基因转染

常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其 它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎 叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)　nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作 用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰 转移酶基因测时可通过放射自显影观察。荧光素酶基因（luciferase Gene）1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用植物整株或部分直接用X-光片 或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。β-D-葡萄糖苷酶基因该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱 、荧光等进行检测。除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长 紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。

[font=宋体]哺乳动物细胞表达系统具有促使蛋白正确折叠和实现复杂修饰的功能，表达的蛋白更近天然状态，能够运用于制药等活性要求高的领域。利用哺乳动物细胞表达系统生产蛋白通常有两种方式：瞬时转染与稳定转染（构建稳定细胞系），这两种方式在原理、操作流程、应用场景上均有所区别，本文主要就瞬时转染与稳定转染之间的区别做一介绍。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]瞬时转染与稳定转染实验原理的异同：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]瞬时转染与稳定转染都是将目的基因转染至特定哺乳动物细胞内，进而表达得到目的蛋白。不同的是瞬时转染的方式外源基因并没有转染到细胞的染色体上而是存在于游离的载体上，这样可以在短时间内获得基因的表达产物，但是随着细胞的不断分裂增殖外源基因最终会丢失，无法继续进行重组蛋白的生产；而利用细胞稳定转染则会将外源基因转染至细胞染色体上，目的基因不会随着细胞传代而消失，稳定转染的细胞株能够长期稳定的生产目的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]实验操作的差别：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]瞬时转染与稳定转染所用的质粒是不同的，瞬转的质粒不需要带有抗性，而用于稳定转染的质粒一定要带有特定的抗性以便于后续的克隆株筛选。另外，两者所用的培养基及实验试剂也有所区别。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]瞬时转染的操作比构建稳定细胞系的操作简单，构建好质粒后，经过细胞复苏、转染、细胞培养、蛋白纯化等步骤即可得到目的蛋白；而构建稳定细胞系需要先将构建好的质粒线性化，再导入培养好的哺乳动物细胞内，通过一定的转染方式实现质粒与细胞的融合，接着经过细胞池筛选、单克隆筛选、细胞传代培养等步骤才能得到稳定转染的细胞系。对稳定细胞系进行培养能够长期稳定的生产目的蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]瞬时转染与稳定转染优缺点对比[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]瞬时转染：[/font][font=宋体]优点：[/font][font=宋体]①能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白[/font][font=宋体]②实验成本低[/font][font=宋体]③一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高[/font][font=宋体]缺点：无法长期生产得到重组蛋白[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]稳定细胞系构建：[/font][font=宋体]优点：能够长期稳定生产目的蛋白[/font][font=宋体]得到稳转株之后后续生产蛋白的成本大大降低[/font][font=宋体]能够对基因进行基因插入、基因敲除等编辑操作[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，详情可以参看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

4、 质粒因素从质粒浓度看，细胞密度为1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml转染效率最高。转染率在一定一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但是到达一个峰值后，随DNA用量增加而转染率逐渐下降，其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度，过量便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率提高。进行小分子量的分子转染时（siRNA/miRNA），应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时（DNA），应使用低电压，长脉冲时间。从质粒的纯度看，用高纯度的DNA才 能提高电转的效率，且应注意以下几点：首先DNA／RNA应该超纯(A260／A2801．8)，其次应不含内毒 素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。

1、 电场参数电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。

6、电转染试剂的选择电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如Entranster-E，将电击对细胞的损伤降到最低。

2、脉冲过程1）脉冲波形脉冲波形主要分为两种：1、方波脉冲；2、指数递减波脉冲。方波脉冲是指：电压瞬间升至预设电压，保持电压放电，然后瞬间终止放电。一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲，有较高的转染效率和细胞存活率。指数递减波脉冲是指：先对电容充电，然后让电容完全放电，其电压变化呈指数递减。一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。2）脉冲时间脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中，脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间，等于电容（C）与电阻（R）的乘积，单位是ms。在参数优化中，增加电压应当降低脉冲时间，而减小电压则应当增大脉冲时间。3）脉冲次数一般而言，对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲，因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。

荧光显微镜下H526细胞的慢病毒转染结果

3、细胞因素用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.细胞悬液浓度一般为1*106/ml，当细胞生长密度大于3*106/ml，转染效率会下降。原因除了细胞老化外，细胞过密会使相邻细胞相互作用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一化，细胞体积越大对电击越敏感，所需电场强度也越小。

5、 温度 一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在 电击前后可对细胞进行冰浴处理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大，但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应，因此，实验一般选择电击前冰浴5min。电击后冰浴，会影响DNA摄入，因为电击后冰浴可增强细胞收缩，细胞膜上的 电穿孔封闭较慢，延长外源性DNA摄入时间，从而提高其摄入量。在室温环境下，虽然细胞膜上的孔 封闭速度快，但在随后2h，质粒还可通过电内化进入细胞，因此摄人量不一定比4℃环境下低。而且，室温下细胞在5 min内即闭孔，在4℃的环境下穿孔状态可保持4h，穿孔封闭缓慢降低了存活率，同时细胞在低温下更容易受到损伤。因此，综合考虑摄人量和存活率，大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。

[color=#1a1a1a]1. 脂质体法[/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]2. 电穿孔法[/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]3. 病毒介导的感染[/color][/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]4.非脂质体转染[/color][/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a].........请大家补充[/color][/color][/color]

慢病毒转染过后的细胞荧光照片明场[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120455921_65_5389809_3.jpeg[/img]低浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120459963_6495_5389809_3.jpeg[/img]高浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120461778_5983_5389809_3.jpeg[/img]

[font=宋体]随着生物技术的快速发展，稳定转染细胞株的构建在基础研究和应用研究中变得越来越重要。这一技术涉及到将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中，从而实现基因的长期表达。然而，这一过程也伴随着一系列的挑战和常见问题。本文将深入探讨稳转细胞株构建的方法，以及在实践过程中可能遇到的问题，旨在为研究者提供实用的指导和建议。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳定转染细胞株构建方法：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、慢病毒感染细胞[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞，包装技术成熟，[/font][font=Calibri]II[/font][font=宋体]代和[/font][font=Calibri]III[/font][font=宋体]代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒，是稳转细胞系构建的首选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制，不适合转录本区域比较长的基因，对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒，病毒表达载体中，是由[/font][font=Calibri]WPRE[/font][font=宋体]元件代替[/font][font=Calibri]PolyA[/font][font=宋体]稳定以达到稳定[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的作用，对部分基因的翻译有一定影响。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、转座子介导的稳转细胞系构建[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]转座子是存在于各种生命细胞内的可移动遗传信息元件，能实现[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]片段在染色体内部[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]之间的转移。工程化的转座子由[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]和转座酶编码基因组成，通过转座酶与[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]结合实现基因转移。将转座子的两个元件分别构建在两个独立载体上，并将目的基因序列替换转座酶序列，与另一个载体共转染目的细胞，实现目的基因在宿主基因组上的整合。与其他技术不同，目的基因在整合酶存在下会持续处于切割—整合状态，实现连续跳跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9 [/font][font=宋体]基因敲入[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]利用[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9[/font][font=宋体]系统，通过[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]修复机制，可将目的基因（如抗性基因和荧光标志）定点敲入细胞基因组。在哺乳动物细胞中，[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]的效率高于[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]。设计特定[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]donor[/font][font=宋体]载体，可在[/font][font=Calibri]AAVS1[/font][font=宋体]位点（人基因组安全港）实现基因定点敲入。此方法稳定、安全，但敲入概率在不同细胞和位点中有所差异，需筛选单克隆以获得稳定细胞系。随着编辑效率提高，此方法将更省时省力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]四、[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]系统，通过融合[/font][font=Calibri]VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]系统对基因进行过表达和干扰[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]通过[/font][font=Calibri]dCas9-VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]激活蛋白实现了多数细胞内源基因的特异性激活，不受基因大小限制。主要优势是应用广泛，但需要三种不同抗性病毒逐次或同时感染细胞。[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]将[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]序列构建在[/font][font=Calibri]lenti[/font][font=宋体]载体中，配合其他两种慢病毒可激活任何基因。主要缺点是筛选细胞时需要三种不同抗性的病毒，部分细胞筛选后表型变化明显。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳转细胞系构建中常见问题解析：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]是否需要进行密码子优化？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于氨基酸密码子的简并性和[/font][font=Calibri]tRNA[/font][font=宋体]的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. Kozak[/font][font=宋体]序列是必须要添加的吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列（通常是[/font][font=Calibri]GCCACCatgG[/font][font=宋体]），真核生物[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]真正的起始密码子位于[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列的保守序列中，其共有序列是[/font][font=Calibri]CCRCCAUGG[/font][font=宋体]，几乎所有[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的翻译起始都依赖于[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点[/font][font=Calibri](IRES)[/font][font=宋体]募集小亚基。[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列通过与翻译起始因子[/font][font=Calibri]eIF[/font][font=宋体]形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]启动子应如何选择？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]启动子表达活性相对较高。而[/font][font=Calibri]EF1a[/font][font=宋体]（延伸因子[/font][font=Calibri]-1[/font][font=宋体]α）启动子更适用于表达长片段的基因。[/font][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]EF1A[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CAG[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CBh[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]稳转细胞系培养体系[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如[/font][font=Calibri]hepG2[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]puro[/font][font=宋体]抗性筛选浓度为[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/ml[/font][font=宋体]，则建议用[/font][font=Calibri]1ug/mL+[/font][font=宋体]完全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者[/font][font=Calibri]HEPES[/font][font=宋体]调节细胞细胞代谢水平，维持细胞增殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]标签放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端还是[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端好？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端有信号肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端；蛋白如果较小，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端，减少蛋白降解；如果下游有[/font][font=Calibri]P2A[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]T2A[/font][font=宋体]等自剪切肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端。如果为了添加[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列，建议加在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. [/font][font=宋体]是否可以构建稳转敲除的细胞系？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，其服务内容详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

不同的慢病毒转染浓度，荧光显微镜荧光场亮度可以作为简单的定量分析数据吗

[size=3]近日，记者在内蒙古自治区鄂托克旗召开的“转基因克隆绒山羊培育成果通报会”上获悉，不久前，位于鄂托克旗的“内蒙古白绒山羊种羊场”诞生了目前国际上规模最大的一批转基因克隆绒山羊，这标志着中国绒山羊现代生物育种技术又有了新的突破。 　　这项研究为国家转基因生物新品种培育重大专项课题，由内蒙古大学生命科学学院实验动物研究中心研究员刘东军带领的研究团队，在中国工程院院士旭日干的指导下取得的一项具有国际先进水平的科研成果。 　　此研究团队成功构建了对绒毛生长有促进作用的转胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因载体，利用该载体成功转染了绒山羊胎儿成纤维细胞，建立起转基因细胞系。再利用转基因细胞进行体细胞克隆，从而获得的转基因绒山羊。 　　2009年9月至10月，这个研究团队在位于鄂托克旗草原上的内蒙古白绒山羊种羊场开展绒山羊转基因克隆胚胎的生产和移植工作。今年2月至3月陆续获得羔羊17只，其中转基因克隆羔羊14只、体细胞克隆羔羊3只。 [/size]

1、基因修复技术修复有机物污染土壤：利用基因修复技术修复含苯酚的污染土壤，通过引入苯酚代谢基因到微生物中，使得微生物可以更高效地降解苯酚，从而达到治理土壤污染的效果。2、基因修复技术修复重金属污染土壤：利用基因修复技术修复含铅污染的土壤，通过引入铅离子转运基因到植物中，使得植物可以更高效地吸收和转运土壤中的铅离子，从而达到治理土壤污染的效果。3、基因修复技术修复农药污染土壤：利用基因修复技术修复含农药的污染土壤，通过引入具有农药降解能力的基因到微生物中，使得微生物可以更高效地降解土壤中的农药，从而达到治理土壤污染的效果。4、基因修复技术修复石油污染土壤：利用基因修复技术修复含石油类化合物的污染土壤，通过引入具有石油降解能力的基因到微生物中，使得微生物可以更高效地降解土壤中的石油类化合物，从而达到治理土壤污染的效果。

[font=宋体]慢病毒构建稳转细胞系的原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并实现外源基因的稳定表达。具体来说，构建稳转细胞系的核心是将慢病毒矢量载体导入宿主细胞中，慢病毒载体通常包含病毒的复制和包装组件，以及外源基因的表达调控序列。当慢病毒载体被导入宿主细胞后，它可以利用细胞的复制和转录机制将外源基因插入宿主细胞的染色体中，从而实现外源基因的稳定表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]构建稳定的慢病毒转染细胞系是在细胞中稳定表达外源基因的一种有效方法。下面是一般慢病毒构建稳定转染细胞系的步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、选择慢病毒载体： 选择适当的慢病毒载体，通常是一个包含[/font][font=Calibri]LTR[/font][font=宋体]、包装信号、引导[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]序列和多功能质粒载体的质粒。这个载体应该包含要表达的外源基因。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、转染慢病毒包装细胞： 使用慢病毒包装细胞系，例如[/font][font=Calibri]293T[/font][font=宋体]或其他适合的细胞系。这些细胞通常被选择因为它们能够支持慢病毒复制和包装。将慢病毒载体与包装蛋白的表达质粒一同转染进这些细胞中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、病毒产生和收集： 慢病毒包装细胞会开始产生慢病毒颗粒，这些颗粒包含了慢病毒载体和外源基因。培养一定时间后，收集细胞培养上清液，这是富含病毒的液体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、测定病毒滴度： 对采集的上清液进行病毒滴度的测定，通常可以通过转染一定数量的目标细胞，然后测定这些细胞的感染率来确定病毒的滴度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、转染目标细胞： 将上一步获得的病毒用于转染目标细胞。这些目标细胞可以是要建立稳定转染细胞系的细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、筛选稳定细胞系： 添加适当的筛选物质，例如抗生素，以选择表达了外源基因的细胞。这可以通过在培养基中添加抗生素，使得只有表达了外源基因的细胞能够存活下来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、单克隆分离： 对稳定表达细胞群进行单克隆分离，以确保每个克隆都来自单一细胞。这有助于保持表达的一致性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、验证表达： 对所得的单克隆细胞系进行验证，确认外源基因的表达水平和稳定性。这可以通过[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Western blotting[/font][font=宋体]等分子生物学技术来实现。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过这些步骤，可以建立一个稳定表达外源基因的慢病毒转染细胞系，为后续的实验和研究提供了有力的工具。这种方法常用于基因功能研究、药物筛选和基因治疗等领域。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]慢病毒构建稳转细胞系的优点：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]与常用的转染方法相比，慢病毒构建稳转细胞系有以下几个优点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①高效性：慢病毒能够将外源基因整合到宿主细胞基因组中，实现稳定的外源基因表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②特异性：由于慢病毒的感染和复制比较特异，只会影响一定类型的细胞，因此可以实现对具体细胞的选择性转染。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③安全性：慢病毒的基因转移速度较缓慢，对宿主细胞和人体的损伤较小，因此具有较高的安全性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳转细胞株构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

植物转基因技术已经成为现代分子生物学研究中的最重要手段。在过去的十几年里，植物转基因技术获得了重大发展，新型和更为有效的转化方法应运而生。尽管如此，农杆菌介导的遗传转化和基因枪法进行的遗传转化仍然是最重要的两种转化方法。农杆菌转化广泛应用于在谷类及双子叶植物。同时，其他转基因技术也迅速发展，如显微注射法、激光微束穿刺法、PEG 法、花粉管通道法、超声波法、阳离子转化法等1][/sup]。常规转基因技术具有很多优点。农杆菌介导的遗传转化成本低，不需要复杂的仪器设备，转化效率高，适用范围广，插入片段大。正因为具有以上优点，农杆菌转化是目前应用最为广泛的转化方法。基因枪法对转化受体要求低，几乎可适用于所有植物物种，方法快速简单；然而基因枪设备要求高，转化成本相对较高，这在一方面限制了基因枪法的使用。同时利用基因枪法获得的转化子通常具有多个转基因拷贝，粒子轰击也常会造成目的片段的断裂失活，转化子出现嵌合体频率高，这些也都在一定程度上限制了基因枪法的使用。其它方法在应用上都存在一定的局限性，或者是操作复杂，或者是适用的物种少。然而不管使用哪种常规方法，都有共同的局限性：1）插入位置的随机性，由于这种随机性的存在，可能导致转化受体发生性状上的改变，如败育，生长不良等等。2）常规的转基因技术多是进行单性状基因的转入，很难将控制多个性状的多个基因同时转入一种作物中，更难将整条复杂代谢途径中的所有基因引入作物中，很难产生新的复杂性状或代谢产物。3）外源基因在转入作物时，往往因整合进内源基因而破坏该内源基因的功能；同时转化的随机性使转入的外源基因受到整合区域上游或下游调控元件的影响，很难进行操控1]。相比之下，植物人工染色体技术具有很多优势：1）植物人工染色体单独成对存在于转化受体，并且稳定遗传给子代，不会影响和破坏其他染色体的结构和功能。2）植物人工染色体采用位点特异重组技术可以将目的基因定点整合到人工染色体的特定位置，不会破坏受体内源基因的功能，也不会受到整合区域上下游的影响。3）植物人工染色体可以承载多个基因，甚至编码复杂代谢网络的众多基因[[url=http://bbs.instrument.com.cn/post.asp?forumid=487&threadid=&postid=&title=&action=&FTTID=1&hasReadRelease=yes#_ENREF_2]2]。正是这些优势的存在，使得植物人工染色体技术当仁不让的成为第三代植物转基因技术，并具有广泛的应用前景。 [size=10pt][1] Barampuram, S. and Zhang, Z.J. (2011). Recent advances in plant transformation. Methods Mol Biol 701, 1-35.[size=10pt][2] Yu, W., Han, F. and Birchler, J.A. (2007). Engineered minichromosomes in plants. Curr Opin Biotechnol 18, 425-31.

1.求助书一本 书名：中国主要经济植物基因组染色体图谱 作 者： 陈瑞阳出 版 社： 科学出版社

来自英国Sanger研究院，Illumina Cambridge公司等处的研究人员发表了题为“Genome Sequencing and Analysis of the Tasmanian Devil and Its Transmissible Cancer”的文章，完成了一种传染性癌症的基因组测序，并从中发现了一些突变，解析了这种癌症的来源，以及如何变得具有传染性的。相关成果公布在Cell杂志上。这种癌症主要发生在世界上最大的肉食性有袋动物：袋獾身上，这种动物也被称为塔斯马尼亚恶魔（Tasmanian Devil），现今只分布于澳大利亚的塔斯马尼亚州。袋獾是袋獾属中唯一未灭绝的成员，其在研究领域最著名的就是袋獾面部肿瘤疾病。袋獾面部肿瘤是一种独特癌症，常出现于袋獾面部或嘴部，但通常会扩散至袋獾的内脏，它与另外一种在犬类中传播的恶性肿瘤是世界上仅有的两种可通过上述方式传播的癌症。这项研究离心机揭示了这种能通过撕咬在动物间传播的肿瘤的奥秘，首次针对一个雌性袋獾的单细胞进行分析。这个雌性袋獾被称为“永恒恶魔（The Immortal Devil）”，因为其死于15年前，但它的DNA仍然在传染癌细胞系中流传。文章的第一作者，Sanger研究院Elizabeth Murchison博士表示，“袋獾癌症是目前发现的唯一一种威胁到整个物种灭绝的癌症”，“通过其测序，将有助于我们整理引发整个袋獾群体癌症的突变。”研究人员从中找到了肿瘤细胞之间的遗传差异，这表明这种癌症在袋獾群体中传播的时候，发生了遗传突变。他们在塔斯马尼亚州不同地区找到了69种不同袋獾的肿瘤样品，构建袋獾面部肿瘤传播的图谱，研究结果表明一些癌症亚型比其它亚型更具有侵染性。Illumina Cambridge公司David Bentley说，“我们发现这种癌症的基因组具有大约两万个突变，这比某些人类癌症中发生的突变更少，这说明癌症变得具有传播性，基因组极度不稳定并不是必要条件”，“追踪这种癌症的进化历史，以及其传播过程，将有助于我们了解这种疾病发生的原因，以及预测其未来的发展。”癌症在个体之间的传播正常来说，会受到免疫系统牛血清蛋白的干涉，因为免疫系统可以鉴别外来组织，这一研究组发现了一些有趣的线索——这种癌症如何能“智斗”免疫系统，比如免疫系统中的一组基因突变。但是还需要更进一步的研究，揭示这种癌症是如何从免疫系统中逃脱出来的。“这项研究十分重要，因为这将会帮助我们理解疾病传播的模式，也有助于疫情的研究，但是我们还需要利用这一基因组测序，更进一步分析这种癌症如何变得具有传染性。癌症具有群体传播性，显示是非常罕见的，我们通过袋獾这一例子来分析这一过程，以防未来在人类身上发生”，Sanger研究院，文章通讯作者Mike Stratton教授说。研究组下一步将进行更多袋獾基因组测序，绘制上千袋獾肿瘤样品基因组图谱，从而更好的了解这种癌症的遗传多样性，并分析癌症与袋獾群体之间的遗传关联性。去年这一研究组在Science杂志上发表文章，发现培养基袋獾面部肿瘤起源于雪旺细胞。他们从分布在澳大利亚塔斯马尼亚岛14处的袋獾群落中采集了25个袋獾面部肿瘤样本，进行基因分析，结果发现，袋獾面部肿瘤起源于雪旺细胞，在大约20年前，袋獾雪旺细胞内的某种基因变异导致了这一癌变。

新疆疾控中心：基因测序显示此次疫情来源于同一传染源。

[align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]慢病毒载体感染技术[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]慢病毒载体感染技术已经被广泛应用于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]干扰技术中。使用慢病毒载体，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]被导入宿主细胞的细胞核内，根据启动子不同，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]可被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]聚合酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]II[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]或者[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]III[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]催化转录[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，这些前体结构被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]加工形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]pre-shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]随后被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Dicer[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TRBP/PACT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]酶切，去除发卡结构，产生在两个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]’[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]末端带有两个游离碱基的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20-25[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]nt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的双链[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。这一有活性的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Argonaute[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] (Ago) [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等蛋白质因子结合，形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]诱导的沉默复合体[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000](RNA-induced silencing complex, RISC)[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]作为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RISC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的一部分，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在镁离子和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ATP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的参与下，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Ago[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]切割靶标[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，产生的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]片段被快速降解，从而在转录后水平沉默靶基因的表达[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][63-65][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凋亡是多[/color][/size][/font][url=https://baike.baidu.com/item/%E5%9F%BA%E5%9B%A0][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]基因[/color][/size][/font][/url][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]家族、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]家族[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。内源性细胞凋亡途径始于线粒体，细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从线粒体内释放是关键的一步。在细胞凋亡信号的刺激下，细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从线粒体释放到胞浆，并与凋亡细胞蛋白酶激活因子[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Apaf-1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]结合，在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]dATP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]存在下，募集并激活[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Cyto-3-Apaf-1-caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凋亡体，激活下游的效应蛋白酶，如[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]7[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，启动[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的级联反应，引起细胞凋亡。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]被认为是凋亡的中心实施者，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]是调控[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，参与打靶与激活调控，激活[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]处于凋亡级联反应的核心位置，是效应[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，是参与凋亡的效应物。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的主要底物是聚合酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，在细胞凋亡启动时，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的裂解剪切参与凋亡的发生。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cappase-3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的蛋白水解作用是凋亡实施的早期事件或前提条件。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]是一种具有抑制细胞凋亡作用的蛋白，能够抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]激活，结合[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Apf-1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]及[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，并维持其非活化状态，抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]级联反应，并且抑制线粒体释放细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，防止细胞凋亡[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][78, 79][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。实验中，我们通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]western blot[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]检测相关蛋白发现，与对照组相比，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved-caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达量增加，而[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抗凋亡蛋白表达量减少，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量明显下降，表明，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达促进了凋亡的产生。[/color][/size][/font]

大家好！论坛中关于转基因检测的坛友貌似很少，很多问题也很难找到同道中人交流，只能自己摸索。 在转基因测试过程中，实时荧光PCR是非常重要的方法之一，而由于该方法的灵敏性，防污染措施至关重要！由于检验行业的特殊性质，除了常见的防污染措施之外，还需要在PCR的反应体系中添加UNG酶以及dUTP。我们对市场上各大分子生物学产商都进行了咨询，除了ABI公司外，其余产商均没有UNG酶的实时荧光PCR试剂盒。而ABI公司的TaqMan Universal Master Mix价格昂贵，出于成本控制考虑，我们也未选择。为解决这一问题，我们经过反复实验，最终成功的配制了荧光定量PCR反应体系Premix（成分包括：Taq Polymerase、含dUTP的dNTP mix、反应缓冲液、ROX、UNG酶等），完美的解决荧光PCR过程中的污染问题。 各位坛友，如果大家对此感兴趣，可以发送站内信和我联系。

广州：两例外地来穗病例病毒基因为奥密克戎，暂未现新增感染者，黄码人员须规范完成"七天三检"。太古汇所有检测结果为阴性，已恢复营业.

序号：1题目：逆转录病毒转染的小鼠IL－3基因在NIH／3T3细胞中的表达.作者：方敏; 王立人; 雷学锋; 毕爱华;期刊：同济医科大学学报, ACTAUNIVERSITATIS MEDICTNAE TANGJI, 编辑部邮箱 1996年 06期 全文链接：http://dlib.cnki.net/kns50/detail.aspx?dbname=CJFD1996&filename=TJYX606.001序号：2题目：基因转染真核细胞的应用及3种常用非病毒转染方法的优化.作者：蒋惠男; 严云勤;期刊：黑龙江畜牧兽医, Heilongjiang Journal of Animal Science and Veterinary Medicine, 编辑部邮箱 2004年 03期 .全文链接：http://dlib.cnki.net/kns50/detail.aspx?dbname=CJFD2004&filename=HLJX200403052序号：3题目：白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞作者：翟旭; 张弘; 霍晓川; 刘兴波; 刘云会;期刊：中国组织工程研究与临床康复, Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 编辑部邮箱 2009年 10期 全文链接：http://dlib.cnki.net/kns50/detail.aspx?dbname=CJFD2009&filename=XDKF200910028

[b][font=宋体]前言[/font][/b][font=宋体]在蛋白质研究领域，稳定细胞系的应用已成为生产高质量结构生物学蛋白质的关键手段。随着技术的不断进步，稳定细胞系的生成与筛选方法得到了显著改进，从而推动了蛋白质生产的高效化与精准化。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]细胞系的建立和应用[/font][font=宋体][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系[/font][/font][/b][font=宋体]因其稳定的蛋白表达和适当的翻译后修饰而被广泛用于结构生物学研究。这些细胞系能有效地生产具有复杂糖基化模式的蛋白质，这对于确保蛋白质的功能和稳定性至关重要。糖基化缺陷细胞系通过特定的基因改造，能够分泌脱糖基化糖蛋白，为蛋白质生产提供了更加纯净的原料。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系的生成[/font][/b][font=宋体][font=宋体]传统的稳定细胞系生成技术如瞬时转染，虽然方法简便，但存在整合频率低、转基因沉默等问题。为了克服这些困难，研究者们开发出了一系列新技术，如细胞分选技术、位点特异性重组（如[/font][font=Calibri]FLP/FRT[/font][font=宋体]系统）、转座子系统（如[/font][font=Calibri]piggyBac[/font][font=宋体]）、慢病毒系统以及噬菌体整合酶等，提高了稳定细胞系的生成效率和稳定性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]序列特异性基因组工程也为稳定细胞系的生成提供了新的思路。通过敲除或修饰特定的基因，研究者们能够实现对细胞功能的精准调控，从而优化蛋白质生产的效率和纯度。例如，一种同时缺乏[/font][font=Calibri]GnTI[/font][font=宋体]和谷氨酰胺合成酶（[/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体]）活性的[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系被成功开发出来，为高效筛选具有[/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体]标记的稳定细胞系提供了有力工具。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系与瞬时转染的比较[/font][/b][font=宋体]稳定细胞系相较于瞬时转染具有多个优点，包括能够进行大规模生产和保持高水平的蛋白表达稳定性。尽管瞬时转染在某些情况下能快速产生大量蛋白，但其表达水平和重复性通常不如稳定细胞系。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]展望[/font][/b][font=宋体]近年来，利用稳定细胞系高效生产结构生物学蛋白质已成为研究的热点和趋势。通过引入新技术、优化筛选方法和改进整合系统，不仅能够提高蛋白质生产的效率和纯度，还能够为结构生物学研究提供更加精准、可靠的实验工具。随着基因编辑和细胞工程技术的进步，预计在未来，通过精确的基因操作能够更有效地创建和利用稳定细胞系。这些技术的进步将促进结构生物学和药物开发中蛋白质的高效和可持续生产。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]本文由义翘神州进行整理，同时提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][u][font=宋体][color=#0000ff]稳定细胞系构建服务[/color][/font][/u][/url][font=宋体]，详情可点击了解！[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=Calibri]Büssow K. Stable mammalian producer cell lines for structural biology. [/font][i][font=Calibri]Curr Opin Struct Biol[/font][/i][font=Calibri]. 2015 32:81-90. doi:10.1016/j.sbi.2015.03.002[/font]

【序号】1【题目】聚噻吩及其衍生物在生物医学领域的应用【作者】王炜; 李大峰; 杨林; 王瑾晔;【链接】http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx?dbname=CJFD2009&filename=GFZT200909008&filetitle=%e8%81%9a%e5%99%bb%e5%90%a9%e5%8f%8a%e5%85%b6%e8%a1%8d%e7%94%9f%e7%89%a9%e5%9c%a8%e7%94%9f%e7%89%a9%e5%8c%bb%e5%ad%a6%e9%a2%86%e5%9f%9f%e7%9a%84%e5%ba%94%e7%94%a8【序号】2【题目】新型阳离子聚合物的制备与性能研究【作者】黄新照;【链接】http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx?QueryID=84&CurRec=1【序号】3【题目】亲水性聚合物在基因载体、表面蛋白固定及蛋白结晶方面的应用【作者】要旸;【链接】http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx?filename=1011045432.nh&dbname=CDFDTOTAL【序号】4【题目】阳离子聚合物基因转染载体的研究【作者】杨生涛;【链接】http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx?QueryID=158&CurRec=1【序号】5【题目】葡聚糖—精胺阳离子聚合物基因载体体外基因转染的研究【作者】平渊;【链接】http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx?QueryID=227&CurRec=1

[font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=18px]海南3日通报，三亚市2月28日确诊病例感染病毒基因测序为奥密克戎变异株。[/size][/font]