨基酸进行特异性荧光基团的标记，无法对所有氨基酸都进行标记；第二个难点是Edman降解是在强酸或强碱的环境中进行，对这些荧光基团的稳定性要求很高；第三个难点是对后期图像处理有较高的要求，如果序列中每个氨基酸都标记上不同的荧光基团，且发光峰易交叠难分辨，这给荧光处理算法带来了难度。因此，基于荧光的单分子蛋白测序技术虽然可以对极微量蛋白质样品分析，但目前仅能测得部分氨基酸序列，对蛋白质全序列的测定目前尚不能实现。[1] Kasianowicz J J, Brandin E, Branton D, et al. 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Solid-Phase Peptide Capture and Release for Bulk and Single-Molecule Proteomics [J]. ACS Chem Biol, 2020, 15(6): 1401-1407.作者简介：中国科学院大连化学物理研究所 单亦初副研究员1997年于中国科学技术大学获理学学士学位。2002年于中国科学院大连化物所获理学博士学位。2002年10月至2009年5月在德国马普协会马格德堡研究所、美国德克萨斯大学医学院及澳大利亚弗林德斯大学工作。2009年7月应聘到中国科学院大连化物所任副研究员。主持多项研究课题，包括国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目等。已在Analytical Chemistry、Journal of Proteome Research、Journal of Chromatography A等杂志发表论文近80篇。主要研究方向包括蛋白质组鉴定和蛋白质组相对及绝对定量、蛋白质翻译后修饰富集和鉴定、蛋白质组末端肽富集和鉴定、蛋白质相互作用分析、蛋白质全序列从头测定及药物靶蛋白筛选。（本文经授权发布,仅供读者学习参考）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：liuld@instrument.com.cn ）。

据德国卡塞尔大学网站报道，近日，该校科学家研制的一种带磁场的微型传感器获得突破，样机在年内即能完成。该传感器通过遥控牵引磁化纳米生物分子，可将检测液中极少量的蛋白质分子检测出来。该技术有望革新医疗诊断方式，其中利用磁性纳米粒子运送生物分子的方法已申请了专利。　　一般情况下，病人体内某些蛋白质组分会“泄露”病情，因此，医生有时可以通过检测体液中的某些蛋白质来及时确诊疾病。不过，由于有的疾病，例如阿尔茨海默氏症(老年痴呆症)，其在血液中只含有少量这种蛋白，进行血液检查时蛋白质不一定能够到达传感器表面，所以往往需要用含较多这种蛋白的脊髓液来检查。而穿刺抽取脊髓液不仅需要麻醉，还给患者带来了手术的风险。　　现在，德国卡塞尔大学物理研究所和多学科纳米结构科学与技术研究中心(CINSaT)阿诺埃雷斯曼博士领导的科研小组提出一个新的传感器概念，通过遥控牵引磁化纳米生物分子，可将血液中极少量的特定蛋白质分子检测出来，从而通过正常的血液分析取代脊髓液检查。　　科学家们首先在表面覆盖受体分子的磁性纳米粒子的帮助下，从检测液体中捕捉特定的蛋白质分子。为此，磁性纳米粒子在回旋磁力场作用下穿过检测液体，并因此产生一个分子漩涡，这在一定程度上起了“搅拌器”的作用。随后，捕获了生物分子的纳米粒子会被磁力场牵引至可识别磁性粒子的传感器上。这个回旋磁力场通过部分磁化材料制成的水平堆积纳米层来产生。科学家们还克服了结构上的障碍，找到了避免纳米粒子通常在检测液体中会相互吸引而产生凝聚的方法。　　研究人员认为，除了在医学诊断上的作用，该新型粒子运输概念还可在化学工业中得到应用，可能会迅速给医疗诊断和生物技术带来革命性影响。

近日，连化物所生物分子结构表征新方法研究组（1822组）王方军研究员、刘哲益副研究员团队与西南交通大学封顺教授团队合作，利用我所自主搭建的高能紫外激光解离—串联质谱仪器，揭示了质子化氨基酸侧链的正电荷在电喷雾离子化过程中影响蛋白质结构的分子机制，为质谱精确表征蛋白质高级结构提供了参考。非变性质谱（nMS）是研究蛋白质及其复合物组成和高级结构的前沿质谱技术。在nMS分析中采用生物兼容溶液和非变性电喷雾离子化将蛋白质从液相转移至气相并保持高级结构和相互作用。然而带正电荷的质子化氨基酸侧链在失去水分子的溶剂化稳定作用后，会与空间接近的蛋白骨架羰基形成氢键，通过分子内溶剂化稳定侧链正电荷。虽然有报道通过离子迁移—质谱检测到了分子内溶剂化引起的蛋白质碰撞截面积变化，但是对其发生的具体位点和引起结构变化的区域仍然缺乏有效分析手段进行精确表征。在本工作中，研究团队利用我所自主搭建的高能紫外激光解离—串联质谱仪器和蛋白质光解离质谱数据处理软件系统，通过蛋白质紫外光解离碎片离子的价态分布和位点解离碎片产率分析，探测到肌红蛋白带电残基侧链分子内溶剂化的具体位点，以及对蛋白质结构影响的区域位置。团队系统表征了不同价态（质子化数目）下的蛋白质结构差异，发现高电荷价态下蛋白质气相结构易受分子内溶剂化效应的影响而偏离溶液态结构，低电荷蛋白质离子的气相结构更加接近溶液状态。研究团队进一步证明，冠醚18C6与蛋白质带电侧链的络合主要发生在溶液中，随后在电喷雾离子化过程中起到稳定蛋白质结构的作用。紫外激光解离质谱分析揭示冠醚主要结合在蛋白质离子的高电荷密度区域，通过阻断带电侧链的分子内溶剂化使蛋白质气相结构更加接近溶液状态。相关研究结果展示了高能紫外激光解离质谱在同时获取蛋白质序列和动态结构信息中的显著优势，为nMS表征中蛋白质溶液结构的保持和高效表征提供了重要的理论和技术参考。近年来，我所王方军和肖春雷研究员通过交叉学科联合创新攻关，在大连相干光源搭建了高能紫外激光解离—串联质谱实验线站，兼容50-150nm极紫外自由电子激光和193nm准分子激光解离模式，已在多肽（Anal. Chim. Acta，2021）、蛋白质（Cell Chem. Biol.，2022）、金属团簇（J. Phys. Chem. Lett.，2020；Sci. China Chem，2022）等大分子体系的解离和结构表征中取得了系列研究成果。相关研究成果以“Ultraviolet Photodissociation Reveals the Molecular Mechanism of Crown Ether Microsolvation Effect on the Gas-Phase Native-like Protein Structure”为题，于近日发表在《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society）上。该工作的共同第一作者是我所1822组联合培养硕士研究生周伶强和刘哲益。

研究背景蛋白质脂化在几乎所有与膜相关的生物学途径中都起着核心作用，例如细胞信号传导、蛋白质分泌、细胞死亡和免疫。然而，由于脂化是高度可变的，可逆的，并且经常与其他蛋白质翻译后修饰相互交叉影响，大多数蛋白脂化的生理功能仍然不明确，常见的功能缺失诱变方法对于探索蛋白质脂化往往效果不佳。研究内容2023年8月，浙江大学生研院林世贤课题组在 Nature Chemical Biology（自然化学生物学）杂志发表了题为“Computational design and genetic incorporation of lipidation mimics in living cells”的研究成果，报告了一种设计脂化模拟的计算方法。研究团队建立了一个工程系统，用于将这些脂化模拟物整合到大肠杆菌和哺乳动物细胞中几乎任何所需的蛋白质位置。这项研究策略能够实现数百种蛋白质脂化的功能获得研究，促进了卓越治疗候选药物的创造。在该研究中，为了证明基因编码脂质模拟物在设计和合成治疗候选药物中的效用，研究人员使用Monolith分子互作仪检测了人血清白蛋白HSA和脂质模拟改造的多肽药物GLP-1变体之间的相互作用。GLP-1-K20-4HexyF和GLP-1-K20-4OctyF对HSA的Kd值分别为2.31 μM和0.58 μM，分别比GLP-1-K20-HepoK的15 μM增加了6.5倍和25.9倍。相比之下，野生型(WT) GLP-1未检测到结合，表明增强的结合是由脂质模拟介导的。图：MST分析多肽药物GLP-1变体对人血清白蛋白HSA的亲和力https://doi.org/10.1038/s41589-023-01400-8IF: 14.8 Q1技术优势Monolith系列仪器可以直接检测带有荧光标记（如CY5）的多肽与其他分子间的相互作用，也可以检测经过荧光标记的蛋白与无荧光的多肽分子间的相互作用。检测不依赖于分子量的改变，样品用量少，仅需10分钟就可获得精确的Kd值。

p /pp　　层析纯化技术由于其高选择性、灵活性、易放大性等优点，已经成为蛋白质药物纯化中不可或缺的技术。传统的层析填料为多糖基质，孔径一般在100 nm以下。1970年代出现了大孔和微孔无机材料硅填料，虽然增大了孔道、提高了层析的分辨率和流速，但只能在PH2-7.5范围内稳定，不利于分离纯化在碱性范围内稳定的蛋白质或是需要碱性层析条件的分离，从而限制了其在大规模快速分离蛋白质层析上的应用。多孔聚合物微球由于其高的比表面积、高的机械强度和多样的表面特征，常被用作层析分离纯化的填料。目前已发展出了多种表面基团、基质种类的层析填料，成功用于疫苗、病毒、抗体、酶、细胞因子等的分离纯化。/pp　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　层析纯化病毒、病毒样颗粒等生物大分子的瓶颈问题/strong/span/pp　　随着病毒、病毒样颗粒在疫苗、肿瘤治疗、免疫治疗中的地位越来越重要，这类复杂生物大分子的分离纯化需求也逐渐增加。然而传统填料由于孔径较小，蛋白质只能以扩散方式通过填料，传质速率慢，处理量低，造成分离时间长、容易失活等问题[1]。当蛋白质体积较大时，填料表面在吸附一层蛋白后，由于体积位阻以及静电排斥作用，会阻碍其它的蛋白质进一步进入孔内，造成填料的载量下降。另一个限制是病毒或疫苗，尤其是带有包膜的病毒或疫苗，在狭窄的填料孔径内发生吸附时非常容易发生结构变化，破坏其整体结构。在乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的纯化中发现这种病毒样颗粒在层析时会发生解聚[2]，经过离子交换层析分离后，疫苗的回收率通常不到50%[3, 4]。而抗原的结构发生变化以后，就会对其免疫原性产生影响，所以需要在纯化过程中尽可能维持抗原的结构。/pp　　为了解决针对病毒及病毒样颗粒纯化的瓶颈问题，目前已有采用膜色谱、超大孔贯穿孔颗粒填料及整体柱的策略进行纯化的案例，成功纯化了包括人乳头瘤病毒、番茄花叶病毒、流感病毒、腺病毒、慢病毒及各种病毒样颗粒。/ppspan style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　　病毒及病毒样颗粒的分离纯化/strong/span/pp　　根据文献报道，超大孔填料相比传统层析填料不仅在载量及处理速度上有极大的优势，还更有利于病毒及病毒样颗粒的结构保持。/pp　　例如，在重组乙肝病毒表面抗原的分离纯化中，采用具有120nm及280nm超大孔径的离子交换填料DEAE-AP-120 nm和DEAE-AP-280 nm(商品名为中科森辉的Giga系列)具有比传统填料DEAE-FF高7倍以上的动态载量[1]。此外，采用ELISA测定抗原收率，发现采用超大孔填料能够减少重组乙肝病毒表面抗原在层析过程中的裂解，从而显著提高活性抗原的收率。/pp style="text-align: center "img width="576" height="450" title="1.jpg" style="width: 415px height: 282px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/3b67db18-4291-4ab6-9874-209cd57644af.jpg"/　　/pp style="text-align: center "重组乙肝病毒表面抗原在不同孔径离子交换填料上/pp style="text-align: center "　　的吸附动力学[1]/pp style="text-align: center "img width="497" height="345" title="2.jpg" style="width: 387px height: 289px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/07fdf233-77a5-4c30-8d20-faf7f044b54a.jpg"/　/pp style="text-align: center "　重组乙肝病毒表面抗原从不同孔径的填料上洗脱下来的/pp style="text-align: center "　　ELISA回收率[1]/pp　　对病毒的分离纯化同样有类似的效果。例如在灭活口蹄疫病毒的纯化中，DEAE-FF导致严重的病毒裂解。而采用具有100nm以上孔径的超大孔填料，不仅载量提高10倍以上，还能显著提高病毒在填料上吸附时的热稳定性，从而减少病毒的裂解，具有更高的收率。最终的分离纯化单步收率达90%以上[5]。/pp style="text-align: center "　　span style="font-size: 14px "strong灭活口蹄疫病毒在传统填料与超大孔填料上的吸附解离过程/strong/span/pp　　与商品填料的小孔道填料相比，超大孔结构可能从以下几方面提高对蛋白质构象的稳定性：/pp　　1)增大孔道(受限空间)：根据蛋白质折叠行为计算显示，蛋白质的折叠速率与空腔大小、形状密切相关，也即当填料孔道与蛋白的相对尺寸超过某一阈值后，蛋白的折叠行为将不受空腔大小影响。与数十纳米中孔结构的传统填料的相比，数百纳米超大孔结构会因孔道增大、与蛋白接触面积减小，从而对某一尺寸下蛋白质的变构行为有所改善。/pp　　2)界面曲率：小孔径填料孔道曲率大，填料与蛋白质接触面积大，因此受更大吸附力影响，蛋白质二级结构变化越严重。而曲率更大的超大孔孔道对蛋白二级结构的保护比狭窄孔道更有优势。/pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "strong　表面曲率变化对蛋白接触面积的影响/strong/span/pp　　3)改善配基与蛋白活性区域的接触面积：超大孔微球内部数百纳米孔道在修饰配基后可能会有效改善传统填料狭窄孔道内由于配基拥挤造成的蛋白质失活现象。/pp　　4)减少蛋白在孔道内的静电排斥作用：有研究者认为，在离子交换填料上蛋白质起初会在孔道入口处形成一圈静电层，这一静电层会对后来蛋白继续进入孔道产生排斥作用从而使孔道关闭，动态载量下降。如果将超大孔填料修饰为离子交换树脂，由于孔道尺寸显著扩大可能会有效改善蛋白吸附静电层对孔道的封闭作用，从而有效引导蛋白质进入超大孔道，提高回收率。/ppspan style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　　快速分离蛋白质及pDNA/strong/span/pp　　除了应用于病毒及病毒样颗粒的分离纯化的分离纯化，利用超大孔填料传质速度快的优势，将超大孔填料镀上亲水表层，再接上不同配基制成多种形式的层析填料，用于快速高分辨率的纯化蛋白混合物或质粒。超大孔填料制备成的亲和层析、反相层析和离子交换层析填料广泛的应用在蛋白质的分离纯化方向，显示出超大孔填料比传统分离填料高速高分辨率的蛋白质纯化优势。/pp　　例如以肌红蛋白、转铁蛋白和牛血清白蛋白的混合溶液为模拟体系，考察不同流速下超大孔聚苯乙烯阴离子交换介质(DEAE-AP，商品名为Giga系列)的分离效果，并与DEAE 4FF介质进行了对比。实验结果(图2)显示，作为对照的DEAE-4FF介质在流速达到361 cm/h时，分离效果已明显降低，而超大孔介质可以在流速高达1084 cm/h的条件下操作，分离效果良好，能够在6 min内实现三种生物大分子的快速分离。/pp style="text-align: center "img width="588" height="170" title="3.jpg" style="width: 473px height: 144px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/65df31ac-bd00-4a08-8a5a-feedfa1aa990.jpg"//pp　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　超大孔填料应用前景与展望/strong/span/pp　　近年来，随着生命科学的发展，生物样品越来越复杂，如人的血样、尿样、组织样品等，对生物分离分析技术提出更高的要求。根据超大孔填料固有的诸多优点，通过合成不同种类的超大孔固定相及在固定相上做不同功能的衍生，超大孔填料已经被广泛应用于生物分离分析中，但也存在一些问题。因此，发展新的制备手段，优化制备条件和过程，探索制备和分离机理，对于开辟新的应用领域以及开展实际样品的分离分析有更大的理论和现实意义。/pp　　根据已有的文献报道，我们可以预测今后几年的相关工作仍会集中在以下几个方面：/pp　　(1)规则的聚合物整体材料内部形态。如获得规则的3D网络骨架，可控的孔径尺寸和分布。/pp　　(2)继续在微分离系统中扩展其应用。如在加压电色谱、微流控芯片材料、微流色谱和纳流色谱系统，甚至纳米器件开发等诸多方面大显身手。/pp　　(3)表面物理化学性质的调控向功能化、智能化方向发展。如基于分子印迹技术、温度响应以及pH响应的表面智能化的整体材料。/pp　　(4)制备规模整体柱的开发及其在生物下游技术中的应用。/pp　　目前，已经有一部分整体柱实现了商品化，但种类有限，还无法与种类繁多的颗粒型填充柱相提并论，也远未能满足分离分析的需求。而颗粒型的超大孔填料，由于其制备较困难、批次间重复性较差、价格昂贵等，也没有得到广泛的应用。相对于超大孔填充柱，有机相整体柱存在因流动相变会发生溶胀或收缩、机械强度差、比表面积小、柱容量差以及聚合过程中产生的微孔不利于小分子样品的分析等问题，现有报道大都用于生物大分子的分离。硅骨架整体柱也存在必须预先聚合好装入套管中，制备繁琐，比表面积较小的问题。因此，如何以更简便、有效的方式制备高效新型的超大孔填料并将其应用于实际样品的分离分析仍然是今后工作的重心。在实际工作中所面临的层出不穷的问题也是推动新型超大孔填料制备技术和方法发展的源源不竭的动力，在诸多的尝试中很可能就会出现某些性质优良的超大孔填料，这也预示着将来商品化的超大孔会越来越多。/ppspan style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　　部分商品化的超大孔层析介质/strong/span/pp　　strong超大孔填料因其具有独特的多孔结构，与传统填料相比具有更加优良的渗透性和传质速率，可以在较低的操作压力下实现高效和快速的分离，已成为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第四代分离填料。可以预测，随着制备技术的不断提升，超大孔填料在生命科学、医药、环境和化学化工等领域必将大有可为。/strong/pp　　参考文献/pp　　[1] M.R. Yu, Y. Li, S.P. Zhang, X.N. Li, Y.L. Yang, Y. Chen, G.H. Ma, Z.G. Su, Improving stability of virus-like particles by ion-exchange chromatographic supports with large pore size: Advantages of gigaporous media beyond enhanced binding capacity, Journal of Chromatography A, 1331 (2014) 69-79./pp　　[2] P.M. Kramberger P, Boben J, Ravnikar M, ?trancar, A.S.m.c.a.b. in, p.a.f.q.o.t.m. virus., J. Chromatogr. A 1144(1)./pp　　[3] W. Zhou, J. Bi, J.-C. Janson, A. Dong, Y. Li, Y. Zhang, Y. Huang, Z. Su, Ion-exchange chromatography of hepatitis B virus surface antigen from a recombinant Chinese hamster ovary cell line, Journal of Chromatography A, 1095 (2005) 119-125./pp　　[4] W. Zhou, J. Bi, J.C. Janson, Y. Li, Y. Huang, Y. Zhang, Z. Su, Molecular characterization of recombinant Hepatitis B surface antigen from Chinese hamster ovary and Hansenulapolymorpha cells by high-performance size exclusion chromatography and multi-angle laser light scattering, Journal of Chromatography B, 838 (2006) 71-77./pp　　[5] S.Q. Liang, Y.L. Yang, L.J. Sun, Q.Z. Zhao, G.H. Ma, S.P. Zhang, Z.G. Su, Denaturation of inactivated FMDV in ion exchange chromatography: Evidence by differential scanning calorimetry analysis, BiochemEng J, 124 (2017) 99-107./pp/p

中国科学技术大学研究人员领衔的一个团队最近利用钻石中的一种特殊结构做探针，首次在室内温度空气条件下获得单个蛋白质分子的磁共振谱。该成果使利用基于钻石的高分辨率纳米磁共振成像诊断成为可能。　　这一发现5日发表在新一期美国《科学》杂志上。负责该研究的中国科学技术大学教授杜江峰说，通用的磁共振技术已被广泛用于基础研究和医学应用等多个领域，但其研究对象通常为数十亿个分子，单个分子独特的信息无法观测。基于钻石的新型磁共振技术在继承传统磁共振优势的同时，将研究对象推进到单个分子，成像分辨率由毫米级提升至纳米级，但其主要难点是源自单分子的信号太弱。　　为此，杜江峰的团队利用碳-12富集的钻石为载体，注入氮离子使其产生一种名为&ldquo 氮-空位点缺陷&rdquo 的结构，并使该结构发挥探针作用，在纳米尺度上靠近被探测的蛋白质。此外，他们利用一种名为&ldquo 多聚赖氨酸&rdquo 的物质保护蛋白质，确保其在研究过程中的稳定性。　　研究人员选取了细胞分裂中的一种重要蛋白质MAD2为研究对象。经过两年多的努力和逾百次尝试，最终他们成功在室内温度及空气条件下首次获取了单个蛋白质分子的磁共振谱，并通过谱形分析，获取了其动力学性质。　　关于这项技术的用途，杜江峰表示，最直接的用途是在不影响蛋白质性质的前提下检测其结构和动力学性质，直接在细胞膜上或细胞内研究蛋白质分子，&ldquo 这对生命科学研究来说有极大吸引力&rdquo 。　　总之，该技术拓宽了单个分子领域的研究范围，在分析化学、结构生物学、高分子、磁性材料等领域具有重要应用前景和实用价值。以此为基础，结合扫描探针、高梯度磁场等技术，未来可将该探测技术用于生命及材料领域的单个分子成像、结构解析、动力学监测，甚至直接深入细胞内部进行微观磁共振研究，为获得科学新发现孕育可能。　　《科学》杂志的审稿人评价该工作是&ldquo 单个蛋白质分子检测的突破性成果&rdquo ，开启了利用&ldquo 氮-空位点缺陷&rdquo 进一步研究&ldquo 自旋标记&rdquo 蛋白质的可能，有重要应用前景。参与这项研究的还有来自中国科学院强磁场科学中心和德国斯图加特大学的研究人员。　　原文检索：Single-protein spin resonance spectroscopy under ambient conditions

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T., Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

Synapt™ HDMS™ 质谱分析系统产品发布会在穗盛大召开 2007年8月19 日，上海 - 沃特世公司(NYSE: WAT)在广州珠江帝景酒店召开新产品发布会，正式向中国用户介绍其于今年年初荣获Pittcon最佳新产品金奖的Synapt™ HDMS™ 质谱分析系统（Waters Synapt High Definition MS™ (HDMS) System）。这是第一台基于高效离子淌度测量和分离技术的高性能四极杆-飞行时间质谱仪。此次发布正值第五届中国蛋白质组学大会在穗举行，因此首次亮相的Synapt HDMS吸引了超过110位来自全国各地的蛋白质组学领域的专家和学者。 晚上19点30分，发布会以为产品亮灯作为序幕：四位客席嘉宾应邀上台，与沃特世中国区市场经理陈红女士共同主持这一仪式。在聚光灯的投射之下，白色巨型的Synapt HDMS仿真模型立刻成为全场的亮点。随后，沃特世中国市场总监舒放、亚太总部市场开发经理Mark Ritchie和应用培训经理吴麟堂，以及中国区质谱维修经理葛玉春等几位高层悉数到场进行精彩演讲，并演示了这一新产品所应用的先进技术。 “这是一套很好的产品。众所周知，蛋白质的结构决定其功能。但是，使用普通的质谱仪是不能观察到异构体的，这或多或少会影响检测结果的准确性。” 东北林业大学生命科学学院的李玉花院长说, “而Synapt HDMS的面世可以很好填补这一技术空白，大大丰富了常规质谱力所不能及的独特信息。” 深圳市南山区疾病控制中心柳洁主任也认为，“Synapt HDMS会在很大程度上有利于对离子空间比较结构的分析，在小分子研究、蛋白质解析、代谢物鉴定和生物制药等领域是一个极大突破。因此，这个产品无论是在全球还是中国的相应领域都有着极大的研究应用潜力”。 Synapt HDMS产品发布会在一片愉悦的氛围中圆满结束。沃特世中国市场总监舒放充满信心地表示，Synapt HDMS进入中国市场的策略是坚决的，也是务实的。“这种激动人心的分析手段，将会利用自身的技术优势，帮助相关领域内的研究人员轻松从事所有UPLC/MS/MS的应用分析。” 关于Synapt HDMS质谱 伴随2006年美国质谱年会上推出Synapt HDMS 质谱系统, 沃特世公司成为第一个将高效离子淌度测量与分离技术结合并商业化的公司，同时设计专业操作软件分析样品离子的大小，形状，电荷数及质量。 作为对该质谱系统创新科技的认可，Synapt HDMS 质谱系统在2007年匹茨堡分析仪器展览会上被评为最佳新产品金奖。 另外，行业通讯杂志—《仪器商业展望》也将Synapt HDMS 质谱系统评为2007年匹茨堡大会新产品最高奖。 欲知更多有关Waters Synapt HDMS质谱分析系统的信息，请访问www.waters.com/HDMS。 关于沃特世公司 沃特世公司（股票代码NYSE:WAT） 在全球范围内，通过传递实用，可持续发展的创新技术在人体保健，环境管理，食品安全和水质分析领域建立了商业优势。 拥有整合的分离科学，实验室信息管理，质谱和热分析技术，沃特世公司的技术突破和实验室解决方案为用户的成功提供了保证平台。 沃特世公司2006年收入为12.8 亿美元，在全球拥有4,700 名员工。沃特世公司致力于与全球用户一同推动科学发现并保障产品的卓越性能。 Waters, Synapt, High Definition MS和HDMS是沃特世公司拥有的商标。 媒体查询，请联络： 沃特世科技（上海）有限公司 谢迎锋 小姐 电话：+86 21 54263597 传真：+86 21 64951999 Email：xie_ying_feng@waters.com 网址：www.waters.com www.waterschina.com

安捷伦科技新增C3和二苯基固定相的亚2µ m蛋白质分析生物色谱柱以提供更多选择性和更好峰形 2012 年 2 月 6 日，安捷伦科技公司（纽约证交所:A）宣布了其用于反相液相色谱仪的孔径 300 Å 、亚 2 µ m 填料色谱柱系列迎来了新成员：超高压快速高分离度 ZORBAX 300SB-C3 和 300-二苯基 1.8 µ m 色谱柱。 这两种色谱柱的加入实现了超高效液相色谱（UHPLC）的反相生物分子分离。C3固定相能够为大分子蛋白质分离（包括抗体在内）提供更多选择性和更好的峰形，回收率也更高而 二苯基固定相通过一级结构中的芳香族氨基酸的pi-pi 相互作用带来更多选择性。 安捷伦产品经理 Linda Lloyd 说道：“安捷伦现有的亚 2 µ m 宽孔径生物色谱柱能够全面满足反相液相色谱系统的需求新型 1.8 µ m 色谱柱进一步扩展了 ZORBAX C18、C8 和 C3 固定相系列，这三种固定相已有 3.5 和 5 µ m 两种规格的填料。我们非常高兴能够为 UHPLC 用户带来更准确的鉴定和更快的分析速度。” 该款粒径 1.8 µ m，孔径 300Å 的色谱柱将 UHPLC 特有的效率、分离度和强大的定量功能在反相液相色谱蛋白质分离上发挥到极致。此外，该色谱柱在高达 1200 bar 的压力下同样稳定安捷伦的 C18、C8 和 C3 色谱柱采用成熟的 StableBond 技术，加上封端的联苯和 Pursuit 色谱柱的化学性质，当采用三氟乙酸或甲酸流动相改性剂时能够得到对称峰形，即使在低 pH 条件下亦是如此。丝毫无损色谱柱寿命。 目前，全套 ZORBAX 超高压快速高分离度色谱柱系列包括用于小分子应用的 13 种固定相（包括 HILIC）以及用于大分子分离的四种固定相。如此广的选择范围使得色谱分析人员能够选择最适合的色谱柱来优化 UHPLC 分离。此外，RRHD 高达 1200 bar 的稳定性也提供了更灵活的流速和流动相选择。 要了解更多信息，请访问：www.agilent.com/chem/biohplcproteins。 关于安捷伦科技 安捷伦科技公司（纽约证交所：A) 是全球领先的测量公司，同时也是通信、电子、生命科学和化学分析领域的技术领导者公司的 18,700 名员工为 100 多个国家的客户提供服务在 2011 财政年度，安捷伦的业务净收入为 66 亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com.cn。 编者注：更多有关安捷伦科技公司的技术、企业社会责任和行政新闻，请访问安捷伦新闻网站：www.agilent.com.cn/go/news。

首次将 UHPLC 用于小分子分离时，能得到很好的峰形，但是蛋白质峰的分离几乎没有那么好，因此通常不可能显着缩短运行时间。然而，最近对蛋白质进一步改进让UHPLC 可以提供更好的分离度和更短的运行时间。虽然 UHPLC 不能让科学家始终看到蛋白质之间的所有差异，但它可以让他们看到一些差异——例如，在大体形态、二硫化物异构体、脱氨基作用和蛋白质折叠方面。蛋白质研究人员使用不同的色谱模式来实现这一目标，例如反相色谱 ( RPC )、离子交换 色谱( IEX ) 和尺寸排阻 ( SEC ) 色谱。 为了成功分离出蛋白质的细微变化，可以通过仪器控制在储存和分离过程中具有生物相容性和准确的温度控制来保护脆弱的蛋白质样品免受外部因素的影响。许多蛋白质研究人员在质谱 ( MS ) 分析之前使用超高效液相色谱技术分离蛋白质。这可以很好地工作，具体取决于 UHPLC 分析的模式。 色谱填料改进的粒子技术也对提高蛋白质分析有着显著推进作用。传统上，UHPLC 对小分子的定义特征是直径小于 2 微米的全多孔颗粒柱。但是，这些对较大的蛋白质效果不佳，因为它们会导致背压增加、液相色谱柱堵塞和其他仪器维护问题。对于这个问题，改进的色谱填料采用核壳颗粒（也称为表面多孔、几何结构、融合核或混合颗粒）由被多孔外层包围的实心球形内层制成，可提高 UHPLC 的分离效率处理更大的蛋白质。 恒谱生USHA和USHB系列填料从1.8粒径到200、300甚至更大的粒径都具有很好的重现性、选择性和高分离度的优点。独有的键合方式，可实现百分百水相条件。不管是反相分析还是正相分析，都可以找到合适的色谱柱，能够高效分析维生、类固醇、蛋白质、单糖、多糖、氨基酸等多种物质。 UHPLC 的应用正在扩大，并且越来越多地包括生物治疗药物。核壳颗粒通常用于分离免疫球蛋白， IgG 疗法是当今蛋白质治疗工作的zui大份额。未来可能超高效液相色谱会在核壳颗粒以及研究和生物制药应用方面取得进一步的技术发展。作为化学和生物学的交叉点，用于蛋白质的 UHPLC 已准备好进入一系列有趣的应用领域。

张丽华　　申请发明专利50余项，其中30余项获得授权，7项获得实施转化，主持或参加的科研项目共20余项。作为国家重大科学研究计划的首席科学家，中国科学院大连化学物理研究所研究员张丽华是名副其实的高产“大户”。　　她带领课题组深耕“蛋白质定性和定量新方法和相关技术研究”，为发现与生命活动密切相关的重要蛋白质提供了关键技术支撑，并将发展的新材料、新方法应用于肝癌等重大疾病的研究。　　从蛋白质入手　　在如今这个“谈癌色变”的年代，每年中国有300万新增癌症患者，有220万人因癌症而死亡。国际癌症研究机构预计，至2030年中国每年癌症患者将达到500万人，因此而死亡的人数达到350万人。　　当前，癌症患者求医时大多处于中晚期，病人的存活率也十分堪忧。相比之下，很多早期癌症患者的治愈率在80%以上，“早发现、早治疗”是最行之有效的方法。　　然而，想要在癌症扩散前就作出准确诊断绝非易事。张丽华带领团队从蛋白质下手，捕捉着肿瘤高低转移细胞株中发生变化的蛋白质。作为生命活动的主要执行体，蛋白质承载着重要的信息，其种类繁多、无处不在——催化反应的酶、提供免疫的抗体、跨膜运输的载体统统都是蛋白质。　　“以肝癌高低转移细胞株为例，我们利用自己发展的规模化蛋白质定量分析技术，发现高转移细胞株与低转移细胞株之间有100多个蛋白质存在差异表达，其中就有促进和抑制肝癌转移的重要蛋白质。”张丽华说，“只要能调控这些蛋白质的表达，就有希望降低肿瘤细胞的侵润和转移能力，提高患者的生存力。我们将对其中一些重要的蛋白质进行大量临床样本的验证，期待能推出精准的检测试剂盒，有助于医生评估癌症的转移风险。”　　但看似简单的检测分析过程背后却充满了挑战，要想将这些与疾病发生发展密切相关的蛋白质从海量的蛋白质中筛选出来，定量的准确度和分析速度的快慢至关重要。　　建立分析新方法　　酶解是蛋白质组样品预处理中不可或缺的环节。传统在自由溶液中的酶解方法通常需要消耗十几个小时 不仅严重制约分析速度，而且离线的操作会影响定量结果的准确度。张丽华团队提出了扬长避短的解决之道——固定化酶 通过提高单位面积上酶的浓度，既能加快蛋白质的酶解，又能降低酶的自降解几率。　　固定化技术必须既让酶“死心塌地”，又不能让蛋白质“恋恋不舍”。为此，过去10年间，张丽华带领的团队没少在固载材料上花心思。“球形的、颗粒的、整体的̷̷各种各样的固载材料和修饰方式都进行了优化和选择。”她介绍道，从十几小时缩短到几秒，就像魔术师对酶施了魔力一样。这项技术通用性极强，不仅提高了蛋白质样品预处理的速度，还解决了国内外众多研究蛋白质的同行的“痛点”——实现与分离鉴定系统的在线联用，显著提高了蛋白质组样品的酶解效率和分析通量。　　此外，她带领的团队还取得了一批成果：研制出了新型蛋白质印迹材料、固定化金属亲和色谱材料等，将鉴定灵敏度提高了2～3个数量级 建立了基于质量亏损的准等重标记技术，以及集成化定量分析平台，将蛋白质组相对定量的偏差由40%～50%缩小为10%以内，提高了定量的准确度、精确度和通量。　　恩师的引领　　如今，张丽华谈起蛋白质来头头是道，谁又能想到她其实并没有生命科学的相关教育背景。张丽华读博士期间主攻环境小分子，是在导师张玉奎院士的建议下转向潜力巨大的生物分析领域的。“作为一种生物大分子，蛋白质的分离分析更具有挑战性。”她说。　　从儿时对科学懵懂的梦想，到真正走上科研的道路，张丽华遇到的每一位导师都将严谨的态度和创新的精神传授给她。在张丽华读博士期间，由于她所在的团队重新组建，在急需用人的情况下，导师张玉奎义无反顾地把她送到了国外，在德国DAAD资助下开展博士生联合培养研究，并随后让她继续在日本从事博士后研究。　　导师的胸怀，对学生的无私奉献，让张丽华深深感动。回国后，在对学生的培养过程中，她也希望能够秉承恩师的这种精神，给学生创造更好的机会，让他们具有更好的发展空间。　　中国科学院大连化学物理研究所、德国国家环境健康研究中心生态化学所、日本德岛大学药学院̷̷一路走来，有恩师们的指引和帮助，有团队成员和学生们的辛勤工作，有研究所创造的优异的科研环境，张丽华坦言自己是幸运的，只希望能在这条路上走得更扎实、更久更远。　　“现在我最大的业余爱好就是陪儿子。”张丽华笑称。她会在下班后尽早回家，陪儿子阅读和游戏。她希望在兼顾事业的同时，也能陪伴孩子一同成长。

所周知，细胞会自然衰老和死亡，但细胞蛋白质的适当调节对我们衰老时保持大脑健康至关重要。在神经退行性疾病中，蛋白质聚集体（或错误折叠蛋白质的团块碎片）扩散到邻近的细胞，但对这些有毒物质是如何转移的科学家们仍然知之甚少。　　近日，发表在《美国国家科学院院刊（PNAS）》上的一项研究中，来自美国罗格斯大学新布伦瑞克分校的研究人员首次从分子水平上了解了在阿尔茨海默症和帕金森病等神经退行性疾病模型中，有毒蛋白质是如何调控的。在这项研究中，研究人员对秀丽隐杆线虫模型进行了研究，线虫受到压力的神经细胞可以将神经毒性蛋白质以囊泡的形式挤压出来，这些囊泡被称为exoophers。研究人员还研究了特定的压力如何影响exoophers被挤压出来。他们发现，形成exoophers需要特定的细胞信号，而出人意料的是，禁食可以显著增加exoophers的产生。此外，这项研究还发现了三种在禁食期间增加exoophers产生的细胞途径。　　该研究第一作者、罗格斯大学新布伦瑞克分校分子生物学和生物化学系博士后研究员Jason Cooper说“在神经退行性疾病中，有毒蛋白质会扩散到邻近细胞以促进细胞死亡。鉴于在衰老和神经退行性疾病中管理蛋白质聚集体的重要性以及对这些聚集体如何转移的生物学知之甚少，对转移机制的详细了解可能会揭示以前的未被识别的治疗靶点”。 　　论文链接：　　https://www.pnas.org/content/118/36/e2101410118

大家好，本周为大家分享一篇2023年发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，μMap Photoproximity Labeling Enables Small Molecule Binding Site Mapping1。该文章的通讯作者是来自美国普林斯顿大学化学系的David W. C. MacMillan教授。　　目前，药物发现主要分为两种方式：基于靶点的药物研发(Target-based drug discovery，TDD)和基于表型的药物筛选(Phenotypic drug discovery, PDD)。表型筛选主要是在细胞或动物水平开展实验，因此蛋白靶点以及蛋白-配体结合模式一开始就是未知的，如何在确定活性分子后快速地找到其作用通路、靶点、结合位点、结合模式(正构/别构)一直以来都是众多研究员所关心的问题。常规的蛋白质组学差异性分析能够帮助我们快速确认作用通路、发现潜在靶点，但却缺少更精细的结构信息。光亲和标记(Photoaffinity Labeling)能够有效地补充这方面的信息，将PAL探针靶向交联至靶蛋白结合口袋，再利用LC-MS去寻找标记位点或肽段，从而提供肽段或残基分辨率的结合位点信息。然而，由于PAL探针与蛋白是按照一定的化学计量比进行结合的，所以产生的标记信号和序列覆盖都非常有限。除此之外，每个PAL探针都有不同的二级碎裂模式，使质谱分析复杂化。基于此，David W. C. MacMillan团队开发了一种稳健且通用的光催化标记方法来定位蛋白结合位点。　　如图1B所示,活性分子上连接有具有光催化功能的标签(Catalytic tagging)，本文使用的是铱光催化剂。活性分子-铱光催化剂偶联物能够靶向至蛋白的结合口袋，在可见光的照射下，铱通过能量转移的方式催化附近的双吖丙啶探针生成卡宾自由基，卡宾自由基能够与邻近的氨基酸残基发生反应，从而实现结合口袋的邻位标记。值得一提的是，这种独特的μMap光催化临近标记法将靶向定位和邻近标记分配给不同的分子去完成，邻位标记不受限于靶向定位所需要满足的化学计量比的要求，可实现多个邻近位点的标记，具有信号放大的效果。此外，所有活性分子-铱光催化剂偶联物都可以配合使用统一的邻位标记探针，具有一致二级碎裂模式，有助于简化后续LC-MS数据分析。　　图1 μMap光催化邻近标记法原理　　为了确认该方法的选择性标记能力，作者以牛碳酸酐酶(CA)为例，探究磺胺类抑制剂-铱催化剂偶联物(图2A sulfonamide-Ir (1))能否触发CA上邻近结合位点的选择性标记。将CA与BSA蛋白按照1：1混合，向中加入sulfonamide-Ir，随后加入带有生物素标签的邻位标记探针(图2A Diazirine-PEG3-biotin(2))，根据Western blot的结果可知(图2B)，sulfonamide-Ir (1)的加入触发了CA上的选择性标记，相比于未开启光照以及直接加入free-Ir的两组样品，加入sulfonamide-Ir的样品中CA条带明显变深，说明此条件下，CA上有较多的带有生物素标签的标记位点。随后，作者对样品进行柱上酶切，利用LC-MS鉴定标记肽段、定位标记位点(图2C-E)。值得注意的是，为了获得高置信度的标记残基信息，作者将free-Ir设置为对照组，通过统计sulfonamide-Ir组与free-Ir组中同一标记肽段信号强度的倍差变化(fold change)以及显著性差异分析，筛选出最可靠的标记位点。此次实验结果显示，邻近标记位点为Q135和H2，将其映射至CA的晶体结构上可知两个位点距离磺胺类小分子与CA的结合位点分别17和11Å，说明μMap光催化临近标记法在小分子结合位点的鉴定上是准确且可靠的。　　图2 μMap光催化邻近标记法用于sulfonamide-CA结合位点的表征。为了展现μMap光催化临近标记法的普适性。作者将该方法应用到了其它一些蛋白-配体复合物模型上，如:(+)-JQ-1与BRD4(图3A)、dasatinib与BTK(图3B)、AT7519与CDK2(图3C)和lenalidomide与CRBN(图3D)，以上实验均获得符合预期的结果。此外，作者还将μMap光催化临近标记法应用到了分子胶rapamycin介导的FKBP12-rapamycin-mTOR蛋白复合物结合界面的表征，展现了该方法“穿越空间”的结构表征能力，从蛋白FKBP12与小分子rapamycin互作到小分子rapamycin与蛋白mTOR的互作，描绘了整个结合界面的轮廓(图3E)。　　图3 μMap光催化邻近标记法用于A)(+)-JQ-1与BRD4 B)dasatinib与BTK C)AT7519与CDK2 D)lenalidomide与CRBN E)FKBP12-rapamycin-mTOR蛋白复合物结合位点的鉴定。　　以上均是在已知结合位点的蛋白-配体模型中开展的方法学验证实验，后续作者还将μMap光催化临近标记法应用到难成药靶点STAT3。MM-206是STAT3的小分子抑制剂，在临床前疾病模型研究中显示出较好的抗STAT3活性，但到目前为止还没有STAT3与MM-206结合的晶体结构报道，也没有关于MM-206与STAT3结合位点的信息。在本文中，μMap光催化临近标记的结果显示MM-206主要是结合在STAT3的CCD结构域上，大致在Q198和V291位点附近，属于一种变构调节剂(图4A-B)。最后，作者进一步探究了μMap光催化临近标记法在活细胞水平上的标记能力。如图C-E,使用μMap光催化临近标记法成功找到了(+)-JQ-1的结合蛋白：BRD2、BRD3及BRD4，并定位到了(+)-JQ-1与BRD4结合位点，大致在V90、K91、W81氨基酸残基附近。　　图4 μMap光催化邻近标记法用于A-B)MM-206与难成药靶点STAT3结合位点的鉴定 C-E)组学样品中小分子(+)-JQ-1结合蛋白的鉴定及结合位点的锁定。　　总之，本文开发了一种通过标记近端残基来绘制小分子结合位点的通用方法。该方法已被证明适用于一系列小分子配体-蛋白质、多蛋白质复合物和“不可成药”的靶点蛋白的互作表征，从单一蛋白到组学层面均展现出良好的应用前景。　　撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：μMap Photoproximity Labeling Enables Small Molecule Binding Site Mapping　　参考文献　　Huth SW, Oakley JV, Seath CP, et al. μMap Photoproximity Labeling Enables Small Molecule Binding Site Mapping. J Am Chem Soc. 2023 145(30):16289-16296.

蛋白质是复杂的含氮有机化合物,分子量很大,大部分高达数万至数百万,分子的长链从数纳米至100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合,并具有一定的空间结构,所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有P、Cu、Fe、I等元素,但氮的相对丰度基本稳定,是区别于其它有机化合物的主要标志。不同蛋白质的氨基酸构成比例及方式不同,所以各种蛋白质其含氮量也不同。一般蛋白质含氮量平均为16%,即1份氮素相当于6.25份蛋白质,此即蛋白质系数。 意大利VELP凯氏定氮仪在环保节能方面具有性能， 的蒸汽发生器和钛冷凝器，蒸馏滴定同步进行，分析速度快，冷却水用量仅0.5升/分钟，降低能耗从而节约了成本。因此该仪器被广泛应用于各类蛋白质检测的实验研究。 测定脱脂奶粉中蛋白质的含量，对掌握其营养价值和品质的变化，保障人体健康，合理配料，为乳制品深加工提供数据十分重要，此外，蛋白质分解产物对乳制品的色、香、味都有一定作用，所以测定具有深远意义。

p　　用于生物样品分析的蛋白指纹法，该专利技术被国际顶级科学杂志《科学》以及医学界权威杂志《柳叶刀》评为世界蛋白指纹图谱和蛋白质芯片排名第一的技术。针对这项技术的一些问题，火石创造对许洋博士进行了深度的专访。/pp style="text-align: center "img width="300" height="385" title="001.png" style="width: 300px height: 385px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/ebf3be8e-c0c2-49d6-9891-a76d207d183f.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "strong　　许洋博士/strong/pp　　许洋博士一直致力于蛋白质组学研究开发，怀揣近五十项蛋白分子质谱诊断技术的自主发明专利。2009年他创办了湖州赛尔迪生物医药科技有限公司，凭借专利产品蛋白指纹图谱仪成为行业领头羊，也成为此类器械行业标准的起草者。/ppstrong　　火石：请问您为什么做蛋白质谱?/strong/pp　　许洋博士：我研究蛋白质谱是偶然也是必然。在美国纽约著名的Sloan-Kettering研究所单克隆抗体实验室早期研究治疗白血病时，我们制造了全世界第一枚人源化单克隆抗体(抗CD33人源化单抗)。后来我又和顶尖美国公司合作第一个将人源化单克隆抗体做成了靶向药。有了扎实的基础，必然能在更窄的蛋白质谱领域做的更好。/pp　strong　火石：蛋白质谱当前的临床应用情况如何?/strong/pp　　许洋博士：只有拿到医疗器械注册证才算进入临床，蛋白质谱目前只有三种临床应用：对肿瘤的筛查 对早期肾脏疾病的分析 在细菌上的鉴定应用。蛋白质谱在国内仍处于非常早期的阶段，且具有垄断性，极少人能做且在做。/ppstrong　　火石：作为国家“千人计划”医疗器械特聘专家，您认为蛋白指纹图谱仪在医疗器械中的角色是什么?/strong/pp　　许洋博士：蛋白指纹图谱仪分析的大数据可以生动地比喻为人体疾病的健康地图。/pp　　蛋白指纹究竟是什么?把质谱仪的显示屏中的每一个蛋白质都用一个分子量来表达，这些分子量组合起来就叫蛋白指纹。就像每个人的指纹都是不同的，每种疾病的特定蛋白质表达物也不同，称之为指纹图谱。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器——表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征。这种方法具有微量、精确、简易、快速的特点，适应于基础和临床等各个领域。/pp　　之所以将蛋白指纹图谱仪分析的大数据比喻为人体疾病的健康地图(MAP)，是因为既然β2—微球蛋白是11731、人绒毛膜促性腺激素是37580、转甲状腺素蛋白是13761(数字对于计算机的应用更好管理)，而每个蛋白质在质谱仪分析中都是数字，它本身就是大数据。任何物质在质谱底下都是数字，综合起来就是大数据。我把大数据串联起来，就能将分子在身体的MAP做出来。譬如一位吸烟的男士来体检，能发现他吸了烟数年之后肺部出现影像学病理性位点，结合质谱仪分析发现相关的疾病标志物，我们能够模拟出肺部疾病的健康地图，即通过质谱仪检测的健康大数据，可以模拟出该患者肺部出现了数个小红点，点击每个红点后都会解释原因，如显示铅、铬等数据是否超标，以及告诉你相应的对策。这样的技术开启了全智能健康4.0时代。/pp　　Tips：β2—微球蛋白(β2—MG)被认为是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要参考价值，因此β2—微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。/pp　　strong火石：您和您的团队在蛋白质组学研究的技术或者方法上有什么突破吗?/strong/pp　　许洋博士：蛋白质作为标志物对肿瘤的诊断，确实没有太大的进展。/pp　　一直以来蛋白质组学研究面临的重大瓶颈是蛋白质分离问题：人体内有十万种蛋白质与衍生物，多数可能与疾病有关联，但这十万种蛋白质与衍生物只有分开后，质谱才能分析清楚。此前蛋白质组学技术中最流行、最通用的蛋白质分离方法是双向电泳，基本上能分离近二千种血浆蛋白质，远远不及十万种，所以成为了瓶颈。/pp　　2006年我提出了一个设想：和蛋白有关的抗体至少有一万多种，那为什么不用抗体来分离蛋白质?这件事一直有人在做，但之前都没有人想到用抗体组把一千个蛋白质一次性快速、实时地分离出来。之后就诞生了免疫质谱分析方法(专利号ZL 200610140652.0)，可以在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析，还可以同时检测多个生物标志群。用免疫组质谱技术能测定抗原变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。/pp　　Tips:免疫质谱分析方法：质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。/pp　　双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)：是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。目前是快速成长的蛋白质组学技术中最流行最通用的蛋白质分离方法。目前2D-PAGE能够在同一块凝胶上同步检测和定量数千个蛋白质。/pp　　从整个2015年的政策看，医疗器械行业是受到国家大力扶持的，行业地位与重要性大幅提升，法规向国际化看齐，行业监管不断趋严，医疗器械正成为与药物齐头并进的新兴产业。/pp　　strong火石：是什么驱动着行业的高增长?/strong/pp　　许洋博士：一是需求，老龄化加剧，家庭支付能力增强，导致医疗需求高增长 二是政府加大医疗卫生投入，《医疗器械科技产业“十二五”专项规划》表示，“十二五”期间将扶植形成8～10家产值超过50亿元的大型医疗器械产业集团 三是为配合新医改完善基层医疗建设的目标 四是国内生物技术研发应用进入突破期。/pp　　strong火石：您认为接下来医疗器械未来发展的特点和前景会是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：未来5年，医疗器械和制药占比将会达到1:1。近十年，我国医疗器械市场规模快速增长，国内医疗器械工业总产值从2003年的189亿人民币上升到2013年的1889亿，2013年同比增长21%，增长速度远快于药品。预计在未来5年左右，我国医疗器械行业仍然将保持高速增长。医疗器械行业涉及到医药、机械、电子、塑料等多个行业，中高端医疗器械更是多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，研发成本高，决定了只有大型厂商才能在大中型医疗器械方面有所作为。此外，器械“国产化”也会成为必然趋势。/pp　　strong火石：赛尔迪当前开展的业务、研发的产品有哪些?公司部署战略是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：我们现在正在做一张人类的大健康MAP。通过精准医疗计划，基于环境健康大数据，通过蛋白指纹图谱仪完成健康管理。现在的疾病市场最关注的问题分别是：检测0～6岁儿童智力、优生优育(为什么生不出聪明宝宝)、高达5千万的肿瘤人群以及3.5亿的高血压、糖尿病人群。/pp　　其中糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的并发症之一，是糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常那个渐进性肾功能损害。而微量白蛋白尿即早期糖尿病肾病是可逆的，这不同于大量白蛋白尿即临床糖尿病肾病，因此积极防治早期糖尿病肾病就显得尤为重要。去年底，赛尔迪公司与中国医学科学院北京协和医院签署协议，承担国家对糖尿病肾病体内铅、镉毒素的临床大样本检测。全新升级的蛋白指纹图谱仪，是目前唯一获国家药监局批准、能检测含微量白蛋白、β2—微球蛋白以及泛素3项指标的医疗器械。这对糖尿病肾病的早发现、早治疗具有重大意义。/pp　　赛尔迪接下来将按照个体化精准检测所附带的信息，由这些信息与大数据库交流，提出符合个体化治疗的方案，向个体化精准医学管理方式转变。/pp　　随着大数据时代的来临，“互联网+”概念的提出让医疗健康事业呈现出了新的发展势态和特征。医学知识体系正被大数据、精准医疗所重构，信息化进程提高了知识传递速度与医疗协同效率。/ppstrong　　火石：蛋白质组学技术如何助推精准医疗?/strong/pp　　许洋博士：常识知道铅、镉会引起糖尿病性肾病。但铅、镉指标不是医院常规检测的项目。如果采取个体化精准治疗，每年常规检查一次体内铅与镉的指标，发现异常就能进行针对性的从尿液排泄的治疗。已经得了肾病正在透析的病人，检测铅与镉指标后进行针对性排泄也会增强治疗效果。利用蛋白指纹图谱仪能够发现早期的肿瘤和心血管标志物，这就会对疾病的治疗带来极大的希望。随着质谱技术在精准医疗的应用，越来越多的个体化标志物将会被发现，人体的蛋白指纹图谱测定将会成为医院的常规工作。/pp　　精准医疗，即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。正确的选中一个工具，解决关键问题，这就是精准医疗。基于基因组测序技术、生物医学工具以及大数据工具逐步成熟和完善，精准医疗能够为个体基因特征、环境以及生活习惯进行疾病干预及治疗，但如何尽快与大数据结合才是发展重点。日前我与北京协和医院合作，创立了中国特色的首个百万人疾病与环境毒素数据库与IMS(爱睦世)特检中心：HZIMS2008，首次在复杂疾病系统中构建了基于环境毒素大数据的移动网络数据库的质量控制体系，使我国重大疾病，如高血压、糖尿病、肿瘤的大数据病因学研究处于世界领先。/pp/p

几种不同折叠模式的蛋白质模型(图片来源Protein Data Bank Japan )　　上个世纪初，科学家们认为蛋白质是生命体的遗传物质，而具有独特的作用。随着这个理论被证伪，真正的遗传物质DNA的结构被给予了很大关注。然而，蛋白质作为生命体的重要大分子，其重要性也从未被忽视，而且在1950年代开始，科学家一直在探寻DNA序列和蛋白质序列的相关性。与此同时，蛋白质测序和结构解析蛋白质结构的努力开始慢慢获得回报。更多的生化研究揭示了蛋白质的功能重要性，因此蛋白质的三维结构的解析对于深入理解蛋白质功能和生理现象起着决定性作用。　　本文简要回顾了蛋白质结构解析的重大历史事件，并总结了蛋白质结构解析的常用方法和结构分析方向。通过了解蛋白质结构，能够让我们更好地理解生物体的蛋白的理化特性，以及其相关联的化学反应途径及其机制，对于我们认识生物世界和研发治疗方法和药物都起着关键作用。在即将召开的2015高分辨率成像与生物医学应用研讨会上，各位专家学者将会进一步讨论相关议题。　　蛋白质结构解析六十年来大事件　　在1958年，英国科学家John Kendrew和Max Perutz首先发表了用X射线衍射得到的高分辨率的肌红蛋白Myoglobin的三维结构，然后是更加复杂的血红蛋白Hemoglobin。因此，这两个科学家分享了1962年的诺贝尔化学奖。事实上，这项工作在早在1937年就开始了。　　然后在1960年代，蛋白质结构解析方法不断进步，获得了更高的解析精度。这个时期，蛋白质序列和DNA序列间关系也被发现，中心法则被Francis Crick提出，然后科学界见证了分子生物学的崛起。分子生物学(Molecular Biology)的名称在1962年开始被广泛接受和使用，并逐渐演变出一些支派，如结构生物学。然后在1964年，Aaron Klug提出了一种基于X射线衍射原理发展而来的全新的方法电子晶体学显微镜(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白质或者蛋白质核酸复合体结构。因为这项研究，他获得了1982诺贝尔化学奖。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射来确定大分子中固定位置的氢原子坐标。　　进入1970年代，很多新的方法开始发展。存储蛋白质三维结构的Protein Data Bank(1971年) 开始出现，这对于规范化和积累蛋白质数据有着重要意义。1975年新的一种仪器叫做多丝区域检测器，让X-ray的检测和数据收集更加快速高效。次年，Robert Langride将X-ray衍射数据可视化，并在加州大学圣地亚哥分校成立了一个计算机图形实验室。同年，KeithHodgson和同事首次证明了可以使用同步加速器获得的X射线并对单个晶体进行照射，并取得了很好的实验效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白质结构的解析 同年首个高精度病毒(西红柿丛矮病毒)衣壳蛋白结构被解析。　　在1980年代，更多蛋白质结构被解析，蛋白质三维结构的描述越来越成熟，而且蛋白质结构解析也被公认成为药物研发的关键步骤。在1983年，冷冻蚀刻的烟草花叶病毒结构在电子显微镜结构下得到描述。两年后德国科学家John Deisenhofer等解析出了细菌光合反应中心，因此他们共享了1988年的诺贝尔化学奖。次年，两个课题组解析了HIV与复制相关的蛋白酶结构，对针对HIV的药物研发提供了理论基础。　　下一个十年，因为大量同步加速器辅助的X射线衍射的使用，数千个蛋白质结构得到解析，迎来了蛋白质结构组的曙光。1990年多波长反常散射方法(MAD)方法用于X射线衍射晶体成像，与同步辐射加速器一起，成为了近二十多年来的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年发表了第一个高精度的钾离子通道蛋白结构，对加深神经科学的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的诺贝尔化学奖。Ada Yonath等领导的课题组在1999年首次解析了核糖体结构(一种巨大的RNA蛋白质复合体)。　　进入新千年，更多的技术细节被加入到蛋白质解析研究领域。2001年，Roger Kornberg和同事们描述了第一个高精度的RNA聚合酶三维结构，正因此五年后他们共享了诺贝尔化学奖。2007年，首个G蛋白偶联受体结构的解析更是对药物研究带了新的希望。近些年来，越来越多的大的蛋白质结构得到解析。Cryo-EM超低温电子显微镜成像用于超大蛋白质结构成像的研究日益成熟，并开始广泛用于蛋白质结构的解析。　　蛋白质结构解析的常用实验方法　　1.X-ray衍射晶体学成像　　X射线衍射晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。X射线是一种高能短波长的电磁波(本质上属于光子束)，被德国科学家伦琴发现，故又被称为伦琴射线。理论和实验都证明了，当X射线打击在分子晶体颗粒上的时候，X射线会发生衍射效应，通过探测器收集这些衍射信号，可以了解晶体中电子密度的分布，再据此析获得粒子的位置信息。利用这种特点，布拉格父子研制出了X射线分光计并测定了一些盐晶体的结构和金刚石结构。首个DNA结构的解析便是利用X射线衍射晶体学获得的。　　后来，获得X射线来源的技术得到了改进，如今更多地使用同步辐射的X射线源。来自同步辐射的X射线源可以调节射线的波长和很高的亮度，结合多波长反常散射技术，可以获得更高精度的晶体结构数据，也成为了当今主流的X射线晶体成像学方法。由X射线衍射晶体学解析的结构在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。　　X射线衍射成像虽然得到了长足的发展，仍然有着一定的缺点。X射线对晶体样本有着很大的损伤，因此常用低温液氮环境来保护生物大分子晶体，但是这种情况下的晶体周围环境非常恶劣，可能会对晶体产生不良影响。而且，X射线衍射方法不能用来解析较大的蛋白质。　　上海同步辐射加速器外景(图片来源 上海同步辐射光源网站)　　2.NMR核磁共振成像　　核磁共振成像NMR全称Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年诺贝尔奖)描述，在上世纪的后半叶得到了长足发展。其基本理论是，带有孤对电子的原子核(自选量子数为1)在外界磁场影响下，会导致原子核的能级发生塞曼分裂，吸收并释放电磁辐射，即产生共振频谱。这种共振电磁辐射的频率与所处磁场强度成一定比例。利用这种特性，通过分析特定原子释放的电磁辐射结合外加磁场分别，可以用于生物大分子的成像或者其他领域的成像。有些时候，NMR也可以结合其他的实验方法，比如液相色谱或者质谱等。　　RCSB Protein Data Bank数据库中存在大约11000个用NMR解析的生物大分子结构，占到总数大约10%的结构。NMR结构解析多是在溶液状态下的蛋白质结构，一般认为比起晶体结构能够描述生物大分子在细胞内真实结构。而且，NMR结构解析能够获得氢原子的结构位置。然而，NMR也并非万能，有时候也会因为蛋白质在溶液中结构不稳定能难得获取稳定的信号，因此，往往借助计算机建模或者其他方法完善结构解析流程。　　使用NMR解析的血红蛋白结构建模(图片来源RCSB PDB)　　3.Cryo-EM超低温电子显微镜成像　　电子显微镜最早出现在1931年，从设计之初就是为了试图获得高分辨率的病毒图像。通过电子束打击样本获得电子的反射而获取样本的图像。而图像的分辨率与电子束的速度和入射角度相关。通过加速的电子束照射特殊处理过的样品表明，电子束反射，并被探测器接收，并成像从而获得图像信息。具体做法是，将样品迅速至于超低温(液氮环境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于样品池，在电子显微镜下成像。图像获得后，通过分析图像中数量众多的同一种蛋白质在不同角度的形状，进行多次的计算机建模从而可以获得近原子级别的精度(最低可以到2.0埃)。　　Cyro-EM解析TRPV1离子通道蛋白(图片来源Structure of the TRPV1 ion channel )　　将电子显微镜和计算机建模成像结合在一起的大量实践还是在新世纪之后开始流行的。随着捕捉电子的探测器技术(CCD技术，以及后来的高精度电子捕捉、电子计数electron counting设备)的提升，更多的信息和更低的噪音保证了高分辨率的图像。　　近些年来，Cryo-EM被用来解析很多结构非常大(无法用X-ray解析)的蛋白质(或者蛋白质复合体)，取得了非常好的结果。同时，单电子捕捉技术取代之前的光电转换成像的CCD摄像设备，减少了图像中的噪音和信号衰减，同时并增强了信号。计算机成像技术的成熟和进步，也赋予了Cryo-EM更多的进步空间。然而，Cyro-EM与X-ray不同，该方法不需要蛋白质成为晶体，相同的是都需要低温环境来减少粒子束对样品的损害。　　除去介绍的这三种方法以外，计算机建模技术也越来越多地被用在了蛋白质结构解析中。而且新解析的结构也会提高计算机建模的精确度。未来，我们或许能够用计算机构建原子级别的细胞模型，构建在芯片上的细胞。　　蛋白质结构对了解生命体的生化反应、有针对性的药物研发有着重要意义。从1958到如今已经接近60年，蛋白质结构解析得到了较快的发展。然而，在如今DNA测序如此高效廉价的时代，蛋白质和DNA结构解析并没有进入真正高速发展阶段，这也导致了在如此多的DNA序列数据非常的今天，结构数据却相对少的可怜。大数据时代的基因组、蛋白质组、代谢组、脂类组等飞速发展的时候，蛋白质结构组也得到了更加广泛的重视。发展高精度、高效的结构解析技术也一直都有着重要意义。未来，蛋白质结构解析，对针对蛋白质的药物筛选，和计算机辅助的药物研究研究不应被低估。未来说不定在蛋白质结构领域有着更多惊喜，让我们拭目以待。 第一届电镜网络会议部分视频回放

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

《自然》选出将在未来一年对科学产生巨大影响的工具和技术。从蛋白质测序到电子显微镜，从考古学到天文学，本文将讲述七项有可能会在未来一年震动科学界的技术。　　单分子蛋白质测序　　蛋白质组体现了细胞或生物体制造的一整套蛋白质，可以提供关于健康和疾病的深入信息，但对蛋白质组的表征仍然是一项挑战性的工作。　　相对于核酸来说，蛋白质是由更多的分子砌块(building blocks)组成的，约有20种天然存在的氨基酸(相比之下，组成DNA和信使RNA等分子的只有4种核苷酸) 因此，蛋白质具有更大的化学多样性。有些蛋白质在细胞中的含量较少 并且与核酸不同，蛋白质不能被扩增 ——这意味着蛋白质分析方法必须使用任何能用的材料。　　大多数蛋白质组学分析使用质谱法，这是一种根据蛋白质的质量和电荷来分析蛋白质混合物的技术。这些谱图可以同时量化数千种蛋白质，但检测到的分子并不总能明确识别，并且混合物中的低丰度蛋白质常常被忽视。现在，能对样本中的许多(甚至全部)蛋白质进行测序的单分子技术可能即将问世，其中许多技术类似于用于DNA的技术。　　德克萨斯大学奥斯汀分校的生物化学家Edward Marcotte正在研究一种这样的技术，称为荧光测序(fluorosequencing)[1]。Marcotte的技术报道于2018年，该技术基于一种逐步的化学过程，在此过程中，单个氨基酸被荧光标记，然后从表面偶联蛋白的末端逐个被剪切下来，此时摄像机会捕捉到所产生的荧光信号。Marcotte解释道：“我们可以用不同的荧光染料标记蛋白质，然后在切割时逐个分子地观察。”去年，位于康涅狄格州的生物技术公司Quantum Si的研究人员描述了一种荧光测序的替代方法，该方法使用荧光标记的“粘合剂”蛋白来识别蛋白质末端的特定氨基酸(或多肽)序列[2]。　　其他研究人员正在开发模仿基于纳米孔的DNA测序技术，根据多肽通过微小通道时引起的电流变化来分析多肽。荷兰代尔夫特理工大学的生物物理学家Cees Dekker及其同事于2021年展示了这样一种方法，他们利用蛋白质制成纳米孔，并能够区分通过纳米孔的多肽中的单个氨基酸[3]。在以色列理工学院，生物医学工程师Amit Meller的团队正在研究由硅基材料制成的固态纳米孔器件，该器件可以同时对许多不同的蛋白质分子进行高通量分析。他说：“你可能可以同时观察数万甚至数百万个纳米孔。”　　尽管目前单分子蛋白质测序只是概念上的验证，但其商业化正在迅速推进。例如，Quantum Si公司已宣布计划今年推出第一代仪器，并且Meller指出，2022年11月在代尔夫特举行的蛋白质测序会议上有一个专门针对该领域初创企业的讨论组。他说：“这让我想起了第二代DNA测序技术面世前的那些日子。”　　Marcotte是德克萨斯州奥斯汀市蛋白质测序公司Erisyon的联合创始人，他对此持乐观态度。他说：“这已经不是个行不行的问题，而是这项技术几时能送到人们手上。”　　詹姆斯韦勃太空望远镜　　天文学家们从去年开始就翘首以盼，兴奋不已。经过20多年的精心设计和建造，美国国家航空航天局(NASA)与欧洲航天局和加拿大航天局合作，于2021年12月25日成功将詹姆斯韦布太空望远镜(James Webb Space Telescope，缩写JWST)送入轨道。因为仪器设备需要展开并确定第一轮观测的位置，全世界不得不等待了近七个月，JWST才开始正常工作。　　等待是值得的。马里兰州巴尔的摩市太空望远镜科学研究所天文学家、JWST的望远镜科学家Matt Mountain表示，最初传来的图像超出了他的最高预期。“实际上天空并不空旷——到处都是星系，”他说，“理论上我们知道这一点，但真正看到这一景象带来了别样的情感冲击。”　　詹姆斯韦布太空望远镜(James Webb Space Telescope)的6.5米主镜片(图中展示了18片镜片中的6片)可以探测数十亿光年外的物体。资料来源：NASA/MSFC/David Higginbotham　　JWST的设计是为了接替哈勃太空望远镜的工作。哈勃望远镜可以看到令人惊叹的宇宙景象，但也有盲点：它基本上无法看见在红外范围内具有光信号的古老恒星和星系。要弥补这一点，需要一台高灵敏度的仪器，其灵敏度要能够探测到数十亿光年外发出的极为微弱的红外信号。　　JWST的最终设计包括18个完全光滑的铍质镜片阵列，当其完全展开时，直径为6.5米。Mountain说，这些反射镜的设计非常精密，“要是把一块镜面等比放大到美国那么大，上面的隆起也不超过几英寸(高)。”这些反射镜配有最先进的近红外和中红外探测器。　　这一设计使JWST能够填补哈勃望远镜的空白，包括捕获来自一个有135亿年历史的星系发出的信号，该星系产生了宇宙中最早的一些氧和氖原子。JWST也带来了一些惊喜，例如，它能够测量某些类型的系外行星的大气组成。　　世界各地的研究人员都在排队等待观察时间。英国卡迪夫大学的天体物理学家Mikako Matsuura正在用JWST进行两项研究，调查宇宙尘埃的产生和破坏，这些尘埃可能会导致恒星和行星的形成。Matsuura说，与她所在小组过去使用的望远镜相比，“JWST拥有完全不同的灵敏度和清晰度等级”。她说：“我们看到了这些天体内部正在发生的完全不同的现象——这真令人叹为观止。”　　体积电子显微镜　　电子显微镜(Electron microscopy，EM)以其卓越的分辨率而闻名，但观察的主要是样本的表面。深入研究样本的内部需要将样本切成非常薄的切片，这对于生物学家来说往往不够。伦敦弗朗西斯克里克研究所(Francis Crick Institute)的电子显微镜学家Lucy Collinson解释说，仅覆盖单个细胞的体积就需要200个切片。她说：“如果你只有一个[切片]，你就是在玩统计把戏。”　　现在，研究人员正在将EM的分辨率应用于包含多个立方毫米体积的3D组织样本上。　　此前，从2D的EM图像重建这样体积的样本(例如，绘制大脑的神经连接图)需要经历艰苦的样本准备、成像和计算过程，才能将这些图像转换为多图像堆叠。现在，最新的“体积电子显微镜”技术大大简化了这一过程。　　这些技术有各种优点和局限性。连续切面成像(Serial block-face imaging)是一种相对快速的方法，它使用金刚石刀片在树脂包埋样品上切下一系列薄片，并进行成像，可以处理约1立方毫米大小的样品。然而，它的深度分辨率较差，这意味着生成的体积重建将相对模糊。聚焦离子束扫描电子显微镜(Focused ion beam scanning electron microscopy，FIB-SEM)能制备更薄的薄片样品，因此深度分辨率更高，但更适用于体积较小的样品。　　Collinson将体积电子显微镜的兴起描述为一场“安静的革命”，因为研究人员专注于用这种方法得到的结果，而不是生成这些结果的技术。但这正在改变。例如，2021年，弗吉尼亚州珍利亚研究园区(Janelia Research Campus)从事电子显微镜中细胞器分割(Cell Organelle Segmentation in Electron Microscopy，COSEM)计划的研究人员在《自然》上发表了两篇论文，聚焦了在绘制细胞内部结构方面取得的重大进展[4,5]。“这是一个绝佳的原理论证。”Collinson说。　　COSEM研究计划使用精密的定制FIB-SEM显微镜，在保持良好空间分辨率的同时，可将单个实验中可成像的体积增加约200倍。将这些仪器与深度学习算法结合使用，该团队能够在各种细胞类型的完整3D体积中定义各种细胞器和其他亚细胞结构。　　这种样品制备方法费力且难以掌握，并且由此产生的数据集非常庞大。但这一努力是值得的：Collinson已经看到了该技术在传染病研究和癌症生物学方面产生的见解。她现在正在与同事们合作，探索以高分辨率重建整个小鼠大脑的可行性。她预计这项工作将需要十多年的时间，花费数十亿美元，并产生5亿GB左右的数据。她说：“这可能与绘制第一个人类基因组工作的数据量在一个数量级。”　　CRISPR无限可能　　基因组编辑工具CRISPR–Cas9作为在整个基因组的目标位点引入特定变化的首选方法，在基因治疗、疾病建模和其他研究领域取得了突破，无可非议地享有盛誉。但它的用途多受限制。现在，研究人员正在寻找规避这些限制的方法。　　CRISPR编辑由短链向导RNA(short guide RNA，sgRNA)协调，sgRNA将相关的Cas核酸酶导向其目标基因组序列。但这种酶发挥作用还需要在靶点附近有一种叫做原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)的序列 如果没有PAM，基因编辑很可能会失败。　　在波士顿的马萨诸塞州总医院，基因组工程师Benjamin Kleinstover利用蛋白质工程技术，从化脓性链球菌中制造出常用Cas9酶的“近乎不受PAM序列限制的(near-PAMless)”Cas变体。一个Cas变体需要由三个连续核苷酸碱基组成的PAM，其中腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)核苷酸位于中间位置[6]。“这些酶现在几乎可以读取整个基因组，而传统的CRISPR酶只读取1%到10%的基因组。”Kleinstover说。　　这种对PAM序列不太严格的要求，增加了编辑“脱靶”的机会，但进一步的蛋白质工程设计可以提高其特异性。作为一种替代方法，Kleinstiver的团队正在设计和测试大量Cas9变体，每个变体对不同的PAM序列表现出高度的特异性。　　还有许多天然存在的Cas变体有待发现。自然条件下，CRISPR–Cas9系统是一种针对病毒感染的细菌防御机制，不同的微生物进化出了具有不同PAM序列偏好的各种酶。意大利特伦托大学的病毒学家Anna Cereseto和微生物组研究人员Nicola Segata梳理了100多万个微生物基因组，鉴定和表征了一组多样的Cas9变体，他们估计这些变体可能总共可以针对98%以上的已知人类致病突变[7]。　　然而，其中只有少数能在哺乳动物细胞中发挥作用。Cereseto说：“我们的想法是测试许多种酶，看看是什么决定因素使这些酶正常工作。”从这些天然酶库和高通量蛋白质工程工作中获得的见解来看，Kleinstiver说，“我认为我们最终会有一个相当完整的编辑工具箱，能让我们编辑任何我们想要的碱基。”　　高精度放射性碳测年　　去年，考古学家利用放射性碳测年技术的进步，对维京探险家首次抵达美洲的确切年份——甚至是季节——进行了研究。荷兰格罗宁根大学的同位素分析专家Michael Dee和他的博士后Margot Kuitems带领的一个团队在加拿大纽芬兰岛北岸的一个聚落中发现了一些被砍伐的木材，通过对这些木材的研究，确定这棵树很可能在1021年被砍伐，而且可能是在春天[8]。　　自20世纪40年代以来，科学家一直在利用有机人工制品的放射性碳测年法来缩小历史事件发生的时间范围。他们通过测量同位素碳-14的痕迹来做到这一点，碳-14是宇宙射线与地球大气相互作用的结果，在数千年中缓慢衰变。但这种技术的精确度通常仅为几十年左右。　　加拿大纽芬兰省兰塞奥兹牧草地(L'Anse aux Meadows)木材的精确放射性碳年代测定显示，维京人于1021年在此地砍倒了一棵树。图片来源：All Canada Photos/Alamy　　2012年，情况发生了变化，日本名古屋大学物理学家三宅芙沙(Fusa Miyake)领导的研究小组发现[9]，公元774到775年之间，日本雪松年轮中碳-14含量显著升高。随后的研究[10]不仅证实了这一时期世界各地的木材样本中都存在这种碳-14含量的显著升高，而且还发现历史上存在至少五次这样的碳-14含量上升，最早的一次可以追溯到公元前7176年。有研究人员将这些碳-14峰值与太阳风暴活动联系起来，但这一假设仍在探索中。　　无论其原因是什么，这些“三宅事件”的存在，能让研究人员通过检测一个特定的三宅事件，然后对此后形成的年轮进行计数，从而准确地确定木制文物的制造年份。Kuitems说，研究人员甚至可以根据最外圈年轮的厚度来确定树木被砍伐的季节。　　考古学家现在正在将这种方法应用于新石器时代聚落和火山爆发遗址的研究，Dee希望用它来研究中美洲的玛雅帝国。在接下来的十年左右，Dee乐观地认为，“我们将对这些古老文明中的许多历史事件有真正精确到年代的完全记录，我们将能够以相当精细的时间尺度谈论这些历史发展。”　　至于三宅，则还在继续寻找历史中的时间标尺。她说：“我们现在正在寻找过去一万年中与公元774到775年的事件相当的其他碳-14升高。”　　单细胞代谢组学　　代谢组学是研究驱动细胞的脂质、碳水化合物和其他小分子的科学，它最初是一套表征细胞或组织中代谢产物的方法，但现在正在转向单细胞水平。科学家们可以利用这些细胞水平的数据，理清大量看似相同的细胞的功能复杂性。但这一转变带来了艰巨的挑战。　　代谢组包含大量具有不同化学性质的分子。欧洲分子生物学实验室的代谢组学研究人员Theodore Alexandrov说，其中一些分子存在的时间非常短暂，代谢周转率为亚秒级别。它们可能很难检测：尽管单细胞RNA测序可以捕获细胞或生物体中产生的近一半的RNA分子(转录组)，但大多数代谢分析仅涵盖细胞代谢产物的一小部分。这些缺失的信息里可能包含了重要的生物学奥秘。　　“代谢组实际上是细胞的活性部分。”伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的分析化学家Jonathan Sweedler说，“在疾病状态下，如果你想知道细胞状态，你真的要研究代谢产物。”　　许多代谢组学实验室使用分离的细胞，这些细胞被捕获在毛细管中，使用质谱法单独分析。相比之下，“成像质谱”方法获取了样本中不同位置的细胞代谢产物发生变化的空间信息。例如，研究人员可以使用一种称为基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的技术，其中激光束扫过经特殊处理的组织切片，释放出代谢产物，用于随后的质谱分析。这种方法也能捕获样本中代谢物来源的空间坐标。　　Sweedler说，理论上，这两种方法都可以量化数千个细胞中的数百种化合物，但要实现这一目标通常需要顶级的定制硬件设备，成本在百万美元左右。　　现在，研究人员正在普及这项技术。2021年，Alexandrov团队报道了SpaceM，这是一种开源软件工具，它能用光学显微镜成像数据，使用标准商用质谱仪对培养的细胞进行空间代谢组学分析[11]。他说：“我们算是做了数据分析部分的体力活。”　　Alexandrov的团队使用SpaceM对数以万计人和小鼠细胞中的数百种代谢产物进行了分析，并转向标准的单细胞转录组学方法将这些细胞分类。Alexandrov表示，他尤为热情的是后一项工作，以及构建“代谢组学图谱”的想法——类似于为转录组学开发的图谱，以加速该领域的进展。他说：“这绝对是一个前沿领域，并将对科学起到巨大的推动作用。”　　体外胚胎模型　　研究人员现在可以在实验室中制造出人工合成胚胎(下图)，它与8天大的自然胚胎(上图)类似。来源：Magdalena Zernicka Goetz实验室　　科学家们已经在小鼠和人类的细胞水平上详细描绘了从受精卵到完全形成的胚胎这一过程。但驱动这一过程早期阶段的分子机制仍不清楚。现在，“胚状体”模型的一系列活动有助于填补这些知识空白，让研究人员更清楚地了解可以决定胎儿发育成败的重要早期事件。　　该领域一些最精细的模型，来自加州理工学院和英国剑桥大学的发育生物学家Magdalena Zernicka Goetz的实验室。2022年，她和她的团队证明，他们可以完全从胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)中产生植入期的小鼠胚胎[12,13]。　　与所有多能干细胞一样，ES细胞可以形成任何细胞或组织类型，但它们需要与两种类型的胚外细胞密切相互作用才能完成正常的胚胎发育。Zernicka-Goetz团队研究出了诱导ES细胞形成这些胚外细胞的方法，并表明这些细胞可以与ES细胞共培养，以产生胚胎模型，该模型的成熟度是以前的体外实验无法达到的。“它就如你能想象的胚胎模型那样。”Zernicka Goetz说，“我们的胚胎模型发育出一个头部和心脏——而且还在跳动。”她的团队能够利用这个模型来揭示个别基因的改变如何破坏正常的胚胎发育。　　经过工程设计用于模拟胚胎8细胞期的细胞构成的胚状体。来源：M.A Mazid et al./Nature　　在中国科学院广州生物医药与健康研究院，干细胞生物学家Miguel Esteban和同事们正在采取一种不同的策略：重新编程人类干细胞，以模拟最早的发育阶段。　　Esteban说：“我们最初的想法是，实际上甚至制造合子也是可能的。”该团队没能完全实现这一点，但他们的确发现了一种培养策略，能使这些干细胞回到类似于8细胞期人类胚胎的状态[14]。这是一个至关重要的发育期里程碑，与基因表达的巨大变化相关，最终产生不同的胚胎细胞和胚外细胞谱系。　　尽管还不完美，但Esteban的模型展示了自然状态下8细胞期胚胎中细胞的关键特征，并凸显了人类和小鼠胚胎如何启动向8细胞期阶段转变之间的重要差异。Esteban说：“我们发现，一种甚至在小鼠体内都没有表达的转录因子，调节着整个转化过程。”　　结合起来，这些模型可以帮助研究人员描绘出仅仅几个细胞是如何发育为高度复杂的脊椎动物躯体的。　　在许多国家，对人类胚胎的研究只能在发育14天以内进行，但在这些限制条件下，研究人员仍有许多工作可做。Esteban说，非人类灵长类动物模型提供了一种可能的替代方案，而Zernicka-Goetz说，她的小鼠胚胎策略也可以产生发育到第12天的人类胚胎。她说：“在这个我们能研究的胚胎阶段，仍有很多问题有待提出。”　　参考文献：　　1. Swaminathan, J. et al. Nature Biotechnol.36, 1076–1082 (2018).　　2. Reed, B. D. et al. Science 378, 186–192 (2022).　　3. Brinkerhoff, H., Kang, A. S. W., Liu, J., Aksimentiev, A. & Dekker, C. Science 374, 1509–1513 (2021).　　4. Heinrich, L. et al. Nature 599, 141–146 (2021).　　5. Xu, C. S. et al. Nature 599, 147–151 (2021).　　6. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N. & Kleinstiver, B. P. et al. Science 368, 290–296 (2020).　　7. Ciciani, M. et al. Nature Commun. 13, 6474 (2022).　　8. Kuitems, M. et al. Nature 601, 388–391 (2022).　　9. Miyake, F., Nagaya, K., Masuda, K. & Nakamura, T. Nature 486, 240–242 (2012).　　10. Brehm, N. et al. Nature Commun. 13, 1196 (2022).　　11. Rappez, L. et al. Nature Methods 18, 799–805 (2021).　　12. Amadei, G. et al. Nature 610, 143–153 (2022).　　13. Lau, K. Y. C. et al. Cell Stem Cell 29, 1445–1458 (2022).　　14. Mazid, M. A. et al. Nature 605, 315–324 (2022).　　原文以Seven technologies to watch in 2023为标题发表在2023年1月23日《自然》的技术特写版块上

报讯据美国《每日科学》网站8月31日报道，美国加州大学伯克利分校制出世界最小半导体激光器，能使激光从一个蛋白质分子粗细的小孔中穿过。相关论文8月30日在线发表在《自然》杂志网站上。该成果在激光物理学领域具有里程碑式的意义，将有可能开创光学研究的新时代。　　加州大学伯克利分校纳米科学与工程中心主任张翔（音译）说：“该研究打破了传统意义上对激光极限的认识，在生物学、通信和计算机领域有着广泛的应用前景。”　　据了解，在分子生物学上，纳米级的激光可用于对DNA分子进行探测和控制；在通信领域可大幅提高基于光传导的信息传送速度和带宽；在光学计算机领域对现有技术也有极大的促进作用。　　在传统观点看来，包括激光在内的电磁波最细只能聚焦到其波长的一半。经过努力，科学家们找到了一种将电子和光子相互震荡并让其沿着金属表面传播的方法，才将激光压缩到几十纳米细，这种沿着金属表面传播的电磁表面波就是表面等离子体。此后各国科学家开始竞相建造等离子体激光器，但由于金属内在电阻的干扰，表面等离子体在产生后极易衰减，研究人员不得不为此再制造磁场以汇聚光线。　　张翔和他的研究小组破解了这个难题。他们用比头发丝还要细1000倍的硫化镉纳米丝在金属银的表面分隔出一个5纳米宽的缝隙。在这个结构中所产生的激光比其波长小20倍。由于光能主要集中在这个极为狭小的缝隙中，其在传播中损耗也被降到了最低。自发辐射率的增加程度是衡量该设备的一个重要指标，在这项研究中，研究人员在该设备5纳米的间隙中测量到了6倍的自发辐射率。（王小龙） 本篇文章来源于 科技网|www.stdaily.com原文链接：http://www.stdaily.com/kjrb/content/2009-09/02/content_100089.htm

内容简介放射性示踪技术在生命科学的发展中起着重要作用。虽然发展了许多替代技术，但是在许多特定的条件下，放射性示踪仍然是首选的高效、专一、可靠的实验方法。液闪计数分析，作为b射线检测的一种实验技术，在蛋白质的功能研究中起着重要的作用，尤其是上世纪70年代末为医药工业的高通量筛选建立的、近年来在基础研究的多个领域崭露头角的临近闪烁分析方法，对蛋白质功能研究提供了一些新思路，使得蛋白质功能的研究从分子到细胞成为可能。本期Webinar邀请到的主讲人张洪杰博士为中国科学院生物物理研究所科学平台的同位素实验技术主管。其负责的放射性同位素实验室面向所内、所外提供技术支撑服务。目前实验室有3H、14C、32P、33P、35S、51Cr、125I等7种核素，经过近几年的改造、建设，同位素示踪实验平台已经基本形成了放射实验场所（辐射）清洁、放射操作安全防护配套、放射试剂许可剂量充足、放射废弃物处理规范、放射样品的制样设备和检测仪器齐全的开放共享的实验场所。目前该平台已助力两个实验室在Cell，多个实验室在nature子刊等影响因子大于10的学术期刊上发表研究成果。本期讲座主要以在中科院生物物理所同位素实验室完成的实验结果为基础，结合一些其它实验室发表的文献数据，对酶、转运蛋白的活性分析，配体和受体的结合分析以及蛋白质的体内代谢分析，介绍相关测试过程中的样品制备、测试信号选择中的一些注意事项，帮助大家理解液闪分析中的一些关键步骤，提高实验的成功率。 讲座题目：液体闪烁技术在蛋白质功能研究中的应用:从分子到细胞讲座时间：2019年6月27日14：00-15:00主讲人：张洪杰 博士（中科院生物物理研究所）讲座形式：网络讲座，手机或PC即可参与（会议链接和如下报名链接相同） 主讲人简介张洪杰博士，放射性同位素实验技术主管， 高级工程师，复旦大学化学系理学学士，中科院生物物理研究所分子生物学博士，在生物物理学和分子生物学领域从事过多年的研究工作，2012年开始负责放射性同位素的运行管理和实验技术指导，有着较为丰富的经验。近几年已经有20余篇和同位素技术支撑相关的被致谢的文章。 关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

鉴定和定量蛋白质生物标志物是精准医疗的迫切需求。功能蛋白质组学的最新进展表明，仍有许多未开发的蛋白质对病理状况的进展具有潜在的影响。一般来说，蛋白质生物标志物在致癌条件下上调。这些生物标记物的临床检查对预后、诊断和治疗都有帮助。因此，利用对各种生化刺激的快速信号反应，研发高度特异性和敏感性的蛋白质传感方法至关重要。3月20日，《Nature Communications》发表题为《A generalizable nanopore sensor for highly specific protein detection at single-molecule precision》的论文。在文章中，他们介绍了自己设计出的一种微小的纳米传感器。这种传感器被戏称为“鱼钩和鱼饵”，能够以单分子精度检测样品中的蛋白质标志物。研究者们制定的一类传感元件：一个可编程的抗体模拟粘合剂融合到一个单体蛋白质纳米孔。这些传感器将有一种模拟抗体的蛋白质粘合剂，通过一根像鱼钩一样的柔性系绳，在tFhuA纳米孔(一种单体β桶状支架)上进行工程设计。蛋白质识别元件，而不会破坏其膜嵌入结构和成孔特性，从而实现“精准垂钓”。设计原理在针对不同抗体的时候仅需要改变粘合剂的一小部分即可，通过这种方式，极大地扩展了纳米孔传感器对许多蛋白质的效用，同时保留了它们的结构、特异性和灵敏度。研究者们通过开发和试验证明了这些传感器可用于在大小、电荷和结构复杂性方面发生巨大变化的蛋白质分析物。这些分析物产生的独特的电特征取决于它们的身份和数量以及纳米孔尖端的粘合剂-分析物组装。虽然该研究还只是一个概念原型，但在未来在诊断癌症时，这些纳米传感器将在一定程度上替代成像和活组织检查，并为预后、诊断、治疗提供具有参考价值的信息。这项工作的结果可以通过为生物流体中的生物标志物检测提供基础，影响生物医学诊断。

项目编号：JSHC-2022121190C2项目名称：东南大学医学与生命科学平台蛋白纯化仪采购预算金额：96.0000000 万元（人民币）采购需求：东南大学医学与生命科学平台采购蛋白纯化仪一套，主要功能要求如下：可以进行生物大分子的范例纯化，已知和未知蛋白质的纯化，蛋白质的结构动力学药物作用靶点研究，药物蛋白的分离，蛋白质工程药物的合成，蛋白质的定性，基因表达产物的分离。主要技术要求如下：蛋白纯化系统主机部分系统泵：精确的全自动微量柱塞泵，双泵四泵头，每个泵头都有独立除气阀。流速：0.001-25ml/min；装柱可以双泵模式运行，达到0.1–50ml/min。压力范围：0–20 MPa (200bar，2900 psi)；梯度流速范围：0.5-25ml/min。具备恒压调速功能，自动根据压力调节流速输出，使压力保持稳定。项目编号：JSHC-2022121193C7项目名称：东南大学医学与生命科学平台蛋白质稳定分析仪采购预算金额：43.0000000 万元（人民币）采购需求：东南大学医学与生命科学平台采购蛋白质稳定分析仪一套，主要技术要求如下：（1）适用范围：可分析任意类型的蛋白样品：病毒颗粒、膜蛋白、标签蛋白、酶、抗体、激酶、多聚复合物等。（2）样品数量：≥6 个（3）测量时间：≤3 分钟（4）样品消耗量：≤10 µL合同履行期限：详见采购文件本项目( 不接受 )联合体投标。

在人体内，有数千不同的蛋白质。每个蛋白质都有独特的形状，这样决定了它们独特的功能。科学家们至今都有很难捕捉单个蛋白的图像。问题在于，高功率成像工具往往会抹导致脆弱的蛋白质结构发生破坏，因此研究人员拍摄数以百万计的照片，来全面地了解一种蛋白质的晶体结构。这些工具所产生的图像，通常是模糊的，并且一些蛋白质不能被拍照，因为它们无法形成晶体。　　现在，一个研究团队已经可以用新的石墨烯材料来采集单个蛋白的图像。根据最近公布的arXiv上的一项研究，这种使用全新材料石墨烯获得的蛋白质图像是第一个针对单个蛋白质的高分辨率图像。　　捕捉单个蛋白质的图像时，研究人员将蛋白质的溶液雾化，并混合到非常薄的石墨烯片上。然后他们使用了低能量的全息电子显微镜，通过弹跳电子束来撞击蛋白质，然后记录这些电子与其它电子的如何相互作用产生的图像。这种低能量的电子束可以保证蛋白质结构不会出现太大的破坏。不同于以前其他成像方法，研究人员使用全息电子显微镜可以保证蛋白质结构的完整性和可靠性。利用计算机技术，研究人员使用了全息电子显微镜产生的图像来重建蛋白质的原始结构。　　细胞色素C图像。A)从全息电子显微镜获取的细胞色素C蛋白的图像。B)三种不同的蛋白质观察角度的重建。C)使用电子计算机技术来数字重建的蛋白质的不同角度的模型。　　(图片来自：Jean-Nicolas Longchamp et al, 2015, arXiv)　　研究人员试图将自己解析的结构与几种已经广为人知的蛋白质结构做对比，比如血红蛋白(在红血球中携带氧气的蛋白)，牛血清白蛋白(在实验室常用的蛋白)和细胞色素C(细胞内的电子转移在他)。他们比较了所得图像，并与其他成像技术获得的图像做对比，并发现，他们的照片有更高的清晰度。研究人员接下来希望获取其他未解析过的蛋白质图像。如果科学家更好地了解蛋白质结构，他们可以找可能存在的错误折叠的蛋白、如阿尔茨海默氏症，帕金森氏和亨廷顿氏病相关的蛋白质，这对于人类健康和基础生物学的研究大有益处。

蛋白质作为生命活动的执行者,通过自身结构的动态改变,以及与其他蛋白质相互作用组装为蛋白质复合物,调控各种生物学过程。因此,如何实现蛋白质复合物的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。化学交联结合质谱(CXMS)技术作为蛋白质复合物解析的新兴技术,利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质分子内或分子间的氨基酸残基以共价键连接起来,再利用液相色谱-质谱联用对交联肽段进行鉴定,实现蛋白质复合物的组成、界面和相互作用位点的解析。该技术具有分析通量高、灵敏度高、可提供蛋白质间相互作用的界面信息、普遍适用于不同种类和复杂程度的生物样品等优势,已成为X射线晶体衍射、低温冷冻电镜、免疫共沉淀等蛋白质复合物研究技术的重要补充。化学交联位点的鉴定覆盖度和准确度决定着该技术对于蛋白质复合物结构的解析能力。目前,为了实现蛋白质复合物的高覆盖度交联,研究人员发展了可用于共价交联赖氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基、精氨酸(R)的胍基以及半胱氨酸(C)的巯基等多种活性基团的新型交联剂。进而,为了提高低丰度交联肽段的鉴定灵敏度,体积排阻色谱法、强阳离子交换色谱法,及亲和基团富集策略被提出用于交联肽段的高选择性富集,如可富集型化学可断裂交联剂——Leiker,与不具备富集功能的交联剂相比,通过亲和富集可以将交联位点鉴定数目提高4倍以上。胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)的酶切位点与胰蛋白酶互为镜像,可特异地切割赖氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特点,电荷主要分布在交联肽段的N端,在碰撞诱导裂解(CID)和高能诱导裂解(HCD)模式下产生以b离子为主的碎片离子,与胰蛋白酶酶切肽段以y离子为主的碎片离子互为镜像补充,为胰蛋白酶酶解肽段在质谱鉴定中b离子缺失严重的问题提供了很好的解决办法。由于具有较高的酶切特异性和酶活性,镜像酶已经成功地应用于蛋白质C末端蛋白质组鉴定、磷酸化蛋白质组研究、甲基化蛋白质组鉴定等方面,然而在CXMS中的应用仍未见报道。为进一步提高对蛋白质复合物结构及相互作用位点的解析能力,本文发展了LysargiNase与胰蛋白酶联合酶切的方法,基于镜像酶正交切割的互补特性,通过产生赖氨酸及精氨酸镜像分布的交联肽段,以增加特征碎片离子数量和肽段匹配连续性,从而提升交联肽段的谱图鉴定质量,达到提高交联位点的鉴定覆盖度和准确度的目的。通过分别对牛血清白蛋白及大肠杆菌全蛋白样品的交联位点鉴定结果的考察,评价该策略对单一蛋白样品和复杂细胞裂解液样品蛋白质复合物表征的应用潜力。蛋白质样品制备称取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作为缓冲体系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。大肠杆菌细胞(种属K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培养基培养24 h,然后于4 ℃以4000 g离心2 min,收集细胞沉淀。细胞沉淀采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后,悬浮于细胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制剂)中,冰浴超声破碎180 s(30%能量,10 s开,10 s关)。匀浆液于4 ℃以20000 g离心40 min,收集上清,采用BCA试剂盒测定所得蛋白质含量。稀释大肠杆菌蛋白裂解液至蛋白质含量为0.5 mg/mL。化学交联样品制备以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)为溶剂配制浓度为20 mmol/L 的BS3交联剂母液 将交联剂母液加入牛血清白蛋白的缓冲溶液及大肠杆菌蛋白裂解液中,使交联剂的终浓度为1 mmol/L,在室温条件下反应15 min 通过添加终浓度为50 mmol/L的淬灭溶液NH4HCO3进行交联反应淬灭,并在室温下孵育15 min 在冰浴条件下,将交联样品逐渐滴入8倍体积的预冷丙酮中,于-20 ℃静置过夜 在4 ℃条件下,以16000 g转速离心,去除丙酮,然后将交联蛋白用预冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室温挥发掉残余的丙酮 以8 mol/L尿素溶液复溶蛋白质沉淀 将牛血清白蛋白交联样品以5 mmol/LTCEP作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原 将大肠杆菌样品以5 mmol/LDTT作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原,避免大肠杆菌蛋白在酸性条件下发生变性 添加终浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室温下反应30 min 以50 mmol/LNH4HCO3稀释样品至尿素浓度为0.8 mol/L后,将样品均分为两份,一份以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈50:1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,另一份加入终浓度为20 mmol/L的CaCl2,以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈20:1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃温度下酶解过夜。液相色谱-质谱鉴定及数据搜索上述所有样品经过除盐,使用0.1%甲酸(FA)溶液复溶,用超微量分光光度计测定肽段浓度,进行反相高效色谱分离和质谱分析。牛血清白蛋白样品采用Easy-nano LC 1000系统偶联Q-Exactive质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA) 流动相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~10 min, 2%B~7%B 10~60 min, 7%B~23%B 60~80 min, 23%B~40%B 80~82 min, 40%B~80%B 82~95 min, 80%B。Q-Exactive质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 300~1800,分辨率为70000(m/z=200),自动增益控制(AGC)为3×106,最大注入时间(IT)为60 ms,母离子分离窗口为m/z 2。MS/MS扫描的分辨率为17500(m/z=200),碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量(NCE)为35%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms,仅选择电荷值为3~7且强度高于1000的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。大肠杆菌样品采用EASY-nano LC 1200系统偶联Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液 流动相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~28 min, 5%B~16%B 28~58 min, 16%B~34%B 58~77 min, 34%B~48%B 77~78 min, 48%B~95%B 78~85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 350~1500,分辨率为60000(m/z=200), AGC为4×105, IT为50 ms,母离子分离窗口为m/z 1.6。MS2扫描的分辨率为15000(m/z=200),碎裂模式为HCD, NCE为30%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms。仅选择电荷值为3~7且强度高于2×104的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。质谱数据文件(*.raw)采用pLink 2软件(2.3.9)对交联信息进行检索和鉴定。使用从UniProt于2019年4月27日下载的牛血清白蛋白序列和大肠杆菌序列,搜索参数如下:酶切方式为胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端) 漏切位点个数为3 一级扫描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5 二级扫描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5 每条肽段的质量范围为500~1000 Da 肽段长度的范围为5~100个氨基酸 固定修饰为半胱氨酸还原烷基化(carbamidomethyl [C]) 可变修饰为甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白质N端乙酰化(acetyl [protein N-term]) 肽段谱图匹配错误发现率(FDR)≤5%。映射胰蛋白酶与LysargiNase酶解样品的交联位点在牛血清 白蛋白晶体结构(PDB: 3V03)的映射 LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品的交联位点对及单一交联位点的互补性LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品共同得到的交联位点鉴定打分比较b+/++与y+/++离子碎片分别在α/β-肽段的碎片覆盖度LysargiNase与胰蛋白酶酶解的交联肽段质谱图大肠杆菌样品中LysargiNase与胰蛋白酶酶切鉴定蛋白质复合物信息互补性带点击了解原文：https://www.chrom-china.com/article/2022/1000-8713/1000-8713-40-3-224.shtml

16年来，他们针对肝脏疾病、恶性肿瘤、免疫系统疾病、骨质疏松等重大疾病潜在药靶及蛋白质药物方面创造了一批引领世界的创新成果，一篇篇科研论文登上了《自然-遗传学》、《自然-细胞生物学》、《自然-医学》、《自然-免疫学》等国际著名期刊的殿堂。16年来，中国科学院院士、973项目首席科学家、总后科技金星、&ldquo 千人计划&rdquo 科学家、&ldquo 万人计划&rdquo 科学家等一座座学术&ldquo 桂冠&rdquo 在这里扎根，国家创 新团队奖、国家自然科学奖、国家科技进步奖、何梁何利奖、求是奖、中国青年女科学家奖、中国青年科技奖等一座座丰碑在这里崛起。16年来，一个个年富力强的杰出&ldquo 海归&rdquo 和国内著名高校的骄子们从这里踏上了为&ldquo 中国梦&rdquo 、&ldquo 强军梦&rdquo 奋斗的新征程。这就是军事医学科学院蛋白质组学创新团队。10日，在国家科技奖励大会上，这个创新团队被授予国家科技进步奖框架下的创新团队奖。梦想，瞄准最浩瀚的&ldquo 生命海洋&rdquo 蝴蝶从卵变虫、成蛹、化蝶，变幻诡异。让科学家们意想不到的是，其幕后操盘者竟是蛋白质组，而非基因组。2003年，记录人类生命&ldquo 天书&rdquo 的基因组计划宣告完成，但&ldquo 蝴蝶迷案&rdquo 更加扑朔。全球科学家愈来愈意识到一项更艰巨、更宏大的任务&mdash &mdash 解读&ldquo 天 书&rdquo ，即基因组功能的阐明已经摆在面前。人类经过百年跋涉，重返近代生命科学的发源地之一：蛋白质，但不仅关注个体，而是全面揭示数以万计的整体。1838年，荷兰科学家发现了蛋白质。这是生物体内一种极为重要的高分子有机物，占人体干重的54%。&ldquo 蛋白质组&rdquo 一词，1995年最早由澳大利亚科学家正式提出，其含义是指一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。&ldquo 1998年初，我在科学海洋里寻觅更有效的研究工具与策略。机缘巧合之下，敏锐地关注到刚刚出现的蛋白质组学，并逐渐把精力投入到这个新兴领域。&rdquo 国际人类蛋白质组计划的奠基人和开拓者之一、中国科学院院士贺福初介绍说。蛋白质是基因的编码产物，科学家将它们的关系，比作建筑材料与设计图纸。就人体而言，基因组固定，蛋白质组就能变幻出形态、功能各异的不同器官。由此可见，蛋白质组对进一步阐释&ldquo 生命天书&rdquo 的重要性不言而喻。拼搏，为中国科学开辟&ldquo 新天地&rdquo 2002年4月，人类蛋白质组计划开始孕育。贺福初院士在华盛顿筹备会议上提出了&ldquo 两谱两图三库&rdquo 的研究策略，阐述了人类肝脏蛋白质组计划暨 &ldquo HLPP蓝图&rdquo ，打动了各国与会学者。他们接受邀请，来到北京香山继续研讨。2002年11月，第一届国际人类蛋白质组学大会在五四运动爆发的源头&mdash &mdash 法国凡尔赛召开，40岁的贺福初院士在这里当选为&ldquo HLPP&rdquo 首任执行主席，成为该领域全球科研大军统帅。时任国家科技部部长徐冠华说，这是首次由我国科 学家牵头负责的重大国际合作计划。 &ldquo 酝酿之初争议非常大。&rdquo 贺福初院士回忆到。&ldquo 2002年，在华盛顿，论证中我们提出：蛋白质组计划必须按生物系统(如器官、组织、细 胞)进行一种战略分工和任务分割。否则，就是一盘散沙。这个策略从华盛顿争到凡尔赛，争到蒙特利尔，然后再争到北京，后来是德国慕尼黑，一直在争。可现 在，国际上不少科学家已逐步按照这个方式进行了。&rdquo 在华盛顿会议上，中国学者的发言激起了千层浪，来自世界各国的科学家议论纷纷，有赞赏、有疑惑、更有激辩，可是唯独没有无动于衷！事实证明，中国科学家在蛋白质组学领域最终赢得国际尊重和广泛支持。

在国家自然科学基金的大力支持下(项目资助号：21021004)，中国科学院大连化学物理研究所邹汉法研究员在磷酸化蛋白质组分析技术方面获得新进展，相关成果发表在最近一期的Nature Protocols上(2013，8，461-480)。(http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n3/abs/ nprot.2013.010.html)。　　固定化金属离子亲和色谱(IMAC) 是磷酸化蛋白质组学研究中最常用的磷酸化肽段富集技术之一，常规的IMAC使用的螯合基团有三羧甲基乙二胺、次氨基乙酸、亚氨基二乙酸等，在螯合铁、镓等金属离子后可用于磷酸肽的富集。其缺点是特异性不高，在富集磷酸肽的同时也富集了一些酸性肽。研究人员发现了磷酸酯锆或钛表面与磷酸肽之间的高特异性相互作用，并利用这一相互作用建立了以磷酸基团为螯合配体的新一代固定化金属离子亲和色谱技术。实验表明，该新型IMAC对磷酸肽富集的特异性优异，可以有效避免酸性肽段的非特异性吸附。与传统的IMAC相比较，其对磷酸肽的富集能力提高3-10倍，从而大大提高了蛋白质磷酸化分析的检测灵敏度和鉴定覆盖率。该新型IMAC方法自2006年发表首篇论文以来，已在Mol. Cell. Proteomics, J. Proteome Res., Anal. Chem.等蛋白质组学与分析化学权威期刊发表论文20余篇，其中2007年发表在Mol. Cell. Proteomics的一篇论文已经被引用110余次。采用该方法为核心技术进行了人类肝脏蛋白质磷酸化的规模化分离鉴定，建立了迄今为止国际上人类肝脏蛋白质磷酸化的最大数据集 (Mol. Cell. Proteomics，2012，11，1070-1083)。

p　　简介：/pp　　1999年，Yates研究组提出“鸟枪法”(shotgun)，其基本技术路线是针对液体或SDS-PAGE条带的复杂混合物用酶(Trypsin)酶解成肽段混合物，然后对肽混合物进行多维毛细管液相色谱分离和串联质谱分析以及数据库检索，从而确定蛋白质的种类，可同时鉴定成百上千种蛋白质。他们把这种思路称为多维蛋白质鉴定技术，即Mud PIT(multidi-mensional protein identification technology)。与传统的双向电泳技术相比具有灵敏度更高，动态检测范围更广等特点。/pp　　鸟枪法(shotgun)可以分析全细胞裂解样品和组织抽提物，也可以分析亚细胞分级组分、分离的细胞器等其他亚蛋白质组。如果样品已经过稳定同位素标记。根据不同标记的信号强度比例就可以精确确定化学上具有均一性的蛋白在不同样品中的相对丰度，这种多重分析可以利用在谱图上产生前后次序的质量标记得以完成。质谱分析以前在样品中加入同位素标记的某种质量校准肽，通过对此肽的相对定量就可以获得绝对定量的信息。实现目的肽段的绝对定量，而这一性质可以被充分应用以提供临床诊断的标准值或阈值。/pp　　差异蛋白质的定量研究是基于肽段水平而非完整的蛋白质，成为该技术最大的技术特色，该技术实现了样品分离与鉴定直接联合，完全自动化操作，可以用于各种蛋白质混合物的蛋白质组学分析，如血清、组织、各种体液以及尿液等。/pp　　技术路线：/pp　　鸟枪法为基因组测序，是先将基因组打断，分段测序， 然后利用计算机重组在一起。从而确定一段的基因序列。/pp　　鸟枪法在蛋白质组研究中的应用方式与此相类似，首先将蛋白质混合物酶解成肽段的混合物， 利用质谱进行分析确定该肽段的氨基酸序列，然后计算机根据设定好的运算法则根据肽段的信息在理论蛋白质数据库中检索出这些蛋白质，从而确定该混合物中的蛋白质成分。/pp style="text-align: center "img title="1.gif" style="float: none " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/130ae366-baaa-4006-9cf4-2c70b8441925.jpg"//pp style="text-align: center "img title="2.gif" style="float: none " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/fe437d70-d969-4f29-a6c9-4e8e1d3e7b65.jpg"//pp　　分析目标：/pp　　寻找差异表达蛋白，并分析蛋白功能。/pp　　Gene ontology分析/pp　　GO数据库包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG(有向无环图)的结构。Gene Ontology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息，纠正了传统功能分类体系中常见的维度混淆问题。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。/pp　　对于每一种表达趋势的基因，选择性的进gene ontology功能分析。对差异表达的所有基因向gene ontology数据库的各节点映射。计算每个节点的基因数目，并结合整个数据库的基因作为背景分部，对于每个节点，得到一个2x2的表格，使用超几何分布检验基因在每个GO节点的富集或贫乏程度。/pp　　Pathway enrichment分析/pp　　找出差异表达基因在生物学通路中的位置，以阐明其生物学功能以及不同基因之间的相互作用。/pp　　1)把差异表达基因定位在生物学通路(Pathway)上。/pp　　2)统计分析，确定差异基因可否可以代表某些生物学通路/pp　　优点：信息量大，样本量低，检测低丰度蛋白更多，相对定量/pp　　应用领域：/pp　　1)差异蛋白组分析(疾病早期诊断、疗效监测)/pp　　2)细胞差异性分析(如正义转染vs空载、目标基因RNAi vs空载)/pp　　3)疾病标志检测(肿瘤标志物，如无血清培养后的分泌蛋白质组)/pp　　4)治疗检测(术前vs术后)/pp　　5)药物开发(给药vs对照)/pp　　6)癌症研究(原位肿瘤细胞系vs转移)/pp　　Shotgun法可以检测动态范围10000:1内的低丰度肽段，是目前蛋白质组学研究最主要的技术路线。 现已成功应用于中大规模蛋白质的分离鉴定，不再依赖于双向凝胶电泳。/pp　　因大部分蛋白质在酶解后总有部分肽段是可用质谱鉴定的，因此，多维蛋白质鉴定技术弥补了碱性、疏水蛋白质、相对分子量极大和极小蛋白质在分离和鉴定方法上的不足。/pp　　该方法可达到对低丰度蛋白、极端等电点、分子量、完整膜蛋白具有与其他蛋白有相同的灵敏度。 如鸟枪法可鉴定出10个跨膜域以上的膜蛋白，而2DE仅能检测出2~4个跨膜域的。/pp　　Shotgun法可实现自动化、快速、高通量的蛋白组学分析。/pp　　但Shotgun法数据冗余复杂，需要专业人员进行分析。/pp　　在医学领域，Shotgun技术可用于以下方面：/pp　　除血清血浆外，还可用于研究体液及组织的蛋白组/pp　　分泌蛋白组/pp　　大脑皮层神经元细胞蛋白组/pp　　新生物标记物的发现/pp　　疫苗研究，分析感染源的表面蛋白质，从而发现潜在的抗原。如，在分析人类疟疾致病源plasmodium falciparum时，发现了大量潜在的抗原, 目前这些抗原的特性巳经被评估出来。/pp　　发现新的药靶。如，研究发现甲硫氨酸氨基肤酶是肿瘤生长抑制因子bengmide的分子作用靶点。/pp　　部分参考文献：/pp　　1)A proteomics approach to discovering natural products and their biosynthetic pathways, Stefanie B Bumpus, Bradley S Evans, Paul M Thomas, Ioanna Ntai1, Neil L Kelleher, Nature Biotechnology,27,951-956,2009/pp　　2)High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes, Paola Picotti, Oliver Rinner, Robert Stallmach, Franziska Dautel, Terry Farrah, Bruno Domon, Holger Wenschuh, Ruedi Aebersold, Nature Methods 7, 43-46 (6 December 2009)/pp　　3)Large-scale analysis of the yeast proteome by means of multidimensional protein identification technology, M.P. Washburn, D. Wolters and J. R. YatesNature Biotechnology, 19, 242-247, 2001/pp　　4)Comparison of alternativeanalyticaltechniques for the characterisationof thehuman serumproteomein HUPO Plasma ProteomeProject, XiaohaiLi, Xiaohong Qian etc. Proteomics, 5, 3423–3441,2005/pp　　5)An Automated Multidimensional Protein Identification Technology for Shotgun Proteomics, Dirk A. Wolters, Michael P. Washburn, and John R. Yates, Anal. Chem., 73 (23), 5683-5690, 2001/pp /p

1．蛋白质组学研究的研究意义和背景 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。 传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。 虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念。 国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF )。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT” 著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human Protein Index 的美国科学家Normsn G. Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization, HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（Human Proteome Project）。2．蛋白质组学研究的策略和范围 蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式（Expression profile）, 随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。3．蛋白质组学研究技术 可以说，蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/ 4）, 而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。当前在国际蛋白质组研究技术平台的技术基础和发展趋势有以下几个方面：3.1 蛋白质组研究中的样品制备 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。 对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记，是蛋白质组研究的重要方向之一。但临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以，常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较。而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面也有新的进展，如采用激光捕获微解剖(Laser Capture Microdissection, LCM) 方法分离癌变上皮类细胞。3.2 蛋白质组研究中的样品分离和分析 利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分开来是一种很有效的手段。它在蛋白质组分离技术中起到了关键作用。如何提高双向凝胶电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。国外的主要趋势有第一维电泳采用窄pH梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染色技术，如新型的荧光染色技术。 质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳－质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。3.3 蛋白质组研究的新技术 做过双向凝胶电泳的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳 (LC-CE) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用 (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注。此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。3.4 蛋白质组生物信息学 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。4． 蛋白质组学发展趋势 在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。 在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。 在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。

食品奶粉蛋白质检测仪维护周期是多久，食品奶粉蛋白质检测仪的维护周期并不是固定的，因为它取决于多种因素，如设备的使用频率、环境条件、操作人员的维护意识等。然而，一般来说，为了确保设备的准确性和可靠性，建议定期进行以下维护和检查：日常清洁：每天或每次使用后，应对设备进行清洁，去除样品残留和灰尘。这有助于保持设备的卫生和准确性。定期检查：每周或每月进行一次全面的检查，包括设备的各个部件、连接线、电源等。确保所有部件都处于良好的工作状态，没有损坏或磨损。校准：根据设备的使用情况和制造商的建议，定期进行校准。校准是确保设备测量准确性的关键步骤。更换耗材：如果设备使用耗材（如过滤器、灯源等），应按照制造商的建议定期更换。软件更新：如果设备有软件支持，定期检查并更新软件，以确保设备具有最新的功能和修复任何已知的问题。具体来说，维护周期可能因设备型号、制造商和使用环境而异。因此，建议参考设备的用户手册或联系制造商以获取更具体的维护建议。此外，为了确保设备的长期稳定运行，建议对操作人员进行培训，使他们了解设备的操作和维护要求。同时，建立设备维护记录，以便跟踪设备的维护历史和性能变化。