巨噬细胞

针对肿瘤的单克隆抗体疗法在很大程度上是通过触发巨噬细胞吞噬癌细胞来驱动癌细胞的清除。然而，癌细胞逃避吞噬作用的机制尚不完全清楚。近日，来自美国的科学家团队在《Nature》杂志发表题为“Inter-cellular CRISPR screens reveal regulators of cancer cell phagocytosis”的文章，详细探讨了癌细胞逃避吞噬作用的机制。　　研究人员对阻碍抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）的因素进行鉴定。发现在癌细胞中除了簇分化抗原47（CD47）等已知因子外，还存在包括酶脂肪细胞质膜相关蛋白（APMAP）在内的许多对ADCP易感性调节因子。APMAP的缺失与肿瘤抗原靶向单克隆抗体和/或阻断CD47的单克隆抗体协同发挥作用，在多数癌细胞类型中显著增加吞噬功能。APMAP的缺失还可以与几种不同的肿瘤靶向单克隆抗体协同抑制小鼠肿瘤生长。使用全基因组反筛选技术，研究人员发现巨噬细胞中G蛋白偶联受体84介导了对APMAP缺陷癌细胞的吞噬增强作用。　　该研究揭示了一种抗体驱动易化吞噬作用的肿瘤内在调节因子，扩展了我们对肿瘤抵抗巨噬细胞吞噬作用机制的认识。 　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41586-021-03879-4

近期，复旦大学研究团队在《ACS Nano》上发表了题为“Sequentially Triggered Bacterial Outer Membrane Vesicles for Macrophage Metabolism Modulation and Tumor Metastasis Suppression”的研究，证实了定向调节巨噬细胞的可能性，同时该团队开发的递送系统可实现对肿瘤微环境中不同类型细胞的靶向调节作用。　　肿瘤微环境中不同类型细胞代谢过程存在异常，许多研究尝试通过调节肿瘤细胞和其他细胞在肿瘤微环境中的代谢途径来抑制肿瘤生长。细菌外囊泡因其外泌体样结构，可作为核酸药物的载体被巨噬细胞吞噬，从而完成对巨噬细胞的基因靶向治疗。基于此，该团队设计了一个以细菌外囊泡为载体的化学药物与Redd1-siRNA的共递送系统。同时，研究人员通过在细胞外囊泡表面增加甘露糖修饰以加强对M2巨噬细胞的靶向作用。通过乳腺癌模型，该团队观察到巨噬细胞活化、肿瘤免疫激活和肿瘤微环境重塑等现象，证明该系统具有较大的研究潜力。　　该研究初步实现了对肿瘤的定向共递送作用，为后续肿瘤递送研究提供了一个新思路。 　　注：此研究成果摘自《ACS Nano》杂志，文章内容不代表本网站观点和立场。　　论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c05613

p　　华中科技大学科研团队揭示了肿瘤微环境中肿瘤细胞与免疫细胞相互调节机制。《临床研究杂志》近日在线发表了该成果。/pp　　近年来，随着肿瘤免疫治疗，特别是Car-T细胞免疫治疗技术和免疫节点治疗在临床上的成功，深入研究肿瘤微环境对免疫细胞功能的调节机制具有重要的基础研究意义。/pp　　华中科技大学基础医学院免疫学系杨想平团队的研究发现，在小鼠模型中，皮下移植的肿瘤细胞在小鼠中生长更快，尾静脉注射的肺腺癌肿瘤细胞向肺转移结节在小鼠中明显增多，血管增多，巨噬细胞向促肿瘤表型极化增强。/pp　　杨想平团队和病理系王国平团队合作发现，在人的临床肺腺癌患者组织中，肿瘤细胞能通过其代谢产物调控巨噬细胞囊泡水解酶表达，从而使肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中编程重组为促进肿瘤生长的免疫细胞。/pp　　该研究还发现囊泡水解酶表达高低可作为肺腺癌重要的预后标志，因此具有重要的临床意义。/pp/p

通过交叉科学研究，提出并发展生物医学前沿新技术，是提高重大疾病治疗效果的重要手段。胶质瘤是发病率和死亡率最高的中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤（GBM）是最恶性的肿瘤，也被称为“癌中之王”。临床上治疗GBM以外科手术为主，同时辅助放化疗，但是效果非常有限；以手术和替莫唑胺联合治疗为例，5年生存率小于5%。因此，亟需开发新型高效的GBM治疗策略。 GMB治疗棘手的原因主要有三方面。首先， 血脑屏障（BBB） 的存在阻止了药物进入中枢神经系统，需要发展更有效的药物递送策略；其次，单一化疗药物的使用易导致耐药性的产生，需要联合新的肿瘤杀伤手段；另外，GBM具有复杂的肿瘤微环境，对其快速生长和向周围组织的浸润起到重要作用，在治疗的过程中不容忽视。 近日，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室 魏炜 研究员、 马光辉 院士、深圳市第二人民医院 李维平 教授，作为共同通讯作者 在 Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊发表了题为： Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects 的研究论文。 该研究基于工程化细胞外囊泡发展了“ 免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动的治疗新策略，为胶质母细胞瘤的治疗带来了新思路。针对胶质母细胞瘤治疗难题，过程工程所生化工程国家重点实验室基于具有定向趋化能力的巨噬细胞的细胞外囊泡 （EVs） 和工程化的设计，提出了“免疫调控-化学动力-乏氧激活”多级联动的治疗新策略，并联合深圳市第二人民医院交叉合作，进行了个体化创新药物制剂的研发。 研究团队首先基于胶质瘤患者的临床样本和小鼠模型进行了免疫组化的研究，发现胶质瘤恶性程度越高，肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞/M1型巨噬细胞的比例也相应更高，并且这些巨噬细胞大多来源于外周血。在此基础上，研究团队提出了以M1巨噬细胞EVs作为载体，一方面可以利用M1巨噬细胞的趋化特性在GBM部位大量蓄积，另一方面可以通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境的免疫调控。图1 胶质瘤样本中巨噬细胞的表型及其来源分析：a. 胶质瘤患者临床样本中巨噬细胞表型分析示意图；b. 不同级别胶质瘤中M1、M2和Ki67（细胞增殖指标）的分析；c. 基于TCGA数据库分析不同级别胶质瘤中M2/M1比例；d. 基于TCGA数据库分析胶质瘤患者瘤内M2/M1比例与生存曲线的关系；e. GBM组织中小胶质细胞和M1巨噬细胞的共定位分析；f. 免疫荧光染色分析GBM组织中小胶质细胞和M2巨噬细胞的共定位；g. 小鼠胶质瘤样本中巨噬细胞表型分析示意图；h. 在不同胶质瘤细胞系（U87MG、G422和GL261）中M1、M2和Ki67的分析；i. 免疫荧光染色分析不同鼠胶质瘤组织中小胶质细胞和M1或M2巨噬细胞的共定位情况；图中标尺均为50 μm 研究团队进一步在M1EVs的细胞膜和内腔差异化装载了化学激发分子对 （CPPO和Ce6） 以及乏氧药物 （AQ4N） ，以此将肿瘤微环境调控、化学激发动力学及肿瘤乏氧治疗合理有序地集成于M1EVs递送系统中。上述仿生剂型 （CCA-M1EVs） 静脉注射后，M1EVs可以携带上述组分穿过BBB进入GBM病灶，进而实现多级联动治疗：M1EVs调控免疫微环境产生大量过氧化氢，从而激发CPPO和Ce6生成自由基 （ROS） ，同时该反应消耗氧气激活细胞毒性药物AQ4N。借助上述作用的协同，在小鼠原位胶质瘤模型和患者来源的 （PDX） 模型上显著抑制了疾病的进程，大幅延长了生存期。图2 基于M1EVs的仿生剂型构建方案、抗肿瘤机制及PDX疗效：a. 仿生剂型的构建示意图；b. 仿生剂型在GBM模型中的累积及免疫调节、化学激发动力学和乏氧触发化疗的协同作用示意图；c. 基于光声成像分析仿生剂型在PDX小鼠GBM病灶中的累积；d. 各组PDX小鼠的抑瘤效果（20天核磁成像）；e. 各组PDX小鼠的生存期分析；f. 各组PDX小鼠的TUNEL分析（标尺50 μm） 十余年来，过程工程所生化室魏炜研究员和马光辉院士创制了一系列仿生递送新剂型，利用其体内的天然路径和属性，在动物模型上成功用于肿瘤、传染病、炎症性疾病的防治，并且部分剂型已通过医院伦理批准进入个体化临床前和临床研究。 深圳市第二人民医院 王晓君 博士和丁辉博士为该论文的共同第一作者，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室魏炜研究员、马光辉院士和深圳市第二人民医院李维平教授为共同通讯作者。论文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41392-022-00894-3

就像外来非洲杀人蜂(Africanized honey bees)，工蜂像大多数肿瘤细胞，而蜂王是癌症干细胞。蜂王可以重新再生整个杀人蜂群体，但其生存依赖蜂王浆。如果去除蜂王浆，蜂王死亡和整个杀人蜂群也会被杀死，而研究发现Th22源性IL-22就是蜂王浆。HZA007PoELISA Kit for Angiogenin (ANG) 猪血管生长素(ANG)检测试剂盒HZA147PoELISA Kit for Adiponectin Receptor 1 (ADIPOR1) 猪脂联素受体1(ADIPOR1)检测试剂盒HZA153PoELISA Kit for Alpha-Fetoprotein (aFP) 猪甲胎蛋白(αFP)检测试剂盒HZA062PoELISA Kit for Interleukin 16 (IL16) 猪白介素16(IL16)检测试剂盒HZB650PoELISA Kit for Major Basic Protein (MBP) 猪主要碱性蛋白(MBP)检测试剂盒HZA225PoELISA Kit for Atrial Natriuretic Peptide (ANP) 猪心钠肽(ANP)检测试剂盒HZA172PoELISA Kit for Platelet Factor 4 (PF4) 猪血小板因子4(PF4)检测试剂盒HZA164PoELISA Kit for Ubiquitin (Ub) 猪泛素(Ub)检测试剂盒HZA164SiELISA Kit for Ubiquitin (Ub) 猴泛素(Ub)检测试剂盒CEA968PoELISA Kit for Aprotinin (AP) 猪抑肽酶(AP)检测试剂盒HZA263PoELISA Kit for Creatine Kinase, Mitochondrial 1A (CKMT1A) 猪线粒体肌酸激酶1A(CKMT1A)检测试剂盒HZA083PoELISA Kit for Leptin Receptor (LEPR) 猪瘦素受体(LEPR)检测试剂盒HZA085PoELISA Kit for Leukemia Inhibitory Factor (LIF) 猪白血病抑制因子(LIF)检测试剂盒HZA088PoELISA Kit for Monocyte Chemotactic Protein 2 (MCP2) 猪单核细胞趋化蛋白2(MCP2)检测试剂盒HZA267PoELISA Kit for Cathepsin K (CTSK) 猪组织蛋白酶K(CTSK)检测试剂盒HZA274PoELISA Kit for Insulin Like Growth Factor Binding Protein 6 猪胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)检测试剂盒(IGFBP6)HZA093PoELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 1 Beta (MIP1b) 猪巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)检测试剂盒HZA095PoELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 3 Alpha (MIP3a) 猪巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α)检测试剂盒HZA096PoELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 3 Beta (MIP3b) 猪巨噬细胞炎性蛋白3β(MIP3β)检测试剂盒CEA097PoELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 1 (MMP1) 猪基质金属蛋白酶1(MMP1)检测试剂盒HZA098PoELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 10 (MMP10) 猪基质金属蛋白酶10(MMP10)检测试剂盒HZA277PoELISA Kit for Connexin 43 (CX43) 猪间隙连接蛋白43(CX43)检测试剂盒HZA099PoELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 13 (MMP13) 猪基质金属蛋白酶13(MMP13)检测试剂盒HZA302PoELISA Kit for Galectin 2 (GAL2) 猪半乳糖凝集素2(GAL2)检测试剂盒HZA304PoELISA Kit for Galectin 4 (GAL4) 猪半乳糖凝集素4(GAL4)检测试剂盒Th22是一种免疫细胞类型T细胞的子集，通常情况下，T细胞是免疫系统的“士兵”，杀死肿瘤细胞。在结肠癌的情况下，研究人员发现，Th22作为肿瘤的辅助，实际上支持细胞变得能够再生（肿瘤干细胞的标志之一）。

7月6日，《自然-免疫学》（Nature Immunology）在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心孙兵研究组与广东医科大学附属医院合作完成的研究成果（Allergen proteases-activated stress granules assembly and Gsdmd fragmentation control IL-33 secretion）。该研究揭示了过敏原蛋白酶诱导的二型免疫反应过程中上皮细胞释放IL-33的分子机制。研究表明，蛋白酶暴露激活了上皮细胞独立于eIF2α（真核生物起始因子2α）磷酸化的应激颗粒（SGs）组装，从而促进IL-33的核质转运；蛋白酶刺激诱导细胞产生新的Gasdermin D（Gsdmd）N端剪切形式p40功能片段，可在细胞膜上形成孔道直接促进细胞质的IL-33释放到细胞外。这两种机制共同高效地的调控细胞核内IL-33的分泌，为干预IL-33依赖的气道过敏性疾病提出新的治疗策略。GSDMD调控IL-1家族蛋白释放机制图　　呼吸道过敏性疾病如哮喘、花粉热（过敏性鼻炎）等是困扰人类的常见疾病。当患者暴露于尘螨、霉菌、细菌、植物花粉和动物皮屑等过敏原时，这些疾病通常加剧并恶化。过敏原中的蛋白酶活性成分是重要致病因子，多种源自尘螨（HDM）、烟曲霉菌真菌（Aspergillus fumigatus）及地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中的丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶，被报道可高效地在体内外诱导白细胞介素33（Interleukin 33: IL-33）的释放。IL-33是一种组成性表达，并定位于细胞核的二型炎症因子，可快速响应环境损伤刺激从而释放到细胞外，进而引发过敏性炎症反应，在引发哮喘等呼吸道炎症性疾病中起到关键作用。尽管IL-33的胞外功能已被广泛报道，但其如何响应外界损伤信号（包括蛋白酶）刺激进而从细胞核释放到细胞外的过程，知之甚少。　　该研究建立了过敏原蛋白酶诱导的小鼠肺部过敏模型和人肺上皮细胞释放IL-33的细胞模型。体外研究发现IL-33可以在30min内快速相应多种的过敏原蛋白酶的刺激释放到细胞外，此过程伴随着具有细胞焦亡功能的Gsdmd蛋白的活化，即N-端剪切新形式p40的产生，但不伴随明显的细胞死亡。这一现象也存在于免疫细胞如巨噬细胞（骨髓来源的巨噬细胞）中。敲除巨噬细胞中的Gsdmd可以显著抑制IL-33在过敏原蛋白酶刺激下的释放，且Gsdmd p40的剪切以及IL-33的释放这一过程不依赖于经典的炎性caspase家族的蛋白酶，因而这是一种新发现的Gsdmd剪切活化的途径。进一步的机制研究表明，过敏原蛋白酶可以快速诱导细胞的应急颗粒（Stress granules）组装活化，进而促进IL-33的核质转移，进入细胞质的IL-33不能直接释放，而需要过敏原蛋白酶诱导的Gsdmd p40的帮助才能释放到细胞外。多种过敏原蛋白酶都可以诱导应急颗粒的组装，但不同于经典的eIF2α-p依赖的应急颗粒组装，过敏原蛋白酶促进eIF2α的降解，从而促进应急颗粒组装。使用eIF2α的抑制因子抑制剂Actinomycin D，可以有效抑制过敏原蛋白酶诱导的IL-33释放。研究发现，在小鼠体内，Gsdmd蛋白在HDM诱导的二型免疫反应的小鼠肺部呈现升高表达趋势，敲除小鼠的Gsdmd，可以有效抑制包括HDM和木瓜蛋白酶（Papain）诱导的气道免疫反应。在哮喘病人中，研究也观察到Gsdmd肺部表达与肺灌洗液中的IL-33以及血液中的IgE呈现正相关趋势，提示通过抑制Gsdmd蛋白剪切可能作为治疗二型免疫反应的新策略。　　研究工作得到国家自然科学基金、科技部、上海市科技创新行动计划，以及分子细胞卓越中心公共技术服务中心动物实验技术平台/化学生物学平台/细胞生物学平台/分子生物学平台的支持。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41590-022-01255-6

单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行，而细胞状态在这一操作中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况，尤其对于基因通路上表达变化的检测为不利。近期苏伊士理工大学使用FluidFM创建了一种原位活细胞基因测序方法，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。1. Live-Seq测序技术简述由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，该团队先使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了优化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件，该团队采用了先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够很快与缓冲液混合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队成功实现了IBA细胞的测序，证明了这种方法的可行性（图1）。图1. Live-Seq技术a. Live-Seq技术的示意图和代表图片，黑色箭头指代液面；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态为了证实Live-Seq的有效性，该团队对多种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性（图2）。图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态a. 实验方法示意图，使用LPS和PBS对RAW细胞进行处理；b. 前500个高度易变基因的tSNE图；c. 前十的细胞型、细胞状态差别基因的热图；d. 小鼠基因图谱预测，使用前100个标记基因的团簇；e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析，显示两者没有显著差异。3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响Live-Seq技术的显著优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察，发现细胞的形态基本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。图3. Live-Seq对细胞活力的影响a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图；c.不同时间点scRNA-Seq所有能够发现差异的基因（共12个）；d.不同时间点的细胞形态图片。4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验发现，Live-seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化，因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达为相关。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析a. 实验示意图；b. 不同处理细胞的mCherry强度变化；c. 3~7.5h之间mCherry强度变化；d. Tnf-mCherry强度变化的线性回归模型；e. Nfkbia与Tnf在Live-Seq测序中的表达关系；f. Nfkbia与Tnf在scRNA-Seq测序中的表达关系；g. Live-Seq测序中细胞处于S期的评分；h. Live-Seq测序中细胞周期的mTnf-mCherry强度变化；i.Tnf-mCherry的荧光强度增量（3~7.5h）。5. Live-Seq技术对同一细胞多次测序Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。图5. Live-Seq对细胞的多次提取j.连续测序的示意图和代表图像；k.Live-Seq的tSNE图；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。 6. 总结Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。 参考文献：[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752 DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

Incucyte发CNS文章速度又提升了！2024年3月13日，《Nature》和《Cell》分别发表了2篇和1篇研究文章，均应用到了Incucyte。值得指出的是，这些成就并不是个例：2023 一周3篇Nature：Incucyte上演科研帽子戏法！2022一天四篇Nature | Incucyte助力罕见病研究这些里程碑式的成就再次说明了Incucyte因其简单的实验设置和分析、丰富的应用方向使得很多用户对其爱不释手，在体外细胞水平的实验中发挥着重要功能。接下来，就让我们一起来看看这三篇文章。Nature阿尔茨海默病新机制斯坦福大学[1]APOE基因编码的蛋白参与将脂肪滴运送到神经细胞中。APOE 有四种变体，即APOE1、APOE2、APOE3和APOE4，其中APOE4能将最多的脂肪带入脑细胞。本文发现，APOE4/4基因型的阿尔茨海默病患者中，大脑的小胶质细胞会更容易进入一种积累脂滴（LD，lipid droplets）的异常状态（LDAM）。在这种状态下的小胶质细胞受到淀粉样蛋白（Aβ）和其它先天免疫因子刺激后，会激发神经细胞中Tau蛋白的磷酸化和细胞死亡。这项研究揭示了APOE4基因诱发阿尔茨海默病的全新作用机制，并且提供了潜在的治疗策略。研究人员将APOE4/4基因型和APOE3/3基因型iPS细胞分化为小胶质细胞，使用中性脂质荧光染料对小胶质细胞进行Incucyte实时活细胞成像。结果显示，与APOE3/3相比，APOE4/4中LD的积累更大。当用Aβ处理APOE4/4时，LD的积累进一步增加。这说明APOE4 AD风险等位基因的存在加剧了LD积累。在这项研究中，Incucyte不仅可以观察到脂质荧光染料在细胞中聚集的图像，还可以统计实时定量曲线。图1. （b）APOE3/3和APOE4/4 ±Aβ细胞中脂质荧光染料的实时定量曲线；（c）实验终点平均脂斑荧光强度；（e）原代大鼠小胶质细胞未经处理(左)或fAβ处理(右)之后脂质体染料图像；（d）终点数据只需选用合适的染料，Incucyte就能捕捉并记录下细胞的每一种活动。Nature巨噬细胞吞噬机理华盛顿大学医学院[2]在发育过程中以及炎症或组织损伤发生时，巨噬细胞通过吞噬并处理多个凋亡尸体（胞葬作用），以实现组织稳态。本研究发现对于人类和小鼠巨噬细胞，RNA聚合酶Pol II控制的暂停/释放在体外和体内连续吞噬作用中是必需的。有趣的是，阻断Pol II暂停/释放并不妨碍Fc受体介导的吞噬作用、酵母摄取或细菌吞噬作用。巨噬细胞使用Pol II暂停/释放作为一种机制，以迅速改变它们的转录程序，高效处理摄入的凋亡尸体，并进行连续的吞噬作用。作者利用了Incucyte实时活细胞成像分析方法，实时展示了暂停Pol II可以增强巨噬细胞的胞葬作用。利用pH敏感染料标记凋亡的细胞，当凋亡的细胞被巨噬细胞吞噬的时候，会在酸性环境下产生荧光，荧光信号越强吞噬能力越强。在Hoxb8来源的巨噬细胞中通过CRISPR-Cas9技术基因缺失负延长因子NELF-B和NELF-CD，可以破坏Pol II的暂停，使巨噬细胞的胞葬作用的增强；这种增强的胞葬作用对阻断肌动蛋白聚合（加入Cytochalasin D，一种有效的肌动蛋白聚合抑制剂，胞葬作用依赖肌动蛋白介导的质膜重塑）仍然敏感（图2g）。巨噬细胞可以通过不同的表面受体和分子机制进行不同类型的吞噬作用。巨噬细胞的吞噬作用受到Pol II暂停/释放抑制剂flavopiridol影响 而巨噬细胞Fc受体介导的吞噬作用不受暂停/释放抑制剂flavopiridol的影响（图2h）。图2. （g）Incucyte分析检测WT和NELF缺陷巨噬细胞与凋亡Jurkat 细胞共孵育后的胞葬动力学；（h）巨噬细胞吞噬凋亡的细胞和巨噬细胞通过Fc受体介导吞噬处理的胸腺细胞Incucyte实时活细胞成像分析有明场、红、绿3个通道，支持选择多种荧光试剂在不同条件下的使用，从而获得不同条件下的实时动力学曲线。Cell新细胞群的发现加州大学旧金山分校[3]本文发现了一类I型干扰素（IFN-Ⅰ）响应性的小胶质细胞亚群（IRMs），这一类独特的小胶质细胞在大脑皮层的发育和感觉功能中发挥重要作用。作者发现在发育应激时有一种特殊类群的小胶质细胞数量明显增加。进一步研究发现这一类群的细胞在皮层重塑期间高度活跃，可发挥吞噬神经元的作用，而在正常大脑发育过程中罕见。作者通过一系列实验发现这一特殊类群小胶质细胞自身的IFN-Ⅰ信号以及dsRNA信号转导导致其对神经元的吞噬作用，在维持大脑健康中发挥着重要作用。原代小胶质细胞吞噬试验中利用Incucyte实时活细胞成像分析系统来跟踪分析。小鼠原代小胶质细胞进行的体外吞噬试验显示，poly（I:C）处理可加速消化凋亡细胞（图3J和3K），而 Ifnar1 缺失则会降低消化效率（图3L和3M）。这些数据表明，IFN-I 信号增强了小胶质细胞消化能力，这与体内 IRMs 经常同时吞噬和消化多个细胞的观察结果一致。图3. 向小胶质细胞中加入吞噬染料标记的凋亡细胞，每小时采集一次，采集24 小时；使用 Incucyte 活细胞分析软件对图像进行阈值处理，并使用红色通道（溶酶体内的凋亡尸体）的综合强度与小胶质细胞表面积（用明场确定）的归一化值进行分析（G）体外小胶质吞噬作用实验设计；（H）典型的吞噬Incucyte实时分析示意图：前端是吞噬作用，后端是消化作用，用线性相中峰前斜率的线性回归斜率来估计吞噬效率(m1)，用峰后斜率来估计消化效率；（I）添加吞噬染料标记的凋亡细胞24小时后WT小胶质细胞培养的代表性图像（左），WT小胶质细胞中添加poly（I:C）（中），Ifnar1缺失的小胶质细胞（右）；（J）和（L）代表实时吞噬染料信号强度；（K）和（M）表示小胶质细胞消化速率Incucyte通过连续采集，可以实时显示1天内小胶质细胞发生的吞噬和消化过程（信号先上再下），捕捉细胞每个细节。总而言之，在上述研究中体现出Incucyte实时活细胞分析系统的独特优势：1. 自动检测，提升实验效率满足密集时间点以及长时间监测的需求，一次实验得到大量数据，解放人力，是从事细胞研究不可或缺的工具。2. 分析简便，提升数据质量软件采集及分析模块配合荧光检测试剂，得到高度可靠的数据。实时检测整个细胞死亡/凋亡曲线，在细胞死亡状况较为接近的情况下，仍然在大量数据的前提下得到确切的结论。3. 6板位设计，多实验同步开展内设6个板位，可以分别独立设置检测程序，满足6组不同实验或多人实验同时检测的需求。 -参考文献-[1] Haney MS, Pálovics R, Munson CN, et al. APOE4/4 is linked to damaging lipid droplets in Alzheimer's disease microglia. Nature. 2024 628(8006):154-161. doi:10.1038/s41586-024-07185-7[2] Tufan T, Comertpay G, Villani A, et al. Rapid unleashing of macrophage efferocytic capacity via transcriptional pause release. Nature. Published online March 13, 2024. doi:10.1038/s41586-024-07172-y[3] Caroline C. Escoubas, Leah C. Dorman, Phi T, et al.Type-I-interferon-responsive microglia shape cortical development and behavior,Cell, Published:March 14, 2024DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.02.020

p style="TEXT-ALIGN: center"img style="WIDTH: 500px HEIGHT: 404px" title="2015812530441140.jpg" border="0" hspace="0" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201508/uepic/28a495d3-f847-4968-980e-a818f89bc0ae.jpg" width="500" height="404"//pp style="TEXT-ALIGN: center"strong活细胞中的塑料球能发出激光。图片来源：M. SCHUBERT/strong/pp　　两组研究人员分别将微小激光器放置在了活细胞内。这听上去可能有点像蚂蚁侠的下一代武器，但这个“小玩意”将极大提高生物学家追踪单个细胞活动的能力——这可能惠及从发育生物学到癌症研究的诸多领域。/pp　　“这有可能做一些你利用其他技术做不到的事。”英国敦提大学生物物理学家David McGloin说。例如，该激光器能追踪的细胞比荧光标记能追踪的更多，并且比高频ID等萌芽技术更简单易用。剑桥大学神经生物学家Kristian Franze也赞同这一观点。“如果他们能开发出适用于活细胞的此类技术，那对许多人而言将非常有趣。”他说。/pp　　要制作一个激光器，你需要两件东西：一种能被激发产生光的材料或“媒介”以及一个回荡着特定波长的光的“共振腔”，就像管风琴会同特有频率的声波共鸣一样。与谐振腔共振的光会刺激该材料发出更多光，极大地放大其效果来创造激光，结果将产生一个能放大光量的反馈回路。/pp　　之前，科学家也曾“摆弄”过以细胞为基础的激光器。例如，2011年，美国哈佛大学医学院生物医学家Seok Hyun Yun和现供职于英国圣· 安德鲁大学的物理学家Malte Gather，利用工程改造后包含绿色荧光蛋白的单个细胞作为发光媒介，并将其置于一个共振腔内，从而制造了一个激光器。但没有人制出放置在单个细胞内的激光器。/pp　　研究小组多年来一直在探索以单细胞为基础的激光，希望在活组织内造出会发荧光的细胞，以便在这些细胞工作时跟踪它们，深入揭示身体内部机制，比如癌症是如何开始的。目前，Gather和Yun正在利用类似技术分别进行研究。/pp　　一个困难环节是将腔囊放置在细胞内。Gather和同事将细胞与直径约为5~10微米的塑料球混合，这些小球被掺杂了荧光染料。小珠子充当了空腔，而染料则充当了媒介。细胞经由内吞作用将小球吸入“体内”，这一过程就像免疫细胞吞噬病原体。由于这些球体用荧光染料浸过，所以用一种颜色的光撞击后，它们会发出另一种颜色的光。这种光接着在球体内共振，引发激光作用，并放大自己。重要的是，每一束激光会根据球体的精确尺寸发出12种不同波长的光。相关论文发表在近日出版的《纳米快报》上。这一技术能作用于4类细胞，包括人类巨噬细胞和一种白血细胞。/pp　　研究人员指出，这一技术在细胞传感、医疗成像等领域有着广泛应用。“改写传统激光研究领域的知识并在这个平台上展开研究以便将激光性能最优化，将是一件有趣或者说非常激动人心的事情。”Yun表示。/pp　　之后，研究人员设计出一种5纳秒的光脉冲激活这些染料。它发射的光能沿球体的中间线运行——通过一种名为全内反射的过程进行约束。特定波长的共振和增加会更强烈，直到珠子发出足够的激光。/pp　　Yun和同事Matjaz Humar还设法诱导细胞“吞下”塑料珠子，并且他们制造了两类共振球，相关成果日前在线发表于《自然—光子学》期刊。研究人员利用一个细胞内的脂肪滴或油滴反射和放大光，从而产生激光。Yun和Humar报告说，他们能改变波长，并且利用不同直径的荧光聚苯乙烯微球而不是被注射进去的油滴或脂肪滴标记单个细胞。理论上，利用不同组合的微球和具有不同光谱特性的染料，应当可以使为人体中存在的几乎所有细胞进行单独标记成为可能。/pp　　Yun和Gather表示，这些激光器最显著的应用可能将是追踪单个细胞的行动。每个塑料珠子的直径和光学特性都略有不同，因此它们能有效区分波长，充当细胞条形码。Gather和同事用19小时在细胞培养皿中追踪了少量巨噬细胞，而Yun和Humar也进行了类似验证。/pp　　由于激光器能在明确的波长上照亮细胞，这让它们比荧光蛋白质标记等其他细胞追踪技术更有优势。包含荧光染料和蛋白的传统荧光探针拥有相对较宽的发射光谱——约30～100纳米。这限制了能被同时使用的探针数量，因为通常很难从组织中天然分子广泛的背景发射中区分出这些发光源。但这种激光器的光谱特性使其能同时追踪数千个微小指向标。研究人员通过为每个细胞装载数个小球将这一数字扩展到数百万或数十亿。然后，每个细胞将以不同的波长组合发射激光。/pp　　但这一技术还有很长的路要走。首先，研究人员需要确定不同的细胞类型都能“吞下”小球，尤其是活组织中的细胞。Gather预测，这将不是问题。“我相信该技术是可归纳的。”他说。另外，研发人员必须缩小塑料球的尺寸。Yun承认，现在的小球会将细胞填满。但Yun和Gather已经证实，他们可以用更小的玻璃球代替塑料球。/pp　　由于细胞发光可以持续一个较长的周期，可以在较长时间里识别和跟踪活组织内的细胞，有望为研究人员提供一种很有潜力的手段，执行细胞内传感、自适应成像，还可能真正看到肿瘤细胞的生长过程。但科学家指出，目前这一技术还只用在实验室培养的活细胞中，但他们希望进一步研究能带来用于动物实验的细胞跟踪系统，并最终用于人类。“不管怎样，它非常酷!”McGloin说。/p

癌症仍然是威胁人类健康最大的敌人之一，虽然目前针对癌症的治疗方案有了很大的发展，但是癌症治愈难并且治疗费用高的现状仍然不会在短时间内得到改善。因此，除了在治疗阶段应对癌症外，早期的诊断检出仍然是降低肿瘤死亡率的重要手段。除常规筛查外，内源性肿瘤标志物的检测成为当前发展的新兴技术，其中包括CTC，ctDNA以及肿瘤外泌体等的检测。内源性标志物检测的难点在于体内标志物会快速清除且检测背景高以及体内无法富集都是导致它们应用难以推广的重要原因。为解决这个难题，美国斯坦福大学医学院的Sanjiv Gambhir博士团队对免疫细胞中的巨噬细胞进行改造，成功在小鼠肿瘤模型中实现肿瘤细胞的早期检测和跟踪标记。其主要策略是：通过对巨噬细胞进行改造，在肿瘤诱导产生的M2型巨噬细胞的启动子后面标记上生物发光的标记。当在肿瘤环境中，可以更加诱导巨噬细胞向M2型分化，并启动荧光素酶基因的表达。利用该策略可以检测出转移瘤以及皮下瘤的发生。目前，这项技术可用于检测直径小至4毫米大小的肿瘤，不仅更加优于常规肿瘤体积检测，而且与常见生物标志物检测相比，如体外RLU方案，CEA指标检测方案 ，ctDNA，qtPCR方案等检测，表现出更高的灵敏度。参考文献Sanjiv S. Gambhir et al. Engineered immune cells as highly sensitive cancer diagnostics. Nature Biotechnology (2019).

肿瘤异质性对癌症预后和治疗反应有显著影响。传统的基因组和转录组分析被广泛用于研究不同的癌症类型，在预测预后和对不同治疗的反应以及为癌症治疗提供靶点方面具有潜在作用。不同癌症类型的单细胞分析表明，肿瘤免疫微环境的详细信息在多种癌症类型之间共享。目前，自从发现检查点抑制剂以来，免疫治疗彻底改变了癌症治疗并引起了越来越多的关注。肿瘤免疫微环境由非细胞成分(血管、细胞外基质、信号分子等)和细胞成分(T细胞、髓细胞、成纤维细胞等)组成。尽管传统的基因组和转录组学分析，也强调免疫相关途径和计算方法，并已应用于预测免疫细胞成分，但技术限制阻碍了时间的精确表征。传统的批量基因组和转录组分析获得的信号均来自不同细胞，掩盖了特定细胞类型和状态的识别。原位杂交和免疫组织化学已被用于探索单个细胞的基因组、转录组和蛋白质组学特征，但其产量相对较低。流式细胞术能够分析数千或数百万个单细胞蛋白质组学图谱；然而，这些方法需要事先选择感兴趣的抗体。随着细胞分离和测序技术的突破，单细胞转录组测序已经能够在单次运行中在单细胞水平上对许多细胞进行无偏好的全基因组分析。单细胞转录组测序已被用于分析单个细胞的转录组学，用于解析细胞间的异质性。肿瘤免疫微环境在诊断、治疗和预测不同类型癌症的预后方面显示出了潜力。与传统方法相比，scRNA-seq可用于识别新的细胞类型和相应的细胞状态，加深了我们对肿瘤免疫微环境的理解。1.介绍了scRNA-seq的原理，并比较了不同的测序方法。2.根据肿瘤免疫微环境中新的细胞类型、持续的过渡状态以及肿瘤免疫微环境成分之间的相互通讯网络找到了癌症的预后预测和治疗的潜在靶点。3.总结出在肿瘤免疫微环境中应用scRNA-seq后发现的由癌症相关成纤维细胞、T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞组成的新型细胞簇。4.提出了肿瘤相关巨噬细胞和耗尽的T细胞的发生机制，以及中断这一过程的可能靶点。5.对肿瘤免疫微环境中细胞相互作用的干预治疗进行了总结。几十年来，肿瘤免疫微环境中的细胞成分定量分析已被应用于临床实践，预测患者生存率和治疗反应，并有望在癌症的精确治疗中发挥重要作用。总结目前的研究结果，我们认为单细胞技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以导致发现癌症治疗的新观点，并应用于临床。最后，作者提出了肿瘤免疫微环境研究领域的一些未来方向，并认为通过scRNA-seq对这些方向进行辅助。相关会议预告：8.30召开，点击报名scRNA-seq在刻画肿瘤免疫微环境中的应用scRNA-seq技术进展scRNA-seq程序主要包括单细胞的分离和提取、cDNA合成、核酸扩增、测序和数据分析。与传统的批量测序相比，scRNA-seq单个细胞中的RNA量相对较少。因此，需要更有效的扩增方法。研究人员已经成功建立了稳定的单细胞文库构建过程，以产生足够的cDNA用于测序。单细胞分离和捕获是scRNA-seq在不同方法中的基本程序。目前单细胞分离和捕获的常用方法。这些程序分为四大类：激光捕获微切割、油滴包裹技术、流式细胞荧光分选技术和微流控微孔技术。scRNA-seq技术的未来发展可能会降低成本并增加细胞产量，使scRNA-seq成为研究单个细胞转录组的标准工具。肿瘤免疫微环境的细胞成分肿瘤免疫微环境的细胞成分包括淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)、成纤维细胞和其他免疫细胞。成纤维细胞传统上被归类为基质细胞，因为它们在构建细胞外基质中发挥着重要作用。在这里，作者将肿瘤免疫微环境的癌相关成纤维细胞包括在内，因为它们分泌丰富的促炎和抗炎因子来重塑免疫微环境。细胞毒性CD8+T细胞识别肿瘤细胞上的特异性抗原并随后消除它们，是免疫微环境最常见和最有效的免疫细胞。CD8+T细胞的细胞毒性功能依赖于CD4+T Th1细胞。其他CD4+T细胞，包括Th2细胞和Th17细胞，也促进肿瘤微环境中的免疫反应。调节性T细胞抑制肿瘤免疫微环境并加剧肿瘤进展。自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞也参与其中。它们的受体识别肿瘤细胞，从而激活其他免疫细胞。作为先天免疫的重要组成部分，骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞，在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。巨噬细胞通常分为促炎M1和抗炎M2表型。肿瘤相关巨噬细胞主要由M2巨噬细胞组成，通过产生生长因子和细胞因子促进肿瘤生长、肿瘤存活和血管生成。DC对于T细胞的抗原呈递至关重要，连接先天免疫和适应性免疫。癌症相关成纤维细胞在肿瘤免疫微环境中维持增殖和分泌调节因子，可分为炎症性CAF和肌纤维母细胞CAF。炎症性CAF具有较高的细胞因子和趋化因子分泌，而肌纤维母细胞CAF高度表达收缩蛋白，成纤维细胞对免疫微环境起相互抑制作用。研究表明，成纤维细胞募集M2巨噬细胞和调节性T细胞，抑制肿瘤微环境中的免疫反应。肿瘤相关成纤维细胞也被发现在某些情况下会支持抗肿瘤免疫。除了分泌抗体，B细胞还通过产生与T细胞相互作用的细胞因子参与细胞免疫。研究表明，B细胞抑制细胞毒性T细胞并诱导CD4+T细胞分化为调节性T细胞。B细胞也是最近引入的三级淋巴结构的重要组成部分，富含B细胞的三级淋巴结构与各种肿瘤的生存和免疫治疗反应有关。先前的研究强调了细胞成分在时间中的重要作用。然而，免疫细胞的鉴定常基于有限的细胞标记，并借助免疫组织化学。个体免疫细胞的转录组图谱是探索不同免疫细胞及其相应功能所必需的。为了理解细胞进化过程及其决定因素，有必要应用scRNA-seq观察每个细胞的转录动态。利用scRNA-seq探索免疫微环境的新发现聚类和注释对于解释scRNA-seq数据探索至关重要。根据细胞相似性对数据进行划分，挑战在于在不提供先验知识的情况下估计固有的簇数或密度。可能的解决方案是采用分层聚类方法来揭示细胞的分层结构，这也与细胞本体相一致。给定聚类方法产生的数据划分结果，需要细胞类型注释来提供生物学意义。注释的主要挑战是确定每个聚类中存在多少细胞类型，以及是否存在当前未发现的细胞类型。在实践中，研究人员通常首先识别每个聚类的标记基因，然后根据专业知识和文献对其进行注释。scRNA-seq使研究人员能够以更高的分辨率将免疫细胞分类为具有不同功能的亚群，描述了免疫细胞的常规亚型。利用scRNA-seq发现的淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)和成纤维细胞的组成(图2)。人和小鼠样本的scRNA-seq表明，成纤维细胞可分为抗原呈递CAFs、癌症相关成纤维细胞或肌成纤维细胞。抗原提呈CAFs独特地表达主要组织相容性复合体(MHC)II类基因，包括激活CD4+T细胞的CD74。在结直肠癌中也观察到类似的抗原提呈CAFs亚群。乳腺癌症基因工程小鼠模型中成纤维细胞的scRNA-seq进一步鉴定了血管CAF、基质CAF、发育CAF和循环CAF。血管CAF、基质CAF和发育CAF似乎起源于固有成纤维细胞和恶性细胞发生上皮-间充质转化时的血管周围位置。循环CAF是血管CAF群体中增殖的部分。在其他小鼠模型中也发现了血管CAF和基质CAF，它们在患者乳腺肿瘤样本中是保守的，并且发现它们会增加乳腺癌症细胞的转移。提高CAF的分辨率为开发精确靶向CAF的药物提供了生物标志物。另一项关于乳腺癌症的scRNA-seq研究将调节性T细胞分为五类：共表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的调节性T细胞、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，以及相互或仅表达相同基因的GITR和其他调节性T细胞，它们具有不同的功能。不同预后的患者具有不同比例的调节性T细胞簇，为个性化治疗提供了靶点。免疫微环境对T细胞和髓细胞进行了更详细的泛癌研究，发现存在颗粒酶K+T细胞、干扰素刺激基因+T细胞、杀伤细胞免疫球蛋白样受体在记忆性T细胞和NK细胞上表达、转录因子7+CD8+T细胞，ficolin 1+常规DC2、分泌性磷酸蛋白1+TAM，以及肿瘤微环境中的叶酸受体β+TAMs。基于scRNA-seq数据，免疫微环境还发现了新的免疫细胞亚群。葡萄膜黑色素瘤的scRNA-seq鉴定了以前未识别的细胞类型，包括主要表达检查点标记LAG3而不是程序性死亡-1或CTLA-4的CD8+T细胞。同时，在肝细胞癌中发现浸润耗尽的CD8+T细胞和具有高表达layilin的记忆T细胞的克隆富集，这些研究为癌症免疫治疗提供了新的靶点。因为CD8+T细胞是参与消除恶性细胞的主要成分。大肠癌CXC基序趋化因子的scRNA-seq鉴定配体BHLHE40+Th1样细胞与干扰素-γ调节转录因子BHLHE40。在不稳定肿瘤中，这些细胞对免疫检查点阻断有良好的反应，可能会提高免疫疗法的疗效。树突状细胞对于呈递抗原以激活肿瘤免疫微环境中的T细胞是必不可少的。胃癌的scRNA-seq揭示了一个新的树突状细胞簇，表达吲哚胺2,3-双加氧酶1和趋化因子C–C基序趋化因子配体(CCL)22、CCL17、CCL19和白细胞介素-32，它们参与T细胞的募集。胰腺导管腺癌的scRNA-seq还鉴定了除了常规细胞标记物之外还高表达吲哚胺2,3-双加氧酶1的树突状细胞簇。吲哚胺2,3-双加氧酶1对于催化色氨酸消耗和犬尿氨酸产生、抑制T细胞增殖和细胞毒性至关重要，这揭示了树突状细胞和T细胞之间的密切相互作用。此外，通过scRNA-seq鉴定了溶酶体相关膜蛋白3+树突状细胞，并且似乎是经典树突状细胞族的成熟形式。溶酶体相关膜蛋白3+DC可以迁移到淋巴结，并高度表达与T细胞相互作用的配体。这些表达特异性标记物的新型树突状细胞簇的发现为癌症免疫治疗提供了一个新的视角。使用scRNA-seq在肺腺癌中发现了肿瘤相关巨噬细胞的新特征基因，包括髓系细胞触发受体2、CD81、具有胶原结构的巨噬细胞受体和载脂蛋白E。此外，乳腺癌症的scRNA-seq表明，除了M2型基因如CD163、跨膜4域A6A和转化生长因子β1外，血管生成因子纤溶酶原激活剂、尿激酶受体和IL-8也在肿瘤相关巨噬细胞中表达。肿瘤相关巨噬细胞中这些新的基因特征图谱与患者生存相关，并为癌症治疗提供了新的潜在靶点。肿瘤样本scRNA-seq显示，一个肿瘤相关巨噬细胞亚群呈现出SPP1、巨噬细胞清除剂受体MARCO和MHC II类基因的高表达。MARCO和SPP1是巨噬细胞激活中的抗炎和免疫抑制信号，而MHC II类基因与促炎功能有关。其他scRNA-seq研究表明，肿瘤相关巨噬细胞经常同时具有促炎和抗炎特征。这一现象表明，肿瘤微环境中的巨噬细胞活化与传统的M1/M2极化不一致。图2：利用scRNA-seq揭示免疫微环境中的新的免疫亚群单细胞数据揭示免疫细胞进化大多数免疫细胞都处于细胞发育过程中。大量的免疫细胞处于发育轨迹的瞬态状态，而不是分化良好的细胞的离散状态。借助scRNA-seq和深入分析，研究人员可以探索分化细胞的特征、特定细胞类型的转变及其可能的机制。最常用的计算方法是拟时序分析。轨迹描述了细胞的发育过程，其特征是基因表达的级联变化。分支点代表细胞分化的显著差异。各种机器学习计算方法已被用于构建轨迹，包括Monocle3、DTFLOW、DPT、SCORPIUS和TSCAN，这些方法已在单独的综述中进行了评估和比较。由于肿瘤相关巨噬细胞和T细胞代表了免疫微环境中最丰富的免疫细胞类型，这里主要关注这两种细胞类型。scRNA-seq显示，TAMs经常共表达M1基因，包括TNF-α和M2基因，如IL-10，并且肿瘤相关巨噬细胞的分化和状态与其抗肿瘤作用直接相关。拟时序轨迹分析证实，肿瘤相关巨噬细胞在M1和M2表型之间连续转换。转录因子IRF2、IRF7、IRF9、STAT2和IRF8似乎在决定TAMs分化中很重要，并可作为表观遗传学靶点诱导肿瘤相关巨噬细胞的M1极化，从而产生促炎和抗肿瘤的微环境。使用环境刺激和抗原T细胞受体(TCR)刺激测定T细胞表型。不同状态的细胞之间TCR库的重叠，即TCR共享，也可用于研究T细胞的进化。结合scRNA-seq和TCR追踪在结直肠癌中发现20个具有不同功能的T细胞亚群。在黑色素瘤肿瘤的耗竭T细胞中发现了28个基因的耗竭特征，包括TIGIT、TNFRSF9/4-1BB和CD27，并且在大多数肿瘤的高耗竭细胞中也被发现上调。另一项关于T细胞的研究进一步鉴定了CD8+T细胞中的其他耗竭标记物，如LAYN、普列可底物蛋白同源物样结构域家族A成员1和突触体相关蛋白47。拟时序轨迹分析表明，T细胞在时间上处于连续激活和终末分化(衰竭)状态(图3)。已经进行了额外的研究来研究耗尽的T细胞的进化和逆转T细胞耗尽的潜在靶点。scRNA-seq与TCR分析相结合表明，功能失调的衰竭T细胞和细胞毒性T细胞可能在时间上与发育有关。因此，研究集中在CD8+T细胞从效应细胞到衰竭T细胞的过渡过程。scRNA-seq鉴定出两个CD8+T细胞簇为非小细胞肺癌中预先耗尽的T细胞。在肺腺癌中，预先耗尽与耗尽的T细胞比率与更好的预后相关。因此，在耗尽前中断预先耗尽的T细胞可能对癌症免疫治疗至关重要。由于免疫细胞和恶性细胞之间的密切相互作用，恶性细胞的进化在免疫细胞进化中也起着至关重要的作用。拟时序轨迹分析表明，转移性肺腺癌的轨迹分支不同于向纤毛细胞和肺泡型细胞的正常分化。受恶性细胞进化的影响，正常的骨髓细胞群体被单核细胞衍生的巨噬细胞和新型树突状细胞取代。T细胞也被发现会衰竭，从而构建免疫抑制的肿瘤微环境。同样，另一项研究表明甲状腺癌症细胞来源于乳头状甲状腺癌症细胞亚簇，其中构建了不同的肿瘤免疫微环境，导致预后显著恶化。图3：肿瘤相关T细胞和巨噬细胞的进化过程免疫微环境中不同细胞间的通讯网络免疫微环境上的细胞通讯与肿瘤进展有关。配体-受体相互作用是一种重要的细胞通讯类型，对于构建免疫微环境和识别潜在的治疗靶点至关重要。scRNA-seq是在细胞基础上进行的，这使得研究未发现的细胞相互作用变得可行。已经开发了许多基于scRNA-seq数据研究配体-受体相互作用的分析工具，包括iTALK、CellTalker和CellPhoneDB。这些工具利用了已知配体-受体对相互作用的数据库。其中，CellTalker利用差异表达的基因，而CellPhoneDB包括配体和受体的亚基结构。其他工具，如NicheNet，也考虑了受体细胞下游通路的变化。在肿瘤进展过程中，恶性细胞导致免疫细胞的募集和功能障碍，从而相互影响肿瘤的发生和恶性细胞的进化，形成恶性循环(图4)。发现TAMs通过表皮生长因子受体-双调节蛋白配体受体对与恶性细胞相互作用。在基底样乳腺癌细胞系中AREG的调节导致抗炎TAMs的招募。同时，基于scRNA-seq，发现了一种EGFR相关的反馈回路可促进胰腺腺鳞癌的进展。来源于TAMs的抑瘤素M也与其在恶性细胞上的受体相互作用，以激活信号转导子和转录激活子3。研究人员通过整合素受体与胶原蛋白、纤维连接蛋白、血小板反应蛋白1配体和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-R-反应蛋白3的相互作用，发现CAF与胃癌细胞之间的通信，这些配体调节干细胞。此外，胰腺导管腺癌的scRNA-seq揭示了TIGIT与T细胞和NK细胞中的甲型肝炎病毒细胞受体2之间的相互作用，以及它们在恶性细胞中的相应配体PVR和LGALS9，导致免疫细胞功能障碍和胰腺癌症进展。因此，基于单细胞数据探索免疫细胞和恶性细胞之间的细胞相互作用提供了可能治疗靶点，以打破肿瘤进展的恶性循环。除了恶性细胞外，scRNA-seq和随后的分析还预测了免疫细胞之间在时间上的相互作用，这表现出相反的功能(图3)。例如，研究发现TAM降低了CXCL12-C-X-C基序趋化因子受体3和CXCL12-CXCR4的相互作用，增强了鼻咽癌细胞毒性T细胞和Tregs之间的CD86-CTLA-4相互作用，导致肿瘤免疫微环境加重癌症进展。此外，CAFs通过分泌CXCL12募集Tregs，并通过periostin与M2巨噬细胞相关。图4：免疫微环境中的细胞通讯网络基于scRNA-seq的肿瘤免疫微环境的临床应用和潜在靶点几十年来，临床实践中一直采用时间的量化来预测患者的生存率和对治疗的反应。利用免疫组化分析的免疫评分，量化肿瘤中的原位免疫细胞浸润。与传统的免疫评分相比，scRNA-seq在免疫微环境上提供了前所未有的渗透免疫细胞分辨率。已经鉴定出与预后相关的新的免疫细胞簇。例如，在早期复发的肝细胞癌中发现了一种独特的低细胞毒性先天性样CD8+T细胞表型。这些T细胞过表达KLRB1，同时下调共刺激和耗竭相关分子，包括肿瘤坏死因子受体超家族、成员9、CD28、诱导型T细胞共刺激因子、TIGIT、CTLA-4和HAVCR2。这种T细胞簇的浸润与癌症的不良预后相关。此外，基于scRNA-seq的细胞相互作用也被计算在预测模型中。基于细胞间通讯相关基因构建了机器学习模型，以预测肺腺癌的复发。将八个细胞间通讯相关基因和患者的临床信息相结合，获得了0.841的受试者-操作者特征曲线下面积。除了预后预测外，肿瘤免疫微环境中独特的细胞相互作用也与免疫疗法的反应有关。scRNA-seq分析发现，抗PD-1治疗的应答者和非应答者之间存在不同的细胞-细胞通信网络，有可能预测患者对抗PD-1疗法的反应。因此，在scRNA-seq的帮助下，可以更准确地预测患者的预后和对免疫疗法的反应。利用scRNA-seq在精准医学中具有启发性，例如帮助靶向治疗克服耐药性。例如，医生在使用替比法尼治疗的非CR肌肉浸润性膀胱癌症患者治疗前后应用患者衍生异种移植物的scRNA-seq。在治疗后的PDX中发现PD-L1的上调，并降低了免疫细胞的抗肿瘤作用。因此，选择了用PD-L1抑制剂进行额外治疗。随后，患者获得了良好的反应。此外，在单药耐药性肿瘤中，通过scRNA-seq鉴定了新的免疫亚型。用抗集落刺激因子1受体阻断TAMs不能减少胆管癌的肿瘤进展。scRNAs-eq鉴定了表达APOE的粒细胞髓系衍生抑制细胞的补偿富集，其介导T细胞抑制。TAMs和粒细胞性骨髓源性抑制细胞的双重抑制与抗CSF1R和抗淋巴细胞抗原6复合物、基因座G治疗联合增强了小鼠的免疫检查点阻断效果小鼠模型，这在临床实践中很有前景。除了治疗耐药肿瘤外，scRNA-seq在免疫微环境上的应用也突出了需要进一步研究的潜在新靶点。T细胞是免疫微环境中去除恶性细胞最重要的免疫细胞。然而，在不同的肿瘤中，耗尽的CD8+T细胞会导致不利的预后。除了众所周知的免疫抑制检查点外，scRNA-seq还鉴定了高表达内皮前体蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1和内皮素受体B型的耗尽CD8+T细胞，这些细胞可以作为新的潜在靶点。髓细胞是免疫微环境招募免疫细胞所必需的。通过scRNA-seq鉴定TREM2/APOE/补体组分1，q亚组分阳性巨噬细胞浸润为透明细胞肾癌复发的预后生物标志物。另一项研究证实，小鼠中靶向TREM2的抗体与缺乏MRC1+和CX3CR1+巨噬细胞以及表达免疫刺激分子的髓系簇的扩增有关，这促进了T细胞反应并导致更好的预后。细胞相互作用也可以用作治疗靶点。肝内胆管癌的scRNA-seq揭示了血管CAFs与肝内胆管细胞之间的串扰。血管CAFs分泌的IL-6诱导Cajal间质细胞细胞的表观遗传学改变，从而增强恶性肿瘤。因此，IL-6信号在Cajal间质细胞的中断变得非常有趣。表1总结了scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点。表1：scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点总结scRNA-seq可以绘制全面的肿瘤免疫微环境细胞图谱，为各种肿瘤的临床应用提供了新的视角。此外，免疫微环境的细胞成分和通讯为癌症治疗提供了潜在靶点，并有助于精确医学的发展。技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以发现癌症治疗的新观点，助力临床研究。作为突破性的新技术，单细胞分析技术有望逐渐取代传统的整体样本二代测序。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔，可以代替或补充分子、细胞和组织病理检测的现有技术，也可以用于新兴的细胞治疗。

为了对衰老细胞的分子特性进行进一步的理解，美国梅奥医学中心Jan M. van Deursen研究组与Hu Li研究组通过筛选不同的应激因素、细胞类型以及在哺乳动物体内寻找与衰老相关的增强子，希望能够鉴定出免疫系统识别衰老细胞的关键因素。这项工作发表在Science上题为p21 produces a bioactive secretome that places stressed cells under immunosurveillance。研究发现细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21除了经典的细胞周期阻滞的作用之外，会作为免疫监视“侦察兵”以及“计时器”的作用帮助机体建立内在的监察机制，促进衰老细胞的清除，确保机体的稳态。为了对衰老细胞在分子水平上进行更深入的了解，作者们希望鉴定衰老相关的超级增强子所控制的基因。在最初的筛选中，作者们使用了小鼠胚胎成纤维细胞这一体外系统，并且应用在三种不同的衰老诱导应激胁迫条件：γ-射线、过度复制以及癌基因诱导。作者们绘制了细胞过渡到衰老状态后超级增强子以及与这些超级增强子相关的转录激活基因，从中作者们找到了p21这个被调控的基因位点。p21是一个传统的细胞周期抑制因子，在筛选中发现该基因位点引发了作者们的兴趣， 这可能暗示了p21在衰老细胞中还具有其他的功能。为此，作者们在细胞中敲降了p21，发现衰老相关的基因表达中有三分之一是p21依赖的，因此作者们将这种表型称为p21激活的分泌表型（p21-activated secretory phenotype，PASP）。在受到影响的因子中，作者们将目光集中在Rb（Retinoblastoma protein）蛋白之上，因为在p21敲降后Rb在衰老细胞中缺失并且会降低衰老相关分泌表型的减弱。因此，p21是通过降低Rb的磷酸化对SASP产生影响。为了进一步地探究p21介导的Rb低磷酸化水平是如何激活衰老相关分泌表型基因的，作者们对调控不同衰老相关进转录因子以及不同衰老条件所产生的RNA-seq数据进行分析。作者们发现Rb会促进衰老细胞中这些关键转录因子的转录活性，从而建立起p21依赖的衰老相关分泌表型的产生。另外，作者们还发现p21所控制的转录程序是响应应激胁迫的第一道关，会在细胞周期阻滞的情况下开启机体的免疫监控。但是p21的这种免疫监控是如何开启的呢？作者们对衰老相关的分泌表型因子进行分析，发现小鼠胚胎成纤维细胞来源的p21依赖的分泌因子中包括Cxcl14，这是CXC家族趋化因子之一，会作为多种免疫细胞化学引诱剂发挥作用【1】。为了验证p21是否是由CXCL14开启机体的免疫监控的，作者们在实验系统中加入了CXCL14中和抗体，发现在加入后巨噬细胞被引诱后迁移的现象会消失。为了进一步在体内的系统证明这一观点，作者们对构建了标记的p21小鼠品系，p21过表达后肝脏细胞会出现显著的衰老特征，比如laminB1缺失以及HMGB1的核挤出等。但是随着时间的流逝，p21过表达的肝脏细胞数量显著降低，说明这些衰老的细胞会被清除。而再加入中和抗体后，衰老细胞的清除现象就会消失。那么p21所介导的衰老分泌表型因子的是否是特异的呢？为此作者们构建了p16以及p27的过表达品系。p16与p21相比是一个更为特异的细胞周期依赖性激酶抑制因子，只靶向G1-CDK。作者们发现p16也会出现显著的细胞周期抑制，但是并不能促进巨噬细胞的迁移。同样的，p27会作为在细胞终末分化的细胞周期发挥作用，而不似p21。因此，细胞周期阻滞与免疫监控是p21而非其他细胞周期依赖性抑制因子的特征。通过癌变诱导的应激胁迫，作者们证明了在癌基因诱发的应激胁迫中p21所介导的免疫监控作用也会发挥功效，从而作为应对胁迫的第一道防线保护机体的健康和稳态。但应激诱导的致癌点突变是不可修复的，但细胞一般来说遇到的很多应激胁迫都是短暂的或者是可以修复的。那么p21依赖的衰老分泌表型是否可以对可逆的应激胁迫进行响应呢？作者们构建了慢病毒载体的p21小鼠品系，在阿霉素（Dox）作用的情况下会产生符合p21过表达的表型，而在去除阿霉素后p21的水平会逐渐恢复正常，作者们发现p21恢复正常水平后，p21依赖的衰老分泌表型缓解下来，巨噬细胞会从应激胁迫的上释放，细胞的免疫监控状态停止。总的来说，该工作鉴定发现了经典的细胞周期蛋白依赖性激酶p21在应激状态下作用“侦察兵”发挥免疫监控作用（图1），通过促进细胞释放趋化因子CXCL14等招募巨噬细胞，清除机体中危险的存在，同时又具有生物内在“计时器”功能，在应激胁迫撤出的情况下促进衰老分泌表型的缓解，从而解除多细胞内的警报，促使机体恢复正常状况。同期刊发观点文章对该文章进行介绍题为Clearing stressed cells，介绍了该工作中鉴定发现p21不仅对于衰老细胞的周期阻滞有关，还会早期阶段对受到胁迫的细胞进行免疫监控，清除受到胁迫的细胞。在细胞对内在环境进行修复，促使p21恢复正常水平后，可以使得巨噬细胞解离。但是应激胁迫造成的威胁超过细胞的修复能力后，细胞依赖于p21所释放的CXCL14等在内的趋化因子会招募巨噬细胞，巨噬细胞激活后招募T细胞，从而维护多细胞内环境的稳态。原文链接：https://doi.org/10.1126/science.abb3420

目前，单细胞组学分析大都依赖于将细胞裂解的方案，单细胞活检是少有的非侵入性的单细胞分析方法，它允许研究人员在不杀死细胞的情况下获取细胞的转录组信息，单细胞组学通过分离和分析单个细胞的分子成分来阐述细胞异质性。从单细胞活检中获得的基因表达谱是裂解方案获取细胞转录组的全面升级 (Chen et al., Nature, 2022)。FluidFM OMNIUM在单细胞组学研究中的特征：多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM，可以自动、高效的完成单细胞提取或单细胞注射实验，可有效应用于原位活细胞基因测序Live-seq和单细胞活检，让研究人员能够在不杀死细胞的情况下对细胞进行转录组测定，从而为单细胞转录组学带来新的范式。在表型分型前记录细胞转录组。记录随时间推移的转录事件，以揭示分子成分如何影响细胞行为。直接链接单个细胞的历史和生长轨迹，揭示过去的细胞状态和了解细胞的谱系决定。在接受特定疗法之前和之后，对异质性疾病的单细胞进行活检，以确定用于早期药物开发的分子标签。FluidFM OMNIUM进行单细胞活检的显著优势：无创单细胞活检在不改变基因表达、细胞表型或细胞间相互作用的情况下获得可靠的结果。通过活检对单细胞进行连续和实时监测FluidFM提取保留细胞活力:在相同的运行中从相同的细胞中提取几次或随时间周期性地提取。分析时间序列基因表达单细胞转录组序列分析Live-seq活细胞单细胞测序和单细胞活检是如何进行：Live-seq活细胞单细胞测序方法将FluidFM OMNIUM系统与高灵敏度的低输入RNA-seq方案配对。FluidFM OMNIUM可以从活单细胞的细胞室中提取亚皮升体积，然后分离提取物进行进一步分析。通过避免破坏性方法(如细胞裂解)，可以在同一细胞上进行进一步的下游分子和表型分析，甚至随着时间的推移进行转录组分析。这将为您的转录组学、代谢组学、蛋白质组学或任何其他组学研究引入发展路径分析而不是终点分析。专属的——在FluidFM操作软件中内置了专属的Live-seq应用工作流程。易用的——仅需在电脑界面上用鼠标进行指向和点击的操作即可。先进的——空心的、具有力学感应的FluidFM探针（请参考下面FluidFM探针图）FluidFM探针：用金字塔的横截面可以看到镂空的中间通道。FluidFM技术进行单细胞组学研究相关文章：使用Live-seq进行全基因组测序来自中国科学院深圳先进技术研究院的陈万泽研究员等展示了Live-seq活细胞单细胞测序技术的建立，这是一种利用FluidFM技术提取RNA并保留细胞活力的单细胞转录组分析方法。通过使用巨噬细胞暴露于脂多糖(LPS)的模型，他们能够根据影响巨噬细胞LPS反应异质性的能力进行全基因组排序。此外，研究表明Live-Seq可用于连续描绘LPS刺激前后单个巨噬细胞的转录组。这使得细胞轨迹的直接映射成为可能，并将scRNA-seq从终点法跨越到突破性的时间分析方法。W. Chen, O. Guillaume-Gentil, P. Yde Rainer, C. G. Gä belein, W. Saelens, V. Gardeaux, A. Klaeger, R. Dainese, M. Zachara, T. Zambelli, J. A. Vorholt & B. Deplancke. Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells. (Aug 2022) Nature, doi:10.1038/s41586-022-05046-9.单细胞提取质谱联用来自ETH的Guillaume等利用FluidFM技术，通过亚皮升分辨率无损定量地提取细胞内液，然后进行飞行时间质谱分析。通过这种方法，他们从单个HeLa细胞质中检测和鉴定了几个代谢物。通过13C-Glucose摄取实验进行了验证，这表明代谢物采样结合质谱分析是可能的，同时保留了生理环境和被分析细胞的活力。O. Guillaume-Gentil, T. Rey, P. Kiefer, A.J. Ibáñ ez, R. Steinhoff, R. Brö nnimann, L. Dorwling-Carter, T. Zambelli, R. Zenobi & J.A. Vorholt. Single-Cell Mass Spectrometry of Metabolites Extracted from Live Cells by Fluidic Force Microscopy. (May 2017) Anal Chem., 89(9), 5017-5023. doi:10.1021/acs.analchem.7b00367.单细胞提取后细胞内分子成分分析来自ETH的Guillaume等证明了使用FluidFM以亚皮升的分辨率对单细胞的细胞质和核质部分进行定量采样，然后对从细胞质或细胞核中提取的可溶性分子进行全面分析，包括检测酶活性和转录丰度等。O. Guillaume-Gentil, R.V. Grindberg, R. Kooger, L. Dorwling-Carter, V. Martinez, D. Ossola, M. Pilhofer, T. Zambelli & J.A. Vorholt. Tunable Single-Cell Extraction for Molecular Analyses. (Jul 2016) Cell, 166(2), 506-516. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.025.相关产品1、多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM

“学科交叉点往往就是科学新的生长点、新的科学前沿，这里最有可能产生重大的科学突破，使科学发生革命性的变化。同时，交叉科学是综合性、跨学科的产物，因而有利于解决人类面临的重大复杂科学问题、社会问题和全球性问题。”--中国科学院院刊 细胞外囊泡（EVs）作为递送载体，已被广泛应用于生化工程学、生物医学工程学、纳米材料学、分子影像学等交叉学科中。通过交叉学科的火花碰撞，利用前沿新技术，提高疾病治疗效果，造福广大病患。本文与您分享EV递送纳米抗氧化剂等应用案例，拓展您的课题研究思路。巨噬细胞EV参与“免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动 2022年3月，深圳市第二人民医院李维平团队联合中国科学院大学化学工程学院魏炜团队共同发表题为“Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects”于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊（IF：18.19）。 被称为“终结者”的胶质母细胞瘤（GBM）是颅内神经系统最常见的恶性肿瘤。临床治疗GBM以外科手术为主，辅助放化疗，但效果收效甚微。难以穿透的血脑屏障 （BBB） 阻止药物进入中枢神经系统，使得治疗难度雪上加霜。因此，亟需更为有效的药物递送策略。 研究人员利用M1型巨噬细胞来源细胞外囊泡（M1EVs），使其膜被两种疏水剂功能化：化学激发源CPPO（C）和光敏剂Ce6（C），并装载亲水缺氧激活原药AQ4N（A），构成的CCA-M1EVs可穿过BBB，并可趋化富集在GBM部位，通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境免疫调控，增加过氧化氢（H2O2）水平。H2O2和CPPO之间可进行反应，产生的化学能量进一步激活Ce6，产生大量活性氧，实现化学激发的光动力疗法（CDT）。由于该反应消耗氧气，肿瘤缺氧的加剧也导致无毒的 AQ4N 转化为有毒的 AQ4 用于化疗。因此，CCA-M1EVs在GBM中实现了免疫调控-化学动力-乏氧激活的多级联动协同作用，发挥了强大的治疗效果。 研究人员利用全自动Digital Western检测M1巨噬细胞和M1EV中CD9、CD81、ALIX、TSG101、iNOS、F4/80和GAPDH的蛋白水平（如上图b所示）。EV递送纳米抗氧化剂 2021年来自中科院过程所魏炜团队，联合上海交大医学院附属同仁医院等多家单位，共同发表题为“In situ growth of nano-antioxidants on cellular vesicles for efficient reactive oxygen species elimination in acute inflammatory diseases”于《Nano Today》期刊（IF：20.72）。 临床上常见的急性炎症疾病，有急性肠炎和急性肝损伤等等。病情严重的患者，会出现脏器功能紊乱甚至器官衰竭。急性炎症过程中，会产生大量的活性氧自由基（ROS）。ROS会引起细胞膜脂质过氧化，导致细胞膜通透性改变和进一步DNA损伤，进而引起器官功能障碍。ROS大量产生是体内炎症发生发展过程中的一个重要环节，因此需要高效手段，将药物富集在炎症部位，然后消灭ROS。 纳米抗氧化剂，例如氧化铈、氧化钼和氧化锰，可借助其催化活性清除ROS，以此减少ROS引发的组织损伤，并控制疾病进展。然而，这些纳米抗氧化剂在炎症组织中的蓄积量较低。研究人员利用红细胞囊泡递送纳米抗氧化剂，效果显著。该项研究的另一亮点是研究人员将具有组织修复功能的干细胞外泌体融合（ReMeV），并在此基础上原位生长氧化铈（shi）纳米晶体（Ce-ReMeV），用于重症急性肠炎和急性肝损伤的治疗，在有效清除ROS同时，还能修复受损组织和器官，在小鼠模型上取得了满意的效果。 研究人员利用全自动Digital Western检测外泌体 Marker（CD9）、外泌体和红细胞Marker（TSG101、HSP70）以及MSC生长因子（HGF）（如上图c所示）。每个样品仅需3μL。全自动Digital Western，为何备受大家的喜爱？ 传统Western Blot（WB）属于劳动密集型技术，时间长、步骤冗长、人为操作引入过多误差，最终导致数据质量低......最重要的是实在太影响心情！图片取材于网络 全自动Digital Western技术平台的横空出世，一扫传统Western带给广大科研工作者的阴霾，每一天都是做WB的良辰吉日，让您从此享受WB！节省出大量宝贵时间去专注于阅读、思考、交流、仰望天空、参与社团、思考人性、（校园恋爱）等更有价值的事务。全自动Digital Western检测全流程（上样后，剩下的一切都交给她，一顿晚饭的功夫拿到结果） 全自动数字式Western，带给您的仅仅是3 μL超微量的上样量？3小时出结果？全程自动化标准化？更重要的是真正数字化的高质量数据和全膜结果，让您的数据不被质疑！撤稿？不存在的！扫码索取全自动Digital Western产品资料解放双手，从此爱上WB，告别实验Emo！

细胞迁移，指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。移动过程中，细胞不断重复着向前方伸出突触/伪足，然后牵拉后方胞体的循环过程。细胞骨架和其结合蛋白，还有细胞间质是这个过程的物质基础，另外还有多种物质会对之进行精密调节。细胞的运动有很多种，有生理性运动，如发育过程中的细胞运动，生殖细胞、干细胞的成熟过程中的位置变化。也有病理性变化，如肿瘤的迁移和侵袭。从癌症的产生到转移，血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。癌症细胞增殖失控，短时间内可以繁殖出大量后代，这样首先会造成生长空间的局促和养分，如氧气的紧张。这样恶性肿瘤内会形成一片坏死区，正如上面在组织损伤里面提到的，机体会尝试“修复”这些损伤。坏死组织会释放出一系列促血管生成因子，如血管内皮生长因子以及各种免疫细胞，如巨噬细胞。巨噬细胞也会释放大量促血管生成细胞因子和生长因子。因此肿瘤的研究伴随着复杂的细胞运动，如肿瘤细胞沿着循环系统的运动，血管内皮细胞和免疫细胞进入肿瘤实体的运动。划痕法是经典的细胞行为学检测方法。在平铺的细胞单层上划出一条痕迹，然后清洗更换培养液后，细胞会从原有位置向划痕处迁移。统计划痕宽度和面积的变化就可以监控细胞迁移的速度和细胞迁移的能力。以前在做划痕实验的时候受到诸多限制：首先微孔板的孔不能太小，孔越小，枪头越难伸进去；其次划出的痕迹边缘歪斜，无法形成一条直线；孔与孔之间的划痕宽度也不均一。这给划痕这个时间梯度的实验带来了很大的困扰。在多次的拍照过程中，由于划痕宽度的差异性对于划痕拍照位置的复位要求甚高。然而随着细胞迁移的发生，细胞的原位的形态和分布也发生的动态变化。所以复位划痕的拍照位置成为就成为了一个力气活：既然无法准确找到，那就全部拍下；既然每个位置宽度不一，那就全部统计。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统的划痕套装。轻轻一划，解决全部困扰。借助Scratcher整齐的96针，可以在96孔微孔板底面整齐的划出宽度均一的划痕。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统可以盯住一个视野不停的拍。然后生成无抖动的视频。借助专业的划痕分析软件，对划痕宽度、面积、愈合速度进行分析，可以获取的参数包括：划痕面积划痕的覆盖度划痕的宽度划痕的愈合速度相对划痕密度对于原始细胞区域、原始划痕区域、划痕分界线、迁移后细胞的区域进行精准的划分，保证分析结果的精确。轻松的完成整个实验，再也不用熬夜拍划痕了。MuviCyte™ 已于2020年1月1日全新上线，借助它的多荧光通道和多种物镜选择，可以完成多种复杂的复杂细胞模型的拍摄和观察，在肿瘤免疫、干细胞等多个领域都有重要的应用。扫描下方二维码或点击下载链接，即可下载珀金埃尔默MuviCyte™ 活细胞成像系统相关资料。下载链接: http://hyw3rjq7ezkfsnvu.mikecrm.com/naj9QZD

细胞程序性死亡 概念：细胞程序死亡(programmed cell death，PCD)也常常被称为细胞凋亡，是生物体发育过程中普遍存在的，是一个由基因决定的细胞主主动的有序的死亡方式。具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自-杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。而细胞发生程序性死亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，无炎症反应，不遗留瘢痕。死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不影响其他细胞的正常功能。 凋亡细胞的主要特征是(参见表15-2)：①染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体 ②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症 ③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止 ④核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状 ⑤凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。理论意义：程序性细胞死亡在生物发育和维持正常生理活动过程中非常重要.在发育过程中，细胞不但要恰当地诞生，而且也要恰当地死亡。例如，人在胚胎阶段是有尾巴的，正因为组成尾巴的细胞恰当地死亡，才使我们在出生后没有尾巴.如果这些细胞没有恰当地死亡，就会出现长尾巴的新生儿.从胚胎、新生儿、婴儿、儿童到青少年，在这一系列人体发育成熟之前的阶段，总体来说细胞诞生得多，死亡得少，所以身体才能发育.发育成熟后，人体内细胞的诞生和死亡处于一个动态平衡阶段，一个成年人体内每天都有上万亿细胞诞生，同时又有上万亿细胞“程序性死亡”.两者处于一种动态平衡中，使人体器官维持合适的细胞数量得以正常运作的，正是“程序性细胞死亡”机制。(又如蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细生物发育过程中及成体组织中正常的细胞凋亡有助于保证细胞只在需要它们的时候和需要它们活的地方存活。这对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。)实践意义：如果调节细胞“自-杀”的基因出了问题，该死亡的细胞没有死亡，反而继续分裂繁殖，便会导致有问题或恶性细胞不受控制地增长，比如癌症 如果基因错向不该死的细胞发出“自-杀令”，不让之分裂繁殖，使不该死亡的淋巴细胞大批死亡，便破坏了人体的组织或免疫系统，比如艾滋病。控制“程序性细胞死亡”的基因有两类：一类是抑制细胞死亡的 另一类是启动或促进细胞死亡的。两类基因相互作用控制细胞正常死亡。如果能发现所有的调控基因，分析其功能，研究出能发挥或抑制这些基因功能的药物，那么人类就能够敲响癌症和艾滋病的丧钟。当然，这个过程需经过一番艰苦努力，因为线虫只有959个细胞，而人体则有大约1000万亿个细胞。

单细胞转录组以及蛋白质组分析为获得健康和疾病相关细胞图谱提供了技术支持，也彻底的改变了对多种生物现象的解释。单细胞技术能够在高精度和高分辨率的水平上分析细胞状态。但是当前技术还不能够在动态的场景中捕捉细胞状态的转变。每个细胞的行为改变是遗传和信号网络共同作用的结果，因组织和细胞类型而异。2022年1月5日，来自西班牙国家心血管研究中心的Andrés Hidalgo 团队在Nature上发表题为Behavioural immune landscapes of inflammation 的文章。作者利用成像技术结合机器学习开发出实时细胞行为分析体系。作者首先使用CD11c-YFP小鼠，过继回输CFP+中性粒细胞，并用流感病毒PR8感染小鼠，对气管进行成像。作者总共提取了118个参数进行分析，这118个参数描述了单细胞的运动和性状特征。过滤处理后，生成了一个可视化网络图。通过筛选最能代表细胞行为的参数，作者选定了31个参数，包括19个动力学参数和12个形态参数。作者用31个参数生成了t-SNE图，显示了基于细胞行为的两个主要细胞群。作者进一步在多维度分析基础上确定最能区分各细胞群的特定参数。如细胞运动变化的速度比绝对细胞大小的参数更能预测细胞身份，这也表明行为变化中包含生物信息。作者用每个参数的可预测性强度改进了细胞预测网络，来推断在病毒感染模型中气管中特定的生物学特征。如中性粒细胞在DC附近移动较慢，而DC则表现出较高的同质行为。作者又利用皮肤缺血再灌注和激光烧伤模型测试了这些基于行为的分析模式。在缺血再灌注损伤模型中，三个细胞簇可以匹配三种细胞类型：中性粒细胞、DC和巨噬细胞。进一步子聚类分析可以识别两种中性粒细胞、两种类型DC和三种巨噬细胞。而在激光损伤模型中，作者能够利用参数分析模式更加精准区分中性粒细胞和DC。作者还发现了中性粒细胞以不同的行为模式涌向损伤部位。作者利用每个细胞数据中包含的位置信息将细胞投影到实际位置，以此构建行为图，试图实现个体特征与复杂行为模式的关联。这样的分析能够实现不同细胞分布可视化，同时能够通过实时成像捕获细胞行为，可以在其原生环境中分析细胞特征。炎症与中性粒细胞等细胞亚群特别相关，其中蛋白质或转录组变化都会影响炎症的结果。而细胞状态是细胞动态变化的基础。所以作者接下来用lyzM-GFP小鼠构建TNF诱导的血管炎模型，以此模型分析中性粒细胞状态变化。为了提高形态测量、动力学特征以及与血管壁距离测定的准确性，作者开发了一个基于机器学习的定制分析工具，它可以产生73个参数，准确描述血管内粘附细胞状态。作者总共发现了血管内三种细胞簇。分析发现第一和第三代表一个连续体的两个极端，第二种细胞簇代表血管内中性粒细胞的过渡状态。接下来作者使用24种突变小鼠。并利用以上分析模式对细胞状态进行分析。结果发现其中五种品系小鼠会出现抗炎表型，血管中中性粒细胞行为状态转换会出现不同变化。这表明细胞的状态调控开关主要由特定的信号通路组成，提高了靶向治疗以保护机体免受血管损伤的可能性。作者最后利用肾小球肾炎模型重点分析了Fgr这一分子对中性粒状态的调控。结果发现Fgr可以介导血管中中性粒细胞向致病方向转变。本文利用机器学习结合成像生成的数百种参数分析细胞行为状态变化，可以实现实时捕捉在原生环境中的细胞行为变化，并利用这一体系分析发现靶向特定免疫行为特征，具有治疗价值。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04263-y

目前科学家对人类细胞如何互相作用以组成不同组织与器官的认识仍然十分有限。近年来，一系列单细胞测序的研究工作揭示了正常组织与疾病状态下的单细胞图谱，描绘了组织中多种细胞类型及其丰度与互作，但这些工作往往局限于单一器官。系统性地比较多种组织间的细胞类型及其转录组的异同，有助于科学家理解器官特异性的细胞状态分化。2022年5月12日，Science杂志在线发表了Tabula Sapiens Consortium、Eraslan、Domínguez Conde、Suo等研究人员报道的4篇跨组织人类单细胞图谱的研究，共涉及来自68位捐献者的30余种组织类型，超过100万单细胞，涵盖500种以上细胞类型。北京大学张泽民课题组受邀于Science同期发表Perspective观点文章，对以上研究进行了总结，并对将来单细胞测序技术在疾病研究与药物研发中的应用进行了展望。跨组织单细胞测序揭示了组织间保守的细胞特征。Eraslan等人通过比较多种器官中的巨噬细胞，发现了保守的巨噬细胞发育路径，即monocyte前体在组织中发育为高表达HLAII、行使免疫功能的巨噬细胞类群，与高表达LYVE1、行使血管支持与免疫细胞浸润抑制功能的巨噬细胞类群。跨组织单细胞测序发现了组织特异性的细胞状态。记忆T细胞是经过抗原刺激后的T细胞，Domínguez Conde等人发现了三类CD8记忆T细胞亚型，分别为分布在血液丰富组织中的TEM/EMRA细胞，分布在肠道中的TRM细胞，以及主要分布在脾脏与骨髓当中的TRM/EM细胞，这些T细胞亚型各自特异表达的细胞因子受体可能是形成组织差异性分布的机制。对组织间细胞构成的比较识别了稀有的细胞类型。Tabula Sapiens Consortium发现来自肺、心脏、子宫、肝脏、胰腺、脂肪、肌肉等组织的内皮细胞有着各自独特的转录组特征，提示了高度组织适应的功能。同时胸腺、血管、前列腺、眼球来源的内皮细胞更为相似。泛组织研究的方法发现了心脏内皮细胞的特异性marker SLC14A1，提示了心脏内皮细胞可能的适应性代谢功能。同时，Eraslan等人发现了稀有的细胞类型，包括前列腺中的神经内分泌细胞与食管中的肠系神经。跨组织单细胞图谱同时提示了疾病相关的细胞类型。Eraslan等人以肌肉疾病为例研究了单基因遗传病中的潜在致病细胞类型。研究发现在一种影响神经-肌肉细胞信号传递的疾病中，仅神经与肌肉连接处的肌肉细胞富集该类疾病的相关基因。同时，对受体-配体进行的分析发现细胞间互作失调是肌肉疾病的成因之一。例如在一种致死性的肌肉疾病中，ERBB3突变会导致肌肉细胞与施旺细胞（一种生成神经元旁髓鞘的细胞类型）的互作失调。这一系列跨组织单细胞测序数据集同时为药物副作用和安全性研究提供了重要的参考。虽然新药的分子靶向性不断提高，但全身系统性的给药仍然是最主流的方式，使得药物副反应成为重要的临床问题。对这一系列跨人类组织的单细胞数据集进行基因表达查询将大大助力于新药研发的毒性预测，将毒副作用识别在人体试验之前。本期Science发表的四项跨组织单细胞测序研究代表了构建综合性人类细胞图谱的重要里程碑。将来的研究有必要在更大队列的人群中进行探索与验证。同时，将跨组织的研究方法应用于疾病研究十分重要，例如肿瘤。理解组织保守性与组织特异性的肿瘤发生过程对开发泛癌种与癌症类型特异的肿瘤药物至关重要。例如，对肿瘤免疫的认识促进了靶向PD1抗体药物在多种癌症类型中的成功。近年来张泽民课题组报道了一系列泛癌种的髓系细胞与T细胞单细胞测序研究，这一系列研究方法适合被推广至更全面的细胞类型和患者队列，并最终使科学家在单个基因、细胞、组织与表型层面系统性地理解疾病与生物学过程。

肿瘤微环境（TME）影响患者对免疫治疗的响应度。携带大量生物活性分子的细胞外囊泡（EVs）可以在细胞间传递信号并重塑 TME。因此，在制定抗肿瘤治疗策略时，应综合考虑 EVs、TME 和免疫细胞之间复杂的相互作用。2022年5月，上海交通大学医学院附属第九人民医院陈万涛/严明团队，在Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在线发表题为“CD73 in small extracellular vesicles derived from HNSCC defines tumour-associated immunosuppression mediated by macrophages in the microenvironment”的研究论文，该研究表明头颈鳞癌细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）运载的 CD73 可以重塑 TME 并促进肿瘤进展、介导免疫逃逸。研究内容解析【1】 HNSCC 细胞来源的 sEVs 中高表达 CD73从原代培养的头颈鳞癌（HNSCC）细胞及配对正常黏膜细胞上清中分离 sEVs。蛋白组学分析显示，与正常黏膜细胞相比，HNSCC 细胞来源的 sEVs 中高表达 CD73（图 f-h）。图1 | HNSCC 细胞来源的 sEVs 中高表达 CD73【2】HNSCC 源 sEVs-CD73 被巨噬细胞内化以促进 HNSCC 进展CD73 是由 NT5E 基因所编码的一种膜结合形式的外核苷酸。TCGA 数据分析表明，NT5E 基因在包括 HNSCC 在内的多种肿瘤中高表达，并且与 HNSCC 患者较低的总体生存率密切相关。免疫组化结果显示，CD73 在 HNSCC 肿瘤组织中高表达，并且与患者不良预后和高淋巴结转移率相关。免疫浸润分析表明，NT5E 表达与巨噬细胞密切相关（图 c），免疫荧光结果也表明 CD73 与巨噬细胞共定位（图 d-e）。进一步分析显示，高 NT5E 表达、高巨噬细胞浸润的 HNSCC 患者总体生存率最低（图 f）。图2 | sEVs 中的 CD73 与肿瘤相关巨噬细胞和 HNSCC 恶性进展密切相关小鼠移植瘤注射 sEVsCD73，结果显示 sEVsCD73 主要与巨噬细胞共定位（图 h-i），表明 sEVsCD73 被巨噬细胞吞噬。同时体内实验结果表明（图 j-n），肿瘤细胞来源的 sEVs 可以重塑引流淋巴结微环境，形成利于肿瘤转移的转移前微环境，sEVs 携带的 CD73在这一过程中发挥重要作用。【3】sEVs 通过 CD73 调节巨噬细胞介导的免疫抑制与对照相比，与肿瘤细胞共培养的巨噬细胞中 CD73 表达水平上升（图 b）；而与 RAB27A 敲除以抑制 sEVs 释放的细胞共培养的巨噬细胞相比，其 CD73 含量与正常对照组相当（图 b），表明 CD73 主要通过 sEVs 运输。sEVs 中 CD73 的水平会影响 CD73+ 巨噬细胞的比例，使其随着共培养体系中 sEVsCD73 的累积而增加。当 sEVsCD73 被巨噬细胞内化后，其吞噬作用明显增强（图 c），同时分泌促癌炎性细胞因子 IL6、IL10、TNFα、TGFβ 能力显著增加（图 e-f），预示 CD73+ 巨噬细胞具有更强的促瘤作用。流式分析显示（图 h），sEVsCD73 使巨噬细胞免疫检查点（PD-1，PD-L1，LAG3等）表达上调，表明 CD73+ 巨噬细胞可发挥更强的免疫抑制能力。图3 | HNSCC 细胞源 sEVs 中 CD73 对巨噬细胞功能的影响【4】sEVs 中的 CD73 在体内促进免疫逃逸并促进肿瘤进展接下来评估 sEVsCD73在介导体内免疫抑制和肿瘤进展中的作用。与对照组相比，Rab27a 敲除组（SCC7Rab27aKO）的小鼠肿瘤生长速度慢、肿瘤偏小，表明 sEVs 可促进肿瘤进展。然而，注射外源性中高表达的 CD73 的 sEVs（sEVsSCC7-Nt5eOE 和 sEVsSCC7）则会显著促进肿瘤的发展，但 NT5E 敲除的 sEVsSCC7-NT5EKO并没有此作用（图 b-d）。结果表明 sEVsCD73 在 HNSCC 的进展中具有重要的作用。同时，流式分析显示，sEVsCD73 可招募巨噬细胞、Tregs 细胞，而 CD8+ T 细胞浸润数目减少。此外，在瘤内注射了含 CD73 的 sEVs 后，这些免疫细胞尤其是巨噬细胞表面 CD73、PD-1 的表达水平均有所增加。该体内实验结果提示，sEVsCD73 可诱导免疫抑制，从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。图4 | sEVs 中敲除 CD73 可拯救免疫抑制并抑制了体内肿瘤生长【5】携带 CD73 的 sEVs 通过激活 NF-κB 通路调节巨噬细胞功能对经过 HNSCC 源 sEVs 处理的 M2 巨噬细胞进行转录组测序。利用韦恩图分析M2+HNSCC 源 sEVs（M2+sEVs）相对于对照组 M2 上调的基因，以及 M2+CD73 敲除的 HNSCC 源 sEVs（M2+sEVsNT5EKO）相对于 M2+sEVs 下调的基因。通过对两组差异基因取交集，筛选出了共 143 个可能受到 sEVsCD73 调控的候选下游基因（图 a），而 NFκB1 是与这些差异表达基因最为相关的转录因子（图 b），富集分析也显示 NF-κB 通路富集最为显著（图 c）。进一步实验显示，sEVsCD73 可以显著促进 p65 在巨噬细胞细胞核内积聚（图 f），激活NF-κB 通路，并促进下游基因转录。图5 | sEVs 中 CD73 通过 NF-κB 通路调节巨噬细胞的免疫功能【6】sEVsCD73 是抗 PD-1 治疗潜在的检查点和治疗靶点从 HNSCC 患者血清中分离 sEVs，ELISA 检测显示其 CD73 含量高于健康人血清 sEVs（图 a-c）。并且高水平的循环 sEVsCD73 可能预示着更高的淋巴结转移率和更大的肿瘤大小（图 d）。为研究 sEVsCD73 在抗 PD-1 治疗中的作用，通过体内实验进一步评估 sEVsCD73 敲除联合抗 PD-1 药物对小鼠头颈鳞癌的治疗作用。当 sEVs 中 CD73 敲除时，PD-1抗体的治疗效果发生明显的改善（图 f-h）。将瘤组织取出并进行流式分析，在接受抗 PD-1 药物后，巨噬细胞、Tregs 细胞的浸润数量有所下降，CD8+T 细胞的数目增加。同时，免疫细胞表面的 CD73 和 PD-1 表达下降，说明免疫抑制的现象有所缓解。这一现象在 RAB27aKO+anti-PD-1 组最为显著，说明抑制肿瘤细胞的 sEVs 释放会提高抗 PD-1 逆转免疫抑制的效率。然而在加入外源性的 sEVsCD73 后，巨噬细胞、Tregs 细胞的浸润数量明显上升，CD8+T 细胞的数目减少。此外，免疫细胞表面的 CD73和 PD-1 表达上升，表明 sEVs CD73 显著抑制了抗 PD-1 药物对免疫应答的重激活作用。以上结果表明，肿瘤细胞源 sEVs 携带 CD73 通过 TAM 介导免疫抑制并减弱抗 PD-1 的治疗效果。sEVsCD73 可用于预测 HNSCC 的转移，是潜在的 HNSCC 抗 PD-1 治疗的联合免疫治疗靶点。图6 | sEVsCD73 可减弱抗 PD-1 治疗敏感性原文链接：https://doi.org/10.1002/jev2.12218

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎（COVID-19）自2019年至今仍然在全球蔓延，其变异株Omicron由于高传播率目前已取代其它毒株成为全球新冠的主要流行毒株。各国已采取大规模疫苗接种，通过其产生的中和抗体和抗病毒T细胞来缓解和对抗新冠肺炎。有研究报道，病毒特异性T细胞在病毒清除（即SARS-CoV-1感染后17年）和在抗体滴度减弱的COVID-19患者中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞会持续很长时间。因此需要充分了解新冠肺炎中T细胞免疫过程，对疫苗开发和免疫治疗具有重要意义。COVID-19患者中的T细胞免疫反应T细胞免疫反应是高度特异性的，在引发有效的抗病毒反应方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期阶段，树突状细胞(DC)和巨噬细胞可以吞噬病毒感染的细胞，通过抗原呈递启动T细胞反应。随后，CD4+T细胞刺激B细胞产生病毒特异性抗体，细胞毒性CD8+T细胞靶向病毒感染的细胞。有研究报道，SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞在COVID-19症状发作后的前2周内的外周血中很明显。大多数SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞表现出中枢记忆表型，主要产生Th1细胞因子，而CD8+T细胞具有更高水平的穿孔素表达的效应表型。另外有研究报道COVID-19患者T细胞活化的异质性，并提供证据表明CD4+和CD8+T细胞都能够产生有效的免疫反应，并出现受损或过度的T细胞反应。轻度COVID-19患者的T细胞升高，产生强大的抗病毒免疫反应。特别是CD8+T细胞表达更高水平的细胞毒性分子，例如颗粒酶A和FAS配体，它们有利于消除病毒感染的细胞。然而，在严重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，细胞毒性T细胞）比例减少，同时幼稚和中枢记忆CD8+T细胞的百分比也均较低。此外，与健康对照组相比，COVID-19患者的终末分化效应CD4+和CD8+T细胞的百分比更高。且重症COVID-19患者的调节性T细胞(Tregs)水平低于轻症患者。总之，T细胞亚群（包括Treg、Th1、幼稚和记忆T细胞）平衡中的这些失调可能导致严重的炎症状况，并可能导致COVID-19复发。尽管由CD4+和CD8+T细胞介导的早期抗病毒反应最有可能具有保护作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T细胞难以通过限制I型和III型干扰素反应来产生有效的抗病毒反应。COVID-19恢复期患者和健康人中的T细胞免疫反应恢复康复患者的T细胞计数可以为T细胞在抗病毒反应中的作用提供重要参考。有研究报道，超过70%的COVID-19恢复期患者存在SARS-CoV-2特异性T细胞。100% CD4+T细胞和70% CD8+T细胞在康复患者中具有SARS-CoV-2 Spike特异性反应。功能测定证实CD4+T细胞表现为Th1表型并产生大量IFN-γ，和针对S蛋白较低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同样，大多数SARS-CoV-2刺突特异性CD8+T细胞产生IFN-γ，绝大多数IFN-γ+CD8+T细胞也共表达颗粒酶B和肿瘤坏死因子α (TNFα)。这些数据表明，康复患者中的大多数CD4+和CD8+T细胞产生了针对S蛋白的大量抗病毒免疫反应，说明功能性T细胞在病毒清除和恢复中的重要性。此外，这些数据也说明利用SARS-CoV-2的S蛋白作为疫苗生产关键候选者的重要性。T细胞反应在无症状和未接触过的个体中观察到的T细胞反应最低。但是即使没有并发的体液反应，无症状/轻度恢复期的COVID-19患者也可以产生强大而持久的记忆T细胞反应来预防复发性感染。有研究报道，与有症状的个体相比，无症状患者的免疫反应较弱，并且相当一部分有症状的患者在恢复期早期表现出中和抗体量减少。COVID-19恢复期患者在出院后2周内也显示出与针对人ACE2的中和抗体滴度和病毒特异性T细胞计数的强相关性。细胞因子风暴细胞因子风暴是指在各种病理条件下检测到的大量促炎细胞因子和趋化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中观察到的关键病理特征之一。在重症COVID-19患者中记录到高细胞因子水平。各种免疫细胞类型，包括巨噬细胞、中性粒细胞、DC，以及NK、B和T细胞，可导致COVID-19患者的细胞因子风暴和炎症反应的过度激活状态。由先天免疫细胞释放的TNFα、IL-6和IL-1β可能是SARS-CoV-2感染晚期患者发生细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动力之一，其中一些可能是导致这些患者淋巴细胞减少或Th1反应不足的潜在机制之一。另据报道，在COVID-19重症病例中，血清TNFα和IL-6水平升高与总T细胞计数呈负相关，表明这些细胞因子可能参与淋巴细胞减少和T细胞丢失。相反，处于恢复期的患者上述细胞因子的血清水平显著降低，并显示T细胞计数恢复。鉴于这些发现，有人提出IL-6阻滞剂，如sarilumab、siltuximab和tocilizumab，以及IL-1β受体阻滞剂用于治疗重症COVID-19患者以解决过度炎症和控制炎症的传播。趋化因子和细胞因子水平升高，例如CCL2/3/5、CXCL8/9/10和IFN-γ、TNFα、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 、IL-33、粒细胞/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF和GM-CSF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血小板衍生生长因子亚基B（PDGFB），促进其它白细胞向组织的募集，导致组织损伤。基于T细胞反应的疫苗研究SARS-CoV-2完整基因组的快速可用性可用于开发多种疫苗，使其在刺激幼稚T细胞后产生效应和记忆T细胞，发挥免疫保护。成功的SARS-CoV-2疫苗应该产生对有效免疫反应具有高度特异性的SARS-CoV-2反应性T细胞，而不会产生炎症或疾病开始的不良影响。SARS-CoV-2的蛋白被确定为最适合疫苗开发的靶标，以触发病毒特异性T细胞反应和体液免疫反应。表达S蛋白的腺病毒病毒载体疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康个体(NCT04313127)中检测其疫苗的安全性和耐受性，观察到2周后成功产生特异性抗病毒T细胞和体液免疫反应。Moderna开发了基于mRNA的疫苗，编码SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通过脂质体递送系统给药。因mRNA疫苗可以模拟天然病毒感染，并仅编码抗原蛋白并且不能整合到宿主染色体中。因此，基于mRNA的疫苗更能发挥细胞免疫和体液免疫。T细胞免疫检测---细胞因子释放检测（CRA）疫苗中的抗体测试是常规进行的，但因为特异性病原体的T细胞在血液中存在的总T细胞（通常小于1-3%）中只占很小的一部分，需要在从全血中纯化的细胞中进行。而这些检测都需要复杂的设备和高度专业化的人员，这可能不是每个常规实验室都可以使用的。杜克-新加坡国立大学Antonio Bertoletti教授团队采用了一种快速和简单的替代方法，即基于Ella微流控ELISA技术的全血细胞因子释放测定(Cytokine release assay, CRA)实验：直接将刺激性抗原或肽添加到全血中，导致血浆中细胞因子（通常是IFN-γ）的分泌，然后进行定量。该检测方法通过简单地将Spike肽库添加到全血中，可以轻松快速地检测和相对定量接种疫苗个体中的Spike特异性T细胞反应。此方法检测时间比常规方法缩减了7个小时，总时间缩短了12个小时。总结因T细胞免疫反应在疾病的早期阶段表现出保护作用，也可能导致致命症的发生，因此COVID-19的治疗和预防中需要深入地了解疾病过程中的免疫反应。特别是在症状轻微的患者中阻断促炎细胞因子的早期治疗干预可能会产生有害影响，并导致免疫反应不足和病毒清除受损。在危重COVID-19患者中恢复T细胞耗竭和改善过度炎症反应的晚期治疗干预可能具有更好的临床结果。在疫苗开发中，也要充分考虑其是否可以增强抗病毒免疫和特定T细胞反应从而加强疫苗保护的持久性。参考文献Robust T Cell Immunity in ConvalescentIndividuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.Rapid determination of the wide dynamicrange of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated andnaturally infected.T cell immunity to SARS-CoV-2 followingnatural infection and vaccination.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

基于免疫检查点抑制剂（ICIs）的免疫治疗正在成为一种革命性的肿瘤治疗方案，仅适用于一小部分癌症患者。ICIs的临床反应主要依赖于肿瘤组织中浸润的效应T淋巴细胞（CTL）识别并杀死肿瘤细胞。然而，肿瘤组织中CTL浸润较为有限，且复杂的瘤内物理屏障严重阻碍CTL的浸润，削弱了ICIs的治疗效果。因此，如何重塑肿瘤内物理屏障以增强CTL的浸润成为提高ICIs介导的免疫治疗迫切需要解决的难题。　　1月29日，中国科学院上海药物所研究员张志文、李亚平，以及沈阳药科大学教授王思玲团队合作完成的最新研究成果，以Bioinspired lipoproteins of furoxans-oxaliplatin remodels physical barriers in tumor to potentiate T-cell infiltration为题，在线发表在《先进材料》（Advanced Materials）上。该研究提出并证实利用仿生脂蛋白系统高效递送一氧化氮（NO）供体-奥沙利铂前药，通过重塑肿瘤物理屏障促进CTL瘤内浸润、增强ICIs免疫治疗的新策略。 　　对乳腺癌及结肠癌的临床样本检测发现，肿瘤部位广泛存在各种细胞外基质组分但CD8+ T浸润严重缺乏。基于此，科研团队设计合成了一种细胞内还原响应的NO供体-奥沙利铂前药（FO），构建高效靶向瘤内各种基质细胞的仿生脂蛋白系统（S-LFO）。研究显示，S-LFO能够在肿瘤部位高效蓄积、渗透进入肿瘤深部区域，并可到达瘤内肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和血管内皮细胞（ECs）等基质细胞。S-LFO处理后能够显著促进肿瘤血管正常化、灌注能力和血管密度，降低TAMs和CAFs的比例，清除Collagen、Fibronectin和chondroitin sulfate等主要细胞外基质成分，为促进CTL的瘤内浸润铺平了道路。进一步研究发现，S-LFO能够显著增加肿瘤部位CD3+CD8+ T细胞以及表达IFN-γ、Granzyme B亚型的比例，与对照组相比分别提高2.96、5.02和8.65倍，并显著促进CD8+ T细胞向瘤内4T1-GFP癌细胞区域的浸润和扩散能力，进而在胰腺癌PANC02、乳腺癌4T1和结直肠癌CT26等肿瘤模型中，与aPD-L1合用显著增强了抑制肿瘤生长和延长存活期的疗效。该策略为重塑肿瘤基质屏障提高CTL浸润增强ICIs的免疫治疗效果提供了新方法。　　　　　　　　　　研究工作得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金和复旦-SIMM联合研究基金等的资助。　　论文链接

高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见的卵巢癌病理亚型，75%以上的患者首诊时已是晚期，常伴有广泛的网膜转移和腹水产生。此外，免疫检查点阻断等免疫治疗手段仅在10%左右的卵巢癌病人中起效。研究表明，卵巢癌腹水中的成纤维细胞亚群可以通过激活肿瘤细胞中的JAK/STAT通路以影响患者的预后及其对免疫治疗的响应。然而，卵巢癌腹水环境中的其它细胞类群对其肿瘤微环境的影响方式和途径仍不明确。7月24日，北大张泽民教授课题组与上交大附属新华医院汪希鹏课题组、上海免疫学研究所李子逸博士以“Single-cell analyses implicate ascites in remodeling the ecosystems of primary and metastatic tumors in ovarian cancer”为题在Nature Cancer杂志联合发表了研究论文，揭示了卵巢癌腹水对肿瘤原发和转移病灶微环境的重塑作用。研究人员对5个肿瘤相关部位，包括原发性卵巢肿瘤（Pri.OT）、网膜转移瘤（Met.Ome）、腹水、盆腔淋巴结（PLN）和外周血（PB），进行了单细胞转录组测序和T细胞受体(TCR)测序，共将223,363个高质量单细胞编入五个主要细胞谱系，并通过规范标记表达进行注释，从而描画出了 OC TME 的综合图谱。B细胞和CD4 T细胞在PLN中占主导地位；而淋巴细胞和单核细胞构成了PB样本的主要细胞成分；在Pri.OT和Met.Ome中鉴定出了五种主要细胞系，而且大多数细胞类型的富集模式在这两个部位之间没有明显差异，这表明原发性和转移性肿瘤细胞的发展都需要类似复杂的TME。腹水经常出现在晚期卵巢癌患者中，与化疗反应有关，腹水中含有大量免疫细胞和基质细胞，其中，CD8 T 细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）是腹水的主要成分，表明腹水中存在炎性微环境。5个部位的单细胞测序描画了晚期卵巢癌图谱与非恶性细胞不同，由推断拷贝数变异（inferCNV）定义的肿瘤细胞表现出很强的患者间异质性。值得注意的是，所有腹水样本中都发现了肿瘤细胞，平均比例为 2.7%（53499 个样本中的 1444 个），这与 OC 肿瘤细胞更倾向于 "播种"到腹腔而不是通过血管扩散的观点一致，凸显了腹水与 OC腹腔内扩散之间的紧密联系。此外，推断CNV分析表明，在Met.Ome中发现的肿瘤细胞亚克隆也可在Pri.OT中检测到，表明这些亚克隆是腹膜转移的致瘤群体。通过对单细胞转录组和 T 细胞受体（TCR）的系谱追踪和轨迹推断，研究人员鉴定了多个具有不同分布模式的T细胞群，并揭示了OC中T细胞从腹水到肿瘤组织的潜在动态特征。他们发现腹水富集的记忆T细胞（CD8 GZMK T++EM和 CD4 T+CM）可能是TIL的潜在重要补充库，包括CD8 T+EX和 CD4 T+H1样细胞，特别是对于Met.Ome。这些结果暗示了腹水在T细胞浸润期间塑造OC的TME的潜在作用。此外，作者描述了腹水和肿瘤组织中巨噬细胞的功能状态和本体，肿瘤富集的巨噬细胞偏向于单核细胞来源的本体，而腹水中的巨噬细胞更多来源于组织驻留巨噬细胞（RTM）。HGSOC 中肿瘤富集巨噬细胞和腹水富集巨噬细胞的两种不同功能状态此外，研究人员还鉴定了恶性腹水中的 MAIT细胞和树突状细胞，以及原发性肿瘤中的两个内皮亚群，通过比较不同化疗响应情况的患者治疗前样本中细胞亚群的分布情况，发现肿瘤原位灶中VCAM+内皮细胞占比较高的HGSOC患者对化疗敏感，而IL13RA1+内皮细胞的占比高则提示患者对化疗耐药，这可能是治疗效果的一个重要评价指标。总之，该研究提供了女性恶性腹水生态系统的全貌，为其与肿瘤组织的联系提供了有价值的见解，并为OC疗效评估和治疗耐药性的潜在标志物的开发提供了重要参考。卵巢癌（OC）是一种异质性疾病，由具有不同组织学亚型、分子生物学和微环境特征的恶性肿瘤组成，是致死率最高的妇科恶性肿瘤，占女性癌症死亡人数的 5%。在所有 OC 类型中，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是最常见的组织学亚型，占 OC 患者的 70%以上。一旦确诊，超过 75% 的 HGSOC 患者病情已到晚期，并伴有广泛转移和腹水。据报道，由于网膜的脂肪结构和腹膜循环，OC 患者通常会向网膜转移。虽然化疗加贝伐单抗的治疗可延长患者的 5 年生存期，但总体疗效仍然有限。此外，免疫检查点抑制剂等免疫疗法在临床试验中的客观反应率仅为 10%，而由于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的比例和质量不同，OC 亚型往往对免疫疗法表现出不同的反应。因此，描述 OC 的肿瘤微环境（TME）特征至关重要，因为肿瘤微环境中的多种细胞成分在疾病进展和治疗反应中发挥着重要作用。

CAR-T细胞免疫治疗技术自2017年10月，美国政府批准第二种基于改造患者自身免疫细胞的疗法以来，在治疗癌症方面效果显著。CAR-T治疗全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，指的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T技术已经出现了很多年，基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。CAR-T治疗的机理，我们进行简单的介绍。人体内有一系列的细胞，构成了人体内免疫系统，包括产生抗体的B细胞，吞噬异物的巨噬细胞，直接杀灭有害病毒或有害细胞的T细胞等，其中T细胞，也叫T淋巴细胞。T细胞如同一支守护健康的卫队在人体内巡逻，遇到对人体健康不利的病毒，细胞等就会进行消灭和清除。癌细胞有着很好的伪装能力，伪装成人体正常细胞。T细胞会将这些癌症细胞认为是人体自身健康细胞，并不对齐其进行攻击。科学家从病人体内取出一定数量的T细胞，对T细胞的抗原受体进行修饰，经过修饰的T细胞，能够识别特定的癌细胞。科学家对经过修饰的T细胞，在体外通过仪器设备进行扩大培养。大量培养经过修饰后的T细胞，再注入病人体内。注入病人体内的经过修饰和扩大培养的T细胞，相当于给人体提供了一支可以识别并杀死癌细胞的T细胞军队。这些强化后的T细胞卫队在体内巡逻，癌症细胞的伪装在这些强化后的T细胞面前失去作用。T细胞会像杀死普通入侵异物一样，将癌症细胞杀死并清除，从而达到治愈癌症的疗效。INFORS的细胞培养专用摇床、细胞生物反应器，WIGGENS二氧化碳振荡培养箱，广泛用于CAR-T细胞免疫治疗领域。在业内获得了客户极高的评价，为医疗健康领域做出了应有贡献。 INFORS的细胞培养专用摇床WIGGENS二氧化碳振荡培养箱

11月24日，暨南大学医学部生物医学转化研究院教授尹芝南团队与合作者，在《自然》在线发表的研究成果显示，白细胞介素27（IL-27）具有促进脂肪细胞产热和能量消耗的作用，其主要响应细胞是脂肪细胞而非免疫细胞，并且IL-27具有减轻肥胖和提高胰岛素信号敏感性，即改善2型糖尿病的治疗作用。　　“这一工作历时7年才得以完成。”尹芝南对《中国科学报》表示。　　发现减肥新靶点　　近年来，随着富含脂肪和糖等高能量食品的摄入持续增加，以及越来越多的工作为久坐形式，人们罹患超重或肥胖的比率快速上升。世界卫生组织流行病学调查显示，2016年，18岁以上的成年人中有超过19亿人超重（身体质量指数即BMI≥25），其中超过6.5亿人为肥胖（BMI≥30），流行率与1975年相比增长近3倍。　　“肥胖的根本原因是卡路里的摄入超过消耗，引起能量以脂质形式在脂肪细胞中堆积，而免疫细胞深度参与此过程。因而，寻找新的治疗靶点，尤其是直接靶向脂肪细胞而有效减重的分子尤为迫切。”尹芝南说。　　尹芝南长期从事免疫与健康的基础和临床研究，在T细胞领域取得一系列开创性成果，并将研究成果成功应用于临床转化。此次，尹芝南团队通过构建多种基因工程小鼠，进行高脂饮食诱导的肥胖模型，并结合肥胖人群样本发现，肥胖人群血清中IL-27水平下降；突破了传统观念中IL-27专一性靶向免疫细胞的认知，首次发现IL-27通过直接作用于脂肪细胞，导致白色脂肪细胞棕色化，并激活UCP1介导的“脂肪燃烧”；通过将脂肪组织中的脂质转变为热量消耗掉，从而达到降低体重和改善糖尿病等代谢性疾病的目的。　　“体重增加，从表面上来看是脂肪细胞增大，但根本原因是胰岛素抵抗。”尹芝南解释，团队发现的IL-27作用于脂肪细胞燃烧，一方面是减肥，但最主要是改善了胰岛素抵抗。改善胰岛素抵抗，对治疗肥胖及很多疾病都具有重要意义，如脂肪肝、多囊卵巢综合征等。　　尹芝南指出，该研究突破了对IL-27仅专注于调节免疫系统的传统认知，为肥胖及其相关代谢性疾病的治疗提供了新的靶点和潜力药物，而IL-27作为体内正常表达的分子，具有良好的安全性，因而具有巨大的临床应用潜力和市场价值。不过，他也同时强调，从实验室到临床，还有很长的路要走。　　“在肥胖过程中是哪个细胞产生IL-27？IL-27在脂肪细胞的相互作用过程中有没有受到其他细胞的作用，有没有受到情绪的影响？这些都是团队接下来要做的基础研究。”尹芝南说。　　躺平燃烧卡路里？　　传统观点认为，免疫细胞尤其是T细胞、B细胞和巨噬细胞，是IL-27的主要响应细胞，而脂肪组织局部含有大量的巨噬细胞和T细胞。　　为了探究IL-27通过何种细胞发挥改善肥胖的作用，尹芝南团队构建了IL-27Rα的条件性敲除小鼠。他们意外发现，在T/B细胞和巨噬细胞中特异性缺失IL-27Rα，都不影响小鼠对高脂诱导肥胖的易感性。这促使作者猜想，IL-27是否还有其他未被发掘的响应细胞。　　为此，尹芝南团队利用IL-27Rα全身性敲除小鼠开展了骨髓嵌合实验，并进行了高脂饲喂或寒冷刺激。结果发现，IL-27信号主要通过非造血系统来源的细胞影响产热与肥胖进程。一个大胆的想法在尹芝南脑海中产生：IL-27是不是可以直接靶向脂肪细胞来促进产热、改善肥胖进程呢？　　为了验证上述假设，研究人员首先分离了脂肪组织中的脂肪细胞组分，发现上面确实有IL-27Rα的表达；对体外分化的原代脂肪细胞进行免疫荧光染色，也可以观察到IL-27Rα的阳性表达；并且IL-27处理体外分化的脂肪细胞可以上调UCP1的表达。　　于是，他们再次构建了脂肪细胞上特异性缺失IL-27Rα的小鼠和棕色/米色脂肪细胞特异性缺失IL-27Rα的小鼠，这些小鼠也的确表现出对肥胖诱导和寒冷刺激实验的易感性。这些结果表明，IL-27确实可以直接靶向脂肪细胞，以促进产热、减轻肥胖。　　“我们在动物实验中，注射重组IL-27可以显著减轻肥胖小鼠的体重并改善胰岛素信号敏感性，初步验证了IL-27作为治疗药物的潜力。”论文共同第一作者、暨南大学附属珠海市人民医院博士后王倩解释，该研究成果的主要优势是IL-27是在本体表达的蛋白，不是人工合成的外源性化合物。　　“我们可以在不用限制饮食、不用节食的情况下改善2型糖尿病、燃烧脂肪、减轻体重，从机制上改善胰岛素信号的敏感性。”论文共同第一作者、暨南大学附属珠海市人民医院博士后李德海介绍。　　“我们非常期待能够尽快将这一治疗靶点产业化，推动其临床应用，研发出RNA相关药物，为肥胖、糖尿病、脂肪肝等一系列代谢性疾病提供一个全新的治疗方法。”尹芝南还透露了另一研究方向——通过IL-27水平变化，预判身体健康状况。　　相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04127-5

p　　烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)及其磷酸化形式(NADPH/NADP+)，作为生物体内两对最重要的辅酶和核心代谢物，常被用作评价细胞代谢状态的关键指标，与癌症、糖尿病、肥胖症、心脑血管疾病、神经退行性疾病等的发生发展密切相关。NADH和NADPH的荧光光谱相似，但是二者的生理功能却显著不同。NADH主要参与物质能量代谢，NADPH主要参与合成代谢和抗氧化，传统的自发荧光分析方法难以区分这两种小分子。/pp　　生物反应器工程国家重点实验室(华东理工大学)杨弋教授、赵玉政研究员研究团队与中国科学技术大学刘海燕教授合作，在前期研究基础上，通过对底物结合蛋白的理性设计和改造，strong开发了一系列特异性检测NADPH的高性能遗传编码荧光探针iNap，实现了活体、活细胞及各种亚细胞结构中对NADPH代谢的高时空分辨检测与成像。/strong利用iNap，研究团队精确测定了癌细胞内不同亚细胞结构中的NADPH，发现其受NAD激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD活性调节，证明氧化应激时癌细胞内NADPH代谢受葡萄糖的动态调节。基于大量数据分析，研究团队提出了哺乳动物细胞有很强的维持NADPH稳态的能力的观点。此外，iNap还揭示了NADPH代谢与巨噬细胞免疫激活以及机体创伤反应密切相关。strong细胞代谢荧光探针iNap，不仅可应用于抗氧化、AMPK、脂肪酸合成等代谢途径与通路分析，还可用于衰老及相关疾病创新药物的发现。/strong/pp　　相关成果于2017年6月5日以“研究长文”的形式在Nature Methods上发表。/p

一个受精卵发育为一个复杂个体，正常体细胞变成肿瘤细胞，细胞作为生命的基本单位，其状态的动态变化既是健康发育的基础也是疾病产生的原因。从光学显微镜对细胞形态变化的观察，到绿色荧光蛋白对细胞基因、表达定位等变化的追踪，再到分子记录器在基因组中稳定写入曾经发生的分子事件，以及单细胞转录组测序的发展，允许细胞全转录组的变化拟时序推测，每一次细胞动态变化记录的技术变革均推动了细胞生物学的发展。既有方法或受限于对细胞形态或少数基因的动态表征，或依赖于拟时序分析中多种在实际细胞体系中可能无法满足的假设，目前尚不能直接测量细胞全转录组状态变化。 8月17日，中国科学院深圳先进技术研究院、瑞士洛桑联邦理工学院Bart Deplancke课题组、苏黎世联邦理工学院Julia Vorholt课题组合作，在《自然》（Nature）上以article长文形式，发表了题为Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells的研究论文。 该研究开发了活细胞转录组测序技术（Live-seq），首次实现了单细胞进行转录组测序后依然能够保持细胞存活。该技术兼具全基因表达分辨率和动态解析能力，是当前对单细胞转录组直接动态测量、偶联细胞现有状态及其后续表型的唯一解决方案。 基因表达程序的变化是细胞对外源和内源刺激反应的重要表现。对单个细胞的连续观测是细胞对刺激反应、变化的重要研究手段，活细胞成像是最早的方法之一。随着显微成像技术和荧光标记手段的发展，显微成像可实现从体外细胞培养到体内环境下对基因表达的动态观测。基因编辑技术的发展促进分子记录器的出现。该技术通过细胞原生的或人工合成的基因线路，对刺激的感应并将信息写入基因组，记录历史分子事件。技术的发展和应用促进细胞生物学的发展，例如活细胞成像已成为现代细胞生物学实验室的常用手段；分子记录器虽出现不久，但在体内多场景的适用性和稳定性上颇具潜力。而它们在记录基因表达上存在共同的限制——在一个细胞中只能同时记录一个或几个基因的表达。 2009年汤富酬首创单细胞mRNA测序以来，不再只依靠少数几个基因的表达来分析细胞类型，而可用整个转录组的状态来更系统全面的定义细胞类型和状态。单细胞转录组变革了对细胞状态异质性的解析能力，推动了发育生物学、肿瘤细胞学、免疫学和干细胞生物学等的发展。然而，研究只可测量细胞的静态状态，无法像前述的活细胞成像那样连续观测细胞的动态或检查细胞后续的表型。为了克服这一限制，多种基于计算或标记的方法被开发出来。这些方法基于共同的假设，即群体的静态分布可以模拟个体的动态运动。运用不同的数学模型和/或新旧RNA的标记等手段，研究将转录组相似的细胞连接，产生一条轨迹来代表一个细胞的变化路径。这些方法提供了有意义的生物学认知，但由于这些前提假设在复杂细胞系统不一定能被满足，其提供的变化路径应被解读为一种统计学上的预期，而非细胞真正变化的轨迹。而这些限制的根本原因在于单细胞测序时裂解杀死了细胞，因而无法连续测量。 本研究中，科研人员开发出活细胞转录组测序技术（Live-seq），在进行单细胞转录组测序后，依旧保持细胞的存活和功能。该技术的核心是对部分细胞质进行微创地提取，并对微量的细胞质RNA进行扩增。具体地，该技术整合改造了多种跨学科技术（图1）：具备纳米级移动分辨率和皮牛顿力学灵敏度的原子力显微镜，实现超精密显微操作；亚皮升级别的微/纳流控通道和液压调节系统，实现微量（约1皮升）样品提取和转移；纳米级的、中空可定量的、可和细胞膜无缝密封的特殊探针，可实现微创的细胞质提取；相偶联的实时跟踪成像和细胞培养系统，可以长时间锁定同一个细胞；高灵敏度的RNA扩增测序；对前述步骤的无缝整合。 Live-seq只对少量的细胞质进行测序，其结果能否代表细胞的状态？研究对多种类型和状态的细胞进行活细胞测序，并平行地和单细胞测序结果进行比较。结果显示活细胞测序结果和单细胞测序结果高度吻合，证明了Live-seq能够较好的体现细胞的全转录组状态。这一过程是否改变细胞状态甚至杀死细胞？研究对包括干细胞在内的多种细胞类型进行评估，发现大部分细胞在Live-seq后仍然存活。同时，细胞分裂依然能够正常进行（图2）。研究通过对巨噬细胞对细菌脂多糖LPS刺激的反应和脂肪干细胞分化过程的观测发现，细胞的反应未因Live-seq而有明显变化。研究对接受和未接受细胞质提取的细胞全转录组进行比较，也未发现大量的基因表达变化。结果显示，Live-seq未对细胞的活性和功能产生较大影响。 由于细胞测试后仍旧存活，Live-seq首次实现对同一个细胞全基因表达的连续测量。作为概念验证，Live-seq直接测定了同一个巨噬细胞和脂肪干细胞在刺激前后的变化路径（图3）。Live-seq可以回答细胞怎样的过去决定它的现在。即使是单克隆来源的巨噬细胞对细菌脂多糖的反应依旧有很大的异质性。利用这一模型，研究表明起始状态的少数基因的表达差异和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因，处于细S期的细胞对刺激反应也更弱。对应地，普通的单细胞转录组无法找到这些规律。 Live-seq仍有不足：与高通量的单细胞转录组相比，Live-seq是低通量的手段；Live-seq尚不能在体内应用；在高度极化而mRNA分布不均的细胞（如神经细胞）中，Live-seq或无法体现全细胞转录组；多次采样对细胞的干扰需要更多研究。未来持续的发展如自动化提高通量、通过和双光子显微镜联用运用于体内样品等，有望使上述不足得到改善。Live-seq第一次使得对活细胞的连续观测成为可能，希望可以催生更多新可能。 研究工作得到国家重点研发计划、深圳合成生物创新研究院的支持。 　　论文链接 图1.Live-seq基本原理 图2.Live-seq对细胞的影响，黄色的细胞被提取出细胞质，蓝色和紫色的细胞未被处理 图3.活细胞测序新可能：（左图）对同一个细胞转录组的连续分析；（右图）偶联细胞起始的转录组状态（因）和后续细胞对刺激的反应（果）

肿瘤微环境（TME）在肿瘤的所有阶段中都起着关键作用，从早期发起到转移性疾病。由于对TME的广泛研究，越来越多的免疫疗法，特别是免疫检查点阻断（ICB），已经显著改变了抗癌治疗的格局。然而，由于肝脏是一个高度免疫耐受的器官，肝癌的免疫治疗受到阻碍。2023年6月26日，中山大学附属第一医院彭穗/邝栋明教授团队在Cancer Research上在线发表题为“Crosstalk between myeloid and B cells shapes the distinct microenvironments of primary and secondary liver cancer ”的研究论文。该研究首次从单细胞角度对原发性和继发性肝癌中的免疫微环境进行了深入探讨，揭示了不同类型的浆细胞与髓系细胞相互作用介导免疫抑制微环境的相关机制。证明了B细胞是肝细胞癌( HCC )和结直肠癌肝转移( CRLM )微环境中的重要调节因子。这篇文章详细探讨了骨髓细胞和B细胞之间的相互作用如何塑造原发性和继发性肝癌的不同微环境。研究发现，在肝细胞癌（HCC）和结直肠癌肝转移（CRLM）中，B细胞表现出不同的发育轨迹。单细胞分析揭示，IgG+浆细胞在HCC中优先积累，而IgA+浆细胞则在CRLM中更为丰富。实验部分本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统g肝脏组织样本进行多色荧光图像采集。并且使用多重免疫荧光技术，通过AI Classifier技术获得大量组织形态学信息，还结合了Tissue Cytometry技术中精准的单细胞识别技术。通过多种细胞的组织原位信息，证实了cxcr3 + B细胞和TAMs通过CXCR3-CXCL10轴的相互作用，并通过进一步实验，发现在体内阻断CXCR3可以显著地减弱B细胞向肿瘤的迁移，证明了TAMs在HCC中募集CXCR3 + IgG浆细胞的重要作用。Figure 1 TAMs 通过 CXCR3-CXCL10 轴招募肝细胞癌中的 IgG 浆细胞D mIHC染色验证CXCR3þ B细胞和巨噬细胞在HCC中的相互作用。E mIHC 染色三级淋巴结构以确定 HCC 中 CXCR3þ B 细胞的位置I,J 对照组和抗 CXCR3 小鼠肝脏病变中 CD19 IHC 染色的图像和定量分析（使用StrataQuest软件对抗CXCR3小鼠肝脏病变中 CD19进行定量分析）Figure 2 CRLM 中的 IgA 浆细胞通过 CCR10-CCL28 轴被肿瘤细胞招募F mIHC 染色验证 CRLM 中 CCL28 和 CCR10 的相互作用H,I 对照组和抗CCL28小鼠肝脏病变中IgA的IHC染色图像和定量分析（使用StrataQuest软件对抗CCL28小鼠肝脏病变中IgA进行定量分析）这项研究的重要性在于，它揭示了肿瘤浸润B细胞的免疫调节模式在原发性和继发性肝癌中是不同的，浆细胞介导的重要生理过程推动了癌症的进展。这为理解肝癌的免疫微环境提供了新的见解，并可能对肝癌的免疫治疗策略产生影响。借助于TissueFAXS Cytometry技术，结合多色免疫荧光染色，不但可以对肿瘤组织进行精准识别 ，还可以实现肿瘤微环境中免疫细胞在组织中的空间分布、形态特征、与其他细胞类型的相互作用等方面进行高通量、高精度的原位定量分析。

p style="text-indent: 2em "微生物所strong微生物资源前期开发国家重点实验室/strong杜文斌研究组和黄力研究组共同开发了一种新型的strong微流控界面纳升注射技术/strong(Interfacial Nanoinjection, INJ)，该技术可以将传统的生化反应体系微缩在一个纳升体积的油包水微液滴体系中完成。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "界面纳升注射(INJ)具有诸多显著优势/span/strong/pp　　针对这一技术创新，团队申请了多项中国发明专利和美国专利，并研制了基于INJ技术的小型桌面系统。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/fe470173-c411-4a4f-857f-952adad6e8d5.jpg" title="界面纳升注射(INJ)系统.jpg" alt="界面纳升注射(INJ)系统.jpg"//pp style="text-align: center "界面纳升注射(INJ)系统/pp　　该系统和国外同类产品如美国Labcyte公司的Echo超声纳升移液系统、以及美国TTP Labtech公司的mosquito HTS微量筛选系统相比，strong在仪器成本、耗材成本、最小液滴体积、流式细胞仪兼容性、操作的灵活性、以及污染控制等方面，均具有显著优势，/strong适用于各类单细胞微体积反应分析，也可应用于其他微体积反应分析，在微生物培养筛选、合成生物学、药物筛选、蛋白结晶条件筛选等方面均具有应用潜力。/pp　　在性能方面，INJ系统通过高精密度的微体积控制实现不同试剂组分的纳升体积分步添加，兼容96和384孔板，可以在预先填装矿物油的孔板上，按照程序设定加入纳升样品或试剂液滴，用于实现高通量筛选。利用低成本探针可以精确加注的最小体积达到1 nL，当加样体积为5 nL时，体积标准偏差小于11 %。加注的液滴通过离心可以沉降到孔板底部并融合，液滴的融合效率最高，达到99%以上。利用多次加注样品、试剂的方法，可以实现多步反应和浓度梯度配置。系统加注的体积精确性、线性和重现性良好。/pp　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　FACS-INJ单细胞分析流程和应用/span/strong/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 281px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/7cc806a5-55aa-475f-a110-69b3c5038b70.jpg" title="杜文斌-流式细胞分选+界面纳升注射技术图示.jpg" alt="杜文斌-流式细胞分选+界面纳升注射技术图示.jpg" width="600" height="281" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="text-align: center "FACS-INJ单细胞分选分析流程/span/pp　　strong单细胞分析是一项变革性技术/strong，在单细胞基因组异质性研究及复杂微生物群落中稀有微生物种群多样性研究等领域应用广泛。然而，如何进一步降低单细胞分析的成本，提高可靠性和效率，仍然面临重大挑战。流式细胞荧光激活细胞分选(FACS)是目前最高效的单细胞分选技术，可实现病毒、细菌、真菌和动物细胞的多参数检测和分选 利用荧光标记，可对不同类型的细胞进行有效的区分，分选成功率高。研究团队将INJ与FACS平台相结合，建立了FACS-INJ单细胞分选分析流程，应用覆盖了单细胞表型分析、基因型分析、基因表达分析以及全基因组扩增测序。/pp　　研究团队首先利用FACS-INJ系统实现了strong病原菌微生物单细胞耐药基因的PCR筛查和单细胞药敏表型筛查/strong。经优化，多孔板可预先装载纳升体积的PCR引物或不同浓度的抗生素液滴。PCR筛查体积缩小到500 nL，试剂消耗和成本和常规体系相比降低至原先的1/40，耐药检测的体积控制在200 nL，试剂消耗和成本和常规体系相比降低至原先的1/1000，时间从 12小时缩短至5小时，这对于大幅降低临床病原检测的成本，实现脑脊液、房水等难获取微量样品的耐药基因和表型筛查具有重要意义。/pp　　其次，FACS-INJ系统还可用于strong动物细胞的单细胞基因表达分析/strong。以小鼠巨噬细胞RAW264.7在细菌胞外多糖处理前后的炎症反应为例，通过荧光激活流单细胞式分选处理前后的小鼠巨噬细胞，基于一步法反转录实时荧光PCR扩增，在单细胞水平解析了次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)基因(看家基因)和白介素1β(IL-1β)基因(炎症反应)表达水平的变化。/pp　　最后，团队与北京大学黄岩谊课题组合作，建立了strong基于FACS-INJ的微生物全基因组扩增测序流程/strong，以获得未培养微生物的全基因组信息。流程包括流式分选微生物单细胞、单细胞裂解、酸碱中和、MDA扩增和建库测序。以热泉来源的古菌硫化叶菌(Sulfolobus sp. A20)菌株为模型，将单细胞扩增的体积优化至360nL，硫化叶菌全基因组覆盖度达到80%以上。在纳升级微液滴中实现西南印度洋未培养单细胞微生物全基因组DNA的MDA扩增与测序，拼接后获得15个单细胞基因组，大小在0.1~3.7Mb大小。该方法获得的微生物基因组污染度较传统的MDA扩增方法显著降低( 5%)，显著提高了微生物单细胞基因组数据质量。平台也适用于肿瘤、胚胎等动物细胞的全基因组扩增测序，对肿瘤细胞的单细胞测序的覆盖度达到60-80%。/pp　　上述研究工作近期作为特邀论文在线发表在Small上。微生物研究所助理研究员贠娟莉博士、郑小伟博士、徐鹏博士为论文共同第一作者，杜文斌研究员、黄力研究员和北京大学黄岩谊教授为论文共同通讯作者。该研究该研究得到了中国大洋协会大洋十三五重点项目、中科院战略性先导科技专项(B类)，中国科学院重点部署项目、中国科学院前沿科学重点研究项目、国家自然科学基金面上项目和优青项目等支持。/pp　　论文出处：/pp　　Yun, J.L.sup#/sup Zheng, X.W.sup#/sup Xu. P.sup#/sup Zheng, X. Xu, J.Y. Cao, C. Fu, Y.S. Xu, B.X. Dai, X. Wang, Y. Liu, H.T. Yi, Q.L. Zhu, Y.X. Wang, J. Wang, L. Dong, Z.Y. Huang, L.* Huang, Y.Y.* Du, W.B.* Interfacial Nanoinjection-based Nanoliter Single-cell Analysis, Small, 2019, doi:10.1002/smll.201903739./pp　　a href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/smll.201903739" target="_self" style="text-decoration: underline font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(255, 0, 0) "strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(255, 0, 0) "查看原文戳这里/span/strong/a/pp　　strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "杜文斌/span/strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "，男，中科院微生物研究所研究员。2007年于浙江大学化学系，获博士学位。2007-2011年于美国芝加哥大学化学系从事博士后研究工作。2013年11月加入中科院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室。主要从事微流控芯片技术及新型分析微生物技术与应用研究。已发表论文60余篇，申请中国和美国专利30余项，授权20多项。主持国家优秀青年科学基金项目，国家重点研发计划 “数字诊疗装备研发”项目，中国科学院前沿科学重点研究项目等。/span/p

团队用靶向给药微纳米机器人在小鼠身上做了实验。他们用了乳腺癌细胞种植的皮下肿瘤模型，对30只小鼠跟踪了30天。团队发现，这种方法对小鼠肿瘤确有靶向杀伤作用，且对周围正常组织的影响最小。　　上映于1966年的科幻电影《神奇旅程》，讲了这么一个故事：为给一名科学家实行高难度血管手术，5名医生被缩小成头发丝大小，置于针筒中，注射进他体内。5人驾驶着“潜艇”，躲过了免疫细胞的攻击，一路乘风破浪，成功完成任务。　　50多年过去，当初的幻想，已经部分成为了现实。微纳米医疗机器人，就被认为是一种颇具前途的智能给药平台，目前被广泛用于肿瘤的靶向治疗。　　近日，北京航空航天大学机械工程及自动化学院“卓越百人”副教授、博士生导师冯林课题组，研究出了一种新的更为智能的肿瘤靶向机器人。它有了伪装，还有了导航，能够在磁场的驱动下，精准抵达战场，投掷杀伤肿瘤的弹药。　　让巨噬细胞吞下纳米药物，变身微纳米机器人　　让纳米机器人装载药物，到达指定地点，定向治疗炎症或清除肿瘤，这是医学纳米技术的终极目标之一。但传统微纳米机器人在人体内的运动，其实靠的是分子之间的结合力，这是一种“被动靶向”，难免脱靶。“就好比我们知道，人群中具有某种特质的两类人可能会碰上。但茫茫人海中你最后碰上的是不是想要的人，其实要打一个问号。”冯林说。　　而且，也如当初那部电影里所展示的，被注射进人体内的纳米机器人，稍有不慎，就会遭到兢兢业业工作的免疫细胞的攻击。　　能不能让这类医疗机器人更为安全且精准地到达要去的地方？　　2016年从日本回国后，冯林就一直思考这个问题。在北航机器人所的支持下，冯林和陈华伟老师合作申请获批了国家重点研发计划—机器人重大项目“靶向给药微纳米机器人”。在一次讨论中，陈华伟问可不可以让活细胞作为载体。这句看似很随意的提问提醒了冯林：直接让活的细胞吞进载药纳米颗粒变身微纳米机器人行不行？　　他们想到了巨噬细胞——这是一种喜欢吞食并处理异物的细胞。　　合适的载体和“伪装”找到了，接下来，就是设计机器人的“导航系统”。　　磁性纳米颗粒可以由磁场来控制，药物释放可以利用红外或者超声波。几乎是从零开始，冯林团队自行设计了复合磁控系统。他们从电子线圈开始设计，一点点调整、摸索技术参数。磁性纳米颗粒进入小鼠体内后，通过这套系统，他们可以在体外对其行走路径进行高精度控制。　　再接下来，就是让磁性纳米颗粒装载药物，并让它在合适地点，通过合适方式，释放药物。　　这款机器人其实设计有许多层。在阿霉素外层，是聚乙二醇，一种具有良好水溶性的高分子化合物；再外一层，是吲哚菁绿，它是药物研究中常用的荧光标记物，帮助科研人员判断机器人所在的位置。最后他们还包裹了一层脂质体，它具有非常高的生物相容性。　　团队还为机器人设计了一个开关——近场红外光。近红外光穿透表层皮肤，磁性纳米颗粒吸收光线，产生热量，会释放出阿霉素。　　如此一来，纳米机器人基本实现“指哪打哪”的效果。　　“接收指令，执行指令，完成任务，在我们做机械的人眼中，具备这些能力的，才是智能的机器人。”冯林说。　　团队用靶向给药微纳米机器人在小鼠身上做了实验。他们用了乳腺癌细胞种植的皮下肿瘤模型，对30只小鼠跟踪了30天。团队发现，这种方法对小鼠肿瘤确有靶向杀伤作用，且对周围正常组织的影响最小。　　9月，纳米科学领域权威期刊《小》（Small）以封面文章的形式报道了课题组的研究成果。　　在机械学院，他们建立生物医学实验室　　冯林的团队中，有好几个医学生物专业出身的博士。在他的机械实验室里，还有一块专门区域，用来做生物医学实验。　　所以，你能看到这样一个略显奇特的景象——实验室里，有各类机械模型，有专业级的显微镜，以及小白鼠。　　去采访时，由于已经结束了上一轮的实验，小白鼠所剩不多，正在笼子里踱来踱去，安度余生。　　冯林是“80后”，本科学的电子信息工程，硕士专业是生物机器人，博士留学日本名古屋大学，跟着导师新井史人教授一头扎进了更为微观的世界——微纳米机器人。　　回国后，冯林来到北航，获得北航“卓越百人”，加入了机械学院张德远老师领导的仿生与微纳系统研究所，之后又得到北京市“科技新星”资助。北航提倡“医工结合”，冯林也被聘入了北京市生物医学工程高精尖中心，更深入地进入到医疗机器人领域。　　“不能只是炒概念，说纳米机器人未来能如何如何。”冯林一直存着这个念头，就是要真正把纳米机器人打入体内，真正杀死体内的肿瘤细胞。　　就在不久前，冯林指导的学生团队凭借Medcreate磁悬浮胶囊机器人在第七届中国国际大学生“互联网+”创新创业大赛中获得本科生创意组全国第五名。　　它用到的技术，也是“复合场磁控”。　　这是一款主动可控高速图像传输型胶囊机器人，能对胃部等大体积消化道器官进行全方位无死角视频探查。胶囊机器人可以悬浮运动，无需改变患者体位，就能完成整个胃部的覆盖式检查。　　冯林为学生取得的成绩高兴，但他也知道，要完善各类治疗型的微纳米机器人，还“路漫漫其修远兮”。　　从小鼠到人体，从试验到临床，还需要一步步完善和摸索，这并非坦途。“你要舍得花一辈子的时间。”冯林说。

双特异性T细胞衔接器（bispecific T-cell engager，BiTE）是一种能够同时结合肿瘤相关抗原（tumor associate antigen， TAA）和 CD3 复合物的抗体类抗肿瘤药物。传统的技术是通过靶向TAA 来实现肿瘤内T细胞上CD3信号通路的再激活，从而达到杀伤肿瘤细胞的效果【1-3】。自上世纪90年代起，针对双特异性抗体疗法的设计和改进已经有了近30年的研究。然而，目前为止只有安进公司（Amgen）的Blinatumomab (针对CD19 的 BiTE) 被FDA 批准用于治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia, ALL)【4,5】。以细胞因子风暴（cytokine storm）为主的副作用限制了其他针对实体瘤的BiTE所进行的临床测试。仅在2021年，安进公司就暂停了4种 BiTE的一期临床试验, 所涉及的抗原包括FLT3, BCMA, CD33和EGFRVIII。除了严重的副作用之外，半衰期短，TAA特异性低以及抑制性肿瘤微环境都是限制BiTE在体内发挥抗肿瘤效应的重要因素。因此，提升双特异性抗体的有效性并降低其副作用能够极大的促进该疗法在临床的广泛应用。图1 正在以单药形式进行临床测试的双特异性抗体2021年11月1日，美国德克萨斯大学西南医学中心傅阳心团队在Nature Biomedical Engineering杂志上发表了题为Rejuvenation of tumour-specific T cells through bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells的文章。该研究构建了靶向免疫检验点PD-L1 和CD3ε的双特异性抗体 （PD-L1xCD3）。在多种小鼠肿瘤模型上，PD-L1xCD3比传统的TAA靶向性双特异性抗体（ErbxCD3）展现出了更强的抗肿瘤效果。利用多种条件性敲除小鼠表明，PD-L1xCD3在体内主要结合树突状细胞（dendritic cells， DCs）表达的PD-L1而并非肿瘤细胞或巨噬细胞表达的PD-L1，进而重新激活了肿瘤内部的抗原特异性CD8 T 细胞免疫反应来达到治疗肿瘤的效果。进一步的机制研究表明，PD-L1xCD3与DC上PD-L1的结合，促进了共刺激分子B7和CD28之间的相互作用，从而避免T细胞发生激活诱导的细胞死亡（activation-induced cell death），进而实现肿瘤内T 细胞长效激活的效果。研究团队首先在体外验证了制备的PD-L1xCD3能够同时结合PD-L1和CD3ε，并能够以PD-L1依赖的方式刺激T细胞活化并分泌IFNγ，杀伤肿瘤细胞。体内实验进一步表明PD-L1xCD3能够在MC38模型上产生良好的抗肿瘤效果并优于anti-PD-L1和anti-CD3的联合治疗，从而表明PD-L1xCD3具有其独特的作用机制。通过细胞过继转移和删除实验表明，PD-L1xCD3能够诱导抗原特异性CD8 T细胞反应并产生免疫记忆，而这一现象依赖于肿瘤内预存的CD8 T 细胞。为了研究PD-L1xCD3是否比传统的TAAxCD3具有更强的抗肿瘤效果，作者们制备了靶向TAA的ErbxCD3双特异性抗体，并通过体外实验证明其具有与PDL1xCD3相似的亲和力，激活T细胞能力和肿瘤细胞杀伤能力。然而体内实验却表明，在相同剂量下PD-L1xCD3比ErbxCD3展现出了更强的抗肿瘤效果，并且这一现象在TC1，B16F10，TuBo等多种模型上均得到了验证，提示靶向免疫检验点PD-L1的双特异性抗体比靶向TAA具有更好的激活T细胞能力。为了进一步探究产生这种区别的本质原因，作者们首先通过在不同的细胞上敲除了PD-L1来探寻哪种细胞表达的PD-L1对于PD-L1xCD3在体内的抗肿瘤效果是必须的。出乎意料的是，尽管肿瘤细胞本身是最主要的PD-L1阳性的细胞，但敲除肿瘤细胞上的PD-L1并没有影响PD-L1xCD3的治疗效果。与之相反，敲除宿主细胞上的PD-L1却彻底废除了PD-L1xCD3的治疗效果。通过条件性PD-L1敲除小鼠实验表明，树突状细胞而并非巨噬细胞表达的PD-L1起到了至关重要的作用。作者进一步利用Batf3敲除小鼠确认树突状细胞亚群（cDC1）对于PD-L1xCD3的治疗效果是不可或缺的。前期研究表明，anti-PD-(L)1 治疗能够通过增强B7-1(CD80) 与CD28的相互作用来达到激活T 细胞的效果6, 7。由此，研究人员提出了PD-L1xCD3治疗是通过增强共刺激信号来发挥作用的假设。结果也表明，用抗体阻断CD80/86后，PD-L1xCD3的治疗效果消失同时抗原特异性T细胞反应也大大减弱。通过体外共培养实验证明，PD-L1xCD3能够通过增强共刺激信号的方式促进IL-2的分泌，避免T细胞因过度激活导致的凋亡，从而实现肿瘤内T细胞的长效激活。传统BiTE的设计理念是通过单链抗体（ScFv）衔接T细胞与肿瘤细胞，促使T细胞活化并直接进行肿瘤细胞杀伤。然而，在肿瘤微环境里T细胞的数量和质量都非常有限。而肿瘤细胞不仅数量“占优”并且能够通过激活抑制性信号通路（如PD-L1/PD-1）来逃逸杀伤。与此同时，由于肿瘤细胞本身并不表达共刺激分子，其激活T细胞的效果非常有限。面对数倍于己的“敌军”，T细胞在反复杀伤的过程中很容易产生耗竭而败下阵来。与之相反，作为新型双特异性抗体，PD-L1xCD3能够将T细胞与树突状细胞衔接在一起，从而为其激活提供充足的条件（共刺激分子）。通过与树突状细胞的相互作用，T细胞不仅得到了有效的激活并且能够通过IL-2实现自我扩增。最终实现T细胞的持续性激活并获得持久的抗肿瘤免疫反应。图二：PD-L1xCD3的作用机理综上所述，该研究为新一代双特异性抗体设计提供了思路。证明了PD-L1xCD3 具有优于传统BiTE的如下特点：1）靶向肿瘤组织降低毒性；2）阻断PD-L1/PD-1相互作用，解除T细胞抑制；3）靶向DC细胞为T细胞激活提供共刺激信号，从而促进IL-2介导的T细胞存活。据悉，该论文已被选为Nature Biomedical Engineering 杂志11月份的封面故事。该研究的通讯作者是美国德克萨斯大学西南医学中心的乔健博士和傅阳心教授。刘龙超博士为论文的第一作者。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-021-00800-2