抗体水平

作为一种天然的生物大分子，DNA不仅是生命的密码，还可作为制造纳米级构件和机器的通用元件。由于DNA的尺寸为纳米级别，具有刚性结构、编码性强的特点，于是，DNA纳米技术的研究者利用DNA分子的自组装特性，根据核酸碱基互补配对的作用，设计并在试管中构造出精确而复杂的、纳米级精度的有序结构。这一新兴的领域被称为DNA折纸技术，科学家使用比头发丝还细一千倍的DNA和RNA等核酸分子，折叠、自组装成复杂的结构。 日前，上海交通大学的樊春海教授、中科院上海应用物理研究所的李宾研究员和胡钧研究员等人联合在《NatureCommunications》发表题为“Capturingtransient antibody conformations with DNA origamiepitopes”的文章，报道了一种三角形的DNA折纸骨架，其具有特定位置的锚定和空间组织的人工表位，可在室温下捕获免疫球蛋白Gs(IgGs)的瞬时构象。其中，DNA折纸表位(DOEs)允许表位瞬间的程序化空间分布，从而可以使用原子力显微镜(AFM)对功能复合物进行直接成像。 在本文中，作者建立了IgG亲和力对单分子水平上3-20nm内表位横向距离的关键依赖性。瞬时构象的高速AFM成像进一步为在单一事件中从单价到二价的IgG亲和力提供了结构和动态证据，这为包括病毒中和、诊断检测和癌症免疫疗法在内的各种应用提供了非常创新的思路和研究方法。 图1：基于DOE的IgGs捕获 图2：HS-AFM表征DOE限制的IgG构象灵活性和Fab-Fab距离 图3：IgG与DOEs结合的动力学 图4：引起IgG亲和力的工程DOEs 综上所述，作者设计了DOEs，通过利用DNA折纸技术的空间可寻性来模拟表位在病毒颗粒上的距离分布。DOEs的定位能力和刚度使IgG能够在室温下冻住，以便在单分子水平对瞬时的功能性IgG结合构象进行高分辨率成像。通过对DOEs上抗原决定簇横向距离的可编程控制，可以精确确定抗原决定簇与抗原决定簇之间的亲和力。此外，该DOE平台还支持HS-AFM和smFRET分析，以探测DOE上单个IgG结合的动力学。研究发现IgGs可以响应从短到长的表位距离，采取从高紧密度到远距离伸展的灵活构象。重要的是，当两个表位间隔约10nm时，二价IgG的结合动力学和效率最高。总之，DOEs的可设计性和可编程性提供了一种直观的方法来模仿病毒表位的分布。因此，DOEs不仅增加了在单分子水平上理解Ab-Ag相互作用的设计空间，而且为免疫工程提供了潜在的强大平台。 DNA折纸表位(DOEs)的制备需要精密的工艺，需要进行准确的浓度确定后，方可进行抗体结合的相关表征及动力学研究。而文中DOEs的浓度确定即由德国ImplenNanophotometer超微量分光光度计完成。 我们非常荣幸能够服务于国内顶级的科研机构，助力用户完成开拓性的成果，这也是Nanophotometer的实力展现和价值体现。独特的样品压缩技术、无需校准的光程设计、以及高性能的NPOS操作系统，可以加速您的研究进程，获得可靠的、一致的结果。有关Nanophotometer的详细信息，欢迎咨询Implen中国以及各地合作伙伴。 Implen GmbH因普恩（北京）国际贸易有限公司

p style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "span style="text-indent: 2em "2020旧历庚子年春节，将注定被铭刻在人类抗疫的史册上。占全球人口五分之一的中国迎来自己一年一度最盛大的节日——春节。数亿人将返乡、数亿人将外出旅行，他们的足迹将遍及祖国大江南北每个乡村和世界各大名胜秀地。然而新型冠状病毒的阴影在佳节前开始蔓延，并因春节到来防控难度被指数级放大。新冠病毒的防控从一开始就受到了我国政府及世卫组织的高度重视。/spanbr//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "1月20日，中共中央总书记、国家主席、中央军委主席习近平作出重要指示，强调要把人民群众生命安全和身体健康放在第一位，坚决遏制疫情蔓延势头。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "面对疫情，华大积极参与病原研究，第一时间予以技术支持，并携手多国及地区开展病原合作，进行病毒快速检测、鉴定及病毒变异监测。在最早一批提交至全球共享流感病毒数据库GISAID发布的13例新型冠状病毒基因组序列数据中，有5例数据来自华大智造高通量测序仪——MGISEQ-2000，这为研究分析武汉新型冠状病毒的进化来源、致病病理机制提供了第一手资料。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strong一、研发先行，资质开路，华大为抗击疫情提供完整检测解决方案/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "2020年1月初，华大基因下属子公司紧急组织科研及生产力量，开始了相关试剂盒的研制工作。在通过严格的试剂盒生产工艺和质量控制等环节确保稳定性和准确性后，于1月14日官方宣布完成2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR荧光探针法）成品的全部研制工作。该新型冠状病毒核酸检测试剂盒可以用于疑似患者的快速识别、鉴定，协助疾控部门和医疗机构采取及时有效的防控措施。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 386px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/8e67bffc-6263-4b23-ac34-39c0b1f8ec5d.jpg" title="1 MGISEQ-2000.png" alt="1 MGISEQ-2000.png" width="600" height="386" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "在此期间MGISEQ-2000再次发挥了其全面灵活、质量稳定、测序速度快等优势。基于MGISEQ-2000高通量测序仪进行高敏PMseq-RNA检测，对于部分病毒含量较低的样本，可以作为核酸检测试剂盒（RT-PCR荧光探针法）的补充，能够提高阳性检出率，避免漏检；对于疑似感染、多重感染或继发感染病原样本，可以提供更多可能感染的病原信息，确定病原的完整基因组，来源和变异情况，提供致病病理机制有效依据，辅助临床更加有效的诊疗。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/1a09c714-7814-4310-bc01-038fec89725d.jpg" title="2 MGISEQ-2000.png" alt="2 MGISEQ-2000.png"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "目前华大基因已在提供新型冠状病毒第三方检测服务。以华大集团旗下华大智造生产的系列测序仪为核心构成的世界领先高通量测序平台，坚如磐石的支撑着大疫当前病毒检测的质量与数量需求。span style="text-indent: 2em " /span/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "华大基因新型冠状病毒检测试剂盒和华大智造DNBSEQ-T7测序系统获得国药监局应急审批/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "冠状病毒以其不稳定、高变异性著称，因此在用RT-PCR试剂盒筛查的同时，也需用超级测序仪对病毒进行可能的变异监控。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "此次华大基因有两款试剂盒通过国药监局应急审批。其中新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），基于RT-PCR技术可实现3个小时内快速检测；另一款新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）则是基于宏基因组测序的检测试剂盒，能够鉴别诊断包括新冠状病毒在内的其他冠状病毒和呼吸道病原的感染，实现病毒序列快速检测。获批试剂盒将会发往各地医院、疾控中心和出入境检验检疫局，用于测定疑似患者的样本中是否有新型冠状病毒。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "和两款试剂盒及分析软件一同获批的DNBSEQ-T7测序系统，是目前全世界日通量最高的测序仪，它能在5小时内完成SE50测序，每次运行样本检测通量达到50-200样本，每个样本可获得平均100 M以上数据产出；最快可在20小时内对128个病例实现从样本到下机报告的输出，且每个样本经高通量测序获得的总Reads数超过100 M reads，能有效提高病原微生物的检测灵敏度，在确保高准确度检测外，能提供进一步病毒演变分析数据支持。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "为此，华大基因紧急运送2台华大智造超高通量测序仪DNBSEQ-T7支援武汉。作为超高通量测序仪，T7搭载自动化样本制备系统，有望解决检测瓶颈，进一步提升送检样本的检测效率，对武汉疫情的科学临床防控提供强有力的技术支撑。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/22c04737-550c-4804-8dc9-b769bf7ae273.jpg" title="3 MGISEQ-2000.png" alt="3 MGISEQ-2000.png"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "精准的qRT-PCR检测，配合必要的基因测序复核，为抗击疫情提供新型冠状病毒检测整体解决方案/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "截止目前，华大已探索出针对新型冠状病毒检测行之有效的整体解决方案：精准的qRT-PCR检测，配合必要的基因测序复核及抗体水平的评估是“纾临床诊断之困，解社会恐慌之压、破武汉封城之局”的最佳组合。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "使用快速检测试剂盒（新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒—荧光PCR法）3个小时左右快速检测出具报告。针对阴性疑似样本使用基于宏基因组测序的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）进行补充复核，同时鉴别诊断包括新冠状病毒在内的其他冠状病毒和呼吸道病原的感染。使用抗体检测可以了解人群中有多少人曾经感染过新冠病毒，筛查出无症状感染者。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "因此结合RT-PCR和宏基因组检测，可更快、更全面覆盖2019-nCoV病毒检测，并监测新型冠状病毒在传播过程中可能会发生的变异，进一步结合抗体检测进行流行病学调查。这对新冠的彻底防控以及类似病毒流行病学的研究与防控，具有重要意义。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strong二、主动出击，极致交付，捐赠驰援送爱心/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "疫情攻坚，需要多方力量共同努力，目前华大主动出击和各地疾控中心紧密合作，依托高通量测序系统MGISEQ-2000和T7，快速对各地疑似患者进行宏基因组测序分析，凭借数据质量准确稳定和通量灵活等特点，在多地为新冠状病毒疫情的科学临床防控提供有力的平台支撑。在疫情发生期间，物流运输和技术支持不间断提供服务，确保各地检测第一时间顺利开展，在最短时间产出高质量的测序数据。战胜疫情，共克时艰。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "全力保障试剂盒生产和供应，极致交付，为疫情一线提供最快响应/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "春节期间，华大已快速成立了应急指挥部，安排人员专职负责生产、质量、储运方面的监控和应急值守，开足马力、全力以赴保障检测试剂盒的生产和供应，以尽快让武汉及全国的疑似病例都能在第一时间使用试剂盒，并在到样后3小时左右出检测结果，有效防控疫情蔓延。华大武汉、深圳、天津等各地团队均已随时待命，为疫情一线防控提供最快响应。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "据悉，华大目前已向包括武汉地区在内的全国各地共投放试剂盒约5万人份。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "同时，华大分别宣布向武汉、湖北各捐赠1万人份新型冠状病毒检测试剂盒，以驰援当地新冠肺炎防控。眼见疫情防控形势严峻，又于1月29日宣布联合各界爱心机构和人士追加捐赠10万份新型冠状病毒检测试剂盒。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/557e1355-bca9-45f3-a806-9090f284e9e4.jpg" title="4 MGISEQ-2000.png" alt="4 MGISEQ-2000.png"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "在全力满足国内检测需求的同时，面向国际华大还与文莱卫生部、泰国公共卫生部、尼日利亚国家医学研究中心（NIMR）、南非国家卫生实验局国家传染病研究所（NICD）、中国香港和台湾地区的相关机构，达成“新型冠状病毒试剂盒”的供应和其他病原监测方面的合作。span style="text-indent: 2em " /span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/308985ae-6187-47ec-85c3-428c918a6677.jpg" title="5 MGISEQ-2000.png" alt="5 MGISEQ-2000.png"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strong三、服务升级，想一线之所想，急抗疫之所急/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "疫情前线临床普遍反应，目前各地满足筛查条件和筛查能力的检测实验室数量有限，已有的实验室满负荷工作，无法满足短时间内对所有疑似病患进行病毒筛查与确诊。然而病毒筛查是此次防控疫情的核心，早一分钟确诊，病患就能早一步得到精准的治疗，就能更早康复。这既是高瞻远瞩的国家战略需要，也是普惠健康的民生工程，更是疫情当前急需解决的实际问题。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "华大集团、万科集团、松禾资本30日对外宣布，将以湖北省为重点地区，在全国范围内紧急征集大约20家PCR医学实验室，通过猛犸基金会对于具备一定条件的医学实验室，提供资金和专业支持，使其快速提升检测能力，以应对不断增加的检测需求，预计捐赠投入近千万元。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "同时，针对抗疫一线检验人员对病原微生物检测临床应用实验室操作的培训需求，华大已调集专家紧急制作培训视频，免费上线面向公众开放。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "华大已做好充分准备，将一如既往利用基因科技的力量，助力国家疫情防控，维护全球卫生安全。疫情攻坚，需要多方力量共同努力，愿更多有志之士携手共进，战胜疫情，共克时艰。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: right "供稿：华大基因股份有限公司医疗器械部/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "a href="https://www.instrument.com.cn/zc/134.html" target="_self"strong基因测序仪专场/strong/a/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "a href="https://www.instrument.com.cn/zt/xxgzbd" target="_self"strong“抗击新冠疫情 仪器人在行动”专题/strong/a/p

p style="line-height: 1.75em " /pp style="text-align:center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/insimg/423d89ef-b2c0-432b-82bf-7282dc2e3167.jpg" title="201637164821361.jpg" width="500" height="427" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 500px height: 427px "//pp style="text-align: center "中科院上海巴斯德研究所所长唐宏和MRCT首席执行官Dave Tapolczay代表合作双方签署并交换了合作协议。/pp style="line-height: 1.75em " 抗体类药物开发已经进入成熟阶段。早期主要是解决免疫原性问题，上世纪80年代以前的单抗主要是鼠源抗体，包括免疫原性反应在内的安全性问题使其难以得到临床认同。近年来，全人源抗体技术已经不是难题，最新的抗体药物已经实现全人源化，可完全规避鼠源成分带来的各种安全性风险。/pp style="line-height: 1.75em " 近日，中国科学院上海巴斯德研究所(IPS)和英国国家医学研究院科技部(MRCT)在上海成立合作共建“IPS-MRCT 抗体药物联合中心”，标志着中国抗体药物研发进入全新的阶段。/pp style="line-height: 1.75em " 传统的抗体类药物主要针对某些癌细胞特定抗原或针对肿瘤供给血管，如曲妥珠单抗和贝伐珠单抗。新的研究发现抗体类药物也能有一些新的用途，比如免疫检查点抑制剂PD-1类药物可以改变人体对癌细胞的免疫应答，抗体偶联物可以运输细胞毒类药物直达靶点，双特异性T细胞抗体可以将癌细胞和免疫细胞联络在一起，嵌合CD19单抗可以用于CAR-T治疗等等。抗体类药物的发展无疑为抗肿瘤靶向治疗提供了更多强大的武器。抗体类药物在肿瘤领域可谓大放异彩。不过，抗体类药物已不仅仅用于抗肿瘤治疗，其在多种自身免疫疾病、心脑血管疾病、眼科疾病等治疗领域中都显示出卓越的优势。/pp style="line-height: 1.75em " 中国的抗体类药物创新相比欧美还较为落后，国内抗体药市场绝大部分份额还被外资企业产品占据。中国的抗体药数量较少，技术水平也普遍不高，一些国外不认同的技术或淘汰技术开发的品种尽管在中国获批，但市场并不接受。此外，虽然我国抗体药在研品逐步丰富，但大多数品种依然是癌症或自身免疫疾病用药，新适应症用药还为数不多。/pp style="line-height: 1.75em " 不过，中国的抗体类药物创新水平正逐步赶上。一是国家新药创制政策对生物药创新日益重视，最新的“十三五”新药创制计划明确对抗体类药物新技术和新靶点创新的支持，包括双特异性抗体、抗体偶联物、PD-1类药物等都将给予重点支持。二是海外归国高水平生物药人才在国内陆续创建的生物药创新企业为国内带来了欧美最新的生物药创新技术，也带来了生物药创新的新理念。三是风投等资本力量与生物药创新的结合日益紧密。包括恒瑞的PD-1类药物SHR1210、康方生物的免疫监测点抑制剂AK-107、信达生物的双特异性抗体Anti-PD-1 Bispecific Antibodies等在研药物的海外市场权益，都以数亿美元的高昂价格转让给跨国企业，中国的创新抗体类药物已逐步得到国外企业的认同。/pp style="line-height: 1.75em " 最新成立的IPS-MRCT抗体药物联合中心是中国加速创新抗体类药物研发的又一有力证明。抗体药物联合中心将整合IPS和MRCT优势进行创新抗体药物的研发及转化，致力于中国的研究机构和国际以及国内制药公司之间建立转移转化的桥梁，促进中国创新抗体药物的研发与产业化。/pp style="line-height: 1.75em " 新成立的抗体药物联合中心主任，上海巴斯德所孙兵研究员介绍称：“过去三年中国新药临床申报(IND)中，抗体药物领域大多为仿制药，创新靶点少，未来鼓励创新抗体药物的研发是必然趋势。”他还表示：“中国基础研究发展迅猛，但转化研究的能力有待提升。”这也是IPS选择与MRCT合作的根本目的。/pp style="line-height: 1.75em " 英国国家医学研究院(MRC)拥有强劲的医药研发实力，造就了29位诺贝尔奖获得者。MRCT是负责MRC科技成果转化的非盈利性组织，在创新靶点抗体药物研发、知识产权保护、科技成果开发和转化等方面具有丰富的经验和独特的运作体系。/pp style="line-height: 1.75em " 上海巴斯德研究所科研合作处高级主管孟君对《第一财经日报》记者表示：“此次成立的抗体药物中心，是把双方多年来的合作正式化了，而且能够提供一个开放的平台，加强与国内外各大机构的研究合作，并将科研成果尽快产业化。”/pp style="line-height: 1.75em " 中国科学院上海巴斯德研究所是根据中法两国政府间协议，由中国科学院、上海市政府和法国巴斯德研究所三方为应对中国重要传染性疾病而建立的高水平、非盈利性的科研机构。研究所瞄准国家战略需求，定位于重大传染病的基础和应用研究，研究方向主要集中在新生及突发传染性疾病的病毒学、免疫学、疫苗学研究。/ppbr//p

加拿大多伦多大学的研究人员发现，一个被忽视的名为FAM72A的基因在抗体的形成过程中起着重要作用，它通过激活诱导脱氨酶（AID）促进了高质量抗体的产生，有助于免疫系统识别和对抗新冠病毒、细菌和其他导致传染病的病毒。研究结果当地时间24日发表在《自然》杂志上。　　免疫学家早在二十年前就已知道，AID对于产生能够清除感染的抗体是必不可少的，但其作用的全部机制仍不清楚。此次，研究人员解决了这个问题，发现FAM72A帮助AID促进抗体基因的突变。　　AID可以控制人体免疫系统生成抗体。而抗体基因的突变在很大程度上是通过AID驱动的机制展开的，称为体细胞超突变和类别转换重组，这两种机制都有助于抗体获得对抗广泛病原体所需的多样性和效力。　　这一结果有助于更广泛地了解抗体的发展，多伦多大学医学院免疫学教授阿尔贝托马丁表示，FAM72A也对癌症有影响。产生抗体的B细胞不受控制的突变与B细胞淋巴瘤有关，FAM72A在其他癌症中水平非常高，如胃肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和卵巢癌。数据显示，高水平的FAM72A促进了抗体基因的突变，因此，FAM72A水平的提高可能会通过增加突变来刺激癌症的发展、进展或抗药性。　　研究团队还发现，与其它哺乳动物不同的是，人类有4个FAM72A基因版本，它们在癌症和抗体产生中的作用尚不清楚。

中美两个独立的研究团队 28 日报告说，他们发现了多株可以抑制新型冠状病毒（中东呼吸系统综合征冠状病毒）感染的中和抗体。这是国际上首次报告发现抗新型冠状病毒的中和抗体。中和抗体是免疫细胞分泌的一类蛋白，能在某些病毒侵入细胞之前与该病毒结合，阻止其黏附、感染细胞，相当于把病毒“中和”掉。清华大学张林琦教授和王新泉教授带领的团队在美国《科学-转化医学》上报告说，他们首先从分子水平上分析了新型冠状病毒与其人类受体蛋白 DPP4 之间的相互作用，然后利用正常人的非免疫抗体库，像“钓鱼”一样筛选出两株中和抗体 MERS-4 和 MERS-27 。这两株中和抗体经过验证，可以有效阻断新型冠状病毒与其细胞受体 DPP4 的相互结合。美国戴纳-法伯癌症研究所研究团队利用类似方法，鉴别出7株中和抗体，其中一株抗体 3B11 表现出了最高的中和活性，被认为最有医学应用潜力。这一成果发表在美国《国家科学院学报》（PNAS）上。对比两项研究，张林琦表示，他们发现的两个抗体具有明显的相互协同作用，即联合使用可以大大加强抗病毒效果，从而提高抗病毒的活性和广谱性，对可能变异的病毒保持高效抑制活性。而另一项研究还没有开展这方面的研究，联合使用的效果不详。张林琦表示，他们将尽快展开动物和人体试验，现已开始与中国医学科学院和香港大学的科学家讨论相应的试验方案。新型冠状病毒 2012 年 9 月在沙特被发现，它与非典病毒（SARS）同属冠状病毒。其感染者多会出现严重的呼吸系统问题并伴有急性肾衰竭。新型冠状病毒致死率目前超过 50%，远高于 10 年前 SARS 流行期间大约 10% 的致死率。人们对这种病毒仍知之甚少。

大家好，本周为大家分享一篇发表在mAbs上的综述，A perspective toward mass spectrometry-based de novo sequencing of endogenous antibodies1，通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学Bijvoet生物分子研究中心的Albert J.R. Heck。　　据估计，人体可以产生的抗体理论序列超过1015种，这些序列是独一无二但又高度相似的，这使得它们的表征和测序非常复杂。抗体的结构从功能上分为Fab段和Fc段，其中Fab负责与抗原结合，具有高度变异性，这种突变主要集中在Fab段的互补决定区(CDR)，阐明这部分的序列对抗体的发现非常重要。 图1展示了用于抗体序列分析的三种组学策略。Bottom-up(BU)是最流行的测序方法，可以通过数据库匹配或完全的从头测序实现对抗体的序列分析，但主要用于高度纯化的重组抗体。第二种策略是通过将基于MS的技术与基因组学/转录组学相结合，例如全基因组测序或 BCR 测序，通过B细胞测序生成个性化序列数据库，将BU MS数据靶向该数据库搜索，是一个部分从头测序的流程。第三种策略是结合几种基于MS的de novo方法，如Top-down(TD)和Middle-down(MD)，旨在直接从临床样本中确定选定抗体克隆的完整序列，而无需其他组学数据的帮助。　　图1 基于MS的抗体测序的三种策略　　通过BU方法进行的从头测序需要高度的序列覆盖，理想情况下，抗体中的每个序列位置都由多个重叠的肽段支持。通过缩短酶的孵育时间、微波辅助水解，或使用具有协同序列特异性的多种酶，可以产生较长的肽段或较多的重叠序列。图2所示的工作使用总共9种蛋白酶(包括特异性和非特异性)成功地从头测序抗 FLAG-M2小鼠mAb全长。通过覆盖整个CDR的高分肽获得了高置信度的CDR序列，所选择的6条肽段来自5种不同蛋白酶的消化。　　图2 单克隆抗体Anti-FLAG M2的测序。　　对于抗体这种具有高度变异性的蛋白质，通常无法获得完整和准确的序列数据库来进行匹配。相反，可以使用来自基因组或转录组实验的同源序列。抗体种编码每个区域的基因可作为种系序列获得，基于序列对齐或序列标签提取的容错片段匹配算法可以使用同源数据库对实验确定的序列进行评分。同源序列数据库还可以作为种系模板来辅助从头测序肽段的组装。　　TD/MD策略虽存在对分子量较大蛋白的电离效率低、分辨率低等限制，但近年该领域的一些进展也报告了相对较高的序列覆盖率。Shaw 等人报道了使用现代仪器将完整的 mAb 在非变性状态下片段化(图3)。通过在单个串联 MS 实验中结合 ECD 和 HCD，获得了曲妥珠单抗 42% 的轻链序列覆盖率和 20% 的重链序列覆盖率。产生的碎片谱不仅包含多电荷主链碎片产物，还包含链间二硫键断裂产生的完整轻链。　　图3 轻链 (a) 和重链 (b) 片段图显示了曲妥珠单抗上 ECD 和 HCD 组合产生的序列覆盖率。二硫键用虚线表示，CDR3 区域以黄色高亮显示。(c)为完整曲妥珠单抗的 25+ 电荷态的相应碎片谱，插图显示了轻链的 9+ 电荷态和各种碎片离子。红色和蓝色碎片离子标签分别对应轻链和重链。星号表示质量选择的母离子。　　将抗体测序拓展到内源性抗体存在许多挑战。首先，血浆中单个克隆的中位浓度约为 1 µg/mL，比 mAb 低几个数量级，并且单个克隆的分离极具挑战性，使测序过程进一步复杂化 因为大多数软件工具专为组装单个抗体而设计，当数据代表几个相似的 Ig 序列时可能导致分析失败。此外，在复杂的内源性多克隆抗体混合物中，由于来自恒定区的序列信息被放大并抑制CDR的信号，因此通常无法检测到CDR区的关键序列。使用多组学方法，例如通过使用来自同一供体的基因组学或转录组学数据补充 BU MS 数据，可以绕过从头测序的一些具有挑战性的方面。　　Guthals等人报道了一个例子，使用糖蛋白B抗原从患者的血清中纯化抗体后，进行了完整质量和BU MS分析(图4c)。通过半自动软件PolyExtend用完整质量来检索抗体混合物中最丰富的物种的平均质量，并以此来约束BU MS数据导出的序列结果。在最近的一项研究中，Bondt等人从败血症患者的血清中制备IgG1的Fab亚基，成功地在不经过抗原特异性捕获的条件下，通过MD/BU结合和ETD活化的MS方法，在一个供体的血清中直接对一个高丰度的抗体克隆进行从头测序(图4d)。首先，从IMGT数据库中选择高度匹配的轻链和重链种系模板。然后用采集的从头测序数据来迭代和改进这些模板，产生最终的成熟序列。值得注意的是，确定的序列包含的突变比BCR测序研究报告的突变率所预期的要多，这表明蛋白质水平测序和基因水平测序之间存在潜在的差异。　　图4　　尽管从抗体混合物中重新组装序列仍然是艰巨的任务，但一些研究团队最近已经设法获得了令人兴奋的数据。随着现有方法的众多进步，很可能只需把这些碎片拼凑在一起，创建一个基于MS的方法，以更常规地用于抗体发现。所有近期发表的这些策略概念的验证为更高效的下一代方法铺平了道路。

相比于低水平重复，高水平重复对企业的影响往往更为严重，因为创新药投入更大，研发周期更长。　　还记得去年南方所年会上关于“新药高水平重复现象也已经呈现交错的态势”的观点。与业内广泛认同的“低水平重复”不同，“高水平重复”还未得到部分企业的重视，在某些领域(如替尼类)创新药的研发已经出现了扎堆情况。　　在一系列利好因素的作用下，国内生物药研发非常活跃，尤以抗体类药物最受关注。相比于替尼类等，国内抗体类药物过热态势还不明显，但我们也看到不少国内优秀企业也开始或准备涉水抗体类药物研发。从靶点上看，国内抗体类药物研发依然集中在TNF-α 、CD20、HER2、VEGF等热门靶点，而对于一些国外研发比较活跃的新靶点，国内还比较滞后。　　据笔者统计，截至2016年10月，国内已上市或在研的抗体类药物(不含融合蛋白类药物，排除鼠源单抗)总数达到180个(数据来源于CDE公开数据，在研品种仅包括至少申报临床的品种，不含前期研发品种)。其中，国内企业开发的品种为128个，占71.1% 跨国企业开发的品种为52个。　　180个品种中，创新抗体药有85个，其中国内企业开发的品种为35个，占41.2% 生物类似药共95个，除了2个是国外企业的品种，其余均是国产品种。虽然从分布来看，国内单抗类药物仍以生物类似药为主，但创新药的数量已经大幅增长。同时，一定数量生物类似药的开发无疑也是非常节约研发资源的方式，可以降低开发风险。　　相比于化药品种，抗体类药物的研发投入巨大，难度也更高。不少国内企业对于抗体类药物开发难度并没有清醒的认识，看到类似凯美纳、朗沐、泰欣生和艾坦这样的品种上市后获益颇丰，就简单认为抗体类药物一旦获批就能轻松获得数亿元的销售额。　　比如网上就有大量类似的提法：“某某公司的某产品是全球某畅销品种的相似品种，一旦上市该药销售额有望超过**亿元”。殊不知，这些销售成绩都需要大量的市场推广才有可能实现，加之国内如赫赛汀、美罗华、安维汀和修美乐等品种普遍已有超过10家以上的类似药申请。部分靶点的生物仿制药已经明显过热，一堆产品蜂拥而至，仅在研究阶段的临床基地筛选，病例入组就将让不少企业苦不堪言。　　此外，尽管在小试及中试阶段，生物药的开发已经难度不大，但如何在质量和成本可控的情况实现产业化，这一步依然非常漫长。即便是顺利上市，单抗类药物同样会面临激烈的竞争，尤其对于某些目标人群本就有限的品种。　　因此，对于抗体类药物的研发，国内企业还需冷静思考，切莫跟风。本文梳理出国内抗体类药物的8个研发热门靶点，对各靶点市场情况和趋势进行精辟分析，为国内抗体类药物研发提供参考和建议。　　NO.1 TNF-α 靶点　　[已上市/在研品种] 28种　　[生物类似药热点] 阿达木单抗(17种)　　TNF-α 靶点是单抗取得最为成功业绩的靶点。即便排除TNF-α 融合蛋白药物依那西普，仅抗TNF-α 单抗就有4个重磅炸弹级品种：首个获批的英夫利西单抗，“药王”阿达木单抗，以及新获批的戈利木单抗和赛妥珠单抗。这4个品种2015年全球销售额合计达266亿美元。　　不过，相比于TNF-α 单抗在全球大放异彩，其在国内的表现却相当惨淡。根据样本医院销售数据，尽管类克(英夫利西单抗)及修美乐(阿达木单抗)已在国内上市，但两个产品样本医院销售合计仅为1.33亿元，且连续两年销量止步不前。这也提示，短期内国内类风湿关节炎生物制剂还难以获得市场认可。　　虽然国内销售不佳，却也无碍TNF-α 单抗成为国内最受关注的单抗研发类别，已上市及在研的单抗达到28个。其中英夫利西单抗、阿达木单抗及各自的生物类似药共有22个。　　尤其是英夫利西单抗生物类似药，作为人鼠嵌合单抗，在阿达木单抗上市多年的情况下，国内研发依然活跃。进度最快的上海百迈博制药已经申报生产，值得期待 还在申报临床的几个厂家，则建议进一步评估继续开发的价值。　　阿达木单抗类似药仅仅已申报品种就达到17个，更值得注意的是还有不少准备申报临床的企业。目前申报进度最快的是百奥泰生物和信达生物，均已进入Ⅲ期临床 此外，北京绿竹生物、嘉和生物、江苏众合、复宏汉霖和浙江海正都已获得临床批件。　　在TNF-α 创新药方面，全人源、抗体小型化以及长效是TNF-α 单抗的主要发展方向。因此，与英夫利西单抗和阿达木单抗相比，杨森长效全人源的戈利木单抗和UCB的长效抗体片段赛妥珠单抗有一些优势，这两个品种在国内研发分别进展到申报生产和Ⅲ期临床。　　国内自主创新的一类TNF-α 药物中，目前主要有丽珠的注射用重组人源化TNF-α 单抗，以及三生的人源化抗人TNF-α 单抗注射液(CHO细胞)，两个品种目前都在进行临床研究。　　NO.2 VEGF靶点　　[已上市/在研品种] 26种　　[生物类似药热点] 贝伐珠单抗(19种)　　与TNF-α 一样，VEGF也是药物获得巨大成功的靶点，贝伐珠单抗的上市及其肿瘤饥饿疗法的提出在当时的影响力不亚于PD-1及其肿瘤免疫疗法。　　VEGF单抗除了在肿瘤领域取得巨大成功，也广泛用于眼底新生血管疾病的治疗。包括贝伐珠单抗、雷珠单抗，以及2个VEGF融合蛋白类药物(阿柏西普和康柏西普)，都广泛用于包括年龄相关性黄斑病变在内的多种新生血管疾病。VEGF单抗药物治疗眼底疾病的地位甚至高于其治疗肿瘤的地位。2015年，贝伐珠单抗(安维汀)和雷珠单抗(诺适得)的全球销售额分别达70亿美元和36亿美元。　　　　在国内，目前已上市和在研的VEGF单抗达26种。其中，贝伐珠单抗的类似药达19种，信达生物进度最快，已进入Ⅲ期临床，此外还有多个厂家已经获批临床。雷珠单抗由于上市较晚，目前国内类似药获批临床的仅有齐鲁1个品种。　　VEGF单抗创新药中，礼来最新在FDA获批的Ramucirumab也已在中国进入Ⅰ期临床，该药在国外已获得包括非小细胞肺癌和胃癌在内的多个适应症。先声的Sevacizumab是其联合开发的VEGF单抗，也在中国开展Ⅰ期临床。　　此外，泰康生物正在开展Ⅰ期临床的重组抗VEGF人源化单抗注射液，应该是一个针对眼底疾病的VEGF单抗，该药作为为数不多的针对眼底疾病的创新药，更值得期待。　　NO.3 CD20靶点　　[已上市/在研品种] 19种　　[生物类似药热点] 利妥昔单抗(15种)　　CD20靶点单抗主要用于非霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞白血病的治疗。全球首个获批的CD20类单抗罗氏的利妥昔单抗(美罗华)，2015年全球销售额高达73亿美元。在国内市场，美罗华也是最畅销的抗肿瘤单抗药物，根据PDB样本医院数据，2015年样本医院销售额达到7.93亿元。　　　　在美罗华的刺激下，国内CD20类抗体药物的研发一直非常活跃，目前已上市和在研的CD20单抗共有19个，其中利妥昔单抗及其类似药共有16个。　　在利妥昔单抗类似药的研发竞争中，三生国健的速度最快，已经完成临床研究，正在申报上市。此外，复宏汉霖、神州细胞和信达生物已进入Ⅲ期临床，浙江海正已进入Ⅱ期临床，还有6家企业已获得临床批件。　　CD20创新药方面，目前国内有3个在研品种。考虑到利妥昔单抗是人鼠嵌合单抗，故降低其免疫原性是一个发展方向。　　罗氏的Obinutuzumab是第一个被FDA认定为“突破性治疗”的单抗，与利妥昔单抗一样靶向CD20单抗，但其属于人源化单抗，且通过糖基化修饰其Fc片段增加其对Fcγ 受体的亲和力。GSK的奥法木单抗(Ofatumumab)是全人源的CD20单抗，该药用于CLL同样获得了突破性治疗认定。目前Obinutuzumab和Ofatumumab都在中国开展Ⅲ期临床研究，有望分享美罗华的市场份额。　　国内CD20创新药也有了先行者，北京天广实生物的重组人源化单抗MIL62注射液是人源化CD20单抗，该药目前正在申报临床。　　NO.4 EGF靶点　　[已上市/在研品种] 19种　　[生物类似药热点] 西妥昔单抗(11 种)　　EGF类单抗主要用于结直肠癌的治疗。第一个获批的EGF类单抗是Imclone的西妥昔单抗(爱必妥)，该药2015年全球销售额超过14亿美元。　　在国内，除了爱必妥，百泰生物联合开发的尼妥珠单抗(泰欣生)也获批上市，两个品种上市早期都经历了快速增长，不过目前增速有所放缓，2015年两个品种样本医院销售合计达3.4亿元。　　　　爱必妥的成功和泰欣生的上市促进了国内EGF类抗体的研发，目前已上市和在研的EGF类单抗一共有19个，其中西妥昔单抗及其类似药共有12个。在西妥昔单抗类似药研发竞争中，张江生物的速度最快，目前正在Ⅲ期临床阶段，其余大部分处于Ⅰ期临床或获批临床批件阶段。　　西妥昔单抗的最大问题同样是免疫原性，该药属于人鼠嵌合单抗，因此EGF类单抗研发也着眼于解决免疫原性问题。帕尼单抗(帕妥木单抗)是安进研发的全人源EGF单抗，单药一度被认为有望替代西妥昔单抗，不过上市后大规模临床研究并未支持其在疗效或安全性上优于西妥昔单抗。目前帕尼单抗国内由贝达安进开发，正在开展Ⅲ期临床研究。除了针对西妥昔单抗的类似药，目前国内还有多个针对其他EGF单抗的类似药。齐鲁和上海津曼特生物的EGF单抗类似药都已获批临床，其中前者可能是帕尼单抗的类似药。　　创新药方面，目前国内有4个自主研发品种。神州细胞的重组全人源抗人表皮生长因子受体单抗注射液目前已经进入Ⅰ期临床，而上海赛伦生物和重庆智翔金泰生物各自的重组全人源抗EGFR单抗注射液均已经获得了临床批件，这些品种可能都是采用不同的方式使西妥昔单抗实现全人源。　　NO.5 HER2靶点　　[已上市/在研品种] 19种　　[生物类似药热点] 曲妥珠单抗(10种)　　HER2靶点单抗主要用于乳腺癌等HER2高表达的癌症治疗。第一个获批的HER2类单抗是罗氏的曲妥珠单抗(赫赛汀)，该药2015年全球销售额达到68亿美元，在国内该药销量同样增速迅猛，样本医院2015年赫赛汀销售额达6.66亿元。对于HER2高表达的乳腺癌、胃癌等疾病，曲妥珠单抗的疗效优越，并已经被国内外指南一致推荐为HER2阳性的乳腺癌等疾病的一线用药。　　中国是乳腺癌的高发国，患者众多，故HER2单抗市场巨大。目前已上市和在研的HER2类单抗一共有19个，其中曲妥珠单抗及其类似药共有11个。在曲妥珠单抗类似药研发竞争中，复宏汉霖和嘉和生物的速度最快，目前正在Ⅲ期临床阶段，安徽安科和齐鲁则进入Ⅰ期临床。　　尽管曲妥珠单抗已经得到临床认同，但业内还是希望能在HER2药物中有新的突破。帕妥珠单抗是罗氏新获批的HER2单抗，该药尽管同属HER2单抗，但作用靶点与曲妥珠有所区别。　　临床研究发现曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗的疗效较单用曲妥珠单抗大幅提升。目前帕妥珠单抗正在国内开展Ⅲ期临床。对于帕妥珠单抗，国内不少企业也跃跃欲试，其中齐鲁的帕妥珠单抗类似药获批进入临床，丽珠的重组抗HER2结构域Ⅱ人源化单抗注射液同样定位于HER2的结构域Ⅱ，作为创新药该药已经获批临床。　　抗体偶联技术在HER2单抗使用最多，罗氏的Trastuzumab Emtansine(Kadcyla)是第一个在HER2领域获得成功的抗体偶联物，该药利用曲妥珠单抗和微管蛋白类药物DM1，偶联物较曲妥珠单抗的疗效显著提升，该药目前正在国内开展Ⅲ期临床研究。　　国内针对HER2的抗体偶联物研发活跃，目前已经有百奥泰生物的注射用重组人源化抗HER2单克隆抗体-美登素偶联物和烟台荣昌的注射用重组人源化抗HER2单抗-MMAE偶联剂获批开展临床研究。　　在HER2领域还有一个值得大书特书的国产创新药：武汉友芝友这样一个名不见经传的创新企业正在开发注射用重组抗HER2和CD3人源化双特异性抗体，该药是国内自主研发的首个申报临床的双特异性抗体，从理论上该药可以同时靶向HER2和T细胞，实现靶向免疫。　　NO.6 PD-1/PD-L1靶点　　[已上市/在研品种] 7种　　抗肿瘤无疑是抗体类药物最为关注的领域，而在抗肿瘤领域，以PD-1、PD-L1为代表的抗肿瘤免疫治疗又是其中最闪亮的类别。2014年《Forbes》破例将两个肿瘤免疫药物分别是Opdivo(Nivolumab)和Keytruda(Pembrolizumab)列为该年度最重要的创新药，各大专业医药数据分析公司也纷纷预测两个产品全球销售额将轻松突破50亿美元大关，甚至有望挑战修美乐的药王地位。除了这两个品种，罗氏的Atezolizumab也获批上市，该药是全球首个获批的PD-L1药物。三个药物目前都已进入中国，正在开展Ⅲ期临床研究，都有可能成为首个中国上市的PD-1/PD-L1药物。此外，默克雪兰诺的PD-L1药物Avelumab正在申请临床研究。　　PD-1/PD-L1类药物是国内抗体类药物创新的热点，国内在研的自主研发PD-1/PD-L1药物达7个，其中君实生物的重组人源化抗PD-1单抗注射液已经进入了Ⅰ期临床，此外百济神州的PD-1类药物BGB-A317、恒瑞的PD-1类药物SHR-1210和信达生物的PD-1类药物IBI308均获批临床。而基石药业、誉衡和嘉和生物各有1个PD-1/PD-L1类药物申报临床。　　NO.7 IL-6靶点　　[已上市/在研品种] 7种　　IL-6类单抗主要用于类风关等自身免疫疾病。类风关的生物制剂治疗一度被TNF-α 抑制剂垄断，但欧美最新指南普遍将各类生物制剂放到了等同地位，这使得包括IL-6类在内的各种非TNF类药物获得了巨大的市场机会。　　IL-6类药物目前最畅销的是罗氏的托珠单抗，该药2015年全球销售额达到15亿美元。在国内，IL-6治疗类风关的理念还有待推广，目前仅有静脉注射也阻碍了托珠单抗的推广。尽管不属于国内抗体类药物研究热点，但目前已上市和在研的IL-6类单抗依然达到7个，其中托珠单抗及其类似药共有4个。　　创新药方面，杨森的Sirukumab和Siltuximab(司妥昔单抗)都已申请在中国开展临床研究，其中全人源IL-6单抗Sirukumab已获得临床批件，在免疫原性方面有一定优势。国内IL-6创新药领域目前仅有药明康德的重组全人抗白介素-6单克隆抗体注射液，该药是药明康德和阿斯利康旗下的MedImmune共同研发的产品。　　NO.8 RANK靶点　　[已上市/在研品种] 6种　　核因子-κ B受体活化因子(RANK)及其配体RANKL与破骨细胞的成熟等一系列骨代谢相关信号通路有关。对RANK及其配体RANKL的抑制，可在某些情况下改善骨代谢，减少骨质疏松和骨折等疾病风险。　　根据该机制，安进成功开发了针对RANKL的狄诺塞单抗，该药已获批用于恶性肿瘤骨转移(SREs)和骨质增生等4种有巨大市场容量疾病的治疗。狄诺塞单抗尽管上市时间不长，但市场表现优异，2015年其全球年销售额已达30亿美元。　　国内RANK单抗均属于狄诺塞单抗及其类似药。安进的原研药目前已经在中国进入Ⅲ期临床。5个类似药中，齐鲁进度最快，已获得临床批件 其他厂家则还处于申报临床阶段。

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical chemistry上的文章Epitope Mapping of Polyclonal Antibodies by Hydrogen–Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)1，文章通讯作者是意大利锡耶纳葛兰素史克公司实验室主任Nathalie Norais和丹麦哥本哈根大学药学系教授Kasper Rand。抗体表位定位对理解适应性免疫、研究治疗性抗体和疫苗的作用方式至关重要。对疫苗接种后产生的多克隆抗体群（pAb）的结合特性的深入了解将为疫苗开发提供重要价值，但很少有表位定位方法能耐受pAb样品的复杂性。本文使用氢氘交换质谱（HDX-MS），通过检测存在不同量的pAb时抗原的HDX值变化，绘制了pAb样品识别的表位，并提供了表位与抗体的相互作用信息。因子H结合蛋白（fHbp）是被广泛研究的脑膜炎奈瑟菌抗原之一，在人体中能引发强大的保护性免疫反应。fHbp是27kDa的脂蛋白，N端为一个饼状的β-sheet，C端为一个8股β桶，两端由linker连接。本文的研究对象是fHbp和用fHbp免疫的兔pAb。首先作者进行了被pAb识别的fHbp抗原表位的鉴定。重组fHbp在不孵育和孵育两倍量的pAb下进行了30秒到20分钟的HDX实验，在抗原的多个区域检测到了抗体导致的HDX降低，标记10min后HDX的变化最为显著，因此接下来的HDX-MS实验选择了10 min时间点。随后作者进行了孵育比例的考察以判断结合亲和力，考察了Ag：pAb从1:2、1:5、1:10到1:15，氘代时间为10分钟（图1），可以观察到抗原的3-26、44-72、104-120三个区域的氘代被抗体显著的保护住了，从1:5时开始看出差异，从1:2到1:15，所有肽的平均氘代降低率从3%增加到了16%，104-120的氘代降低率最高。之前的研究表明，fHbp的兔抗中存在与抗原亲和力在1nM及以下的抗体，故氘代保护率随抗体用量增加的原因可能是，在低比例的多克隆抗体中，每种抗体的占比有限，高亲和力的抗体还没达到能与抗原形成1:1复合物的浓度。作者将实验结果与前人研究的fHbp的单克隆抗体结果进行比对，多个氘代减少的区域得到了印证，尤其是104-120区域，残基S112、G116和K117可被认定为抗原表位。同时，抗体之间也存在组合功能，即单个抗体无法发挥的功能会由两到三个抗体协同产生，本实验中使用多克隆抗体研究的优势在于，通过与单克隆抗体研究中氘代降低的区域对照，判断表位抗体间的组合功能和起到免疫效果所需的交叉区域。图1. 不同比例的Ag：pAb对抗原fHbp氘代率的影响。A.颜色由浅到深依次是1:2、1:5、1:10、1:15，正值代表加入抗体后氘代率降低。B.映射到晶体结构上的氘代变化（PDB：3kvd）。C. 15-31、44-71、102-120、209-234区域随抗体加入比例的变化，灰色线为不加抗体时的氘代值，所有氘代是最大氘代值（MX）的相对值，最大氘代值为1:15比例下氘代24h的结果。接着，作者使用VADAR分析研究fHbp的主要表位区。VADAR v1.8算法基于蛋白的X射线结构原子坐标测量fHbp单个残基的表面可及性，将其与HDX结果相结合可进一步描述fHbp的表位区域。可及表面积分数（ASA）超过50%的残基为暴露残基，图2总结了映射到fHbp晶体上的所有暴露的残基，每个识别的表位区域的范围为1992-2509 Å2，作者强调位于表位区的暴露残基不一定都参与表位组成，也可能是间接稳定抗体的结合引起的HDX保护。图2. 结合VADAR和HDX数据的抗原表位区。两个在N端结构域（黑灰、浅绿），两个在C端结构域（浅蓝深蓝、深绿），紫色代表不在HDX鉴定的表位区域内的暴露残基。最后，作者使用了变性剂和盐来评估结合特异性和非特异性相互作用。由于亲和力低的抗体在变性剂存在时可与抗原解离，作者将此策略应用到了HDX实验中，选择1:10结合比例进行HDX，标记缓冲液使用含有或不含有盐（0.5M NaCl）或变性剂（硫氰酸铵AT或尿素），探究这些情况对HDX结果的影响（图3）。在存在0.5M、2M和4M AT的情况下，fHbp的多个区域获得了更多的氘代，N端区域3-26和44-71，以及C端区域176-184显示出氘代增加（相对于不加AT结果），因此作者推断即便在0.5M的浓度水平下AT也能影响fHbp与抗体的结合，2M尿素存在下也是如此。但0.5M尿素和0.5M NaCl的存在没有明显影响fHbp与抗体的结合。因为非结构肽中酰胺氢的交换速率会受到溶剂离子强度、pH值、温度、以及相邻残基侧链的诱导和空间效应的影响，作者额外考察了0.5M尿素和0.5M NaCl是否会影响fHbp酰胺氢自身的交换速率，即在对照条件（PBS缓冲液）和实验条件（加入0.5M尿素或 NaCl）下分别标记5秒和30秒，控制缓冲液的pH相同且控温（在冰浴进行标记）。结果表明实验组序列覆盖率没有降低，相比于对照组，肽的回收率也高达91.8%，三次重复实验可表明0.5M尿素或 NaCl的加入不会对fHbp自身的氘代特性产生任何显著性影响，也不影响fHbp的构象。将0.5M尿素或 NaCl添加到抗原抗体孵育后的氘代实验中，发现fHbp上的所有表位在抗体结合后仍被显著保护，排除了抗体非特异性结合的可能。值得注意的是，在存在尿素或NaCl的情况下，fHbp的表位区域氘代降低变化幅度不同，尤其是在标记30秒时，这说明了不同表位在与抗体互作时的特性不同，例如残基3-26和104-120可能为静电相互作用（被NaCl破坏），残基133-166和209-234可能为氢键作用（被尿素破坏）。图3. 添加剂对抗原结构和抗原-抗体结合的影响。A.在0.5M AT存在下，30秒氘代后fHbp结构中氘代增加的区域（蓝色）。B.抗原-抗体1:10孵育对fHbp氘代的影响。C.49条鉴定肽在30秒氘代时的变化，蓝色为添加0.5 M AT，紫色为添加0.5 M尿素。D. 抗原-抗体1:10孵育后，49条鉴定肽在30秒氘代时的变化，橙色为对照组，蓝色为添加0.5 M NaCl，紫色为添加0.5 M尿素。总结：本文通过监测fHbp与多克隆抗体群pAb孵育后的HDX-MS变化，绘制了fHbp的抗原表位，并使用尿素和NaCl深入了解了抗体群的相对丰度和亲和力，以及潜在的非特异性结合，这种方法可以广泛应用于其他抗原和pAb样品，为免疫学和疫苗设计提供有价值的信息。参考文献：1.Ständer, S. R. Grauslund, L. Scarselli, M. Norais, N. Rand, K., Epitope Mapping of Polyclonal Antibodies by Hydrogen–Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS). Analytical Chemistry 2021, 93 (34), 11669-11678.

p style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 单克隆抗体药物(mAb)是通过基因工程生产的蛋白质药物，具有特异性高、作用机制明确、效果显著、经济效益大等优势，是近年来生物医药产业的重要增长点。br//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "治疗性单克隆抗体（mAbs）的开发和制造是一个高度管制的过程，ICH的指导原则指出了相关产品质量参数允许的异质性水平。电荷异构体是单克隆抗体（mAb）的关键质量参数（CQA）之一，在药品稳定性研究、申报及放行等环节都必须检测、评估。抗体的电荷异构体是由细胞内的酶促和非酶促过程分泌到培养基后形成，电荷异构体可能具有明显不同的生物活性，影响单抗药物的功能、安全性及稳定性。导致电荷异质性的最常见变异之一是C末端赖氨酸剪切，随着一个或两个带正电荷的赖氨酸残基丢失，可导致碱性变异体的形成；另外，在N-和O-连接的聚糖上脱酰胺、糖化和带负电荷的唾液酸的存在都会导致负电荷增加和酸性变异体的形成。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "电荷异构体的检测方法有很多种，如：聚丙烯酰胺凝胶电泳，虽然仪器设备相对便宜，但其分辨率低、操作繁琐，目前应用较少；毛细管等电点聚焦（cIEF）电泳可进行蛋白的等电点测定，现已开发出毛细管电泳与质谱联用的技术，该方法可从完整蛋白水平进行分析，暂未推广使用；离子交换色谱（IEX）在电荷异构体的分析中使用较多，有盐洗脱与pH梯度洗脱两种方式，后续收集各个成分进行质谱检测分析其分子量及翻译后修饰。现已有在线的LC-MS方法，此方法不使用传统的盐缓冲液，改为质谱可以耐受的有机盐缓冲液来进行电荷异构体的分离，但其质谱图谱质量及普适性还有待考量，且不能实现肽段水平翻译后修饰的解析。中国计量科学研究院研制了人源化IgG1 κ型单克隆抗体标准物质，与军事科学院军事医学研究院钱小红、应万涛课题组合作，建立了cIEF-WCID及SCX-HPLC两种方法分离检测了单克隆抗体标准物质中的电荷异构体。运用蛋白质组学技术，从完整的分子量分布、肽图分析、进一步延伸到糖肽分析，建立了逐步深入的分析方法来研究单克隆抗体电荷异构体形成的影响因素，此方法可推广应用于其他单抗类药物的电荷异质性分析与评价。/pp style="text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 272px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/f26eb0c0-ed43-47b2-9965-eb69024d8360.jpg" title="图片1.png" alt="图片1.png" width="600" height="272" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "2020年11月10-12日，中国计量科学研究院和国际计量局拟联合举办span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong第三届 “药物及诊断试剂研发与质控——测量与标准，质量与安全（TD-MSQS 2020）”/strong/span 国际研讨会，以期进一步促进该领域的学术交流和技术发展，提升企业的研发水平和产品质量。本次会议将在南京市政府的支持下，在江苏省南京市举行。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "本次会议可通过官方网站http://tdmsqs.ncrm.org.cn注册或扫描二维码注册，注册成功后请填写参会回执发送至会议邮箱pptd@nim.ac.cn。/pp style="text-align: center text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " /pp style="text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em "img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/11c12ff4-263b-48c2-aff9-f4640b0a1850.jpg" title="图片3.png" alt="图片3.png"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: center "strongspan style="text-indent: 0em "欢迎各位专家、同仁报名参会！/span/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "更多信息请关注会议官方网站：a href="http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" _src="http://tdmsqs.ncrm.org.cn。"http://tdmsqs.ncrm.org.cn。/a /pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: right "供稿：崔新玲 胡志上span style="text-indent: 2em " /span/p

p style="text-align: center "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong目录/strongbr//span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "　　strong1 抗体概述/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　1.1 抗体/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　1.2 抗体的制备过程/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2 抗体药概述及市场分析/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2.1 抗体药概述及发展历程/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2.2 抗体药的分类/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2 抗体药概述及市场分析/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2.3 抗体药作用机制/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2.4 抗体药物的核心技术/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2.5 抗体药物的技术发展趋势/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2.6 抗体药物的应用进展/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　2.7 抗体药与化学药相比的优势/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　3 国际抗体药分析/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　3.1 国际抗体药市场发展/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　3.2 国际抗体药技术发展/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　4 国内抗体药分析/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　4.1 国内抗体药市场布局/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　4 国内抗体药分析/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　4.2 政策有利我国抗体药发展/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　4.3 国内抗体药研究情况/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　4.4 国内抗体药研发企业概况/strong/span/pp style="text-align: left "span style="color: rgb(89, 89, 89) "strong　　4.5 国内抗体药产业投资分布br/br//strong/spanstrong style="text-align: center "一、抗体概述　br//strongstrong style="text-align: center "1.抗体/strong/pp　　抗体(antibody)指的是由抗原刺激后由免疫细胞产生的能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白，典型的抗体结构由两条重链(H 链)和两条轻链(L 链)构成，每条链又分为稳定区(C 区)和可变区(V 区)， 其中可变区的多样性决定了抗体的多样性与特异性，使得抗体具有结合特定抗原的能力。比较不同特异性抗体的VL和VH的氨基酸顺序显示，变异仅集中在其中少数区域的氨基酸上(15%～20%)，称为超变区。(hypervariable)超变区是抗体的抗原结合位，与抗原决定簇的结构互补，故又称为互补决定区(complementarity-determining regions，CDRs) 。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/25de6df2-9266-4c9c-a549-9d2f67756128.jpg" title="1.jpg" alt="1.jpg" width="426" height="199" style="width: 426px height: 199px "//pp　　抗原以异源蛋白居多，通常情况下免疫系统能够识别抗原上面的多个位点，针对不同的位点会特异性的产生针对该位点的抗体来结合抗原，由此产生的抗体集合我们称之为多克隆抗体。多克隆抗体由多种针对不同抗原的抗体组成，因而特异性差,使用时容易出现交叉免疫反应，故治疗范围较小，仅限于免疫学检测、被动免疫治疗和紧急预防。鉴于多抗的种种不足，医疗工作者便开始试想能够筛选制备出由单细胞增殖产生的，针对某一特定抗原决定簇的抗体，这样可以大幅提高抗体的特异性，减少交叉免疫副作用，拓展治疗范围， 这类具有高度均一性抗体就被称为单克隆抗体(monoclonal antibody，简称单抗或 mab)。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/a02af7bf-79f2-4a29-ac42-bfc1678adab5.jpg" title="2.jpg" alt="2.jpg"//pp style="text-align: center "图1. 单抗和多抗/pp style="text-align: center "资料来源： 渤海证券研究所/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/7c4cda66-5941-49c6-8a3e-de4b33dc5fca.jpg" title="3.jpg" alt="3.jpg"//pp style="text-align: center "图2. 抗体产生过程/pp style="text-align: center "资料来源： 长江证券研究所/pp　　strong单克隆抗体具有以下三个特点：/strong/pp　　特异性： 单抗只针对含有特定抗原的病灶细胞(如肿瘤细胞)，因而专一性强、副作用较小 /pp　　特效性： 单抗主要被用于肿瘤和自体免疫疾病(如类风湿)等发病率较高、对人类健康影响较大的复杂疾病，现存疗法(如放化疗、激素疗法)副作用强，效果有限。单抗的问世使其自然而然的成为了此类疾病的特效药 /pp　　改造潜力大： 单抗药物具有很强的改造潜力，在单抗或单抗片段上?“加挂”放化疗药物可以使药物?精确“制导”到达病灶，大幅减少了用药量和副作用。/pp　　strong目前，单克隆抗体在医学上的应用主要有以下三类：/strong/pp　　诊断试剂：主要用于检测淋巴细胞表面分子，鉴别淋巴细胞 鉴定病原体，准确诊断传染病 肿瘤诊断和分型 测定体内激素含量等 /pp　　医学科研：主要用于纯化抗原 分析抗原结构和抗原决定簇分子功能等 /pp　　单抗药物： 包括多个小类，细胞表面分子单抗用于移植排斥反应的防治 细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗 抗肿瘤单抗用于肿瘤治疗。/pp　　在上述用途中， 单抗药物无疑是最为重要、市场最大的应用领域。 相对于多抗和传统化学药物，单抗药物具有多方面的优势，这些特点使得单抗被广泛的应用于抗肿瘤、自体免疫疾病治疗、抗器官移植排异、抗感染等临床治疗领域。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/0e2ac6b1-1771-402d-b854-0e4b278cf34c.jpg" title="4.jpg" alt="4.jpg"//pp style="text-align: center "表1. 单抗与多抗、传统化学药物对比/pp style="text-align: center "资料来源：兴业证券研究所/ppstrong2.抗体的制备过程/strong/pp　　由于单一的 B 淋巴细胞克隆是比较活跃的细胞，它们往往因为自身活跃的基因表达状 态，而比较容易凋亡，因此单独获得 B 淋巴细胞以后也很难大批量的获取单抗。但 Georeges Kohler 和 Cesar Milstein 发明的“单克隆杂交瘤技术”解决了这个难题：他们将B细胞克隆和骨髓瘤细胞进行细胞融合，如此形成的杂交细胞具有肿瘤细胞不死的性质而大大延长了B细胞表达单克隆抗体的能力，使得单克隆抗体的运用成为可能。/pp　　在细胞体外培养技术尚未成熟前，科研人员将融合细胞注入小鼠体内，生产肿瘤，进而 产生大量腹水，单抗主要集中在腹水中，人们收集小鼠的腹水，然后提纯得到单抗。但是该方法的缺点非常明显，就是无法大规模的生产。随着细胞体外培养技术的成熟，目前我们可 以将融合细胞在培养基中大规模的培养获取单抗，这也为单抗药物的诞生创造了有利条件。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/72e15082-e36e-4802-b95d-8ed00b5e7049.jpg" title="5.jpg" alt="5.jpg"//pp style="text-align: center "图2.人工制备单克隆抗体的过程br/strong二/strongstrong 抗体药概述及市场分析/strong/ppstrong1.抗体药概述及发展历程/strong/pp　　抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点，在各种疾病治疗，特别是肿瘤治疗领域的应用前景备受关注。/pp　　第一代抗体药物源于动物多价抗血清，主要用于一些细菌感染性疾病的早期被动免疫治疗。虽然具有一定的疗效，但异源性蛋白引起的较强的人体免疫反应限制了这类药物的应用，因而逐渐被抗生素类药物所代替。/pp　　第二代抗体药物是利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。单克隆抗体由于具有良好的均一性和高度的特异性，因而在实验研究和疾病诊断中得到了广泛应用。1986年，美国FDA批准了世界上第一个单抗治疗性药物——抗CD3单抗OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。此时抗体药物的研制和应用达到了顶点。随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显。由于大多数单抗均为鼠源性，在人体内反复应用会引起人抗鼠抗体(HAMA)反应，从而降低疗效，甚至可引起过敏反应。/pp　　近年来，抗体药物的研发进入了第三代，即基因工程抗体时代。与第二代单抗相比，基因工程抗体具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应 ②基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位 ③根据治疗的需要，制备新型抗体 ④可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/a8d6d77e-a080-418e-9b3e-4d8496afd2d2.jpg" title="6.jpg" alt="6.jpg"//pp style="text-align: center "资料来源： 中商情报网、 FDA、 长城证券研究所/ppstrong2.抗体药的分类/strong/pp　　随着基因工程技术的发展，人们开始改变鼠源单抗的结构，使其更接近人源蛋白的构造，从而减轻其在人体内的免疫反应。目前的单抗产品主要可以分为以下四类：鼠源化抗体、嵌合型抗体、人源化抗体以及完全人源化抗体。/pp　　鼠源化抗体顾名思义就是完全分泌自小鼠细胞的抗体，其与人体的兼容性最差，容易引 起较强的免疫反应，目前已经较少使用。/pp　　嵌合型抗体就是把鼠源抗体的活性区域嵌合到人源抗体的稳定区域中，这样鼠源活性区 域仍能够发挥活性，识别目标蛋白。而新抗体 70%以上的区域均为人源抗体的稳定区域， 这样可以大大降低抗体的异源性，使得嵌合抗体的效价更高。此外，嵌合抗体结合目标抗原 以后，其人源保守区域能够被免疫系统识别，达到通过人体免疫来清除抗原的效果。/pp　　人源化抗体是将鼠源抗体基因中的活性片段转接到人源抗体的基因表达框中，这样表达 出来的抗体人源化区域的比例更高，能够达到 90%左右，这样能够进一步提高单抗在人体 内的活性。/pp　　完全人源化抗体是将小鼠体内的目标抗体基因敲出，然后用对应的人源抗体基因代替， 这样产生的抗体与人体内产生的抗体几乎完全一样，效价能能够达到最高。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/77a936c3-daa0-4ca7-9228-5b9c1be1db3a.jpg" title="7.jpg" alt="7.jpg"//pp style="text-align: center "图4.各种类型单抗的比较/pp style="text-align: center "资料来源：兴业证券研究所/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/844567fb-f131-4eae-9884-d0ca67814338.jpg" title="8.jpg" alt="8.jpg"//pp style="text-align: center "表2. 四代单抗技术对比/pp style="text-align: center "资料来源： Current Pharmaceutical Biotechnology、Methods、兴业证券研究所/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/47a0ea49-7099-452a-bfef-7dcf560f8249.jpg" title="9.jpg" alt="9.jpg"//pp style="text-align: center "图5. 1980-2004 年每年进入临床试验的各类型单抗产品数量/pp style="text-align: center "资料来源：长江证券/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/ac26a08d-774d-4731-aab9-0ac57d3b940a.jpg" style="" title="10.jpg"//pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/7b11b88b-0496-453a-a714-b8c3dfc5ff19.jpg" style="" title="11.jpg"//pp style="text-align: center "表1. 美国FDA批准的抗体药物/pp style="text-align: center "(Therapeutic monoclonal antibodies approved by the US FDA)/pp style="text-align: center "strong二 抗体药概述及市场分析/strong/ppstrong3.抗体药作用机制/strong/pp　　抗体药物作用机制比较复杂，但一般可归结为以下5类：细胞毒性药物、抑制细胞增殖、调节细胞的激活和相互作用、调节人自身免疫系统、中和抗原。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/758a6ec4-3cea-4369-a2d4-c84bc8b6d16e.jpg" title="12.jpg" alt="12.jpg"//pp style="text-align: center "图6. 单抗作用原理/pp style="text-align: center "资料来源：生物制药小编/pp　　3.1 抑制细胞的生长和增殖/pp　　某些抗体药物可以通过结合肿瘤细胞增殖的生长因子，阻断生长和增殖过程，可以用来治疗癌症。如西妥昔单抗、Necitumumab、帕尼单抗靶向EGFR，用来治疗头颈癌和非小细胞癌等。帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和ado-trastuzumab靶向HER2(EGFR family)，用于治疗乳腺癌。VEGF靶点与血管增生有关，癌细胞的增殖需要大量能量，通常伴随血管增生。如阿柏西普、雷莫芦单抗、雷珠单抗、贝伐珠单抗、康柏西普等，可用来治疗癌症和wet-AMD等。/pp　　3.2 细胞毒性/pp　　癌症、自身免疫疾病的一个首要目标就是杀死异常细胞，抗体可以通过各种机制诱导细胞的死亡。ADC药物通过细胞毒素杀死细胞，抗体药物均可以通过ADCC、ADCP、CDC作用杀死细胞。/pp　　3.3 调节人自身免疫系统/pp　　自身免疫疾病从抗体药物的发展中获益巨大，如TNF-α抗体是迄今最为成功的药物靶点。依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗，都是年销售额80亿美元以上的重磅炸弹药物，阿达木单抗更是继立普妥之后坐稳药王宝座，2015年销售额143亿美元，2016年上半年即销售77亿美元。除了TNF-α，还有多个涉及调节炎症性反应的细胞因子靶点，如IL-1、IL-5、IL-6/L-6R、IL-12、IL-17A、IL-23、BCMA等。/pp　　3.4 调节细胞激活和相互间作用/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/43a45803-bda2-4141-a92f-1c520b452351.jpg" title="13.jpg" alt="13.jpg"//pp　　如上图A中，T细胞的激活需要2种信号通路的协同作用：抗原呈递细胞(APC)上的MHC与T细胞上的TCR(其中一个亚基为CD3)结合、APC上的CD80/86与T细胞上的CD28结合。FDA历史上第一个抗体药物Muromomab就是靶向CD3的，近年来双特异性抗体的一个核心发展方向也是结合其他靶标与CD3，达到募集T细胞与靶细胞的作用，2014年，FDA批准了双特异性抗体Blincyto(靶向CD19/CD3)。阿巴西普、贝拉西普则靶向CD80/CD86。这些抗体药物的目的都是阻止T细胞的激活，从而治疗自身免疫病或者器官移植后的排斥反应。还可以通过靶向T细胞上其他蛋白(如阿法赛特靶向CD2)、相关炎症调节因子的受体(如巴利昔单抗、达利珠单抗靶向CD25)来阻止T细胞的激活。/pp　　在针对癌症适应症的时候，则需要激活内源免疫系统来杀灭癌细胞。如伊匹单抗靶向CTLA4、纳武单抗和派姆单抗靶向PD-1、阿替珠单抗(Atezolizumab)靶向PD-L1，即所谓的免疫检点抑制剂，通过解除癌细胞对免疫细胞的抑制作用，杀伤癌细胞。/pp　　3.5 中和外源分子/pp　　FDA批准的第一个此类抗体药物是怕利珠单抗，靶向RSV病毒F蛋白。瑞西巴库单抗、obiltoxaximab是FDA批准的另外两个抗毒素抗体，均用于避免炭疽杆菌的感染。2015年，FDA批准了Idarucizumab，用于中和达比加群酯，主要用于逆转达比加群酯的抗凝作用，使得后者的使用更有保险。/ppstrong4.抗体药物的核心技术/strong/pp　　单抗的研发生产是一个技术密集型流程，大体可分为抗体筛选、抗体表达和抗体纯化三个环节，每个环节都拥有其核心技术，这些核心技术环环相扣，形成了单抗生产企业的核心竞争力。/pp　　4.1 抗体筛选：噬菌体展示技术已成全人源单抗筛选主流/pp　　随着单抗人源化进程的不断深入，以噬菌体展示技术(详见附录)为核心的大规模单抗筛选平台日益受到重视。该技术不仅可以获得全人单抗， 而且不需要细胞融合， 不经过免疫动物， 实验周期短，过程简单，这是人源抗体制备技术的重大突破，目前国际上主流单抗生产企业均使用噬菌体展示技术筛选单抗药物。/pp　　4.2 表达培养技术： 方法、规模、体系和表达量是?四要素/pp　　作为单抗研发生产链条中承上启下的一环，表达培养技术是单抗产量形成和质量控制的关键，而判断企业这方面技术水平高低的指标主要有表达方法、反应器规模、表达体系和表达量这“四要素”。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/54f98542-b88e-41a4-adc7-744586fc68c7.jpg" title="14.jpg" alt="14.jpg"//pp style="text-align: center "表3. 表达培养技术四要素/pp style="text-align: center "资料来源：兴业证券研究所/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/4e4464a3-7926-4800-abae-e3214e1d5084.jpg" title="15.jpg" alt="15.jpg"//pp style="text-align: center "图4. 工业化单抗生产流程/pp style="text-align: center "资料来源：兴业证券研究所/pp　　4.3 分离纯化技术/pp　　在得到单抗之后如何有效的从培养液中分离纯化产物是单抗生产最后一道关键环节，工业上一般采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、蛋白-Sepharose 亲和层析等方式纯化单抗，由于平均每增加一个纯化步骤产品得率会降低约 13%，因而在保证纯度的同时尽可能提高得率也考验着生产商的技术水平。/pp　　总的来说，一个单抗生产商如果在上游能够通过出色的研发平台筛选出理想的单抗药物 在中游能够高效大规模的进行发酵培养，表达单抗 在下游能够高效、高纯度的分离纯化单抗，那么该公司就拥有了单抗研发生产的核心竞争力。/ppstrong5. 抗体药物的技术发展趋势/strong/pp　　根据单抗本身的技术特性和近年来的发展情况，我们认为未来单抗技术发展将呈现以下几方面趋势：/pp　　单抗全人化： 由于高人源化比例抗体在药效和副作用方面的优势，在过去 20 年中人源和全人单抗比例持续上升(08 年底销售占比分别为 31%和 11%)，而鼠源和嵌合单抗比例则不断下降(08 年底占比分别为 10%和 49%)，随着全人化单抗筛选技术的成熟，在研的新型单抗药物越发倾向于使用全人抗体技术，我们预计未来 5 年内新问世的单抗药物中全人单抗将占一半以上。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/89c525c7-c5eb-4bf8-b25a-c82ed46b36ba.jpg" title="16.jpg" alt="16.jpg"//pp style="text-align: center "图5. 人源化比例提高是大势所趋/pp style="text-align: center "资料来源：兴业证券研究所/pp　　抗体多样化： 除了人源化比例的不断提高，单抗研发也在多样性上不断推进。一方面， 单抗的药物靶位逐渐多样化，除了传统的细胞表面抗原(CD 表面抗原，负责多种细胞信号转导，截止 2009 年发现 390 种分子)，还包括了常见的细胞因子(如肿瘤坏死因子 TNF，血管内皮生长因子 VEGF，白介素 IL 等)，部分研制中的单抗药物甚至可以识别多个抗原表位，具有更好的抗突变功能 另一方面，单抗药物的结构也不再限于完整的单抗分子，而是包括了如 Fab、 scFV 等抗体 V区片断或其复合物，这些片断可以通过原核表达体系快速低成本表达，从而降低了药物成本。/pp　　治疗联合化： 虽然在单抗治疗肿瘤方面单抗具有副作用小、特异性高的特点，但由于中晚期肿瘤病灶巨大，一般单靠单抗并不能完全消除，这就需要使用单抗配合手术的治疗方案，通过手术切除肿瘤主体，再使用单抗治疗剩余病灶或防止病灶转移。除手术外，化学药物和单抗联合治疗方案也日益受到医疗工作者的重视，如实验证实 FOL+FOX4 方案(Avastin+奥沙利铂+亚叶酸钙+氟尿嘧啶)可以延长肿瘤患者生存期 2.5 个月。/ppstrong6.抗体药物的应用进展/strong/pp　　目前正在进行开发和已经投入市场的抗体药物主要有以下几种用途：1.器官移植排斥反应的逆转 2.肿瘤免疫诊断 3.肿瘤免疫显像 4.肿瘤导向治疗 5.哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病 6.抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤 7.多功能抗体(双特异抗体、三特异抗体、抗体细胞因子融合蛋白、抗体酶等)的特殊用途。/pp　　在进行器官移植时，可以采用某些抗体类药物来逆转器官移植引起的排斥反应。如最早批准(1986年)进入美国市场的治疗性抗体类药物——抗CD3单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥的逆转。抗体药用于器官移植免疫排斥反应已发展比较完善。/pp　　近年来人们将更多的目光集中在治疗肿瘤的抗体药物开发上。“生物导弹”，即将各种毒素、放射性同位素、化疗药物与识别肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗体偶联后，能够特异杀伤肿瘤细胞的一类药物。这种药物经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。/pp　　抗体药物目前市场占有度较多的领域为抗癌和自身免疫性疾病，其次用于抗感染、心血管疾病、器官移植免疫排斥反应等。从近年来进入临床试验的单克隆抗体的适应症来看，未来一段时期内，肿瘤治疗仍是抗体药应用的主要占比。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/dd78be75-1b98-4c90-a646-cd180e697ff7.jpg" title="17.png" alt="17.png"//pp style="text-align: center "表2. 截止2016年全球上市抗体药物数量/pp style="text-align: center "数据来源：药渡/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/9744ba94-12e2-447a-bb2a-7064942b2343.jpg" title="18.jpg" alt="18.jpg"//pp style="text-align: center "表3. 截止2016年全球上市药物销售额/pp style="text-align: center "数据来源：药渡/pp　　对于后期开发阶段(Ⅲ期临床和BLA)的抗体药物，《MAbs》杂志主编Reichert, J.M自2009年底起连续9年每年推出“Antibodies to watch in ?.year”系列综述，2010年初到2017年初的8年间后期开发阶段抗体数目依序分别为26个、32个、25个、29个、38个、45个、60个和61个(备注：此处61个产品均为首次进入Ⅲ期临床阶段的未上市新产品，而上述IMGT数据库查询结果124个包括了已经上市产品正在进行的Ⅲ期临床适应症扩展)。其中处于Ⅲ期临床阶段的抗体药物数目及其适应症构成如图2，从中可以看出针对非肿瘤适应症类的抗体药物占比有增多趋势，在研抗体药物种类更加多样化。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/d1991550-3f49-4acd-aaa4-22776bd9a226.jpg" title="19.jpg" alt="19.jpg"//pp style="text-align: center "表2. 2010-2017年初III期临床阶段产品适应症分布/pp style="text-align: center "数据来源：Reichert系列综述/ppstrong7.抗体药与化学药相比的优势/strong/pp　　相对于小分子药物，单抗产品最大的优点就是“精确”，能够针对特异性的靶点进行治疗，降低副反应的同时增强了功效。以单抗产品使用最为广泛的肿瘤治疗为例。在传统的治疗中，肿瘤患者一般会接受化疗和放疗两种治疗，但是不论哪种方式都会对患者的身体造成极大的伤害。在化疗过程中，患者一般会出现肠胃功能混乱，免疫力降低，造血功能受抑制等副作用 而放疗使患者本身就要受到辐射伤害。究其原因，是因为这两种传统治疗方法都是“广谱”治疗，也就是不论对肿瘤细胞还是正常细胞都会杀伤，这样造成效价较低。而单抗产品能够精确到细胞级别，针对病灶进行治疗，效价较高。/pp　　单抗药物开发更具资金和时间优势。与开发创新化学药物(包括小分子靶向药物)相比，开发单抗药物具有明显的资金和时间优势。开发一种创新型化学药物需要在临床前阶段进行大量的分子筛选和动物试验，有机化学家需要花费大量时间筛选出新的化学分子以发现“引导”化合物或对既有“引导”化合物进行新的修饰，并再次通过动物试验来初步评价药品的安全性以及收集吸收、代谢、排泄等相关生物效应数据，以保证该化合物可以进入人体临床测试阶段即成为“研究用新药”。整个过程一般需要 5-7 年，花费上亿美金。/pp style="text-align: center "strong三 国际抗体药分析/strong/pp　　strong1.国际抗体药市场发展/strong/pp　　单克隆抗体由于可精确的攻击靶分子，且具有较少的毒副作用而成为人们期望中的理想药物。经过一段曲折的发展历程之后，于二十世纪九十年代进入了一个新的快速成长期。/pp　　随着技术的不断发展，1997 年，全球迎来了首个治疗肿瘤的嵌合单抗药物——Rituxan(美罗华)。Rituxan 是 Genetech 生产的一种用于治疗 B 细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单抗药物，通过联合化疗能显著延长患者的生存期，同时作为嵌合单抗，Rituxan 的副作用相对较小，因而其在 B 细胞 NHL 的治疗中得到了广泛应用，加上次年 Remicade(类克)、Herceptin(赫赛汀)等重磅单抗药物的上市，全球单抗产业开始了突飞猛进地发展。/pp　　1997-2015 年全球单抗产业发展迅猛,CAGR高达37.2%。1997年，全球单抗产业市场规模仅约 3.1 亿美元，到 2015年，市场规模已达到916.3亿美元，年均复合增长率高达37.2%。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/5d1703a1-d791-4f29-a0a8-7e81a2636685.jpg" title="20.jpg" alt="20.jpg"//pp style="text-align: center "图7.单抗药物2005-2015年全球总销售额(单位亿美元)/pp style="text-align: center "资料来源：长城证券/pp　　1997-2007年是全球单抗产业增长的爆发期，2008年后增速放缓明显，但仍要显著高于全球医药行业的整体增速水平。1997-2007 年是全球单抗产业增长的爆发期，十年CAGR高达 58.6%。2008年以后，全球单抗产业增速放缓明显， 年均复合增长率降至 14.8%，但仍要显著高于全球医药行业约5%的增速水平。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/4d3d63ce-3654-4f8a-90f8-2927c60c00e3.jpg" title="21.jpg" alt="21.jpg"//pp style="text-align: center "图8. 1997-2015 年全球单抗产业市场增速与全球医药行业增速对比/pp　　单抗产业现已成为全球生物制品行业中占比最大的子行业。经过多年的高速发展，单抗在全球生物制品行业中的市场占比已由 1997 年 2.5%上升到 2015年的 34.7%，成为全球生物制品行业中市场占比最大的子行业。与此同时，在单抗制品的带动下，生物制品在全球药品市场中的占比也逐年攀升。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/d58ff098-d216-4bdc-9437-a09ca2705332.jpg" title="22.jpg" alt="22.jpg"//pp style="text-align: center "图9. 1997-2015 年单抗在全球生物制品行业中的市场占比/ppstrong2.国际抗体药技术发展/strong/pp　　2.1大型药企优势明显/pp　　单克隆抗体研发的技术壁垒较高，研发周期较长，需要强大的资金和技术支持，因此在 单抗技术方面大型企业具有明显的优势，因此目前国外重磅的单抗产品主要集中在罗氏(基 因泰克)，安进、GSK 和强生等公司，这些公司构建了成熟的单抗研发平台，在靶位基因的 筛选，基因的测序，抗体结构的构建，以及工业化生产等一系列流程上有着技术优势。从目 前已经上市销售的品种来看，我们可以发现单抗产品已经由初期的鼠源性和嵌合性产品逐步 转向了人源化和完全人源化产品，大型企业在蛋白结构重组方面也有自己的优势。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/bd44cdeb-6d56-4eae-8dd0-39745c9bcf80.jpg" style="" title="23.jpg"//pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/485f10af-9064-4086-a32e-7d17c68f73fa.jpg" style="" title="24.jpg"//pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/fefdc633-d80d-486c-a013-98cba0bffb3e.jpg" style="" title="25.jpg"//pp style="text-align: center "表2 国外单抗产品列表/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "CTLA4：细胞毒T淋巴细胞蛋白, PD-1：程序性细胞死亡蛋白1/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　PD-L1：程序性细胞死亡配体1, PD-L2：程序性细胞死亡配体2/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　4-IBB：肿瘤坏死因子受体-9, IDO1：吲哚胺2，3-双加氧酶1/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　LAG3：淋巴细胞活化基因蛋白3, KIR：杀伤细胞免疫球蛋白样受体/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　OX40：肿瘤坏死因子受体4/span/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　TCR(T Cell Receptor，T细胞受体)、CAR(Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体)/span/pp style="text-align: center "数据来源：中国医学科学院陈晓光教授/pp　　2.2靶点和适应症/pp　　各大公司在研产品很多，其大的研发趋势是新靶点的发现和新增适应症，近年来看，在研产品还是以肿瘤治疗为主，在原本治疗淋巴癌、乳腺癌的产品基础上，新增了对实体瘤、黑色素瘤、血液肿瘤、霍奇金淋巴瘤等有效的产品。/pp　　适应症的新增，与新靶点的发现紧密相关。过去，是以传统的 CD 系列、IL 系列和 EGFR 靶点为主，近年随着PD-1、PD-L1、PD-L2、OX40等新靶点的发现，研发种类也日趋多样。当然我们也不能忽视同一靶点可以开发不同适应症，一般来说，同一个靶点在人的不同细胞中都存在，并且可能发挥不同的作用，因此充分发掘一个靶点在不同细胞通路中的作用，对于扩大一个单抗产品的适应症有重要的意义。/pp　　IMGT数据库显示目前(2017年2月17日)有针对298个靶标的抗体药物正在进行开发或已经上市，较2016年同期的269个增加了29个靶标。除去前述的已有产品上市的40个靶点，在研的新靶标有258个。仍然是靶向肿瘤和免疫类的两大类疾病占绝大多数。据Reichert“Antibodies to watch in 2017”，2017年或近几年有可能上市的新靶标有32个，可能获批的新适应症约有18种。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/bb4b4356-d39d-46d7-9df9-bcb852abbc84.jpg" title="26.jpg" alt="26.jpg"//pp style="text-align: center "表2. 近几年可能上市的新靶标和新适应症/pp style="text-align: center "资料来源：IMGT 网站/pp style="text-align: center "strong四 国内抗体药分析/strong/ppstrong1.国内抗体药市场布局/strong/pp　　目前全球化学制药的创新已经进入瓶颈期，而生物制药的创新则层出不穷，随着新靶点 的发现和现有产品适应症的不断扩大，治疗性单抗产品的应用范围不断拓展。/pp　　我国单抗行业处于高速发展期，2010-2015年 CAGR近50%。我国单抗行业起步较晚，直到 1999 年才上市了第一个国产单抗药物——注射用抗人 T 细胞 CD3 鼠单抗，主要用于器官移植排斥反应。经过十多年的发展，至2015年，我国单抗产业市场规模已达到75亿元，近5年 CAGR 近 50%(2010年国内单抗产业市场规模约10.3亿元)，发展迅猛。/pp　　2016-2020 年国内单抗行业 CAGR 达 30%。据中投顾问预测：到 2020 年，我国单抗产业市场规模将达到280亿元，2016-2020 年年均复合增长率达30%，仍远超 Research and Markets预测的未来5年全球单抗产业9.84%的增速水平。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/8e08f4da-a481-45b0-90df-c0dfbad39ea6.jpg" title="27.jpg" alt="27.jpg"//pp style="text-align: center "图10. 2010-2020 年我国单抗产业市场规模及预测/pp style="text-align: center "数据来源：长江证券/pp　　肿瘤治疗的巨大需求推动我国抗体药市场发展。国内单抗药物主要应用于抗肿瘤领域。不同于国际市场，目前国内上市单抗药物主要应用于抗肿瘤领域，相应市场占比超过70%。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f803e304-6545-4b7c-aad1-f877c3c88540.jpg" title="28.png" alt="28.png"//pp style="text-align: center "图11. 当前我国单抗药物主要应用疾病领域/pp style="text-align: center "资料来源：长江证券/pp　　我国恶性肿瘤患病人数不断增加，市场规模持续扩大。受人口老龄化、环境污染等因素影响，我国恶性肿瘤发病率逐年上升，患病人数持续增长。2015 年，我国抗肿瘤药物市场规模已接近1000亿元， 2020年则有望突破2000亿元，市场空间巨大。/pp style="text-align: center "strong四 国内抗体药分析/strong/ppstrong2. 政策有利我国抗体行业发展/strong/pp　　2.1 产业政策/pp　　作为生物产业的重点发展方向之一，政府近年来出台了一系列政策来鼓励和支持我国单抗产业的发展。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/aefd999e-106b-435a-8046-b3955a76c20d.jpg" style="" title="29.jpg"//pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/16b2311a-e78f-41c9-9a75-48a15b5e1a8b.jpg" style="" title="30.jpg"//pp style="text-align: center "表3.近年我国政府出台的鼓励抗体行业发展的相关政策/pp style="text-align: center "数据来源：政府网站，渤海证券研究所/pp　　2.2医保政策/pp　　越来越多的单抗药物进入到地方医保目录。单抗药物价格通常较高，因而暂时未能进入到国家医保目录，但随着其治疗效果不断被认可，越来越多的单抗药物被增补到地方医保目录。随着人社部在时隔七年之后再次对基本医保药品目录展开调整，不排除有重磅级单抗药物进入到国家医保目录的可能。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/9cd91990-a4c7-46cd-89d9-a5f5c0baf50f.jpg" style="" title="31.jpg"//pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/726ee7a1-e1d4-48d3-8f73-2077b4674d2a.jpg" style="" title="32.png"//pp style="text-align: center"br//pp style="text-align: center "表4. 部分进入我国地方医保的单抗药物/pp style="text-align: center "数据来源：药智网、药源网/pp　　药品审评审批政策：新药审评时间长阻碍了我国创新药的发展。长时间以来，我国新药审评耗时冗长，2014 年我国1.1和3.1类新药从申请临床到上市获批平均耗时63个月，远远 长于同期美国新药的平均审评时间(约 10 个月)。新药审评时间长不仅降低了我国药企对创新药研发的热情，也使得我国在全球创新药的竞争中逐渐处于劣势。药品审评审批制度改革将加快我国单抗行业发展。2015年8月，国务院发布《改革药品医疗器械审评审批制度的意见》，明确将加快创新药的审评审批，对创新药实行特殊审评审批制度，单抗药物作为创新药的一员，必将受益于此次药审改革，得到快速发展。/ppstrong3. 国内抗体药研发概况/strong/pp　　至2017年2月17日，目前我国共有82家研制单位正在CDE进行171个抗体药物的注册研究，较去年同期增加企业11家，新增抗体32个。年度新增企业数屡创新高，2016年高达17家 加之以前进行过临床注册或已有产品获批但现无注册申报的6家企业，国内涉及抗体药物研制的单位共计88家。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/cdbc4590-5e6c-4fa9-b390-28a61845ce46.jpg" title="33.jpg" alt="33.jpg"//pp style="text-align: center "表2. 各企业申报抗体数/pp style="text-align: center "资料来源：生物制品圈/pp　　在这171个抗体药中，生产注册的仅有4个【上海百迈博的抗TNFα嵌和(CXSS1200005)，中信国健的抗CD20嵌和(CXSS1100021)、抗HER2人源化(CXSS0700053，CXSS1100005)，山东新时代的TNFαR-Fc融合蛋白(CXSS1000005) 不计数武汉生物制品研究所已终止的抗出血热鼠单抗(CXSS0800002)】。近5年无新申报生产注册的产品，且随着我国生物类似药原则的出台、标准的提高及与国际接轨，之前BLA申报的抗体的审评结局尚不得知。统计CDE“药物临床试验登记与信息公示平台”中登记的抗体药物信息，至今有30家国内本土企业的共计43个抗体药物处于各临床研究阶段。/pp　　在前述申报的171个产品中，以“1类新药”申报的有48个，占比28%。然而许多产品虽然以1类新药申报但国外已经有了相同或相似产品上市，非真正意义上的“国内外尚无产品上市”的1类新药。因可获得的产品确切信息有限，粗略估判国内申报的产品中的85%可归类为抗体类似药或抗体仿创药。其中仅抢仿7大热门“重磅炸弹”抗体的申报数就高达91个，Bevacizumab、Adalimumab、Rituximab、Trastuzumab、Cetuximab、Etanercept、Infliximab的抢仿厂家数分别为23家、21家、15家、10家、9家、8家和5家，合计起来的总占比虽然有降低趋势，但仍达到了注册抗体的一半以上(91/171=53%)，如果这些抗体类似药都能够顺利进入市场，可以预见未来市场竞争态势将会异常惨烈。/pp　　就开发热点而言，国内企业已有了抗PD-1单抗、ADC药物、去岩澡糖化抗CD20抗体、抗PD-L1抗体、抗PCSK-9抗体、双特异性抗体的申报。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/cd122f45-5c13-421c-9b56-7ade8b17f5f3.jpg" title="34.jpg" alt="34.jpg"//pp style="text-align: center "表5. 国内企业关于热点抗体的申报情况/pp style="text-align: center "数据来源：生物制品圈/pp　　综上可见，全球抗体药物产业强劲发展，中国抗体药物上市及原始创新产品开发严重不足。无论是已上市销售的还是正在注册研究的抗体药物，国内企业在抗体靶标和新抗体基因发现、新抗体药物创制、产品种类等诸多方面，都与欧美日等发达国家有较大的差距。如火如荼的抗体类似药开发，对于解决国内抗体药物临床需求迫切、药物可及性差等问题意义重大。但国内在研抗体同质化较为严重，需提升我国创新抗体药物的开发及产业转化能力。/ppstrong4.国内抗体药研发企业概况/strong/pp　　目前我国已形成以北京、上海、西安、武汉等为中心的产业基地，但我国企业研发能力相对薄弱，国产单抗药物主要为仿制药，在国内单抗市场，进口药仍占主导，国内企业市场份额仅占15%。但随着国家政策大力支持国产药品、进口药品专利到期增加等利好因素的叠加，国内抗体药物行业迎来发展机遇。/pp　　目前，在中国上市的抗体药物共有 23 个，其中，13 个是进口药，中国人开发生产的抗体只有10个，并且4个鼠源的抗体已无销售。2016年，中国抗体市场规模为 13.8 亿美元，其中，83% 的市场份额被进口抗体药物垄断。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/703fffda-96a9-458c-b9f7-a03aeda42bbe.jpg" style="" title="36.jpg"//pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/9e50230c-0e8f-4249-84c2-7eab670dc623.jpg" style="" title="37.png"//pp style="text-align: center"br//pp style="text-align: center "表4. 国内已上市抗体药/pp style="text-align: center "资料来源：长江证券/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/ed00826f-82ab-485f-80c1-619b30179f3d.jpg" title="38.jpg" style="text-align: center white-space: normal "//pp style="text-align: center "表2. 国内抗体药研发现状/pp style="text-align: center "数据来源：医药时间/pp　　近几年，中国创新生物药的发展取得了一些令人瞩目的成绩，我国第一个具有全球知识产权的单克隆抗体类药物康柏西普直通(专利持有人为成都康弘生物科技有限公司)美国 FDA 临床 III 期。我国在PD-1、PD-L1方面的研究不断取得突破，已成功报批的药企就有7家：君实生物(我国首个PD-1单抗获批)、恒瑞(2016年2月PD-1单抗获批临床)、百济神州、嘉和(2016年4月PD-1单抗临床申请获受理)、信达生物、思路迪(我国首个PD-L1单抗新药)、誉衡。同时，国内药企与国外企业抗体药物合作不断增加，如药明康德和阿斯利康、恒瑞和Incyte、信达和礼来、广东的中山康方等等。/pp　　目前国内抗体药研发实力较强的公司包括，传统优势药企，如复星、恒瑞、齐鲁、海正等，以及创业型企业，如信达、康宁杰瑞、百济神州等。还有一些科研院所。目前申报抗体品种数大于5家以上的企业有齐鲁制药、海正药业、复宏汉霖、上海恒瑞、深圳龙瑞等9家企业。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/bdac5972-2b9e-4c8f-a40e-66704f3fa056.jpg" title="39.jpg" alt="39.jpg"//pp style="text-align: center "表2. 国内治疗性抗体申报情况/pp style="text-align: center "数据来源：火石创造/ppstrong抗体研发企业大概可以分为以下几类：/strong/pp　　1、以中信国健、百泰为代表，国内最早拥有上市抗体药物产品的生物药物企业，有研发、生产、营销的完整产业链。但在产业剧烈变革的时代，也面临诸多挑战。/pp　　2、 以海正药业、康弘药业为代表，本身已经具有一定规模的中药、化药企业，最早一批重金布局抗体药物领域的企业。海正在研产品线丰富，但上市产品安百诺营销压力大，后续面临新一批抗体药物研发企业的激烈竞争。康弘的郎沐虽上市较晚，但头顶首个获得 WHO INN 的光环，占据了地利人和，获得了初步成功，后续仍有 KH903、KH906 等pipeline 储备。但俞德超走后，生物药长远如何布局，还要再看。/pp　　3、以齐鲁制药、嘉和生物、复宏汉霖为代表，资本充足，起步较晚，以符合国际标准的高质量生物类似药为突破点来破局。但这类企业也最多，竞争也最为激烈。包括正大天晴、华海药业等一大批企业。/pp　　4、以恒瑞医药、百济神州等为代表，研发水平着眼国际水准，靠自主创新达到核心竞争力。这里面又分为两类，一类是已经拥有雄厚资本的恒瑞药业，立志于成为国际一流的创新推动型药企，一类是百济神州这种研发型企业，通过资本市场以及合作开发方式，来获得前期研发需要的资本。这也是欧美通行的研发模式。/pp　　5、不得不提的还有国内的生物药物 CRO/CMO 产业，这类企业在整个抗体药物发展过程中将发挥巨大作用，甚至影响产业格局。/ppstrong5.国内抗体药产业投资分布/strong/pp　　投资简介/pp　　抗体产业的热度也吸引了众多的资本介入，从2012年到2017年上半年抗体药物企业共披露融资次数47次，涉及融资金额达130亿元。从披露投融资情况看，从2015年开始，抗体产业不管是从融资次数还是融资金额上都有大幅提升，产业热度居高不下，融资次数和融资金均以A轮和B轮居多，提示我国抗体产业仍处于上升阶段。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f2b8cdb0-1393-448f-a7ca-628f75a59255.jpg" title="40.jpg" alt="40.jpg"//pp style="text-align: center "表2. 近5年国内抗体药物企业披露投融资金额及笔数/pp　　以高领资本、元禾原点、毓承资本、礼来亚洲基金、启明创投为代表的投资机构为抗体领域的繁荣提供了资本支持。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/42f7de45-55d4-4b8a-9ebd-ba7cd0417afe.jpg" title="41.png" alt="41.png"//pp 表2. 资本主要投资项目br/strong投资风险/strong/pp　　对于生物创新药来说，由于其开发的复杂性，众多国内企业选择合作开发模式以共担风险。由于生物医药专利的复杂性、抗体领域靶点和技术的易重叠性，抗体药物专利问题愈发突出与明显， BMS和默沙东的PD1专利大战、安进/赛诺菲关于PCSK9表位的专利之争更是为国内企业在抗体领域专利布局敲响警钟。/p

导读 在全球和中国医药市场上，抗体药物已连续多年占据销售榜单前几位。当前，随着国家医改政策的改革和完善，国际、国内市场打通，抗体市场也开始进入“你方唱罢我登场”群雄逐鹿的竞争阶段，生产企业如何在确保产品质量的基础上，通过改进工艺，来降低成本、提高生产效率和市场竞争力？江博士文章给读者提供了一条切实可行的思路和方法，请看“如何突破抗体生产瓶颈”。抗体药物市场及发展趋势 全球生物制药产业发展迅猛，根据frost&sullivan市场调研，2018年全球生物制药市场规模约为2642亿美元。单抗类药物由于特异性好，靶向性高，副作用小，疗效显著成为发展最快的一类生物药。单抗药物在全球生物药中所占市场份额超过50%，达到1353亿美金。 中国巨大的市场潜力，国际重磅抗体药专利到期，大量的海归人才回流及中国日益强大的资本助力，都为中国抗体制药发展提供了前所未有的历史机遇。但是中国抗体制药企业也面临巨大的挑战。首先中国药企无论是技术、规模、经验，人才还是资金，跟国际生物制药巨头相比，都有着较大的差距。其次中国加入ich和国际药监管体系接轨，降低药品进口关税，对进口抗癌药物实施零关税等系列政策，降低了国外原研药进入中国市场的门槛，给中国生物药企业带来了巨大压力和挑战。另外，越来越多的制药企业进入抗体药的开发领域，每个重磅抗体药物基本上都有几十家企业在仿制研发申报，因此国内抗体药企不仅要面临国外原研药巨头的打压，还要面对国内众多同行及印度廉价药企业激烈的竞争。最后带量采购新政允许通过一致性评价的仿制药与原研药可以一起同台竞标，低价中标，消除了销售渠道的壁垒使得国内外生物药企的竞争回归到技术创新，产品质量和成本的竞争。 因此国内生物药企是否能在激烈的竞争中取得优势取决于其生产工艺的先进性，因为制药工艺水平决定了产品的质量和成本。抗体药物的生产工艺进展 抗体药物生产是个非常复杂的过程，大致分为上游的发酵及下游的分离纯化：上游工艺主要包括细胞复苏、传代、发酵生产。而下游工艺主要包括膜过滤及多步层析分离纯化。过去十多年来，基因工程获得突飞猛进的进步，细胞培养的表达量从原来的不到0.5 g/l 到现在普遍达到5g/l，有的甚至超过10g/l。这些进步是由细胞表达载体的开发，克隆筛选以及细胞培养基优化等技术创新所驱动的。由于发酵产率的大幅度提升，使得上游细胞培养成本大幅度降低（表1）。表1 表达量与抗体生产成本关系与上游十多倍生产效率提升相比，下游分离纯化技术进步明显滞后，导致下游工序成为生产瓶颈，抗体主要生产成本也转移到下游。下游工艺在整个生物制药生产中占据60%以上生产成本，也被认为是最需要改进的技术领域。下游工艺先进性决定了药品的质量，及药品生产效率和成本，也成为生物制药企业的核心竞争力所在。生物制药下游生产工艺目的就是把目标药物分子从复杂发酵液体系中分离出来以满足药品纯度及质量的需求。一方面监管部门对生物药的纯度和质量要求越来越高，另一方面生物分子具有结构复杂，且对外部条件敏感，稳定性差，杂质多，浓度低等特点，使得生物药分离纯化的挑战更大。比如说治疗用抗体不仅对含量有严格的要求，还必须去除各种潜在的杂质如宿主hcp, dna，endotoxin, 抗体聚集体及降解片段等（表2）。表2 抗体药物对各种杂质的要求 层析技术具有分离纯化效率高，条件温和且容易保持目标分子的生物活性，因此成为生物制药分离纯化最主要工具。但下游层析分离纯化技术牵涉到材料、生物、化学及设备等交叉技术领域。因此研究下游分离纯化技术的人才较少，另外上游基因工程技术几乎在所有高校都有专业研究团队，而且培养了大量的人才，而下游分离纯化技术却很少在高校有专门研究，也缺乏相关的专业课程来培养分离纯化的人才。过去10多年上游基因工程的迅猛发展虽然带来上游发酵成本的大幅度下降，但下游分离纯化技术进步缓慢使其成本居高不下。因此要降低抗体生产成本关键就是要解决下游分离纯化的瓶颈问题。 抗体的层析分离步骤基本都可以采用标准化的三步曲：第一步用protein a介质进行抗体捕获和浓缩；第二步用离子交换进行中间纯化以去除多聚体，宿主蛋白等杂质；第三步是精纯去除剩余dna，endotoxin,protein a 等微量杂质。在这三步抗体的分离纯化过程中，第一步的protein a亲和捕获占据分离纯化成本80%以上，也是下游分离纯化的瓶颈所在。亲和层析之所以成本高的主要原因：首先是protein a 价格昂贵，其价格是普通层析介质十几倍；第二，protein a使用寿命短，一般离子交换填料使用寿命多达1000次，而亲和填料寿命通常在100-200次；第三，protein a 用于抗体的捕获和浓缩，需要处理大体积的发酵液，而亲和步骤载量往往又低于阴阳离子交换层析，使得亲和层析介质使用量比中间纯化或精纯的要多得多。因此，要降低抗体的生产成本，解决抗体的生产瓶颈关键在于改进第一步protein a 亲和捕获。 下游分离纯化核心的工艺流程 protein a 亲和层析是利用protein a 配基与目标抗体具有专一亲和吸附作用从而达到分离纯化抗体的目的。野生型protein a蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁锚钉蛋白。三维空间上，抗体fc端ch2-ch3区域与protein a蛋白b结构域上两条反相平行的α螺旋结构相互结合。因此protein a与抗体分子特别是与igg1、igg2、igg4有特异性结合，使得抗体分子与发酵液中不具fc端结构的杂质如宿主蛋白与核酸等有效分离，进而达到纯化目的。protein a 亲和层析介质是通过把proteina 配基偶联到微球介质上制备而成的。因为protein a配基与目标抗体的作用的专一性，因此亲和层析的分离纯化工艺和方法与抗体样品杂质含量和种类多少影响不大，使用protein a 介质一步纯化目标抗体就可以达到95%以上纯度，回收率达到90%以上。亲和纯化效率也基本不受杂质多少影响，而其它分离模式如离子交换，疏水，分子筛等的分离工艺方法及效率大多取决于与目的蛋白同时存在的杂质种类和含量。因此，只要样品杂质不同，即使是纯化同样的目标生物分子，采用的分离工艺和方法就不同。以重组胰岛素分离纯化为例，不同厂家虽然生产的是同一目标胰岛素，但采用分离纯化方法完全不一样，主要原因就是每家生产的胰岛素杂质组成和含量不一样，因此需要不同的纯化工艺。而比胰岛素分子量更大，结构更复杂的抗体基本可以采用标准化的三步曲，主要原因就是protein a 亲和介质的出现大大简化抗体的分离纯化工艺，但protein a 价格昂贵让抗体生产厂家爱恨交加。 protein a 介质价格高的主要原因是其生产工艺复杂，proteina 配基是通过生物发酵生产的，经过纯化后偶联到介质上成为protein a 亲和介质，因此生产成本远高于传统的离子交换、疏水、分子筛等介质。另一方面protein a产品主要由欧美几家供应商垄断，也是价格居高不下的原因之一。为了降低抗体生产成本，不少研究工作者在寻找可以取代protein a且价格低廉的新型层析介质来纯化抗体，虽然可能在一些个案中获得成功，但都无法撼动protein a 在整个抗体分离纯化的垄断地位。proteina 亲和层析成为过去近30年里抗体纯化捕获的金标准。因此要降低抗体亲和层析这一步的成本首要的方案是实现protein a 介质的国产化以降低产品价格；其次是通过采用创新的连续层析工艺技术或其它新工艺以提高protein a 介质的利用率并提高抗体生产效率。当然不断改进protein a 介质性能使其具有更高的载量和更长的使用寿命也可以降低抗体的生产成本。 protein a 介质国产化创新之路 目前市场上主流protein a产品是ge生产的以琼脂糖为基质的产品，也是最早商业化的产品。琼脂糖为基质的protein a 介质具有载量高，亲水性能好，非特异性吸附低等优点，但琼脂糖介质天然缺陷是机械强度差，因此也被称为软胶。由于该介质耐压性能差，生产中需要降低柱高、减小流速以防止压力过高造成柱床塌陷，限制了抗体批处理量及抗体生产效率。软胶protein a 另外一个缺陷是传质速度慢，主要原因是软胶孔径较小，排阻大。因此软胶protein a 都需要驻保留时间长，流速慢条件下，抗体吸附载量才会比较高，但在高流速下动态载量下降的非常快。因此一个理想的抗体纯化用protein a 介质需要具有高流速，高载量，高机械强度，及更长的使用寿命等特点。protein a 介质载量是由微球孔径，比表面积，配基密度来决定的；机械强度则是由protein a基球材料化学组成，交联度及孔隙率来决定的；protein a 配基脱落及使用寿命主要由配基，基球性能及偶联方式来决定。实现高性能protein a 亲和介质的国产化需要从底层创新开始。抗体结构示意图 创新之一：单分散基球替代多分散基球 层析介质粒径大小和粒径分布是影响层析分离的重要参数。粒径分布越均匀，装柱越容易、柱床越稳定、柱效越高、流速越均匀、洗脱越集中、分离效率越高、流动相用量越少，柱与柱重复性也越好；protein a 介质被誉为层析介质皇冠上的明珠，价格昂贵，可是市场上protein a 介质都是采用粒径分布较宽的基球。主要原因是单分散微球制备技术难度极大，世界上可以规模生产的单分散多孔微球只有dynal公司一家，ge销售的source 系列单分散聚苯乙烯色谱填料就是dynal生产的。但source 产品的粒径最大只有30微米，不能满足protein a 介质对粒径一般要大于40微米的要求。纳微经过多年的努力开发出世界领先的微球精准制备技术，突破大单分散大粒径多孔微球的制备难题，成为全球第一家生产单分散protein a 亲和层析介质的公司。纳微单分散protein a介质与传统软胶基质微观结构对比传统多分散protein a亲和软胶与unimab液流路径对比示意图 创新之二：通透大孔径基球微替代小孔微球 protein a 基球孔径大小会影响生物分子在介质的传质速度和有效载量，孔径越大，分子传质速度越快，在高流速下具有高载量。基于软胶基质的ge protein a亲和介质孔径较小，比表面积高，其静态吸附载量高，但传质阻力大，在驻留时间短，流速快的条件下，动态载量下降的很快。纳微经过优化筛选，专门设计的大孔结构基球，其孔径达到ge protein a 介质的一倍左右。因此该介质传质速度快，使得介质在高流速下具有高载量。从实验测试数据可以看到，纳微unimab与ge mabselectsure在驻留时间大于4分钟时，载量都差不多，当驻留时间小于2分钟时unimab的载量比mabselectsure载量高50%以上, 而且速度越快unimab载量优势越明显。抗体生产效率是由动态载量和流速共同决定，流速越快载量越高，生产效率越高，成本越低，但亲和层析介质的动态载量与流速成反比，流速越快，载量越低，因此对于每个protein a亲和介质纯化抗体效率都会随着流速升高效率逐步提高，到了一个最优的流速后，如果继续增加流速，纯化效率反而降低。林东强教授实验证明对于批次亲和层析，驻留时间是2分钟时生产效率达到最高，而驻留时间在2分钟条件，unimab的动态载量比mabselectsure 高50%以上。对于连续层析驻留时间是1分钟时生产效率最高，而这个保留时间，unimab的动态载量更是mabselectsure一倍以上。另外从抗体流穿曲线对比图也可以看出具有大孔结构及高度粒径均匀性的单分散protein a亲和层析介质与多分散软胶porteina 介质相比具有更陡的穿透曲线，说明纳微单分散层析介质具有更畅通的孔道结构，分子扩散速度快，抗体流穿少，回收率高。因此利用纳微大孔结构微球不仅可以提高分子传质速度，提高抗体生产效率，降低成本，而且在连续层析中，具有更明显的优势。unimab与mabselectsure产品不同驻留时间动态载量对比不同protein a 层析介质驻留时间与抗体生产效率与关系对比抗体流穿曲线对比图 创新之三：高度交联聚丙烯酸酯基球替代软胶或低交联的聚丙烯酸酯基球 高机械强度介质不仅可以耐受更高流速、更高压力、更大粘度样品，还可以装更高的柱床，以增加抗体批处理量、提高抗体生产效率、减少设备投资、减少厂房占用面积。因此纳微protein a 介质是选择高度交联的聚丙烯酸酯基球，与市场上以琼脂糖或低交联度聚丙烯酸酯为基球生产的protein a 介质相比具有溶胀系数小、压缩比例低、而且机械性能强。实验证明 unimab在2公斤装柱压力下，其柱床压缩比例只有5%，而无论是ge 生产的以琼脂糖为基球还是tosoh 生产的低交联聚合物为基球的protein a 介质压缩比例往往超过15%。unimab与软胶与压力流速曲线对比 创新之四：表面亲水化改性微球替代亲水性微球 用于抗体或蛋白纯化分离的层析介质必须具有很好的表面亲水性，因此市场上主要的protein a 产品要么是基于亲水多糖类材料，或者是用亲水单体做的基球，这种基球虽然亲水性能好，非特异性吸附低但机械强度差。为了保持基球的机械强度并解决介质亲水性问题，纳微采用先合成高机械强度高交联的聚丙烯酸酯微球，然后通过多步表面亲水化改性，再进行protein a配件偶联。这种方法虽然工艺复杂，但生产的介质既有高机械强度，又有表面亲水性能好，非特异性吸附低等特性。因此unimab在抗体分离过程中，hcp去除效果好, 可以达到软胶protein a 的同等水平。纳微unimab与对照填料的hcp去除效果 创新之五：protein a 配基创新 除了基球之外，protein a 配基也是影响介质性能重要因素，尤其是介质的寿命。ge之所以垄断protein a 亲和层析介质市场，最主要的是ge拥有耐碱性protein a 专利技术，其核心专利技术是通过基因工程改变b domain 不耐碱的3个氨基酸以改善其耐碱性能。纳微通过优化组合不同片段设计出新序列的protein a 配基，不仅耐碱性好，而且具有自主知识产权，并能自主实现大规模生产。纳微独有的耐碱性配基加上具有卓越性能的基球，及优化偶联工艺开发出高性能的protein a 亲和介质。以下是某单抗项目上unimab介质载量随使用次数增加的衰减变化表。每个cycle采用0.1m氢氧化钠cip，接触时间1小时。连续200个cycle 后dbc10%依然在初始值的75%左右，充分体现了纳微proteina介质的良好耐碱性。纳微世界领先的微球精准制造技术，可以对微球的材料组成、粒径大小、粒径均匀性、孔径大小及表面性能达到前所未有的精准控制。纳微利用这一技术平台开发出新一代单分散多孔聚丙烯酸酯为基质的protein a 亲和层析介质克服了传统proteina 软胶的缺点，也为实现下一代连续层析技术产业化提供理想的介质。unimab载量随使用次数增加的衰减变化表 protein a介质创新和生产工艺创新实现抗体生产效率提升 单抗药物的市场竞争越来越激烈，降低抗体生产成本，高效、稳定的产出合格的产品是每个抗体生产厂家追求的目标。亲和层析作为单克隆抗体分离纯化的关键步骤，关系到下游的主要成本及生产效率，产品质量，也是目前下游生产的主要瓶颈。因此纳微通过底层技术创新不仅实现protein a 介质的国产化，而且克服了现有产品的缺陷，必将大幅度提供抗体生产效率，降低抗体生产成本，更重要的是纳微创新性单分散层析介质可以推动下游工艺技术的创新和进步。比如说高机械强度的protein a 介质就使得通过增加柱床提高批处理量成为可能。而高流速下的高载量及耐高压特性为最终实现抗体连续层析工艺打下基础。1.高柱床提高抗体批处理量和生产效率 目前ge 生产的protein a 软胶占据抗体分离纯化的90%市场。由于软胶机械强度差，耐压受限（压力小于3公斤），为了防止柱床塌陷，一般柱床只装到15cm高度，严重限制抗体的生产效率，增加抗体的生产成本。柱床高不仅可以增加抗体的批处理量，提供抗体的生产效率，还可以减少qa及qc等配套人员的工作量，减少纯化系统的数量及设备投资。其实，通过高柱床提高生产效率的方法早在成本更加敏感的胰岛素、白蛋白、多肽等生物药生产上成功实现。但要增加柱床高度，protein a 介质必须具有高机械强度性能，以满足高柱床高流速下产生的压力。纳微开发的新一代单分散protein a 介质是以高交联的单分散聚丙烯酸酯为基质，机械强度高，耐压性能好。因此柱床可以装到40cm以上高度，使得抗体批处理量及生产效率可以提高一倍以上，不仅减少设备投资及厂房的占用面积，而且大幅度降低生产成本。另外实验证明提高柱床还可以提高介质有效载量和利用率，柱床提高一倍，抗体上样量至少增加2.2倍（见表）。高柱床可以解决因为上游发酵规模的扩大及蛋白表达量的增加而带来下游分离纯化生产瓶颈的问题。另外软胶放大往往只能通过等高放大，而纳微生产的高机械强度protein a 可以等保留时间放大。传统软胶基质只能等高放大（上）和纳微protein a介质可等保留时间放大（下）表 unimab对某抗体dbc5%比较unimab在不同柱高下的压力流速曲线2.连续层析提高抗体生产效率 随着细胞培养技术的迅猛发展，蛋白表达量不断增加以及新兴的连续灌流培养技术的发展对下游纯化效率提出越来越高的要求。批次层析越来越难以满足生产的需求，而连续层析由多根串联的层析柱组成，因为第二根柱子可以承接并吸附从第一根层析柱流穿的抗体，因此第一根柱子可以持续上样到更高的蛋白穿透从而显著提高层析柱的使用载量，进而提高介质利用率，降低生产成本。连续层析可以极大提高设备的利用率，缩短生产周期，还可以减少缓冲液的消耗。传统间歇式层析（左）新型连续层析工艺（右）连续流层析分离过程示意图(来源于林东强教授课题组文章)unimab与mabselectsure在批次与连续层析的对比数据(来源于林东强教授课题组文章) 连续层析系统已被认为是下游分离纯化的发展必然趋势，可以大幅度提高抗体下游分离纯化效率，降低生产成本。与批次层析相比，连续层析对设备、软件有更高的要求，而且对介质的要求也不一样。 首先，连续层析由多根串联的层析柱组成。为了保障产品连续生产的质量，对每根柱子的一致性要求高。因此介质填料均匀性就显得更为重要，因为介质越均匀，越容易装柱子，柱效也越高，柱与柱之间的一致性也越好。传统多分散介质由于颗粒有大有小，在装柱过程中大小颗粒的沉降速度不同，使得柱与柱之间差异较大；而且小颗粒容易堵塞筛板，影响流速，大颗粒又会降低柱效，也容易使样品流穿，从而影响分离效率。因此高度粒径均一的单分散层析介质可以克服传统多分散介质在连续生产中存在的问题，单分散介质由于粒径分布均匀可以确保柱与柱的一致性和稳定性。 第二，在连续层析过程中，使用的是串联的小柱子，为了提高生产效率，线性流速要快，这就对层析介质机械强度要求更高，以满足高流速下产生的高压力。目前市场上主流的介质是软胶，耐压性差，只能低流速操作。纳微新型单分散层析介质由于是高度交联的介质，因此机械强度高，可满足高流速的需求。第三，层析介质的实际有效载量与纯化效率也有直接的关系，实际有效载量是指介质在实际生产条件尤其是流动相速度下的载量。实际有效载量越高，样品上样量可以越大。但线性流速越快，柱保留时间越短，则实际有效载量越低。软胶虽然在低流速下有较高载量，但在高流速下，载量迅速下降。单分散聚合物层析介质是大孔结构的微球，通透性好，蛋白在微球内的传递速度快，因此在高流速下能保持较高的载量。因此粒径均一（单分散），高机械强度，高流速下保持高载量的介质是连续层析生产的理想的介质。连续层析技术是实现连续生产的关键技术。连续生产制药技术是一种新兴技术，虽然还面临着许多监管的问题和技术的挑战，但连续生产的优越性却显而易见，也是生物制药工艺发展的趋势之一。 随着多个重磅原研生物药的专利到期，为了满足临床市场的需求和降低原研生物药的昂贵医疗费用，越来越多的制药企业进入生物类似药的开发领域，这进一步加剧了生物类似药的竞争，企业成本压力日益凸显。抗体的主要成本在于下游的分离纯化，而protein a 亲和层析成本占据整个层析分离纯化的80%以上，也是下游分离纯化的瓶颈，因此，实现protein a亲和层析介质国产化，并通过底层技术创新改善protein a 机械强度，传质速度及耐碱性能，开发出新一代单分散protein a亲和层析介质，使其可以在高流速下纯化抗体以提高生产效率，降低成本生产。另外机械强度高及传质快的protein a 介质又有利于创新连续层析及高柱床的工艺实施，进一步提高抗体的生产效率和降低抗体生产成本，也为中国生物制药发展实现后发优势提供支撑。

近日，AI制药公司华深智药生物科技有限公司（以下简称为“华深智药”）、清华大学智能产业研究院（AIR）、清华大学医学院联合宣布，通过人工智能抗体平台，三方合作在新冠抗体设计和优化等方面取得了突破性进展，设计出具有广谱抗病毒能力的新冠抗体，并为新一代抗体药物的研发开创了全新的路径和范式。　　自2021年8月开始，华深智药与清华大学医学院张林琦教授团队及智能产业研究院（AIR）智慧医疗团队合作，利用自主研发的AI抗体设计平台Helixon Design，对现有抗体开展了系统设计和优化。通过综合分析抗体与新冠病毒刺突蛋白在原子水平的相互作用，结合蛋白与蛋白相互作用的大数据提炼，合作团队在短时间内完成了从设计、合成、评估和再优化的全链条闭环程序，研制出了全新的新冠特效中和抗体。该抗体对新冠病毒原始株和阿尔法、贝塔、伽马和德尔塔等突变株具备高效和广谱的中和效果，抗病毒能力达到或超越目前已经获得紧急批准使用的新冠抗体。HelixonDesign 人工智能抗体设计平台 Helixon Design平台不仅能对新冠病毒变异株快速响应，同时开展多个靶点设计与优化，生成有针对性的广谱中和抗体，并能随着新冠病毒的突变快速随动，生成新的抗体设计。这一平台还能够帮助研究人员同时优化抗体稳定性、溶解性、亲和力等多个参数，在成药性上对抗体候选进行评估，大大缩短研发周期并提高了研发成功率。科研团队合影 华深智药由清华大学智能产业研究院（AIR）孵化，创始人彭健博士是世界知名的计算生物学专家，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（UIUC）计算机科学系及医学院终身教授，计算生物领域最高奖项ISCB Overton Prize唯一华人得主。　　目前，华深智药正利用Helixon Design平台开展多款新一代抗病毒中和抗体及其他大分子药物研发。清华大学智能产业研究院（AIR）张亚勤院长表示：“AI制药是全球AI科研和产业关注的热点，新冠病毒的流行给全世界带来新的挑战，华深智药和清华大学团队通力合作，在短时间内开发出AI抗体设计平台Helixon Design，并设计出世界领先的广谱新冠中和抗体，是继AlphaFold2之后AI在生命科学领域取得的又一里程碑式的突破。”

英国科学家在最新一期《自然微生物学》杂志上发表论文指出，他们的最新研究发现，感染新冠病毒10个月后，体内仍然存在抗体。　　在该研究中，他们观察了圣托马斯医院38名患者和医护人员接种疫苗前体内的抗体情况，这些人在第一波新冠疫情暴发时受到感染。研究表明，尽管感染新冠病毒后抗体水平有所下降，但结果显示，大多数人在感染10个月后，体内仍保持可检测到的抗体水平。　　研究人员解释说，抗体通过与新冠病毒结合来阻止病毒感染细胞，从而有助于对抗新冠病毒。最新研究结果显示了抗体可以在体内停留多长时间来对抗未来的感染。　　由伦敦国王学院免疫学和微生物科学学院的凯蒂多尔斯博士领导的这项研究还测试了针对新冠病毒特定变异毒株而产生的抗体对其他变异毒株的反应。他们研究了新冠病毒原始毒株、阿尔法变异毒株、贝塔变异毒株和德尔塔变异毒株。　　研究结果表明，虽然感染新冠病毒特定变异毒株而产生的抗体能对该变异毒株产生强烈的免疫反应，但在应对其他不同变异毒株时效果较差。　　抗体会与新冠病毒上的刺突蛋白结合，刺突蛋白是病毒进入并感染人类细胞的关键。新冠疫苗的作用机理是让人体的免疫系统产生针对新冠病毒抗原的中和抗体和细胞免疫反应。接种疫苗后，如果病毒此后感染人体，疫苗会引发免疫系统攻击病毒。　　新冠病毒出现的新变异让人们担忧，针对新冠病毒原始毒株开发的疫苗能否有效对抗新变异，以及是否应针对这些新变异毒株设计新疫苗。最新结果表明，新冠病毒阿尔法、贝塔、德尔塔变异毒株的刺突蛋白存在差异，这意味着围绕其中一种变异毒株设计的疫苗可能对其他变异毒株的效果较差。　　研究结果还表明，科学家们目前针对新冠病毒原始毒株设计的疫苗提供了对所有变异毒株的最佳保护，应用于疫苗接种计划。

流式抗体的重要性流式抗体是流式细胞术中的关键组成部分，在科研中扮演着重要角色。它们可用于分析细胞表面标记物，帮助科研人员识别不同类型的细胞，分离和纯化细胞群，诊断疾病，以及在免疫学和药物研发中发挥作用。流式抗体为科研人员提供了强大的工具和技术支持，对细胞生物学、免疫学和临床诊断等领域具有重要意义。 阿拉丁流式抗体涵盖多种热销靶标阿拉丁致力于持续推出各种新型靶标流式抗体。高质量阿拉丁生产的流式抗体经过严格的质量控制，具有高特异性、高灵敏性和高再现性的特点，能够帮助您得到可靠的实验结果。采用重组抗体CD20抗体（FITC）进行流式实验结果（黑色代表未标记样品，绿色代表细胞被重组蛋白CD20抗体（FITC）染色）专业支持阿拉丁公司拥有专业的科研团队，能够为客户提供流式抗体选择方面的专业建议和支持。 阿拉丁相关产品 了解更多产品详情可进入阿拉丁官网（https://www.aladdin-e.com），搜索“流式抗体”。

尽管疫苗技术取得了重大而惊人的进步，但新冠疫情尚未结束。控制新冠病毒传播的一个关键挑战是识别受感染的个体。日本研究人员开发了一种基于抗体的新方法，用于快速可靠地检测新冠病毒，且不需要血液样本。研究成果近日发表在《科学报告》杂志上。　　对新冠病毒感染者的无效识别严重限制了全球对新冠疫情的反应，而较高的无症状感染率（16%—38%）加剧了这种情况。迄今为止，主要的检测方法是通过擦拭鼻子和喉咙来收集样本。然而，该方法的应用受到其检测时间长（4—6小时）、成本高以及对专业设备和医务人员的要求的限制，特别是在资源有限的国家。　　确认新冠感染的另一种补充方法是检测新冠病毒特异性抗体。基于金纳米颗粒的测试条目前在许多国家广泛用于即时测试。它们在10到20分钟内产生灵敏且可靠的结果，但其需要使用采血装置通过手指针刺采集血样，既痛苦又增加了感染或交叉污染的风险，此外，使用的试剂盒组件也存在潜在的生物危害风险。　　东京大学工业科学研究所的研究人员解释说：“为了开发一种可避免这些缺点的微创检测方法，我们探索了对间质液进行采样和检测的想法，间质液位于人体皮肤的表皮层和真皮层中。尽管间质液中的抗体水平约为血液的15%—25%，但仍然可以检测到抗新冠病毒IgM/IgG抗体，并且间质液可作为血液采样的直接替代品。”　　在证明间质液可能适用于抗体检测后，研究人员开发了一种采样测试的创新方法。首先，研究人员开发了由聚乳酸制成的可生物降解的多孔微针，可从人体皮肤中提取间质液。然后，他们构建了一种基于纸张的免疫测定生物传感器，用于检测新冠病毒特异性抗体。通过整合这两个元素，研究人员创建了一个紧凑的贴片，能够在3分钟内现场检测抗体。

2013年6月21-22日 广州　　2012年全球销售额前10名的药物中，抗体药物占据“半壁江山”，且市场增速势头不减 在中国，乐观估计，到2015年，抗体药物市场规模将达到325亿-650亿元。对抗体药物生产企业而言，机遇和挑战并重。　　易贸医药第三届抗体药物高峰会，在两届成功召开的基础上，将于2013年6月21-22日在广州举行。在议题上，本届会议更为专注的讨论抗体治疗药物产业化。从市场概况、前期研发、药物开发、临床试验、生产工艺出发，通过总、分会场的形式，更为细致、深入的探讨抗体治疗药物在发展过程中面临的挑战。　　战略合作伙伴：　　华南新药创制中心　　广东华南新药创制中心(以下简称中心)是在广东省政府主导下，由广东省科技厅等多家政府机构及部分骨干医药企业共同出资，于2008年10月成立的科技类民办非企业机构，坐落于广州科学城。理事单位包括：广东省科学技术厅、广东省财政厅、广东省发展和改革委员会、广东省卫生厅、广东省食品药品监督管理局、广州市科技和信息化局、广州开发区、广州中大控股有限公司、广州华银医药科技有限公司、广州白云山制药股份有限公司、广州药业股份有限公司等　　主会场　　抗体药物产业发展趋势及项目合作　　分会场一　　抗体药物临床前与临床研究　　分会场二　　抗体药物的产业化流程　　2013年抗体药物高峰会发言嘉宾：　　郭亚军教授　　中国人民解放军总医院肿瘤中心主任，第二军医大学肿瘤研究所所长，抗体药物国家工程研究中心和抗体药物国家重点实验室主任　　倪健教授　　苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司董事长兼首席科学家，卫生部抗体技术重点实验室学术委员会副主任，被中央六部委(中央组织部、中央宣传部、中央统战部、人事部、教育部、科技部)评为全国留学人员先进个人及留学回国人员成就奖(国家主席胡锦涛等亲切会见)曾任二届美国华人生物医药科技协会会长(2001-2003年)，上海市优秀留学回国人才，上海市优秀学科带头人，上海市科学预见专家， 2005年享受国务院政府特殊津贴人员。　　周新华博士　　嘉和生物药业有限公司首席执行官。国际公认的著名生物制药，特别是单克隆抗体药物专家，是生物医药领域新技术创新的领军人物，是膜层析技术应用于生物医药大规模生产的先驱，单克隆抗体药物工艺病毒验证专家，曾任全球最大生物制药公司Amgen工艺开发总监，首席科学家，现担任北京大学客座教授。他是具有十多年会龄美国制药科学家学会资深会员，目前也是美国化学学会会员和美国华人生物医药协会终身会员。　　Dr. Dorothee Ambrosius　　Head Global Process Science at Boehringer-Ingelheim。Dr Ambrosius has a broad expertise in biochemistry/protein chemistry and over 15 years of experience in identification and development of novel biopharmaceutical proteins (antibodies and proteins factors) from different sources. She completed her PhD in biology at the RWTH in Aachen and joint Boehringer-Mannheim, biotechnology Research Center in 1989. She held several research management positions at Boehringer-Mannheim and Roche in the area of recombinant protein production.　　关于主办方　　易贸医药，作为易贸商务旗下独立业务，自2008年开始紧密跟踪，秉承易贸十多年来对于各个行业深入研究，并保持与业内人士紧密联系的优良传统，以专业第三方的角度，定期举办围绕市场热点的行业高端峰会，打造品牌峰会、市场调研、公关路演、商务合作等一系列活动。我们致力于增进国际与国内同行的了解，促进科研与生产企业的沟通，提升政府和产业企业的交流，借助会议的平台，在政府、企业和园区之间建一个信息共享的桥梁。　　官方网址：http://antibody.cbichina.com

前不久，重庆医科大学金艾顺教授带领新冠病毒应急攻关团队发现了三个对新冠病毒多种突变株具有广谱中和活性的超强抗体，这项最新成果发表在了国际顶级期刊《Nature Communications》上。近两年来，新冠病毒变异株不断出现，已获得紧急使用授权抗体的中和能力正在显著降低。在这样的情况下，发现新的活性强的广谱新冠中和抗体，将对新冠病毒患者的治愈乃至最终战胜新冠疫情具有重要意义。为加强新冠广谱中和活性抗体研究学术、技术交流，分享研究进展，展示创新技术，助力抗击新冠疫情，仪器信息网特别举办“新冠病毒广谱中和活性超强抗体的发现”专题讲座，诚邀生命科学、医学等各界科技工作者参与，为疫情早日结束贡献科技力量。扫码或点击报名https://insevent.instrument.com.cn/t/Y7a【会议日程】【演讲嘉宾】 金艾顺 教授（重庆医科大学基础医学院微生物与免疫学系 主任 ）金艾顺，教授，博士生导师，重庆医科大学基础医学院微生物与免疫学系主任、免疫教研室主任，肿瘤免疫基础与转化研究重庆市重点实验室主任。曾留学日本，攻读日本东京医科齿科大学分子肿瘤学并获得博士学位。2006-2014年期间，在日本富山大学医学研究部免疫学研究室兼日本SC World. Inc生物制药公司研究员，及日本学术振兴会特聘研究员（JSPS）（2011-2013）。长期从事抗体药物和T细胞受体T细胞治疗等相关免疫学技术开发，相关研究成果发表于Nature Medicine等系列高水平学术杂志上（2009，2013）。2017年被重庆市以高层次人才引进，聘为巴渝学者特聘教授，组建免疫学创新研究平台(2018年被市科技局认定为重庆市重点实验室)，与企业合作开展肿瘤免疫治疗转化应用研究。获得重庆市学科学术带头人、重庆市第一届英才计划创新领军人才。2020年新冠病毒疫情爆发时期，带领科研团队投入新冠病毒中和抗体研发应急攻关项目。在短时间内攻克重重技术瓶颈，建立了高效快速筛选中和抗体技术平台，筛选得到多株新冠病毒及突变株的高效中和抗体。相关成果发表在Nature Communication、Frontiers in immunology、Frontiers Cell and Developmental Biology、Genes & Diseases等学术期刊共10余篇，相关成果申请15项专利，其中3项国际专利。张财辉先生 （赛多利斯 生物分析产品应用科学家）赛多利斯生物分析产品应用科学家，从事蛋白药物表达纯化以及结合活性分析工作近十年。有着丰富的分子互作和troubleshooting经验。曾协助国内多家医药企业建立了基于Octet平台的药物筛选和质量属性分析方法。

从武汉大学了解到，近日，武汉大学病毒学国家重点实验室与湖北省疾病预防控制中心合作，在新型冠状病毒康复者体内中和抗体的持久性和交叉保护活性研究中取得了新进展，提出及时更新疫苗的S蛋白氨基酸序列、合理安排加强免疫的时间或是更经济可行、更科学的免疫策略，并为发展广谱新冠疫苗和抗体提供了理论依据。 据介绍，研究者收集了武汉市感染新冠病毒患者康复一年后的血清样品248份，进行了一系列的研究。研究发现，武汉市的大多数新冠康复者（包括无症状感染者和老年患者）在感染一年后体内针对SARS-CoV-2的中和抗体滴度仍处于较高水平，而中和活性与康复者的年龄、发病的严重程度、性别等的相关性并不显著。 研究还发现，大部分康复者血清中的中和抗体能有效的中和新冠病毒的野生株和英国株（B.1.1.7），而对巴西株(P.1)、立陶宛株(B.1.620)、尼日利亚株（B.1.525）、印度株(B.1.617.2)和南非株(B.1.351)的中和效果显著下降。其中，南非株在这些突变株中免疫逃逸最为显著。少数个体的血清对以上突变株都具有较强的中和作用，说明这些康复者体内存在高效的广谱中和抗体。 科研人员表示，这一结果提示可能存在广谱的SARS-CoV-2中和表位，为开发广谱中和抗体和广谱新冠疫苗带来了希望。 受体结合域（RBD）是病毒介导入侵的关键区域，研究人员测试了RBD区域内的四个关键突变位点。N501Y是英国株RBD中的唯一突变，研究人员发现这一突变未引起显著的免疫逃逸，这与英国株较弱的免疫逃逸现象相吻合。L452R/E484Q突变表现出最强的免疫逃逸，其次是E484K、K417N和L452R，说明关键的RBD突变在突变株的免疫逃逸中具有重要影响。 综上，该研究提供了可靠的证据，证明了在武汉地区大多数康复者体内的新冠病毒特异性中和抗体至少可以持续一年，且能够有效中和野生株和英国株，但是对部分突变株，尤其是南非株和印度株，其抗体中和能力出现了较大的下降。 根据研究结果，科研人员进一步提出，及时更新疫苗的S蛋白氨基酸序列、合理安排加强免疫的时间或是更经济可行、更科学的免疫策略。同时，少数康复者血清存在广谱中和活性，表明可能存在针对SARS-CoV-2的广谱中和表位，为发展广谱新冠疫苗和抗体提供了理论依据。 该研究成果近日发表在《创新》上。该研究工作得到了武汉大学新冠科技攻关专项基金、北京泰康溢彩公益基金会、国家自然科学基金新冠病毒专项等资助。

第2轮感染高峰为何预测在3到5月？华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科主任医师邢铭友1月31日在接受采访时分析，从病毒学的角度和流行病学的角度来看，“阳康”后体内抗体水平会维持3到6个月比较高的峰值，短时间内再感染的人只有2%的概率。但是我们国人口基数非常大，从去年12月开始，再过3到6个月，我们的抗体水平慢慢下降以后，这时候如果有新的病毒变异株，我们再次感染后出现临床症状的可能性非常大，仍有可能出现高峰。邢铭友教授预测，第二轮感染高峰可能会在3-5月到来，但这次高峰民众可能感觉不那么明显。由于大家感染的时间先后有差异，再加上我们第二次感染以后，由于有一个基础抗体水平的存在，第二轮感染的人数、感染症状的轻重，以及时间集中的幅度都会比第一次要弱得多。德国华裔病毒学家、埃森大学医学院病毒研究所教授陆蒙吉也在2月1日在接受采访时表示，预计从今年3月下旬开始，随着人群免疫力的下降，人群感染风险会增加，五六月份时，疫情变化会非常明显，到时候可能会面临第二波的冲击。但第二波疫情会出现在三月份还是五六月份，取决于是否会出现一种冲击力非常大的新毒株。两类人群未来或受影响大1.还在恢复身体的老人陆蒙吉教授谈到，现在很多感染过的老人正处于身体恢复期，很多体质差的人再感染一次，后果可能非常严重。这个阶段，没发生感染的部分有免疫缺陷的高危人群，也可能面临下一波疫情的冲击。2.尚未感染的人群目前受疫情影响最大的是尚未感染人群，估计在15%到20%。这和此前整体人群都易感的情况相比，影响程度已有所减少，但鉴于我国人口基数，涉及的人群规模还是很大的。我们能做什么？做好两点每个人做好自己健康的第一责任人，保持社交距离，养成良好的卫生习惯，很大程度上还是可以预防感染和二次感染。1.保持戴口罩的习惯邢铭友教授提醒，特别是在人群较密集的公共场合，必须规范佩戴口罩。普通民众常规出行规范佩戴医用外科口罩就足够。从事一些高风险岗位和环境下，感染概率增加需要佩戴N95口罩。2.三类人群优先接种疫苗由于“阳康”后6个月，我们第一次感染以后产生的抗体已经消失殆尽，这时候补种加强疫苗非常有必要。接种后可以推迟感染的时间，或者说减少感染的概率。三类人群建议优先接种：一、从事高风险岗位工作如医生、快递员等；二、有基础疾病的老年患者如糖尿病、高血压、有肿瘤或者是透析做过移植的这些患者；三、在第一次感染中出现了肺炎的表现，症状较重住院治疗过的人群，在第一次“阳康”以后6个月一定要接种加强疫苗。北京将开展人群血清抗体调查专家详解日前，北京市疾控中心副主任王全意接受媒体采访时介绍，北京市目前已建立临时人群免疫，近期发生新冠病毒感染疫情流行风险较小。为全面评估新冠病毒感染情况，了解社区人群血清抗体水平，北京市即将开展人群血清抗体调查。何为血清抗体调查？据王全意介绍，北京市人群血清抗体水平调查计划于今年2月至3月完成。该调查采取多阶段分层随机抽样调查方法，从16个辖区和经开区中选取约5000名社区人群，进行问卷调查和血清学标本采集。他表示，该研究将为未来优化资源配置和新冠防控提供参考。早在2020年，中国疾控中心就已组织完成全国新冠肺炎血清流行病学调查和分析。该调查涵盖三类地区，包括武汉市、湖北武汉之外市州、以及湖北之外六个省份（北京、辽宁、上海、江苏、广东和四川），采用抽样调查设计选取社区人群3.4万余人，通过检测调查对象的血清新冠病毒抗体，估计人群中新冠病毒的感染水平。中国疾控中心在2020年发布的《科学认识人群新冠病毒抗体流行率——全国新冠肺炎血清流行病学调查结果问答》中解释，血清流行病学调查是采用血清学方法和技术开展的流行病学调查，通过对人群血清中特异性抗原或抗体的分布规律及其影响因素的分析研究，阐明传染性疾病的发生与流行的规律，评价预防接种的效果等。为何要开展血清抗体调查？中日友好医院呼吸与危重症医学科医生王一民向中新网介绍，新冠血清抗体检测包括特异性IgM抗体和IgG抗体，发病1周内阳性率较低，恢复期IgG抗体滴度较急性期升高4倍以上可作为新冠病毒感染回顾性诊断依据。王一民还表示，抗体检测可能存在假阳性，如疫苗接种者，既往类风湿关节炎等免疫性疾病患者等，因此临床一般不单独以血清学抗体作为诊断依据，仍要结合临床表现、流行病学史及抗原或核酸检测综合判断。王一民指出，目前监测的血清IgG和IgM抗体不完全等同于感染新冠病毒后的保护性中和抗体，因此不能认为抗体滴度高度就与“保护力”有关，如果有条件的机构可以开展中和抗体检测，这一指标的高低对于指导疫苗接种，评判全体免疫保护水平及反复感染风险有一定作用。对于北京此次开展的人群血清抗体调查，王全意也表示，考虑到随着时间推移，抗体水平也会自然下降，将来根据需要，可能开展动态评估。

1890年冯˙贝林（von behring）发现了抗白喉毒素血清，发明了人工被动免疫，并提出了抗原和抗体的概念，在后续漫长的抗体研究中，人类相继发展出三代抗体制备技术：①第一代抗体：以抗原免疫高等脊椎动物制备的多克隆抗体；②第二代抗体：由杂交瘤技术产生的只针对某一种特定抗原决定簇的单克隆抗体；③第三代抗体：应用分子克隆技术、基因突变技术改造某种抗体的基因编码序列，生产出的性能更优越的抗体，也称为基因工程抗体或重组抗体。单抗的出现及其显着的优越性（特异性高、蛋白类天然产物等特性）使其在疾病的研究、诊断和治疗中得到广泛应用，但也受到人体的强烈排斥。第三代抗体的产生在一定程度上解决了由于鼠单抗的异源性导致的排斥反应。从最初的人-鼠嵌合抗体将人源化比例升到60~70%，到通过cdr嫁接技术产生的人源化比例更高的人源化抗体，再到由噬菌体展示技术获得的全人抗体，技术的发展不断提高着抗体的质量及人类对抗疾病的能力。除此之外，基因工程除了可获得全长抗体，还可获得抗体片段——小分子抗体，例如单链抗体、fab片段等。这些小分子抗体由于其独特的分子量小、组织渗透性强等特点，也被广泛应用于临床诊断及治疗。下面小编带大家看看这些重组抗体是怎么产生的：1.人-鼠嵌合抗体。用人抗体恒定区基因与小鼠单抗抗体可变区基因组合表达，形成人-鼠嵌合抗体，人源区域占比在60-70%。2.人源化抗体。因为嵌合抗体仍然有较大比例的鼠源性区域，在临床实践中仍会产生比较强烈的排斥反应。为了进一步降低鼠源性区域，产生了cdr嫁接技术（cdr grafting），该技术仅仅保留了鼠源单抗的可变区cdr区域，其他区域是人源的，得到的人源化抗体的人源化比例可高达80-90%。此处科普下cdr区域，它是抗体互补决定区（complementary determining regions，cdrs），是与抗原分子上的表位氨基酸相互作用的区域，也称高变区（hypervariable region，hvr）。后续科学家们又发展出表面重塑技术，即对鼠源抗体的可变区进行表面残基的修饰处理，以降低其免疫原性。3.全人抗体。人源化抗体虽然显着降低了异体排斥反应，然而并未完全消除，其潜在的安全隐患使得科学家不断进行探索。近年来人们将核糖体展示技术、噬菌体展示技术应用于抗体药物的研发，使得制备全人抗体成为可能。噬菌体抗体库筛选是利用噬菌体展示技术，将编码抗体可变区的基因片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合（插入信号肽与衣壳蛋白基因间），以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，利用特定蛋白/抗原进行筛选获得高亲和力可变区的抗体片段。当使用人源的免疫细胞（或组织）得到的人抗体可变区基因片段构建噬菌体库，然后利用特定抗原进行展示库的筛选，即可获得针对某抗原的人源抗体片段及对应基因序列，最后通过体外蛋白表达及筛选可得到包含人抗体重链和轻链的特异性全人抗体。4.小分子抗体通常我们所说的抗体是全长抗体，包括了轻链和重链全长，全长抗体分子分子量在150~196kda之间。这么大的分子量在实际运用中常遇到组织渗透性差、易降解等问题，为解决这些问题，科学家开发出分子量小、结合力强的抗体片段，如单链抗体、fab抗体等。4.1 单链抗体（single chain variable fragment，scfv）由抗体的重链可变区与轻链可变区连接而成，分子量仅全长抗体的1/6，具有很好的组织穿透性，在临床治疗中得到很好的应用。单链抗体由于保持了全长抗体轻链和重链的可变区，其抗原结合位点没有变化因此仍具有良好的结合特异性。另外，单链抗体的多肽接头可根据需要设计为其他位点如金属螯合位点、连接药物位点等，在临床应用中是一种强有力的工具。4.2 fab片段（antigen binding fragment，抗原结合片段）保留了抗原结合区域，分子量是抗体全长的1/3，具有较好的组织渗透性，同时因为其没有fc段故免疫原性低，常用作导向药物载体及显影等。4.3 多价抗体是能结合多个抗原的抗体，是联合基因工程技术和化学偶联技术制备的一种新型抗体。目前关注较多的“双特异性抗体”，能结合两种不同的抗原，在肿瘤免疫治疗中具有显着的优势。例如，能结合肿瘤细胞表面抗原和杀伤性ｔ细胞表面抗原的双特异性单抗，可以促使这两种细胞彼此靠近，利于杀伤性ｔ细胞杀伤肿瘤细胞，起到促进治疗的作用。

我国生物制药产业发展正处于快速上升期，而单克隆抗体药物无疑是其中表现最为活跃的组成。2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元，国内市场规模超过10亿元，并且每年以50%以上的速度递增，高于国际单抗市场的增长速度。全球重磅单抗历年销售额　　目前，我国的单克隆抗体产业已经形成了以北京、上海、西安以及武汉等产业化基地，而单克隆抗体也发展到了第四代，我国已经上市的十几个单抗药物多为鼠源性，正在研究中的多为嵌合或者人源化单抗，而全人源单抗还没有。而在全球的单克隆抗体市场，全人源化单克隆抗体是其未来的发展方向。在FDA批准上市的80多种基因工程和抗体工程产品中，抗体类产品有26种，其中18种为人源化抗体。目前基本上所以有关抗体的制药技术都被欧美国家垄断，致使国内制药企业在抗体药物研发方面备受掣肘。2012年10月23-24日，"2012生物制药工程论坛"在上海万豪虹桥大酒店召开，近二十位嘉宾就生物制药工程工艺发表了精彩的演讲，围绕生物制药研发和生产过程中的技术要点、生产关键工艺等问题与参会者展开了深入探讨。大家一致认为：我国抗体药物产业化的主要限制因素有三个方面：动物细胞大规模培养、抗体大规模纯化及药物质量分析和质量保证。　　动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点　　动物细胞大规模培养技术在抗体、重组蛋白和病毒疫苗等生物医药产品的研发和工业化生产中具有广泛的应用，动物细胞表达药物已经成为当今生物医药产业发展的主流。由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性，大大促进了动物细胞大规模培养技术的深入研究与发展。当前动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点。　　动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择，应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间，以加速其产品产业化的进程。当前，在被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是：获得最大生产力的同时注重维持产品的质量，去除所有培养环境中外源因子的污染，更为精确有效的工艺控制手段，规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。　　我国动物细胞工程行业起步晚，目前上市产品数量和种类少，工程细胞株表达水平低，工业化生产规模小，最大规模只有3000L。华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室谭文松教授在"2012生物制药工程论坛"演讲中指出：“我国动物细胞生物医药产业面临诸多瓶颈，如细胞培养生产工艺技术落后，受产能和成本制约严重 无血清培养基、生物反应器和原辅料等过分依赖进口 表达产物质量低，标准缺失 分工不够明确，产学研用合作严重不足，对相关人才培养和储备远远不够。而根本问题在于忽视工程问题，轻视工程研究。”　　针对如上问题，谭教授也提出了自己的建议，他认为：“我国应该致力于各种无血清无蛋白培养基开发和生产，加大力度进行工程细胞株的代谢工程改造以早日拥有真正属于中国的CHO工程细胞，也需加强对细胞培养过程的理解和优化，提高抗体表达速率，开发高产量、高质量的细胞培养工艺。在生物反应器放大和强化技术方面，应致力于突破千升级、万升级动物细胞生物反应器的设计、制造和操作，重视培养过程计算机实时监测和控制技术，更好地理解生物反应器中的代谢规律，满足高密度培养过程的需要。”　　北京天广实生物技术有限公司副总经理叶培在报告中也提到，在动物细胞大规模培养工艺开发过程中，需要从生产过程工艺、培养条件参数设置和罐体控制三个方面进行优化，包括设备的配置、搅拌桨设计、sparger选择和流加条件、溶解氧、气体流量、代谢产物等方面，是一个涉及到生物、化工、机械等的综合学科知识。　　抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯化工艺研究刻不容缓　　随着越来越多的生物药物得到批准和投入生产，临床使用量达到数十到数百毫克，对生产制造纯化工艺的效能和成本要求也越来越高。生物技术药物产业的发展对生产制造规模和产品纯度的要求也越来越严格。　　据统计，抗体药物开发的60%资金投入都在下游纯化工艺的建立，药物制造成本可达到售价的20-25%。上海交通大学生物制造实验室主任李荣秀教授指出：“细胞培养产率从0.1g/L提高到1g/L，可以引起下游纯化成本比例从45%到70%，这是所有生物制药企业不可忽视的一个环节。生产中可以减少纯化步骤，缩短生产周期，降低生产成本，提高生产效率，将在生物技术药物制造纯化方面发挥重要作用。”　　嘉和生物药业有限公司产品及工艺研发部总监李晓辉认为：“抗体药物下游纯化工艺的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑纯度、收率、成本、时间等因素。”　　抗体药物质量分析：QbD(质量源于设计)理念重要性凸显　　抗体药物质量检测标准的建立和验证是药物最终获得批准进入生产流通的核心环节，目前我国还没有完全形成标准，需要学术界和产业界积极配合共同制定符合标准的抗体药物质量标准。　　上海药明康德新药开发有限公司蛋白质分析及生物分析服务执行主任王少雄博士在报告中提到：“根据目前美国FDA通用的QbD理念，质量分析检测需要贯穿整个过程，对最终产品有着至关重要的影响。在抗体药物研发过程中，从细胞株构建、细胞工艺开发、纯化和制剂等环节都需要进行严格的检测，包括蛋白A高效液相法色谱滴度分析，糖基化分析，聚体分析、肽图、结合力分析、效价分析、宿主细胞DNA、残留细胞DNA、残留蛋白A等的检测。”　　QbD(质量源于设计)理念在制药领域中愈受重视　　在制药技术发展及“十二五”医药生物产业相关规划的推动下，我国抗体产业发展迅速，"2012生物制药工程论坛"演讲嘉宾们也纷纷看好抗体药物发展前景，上海药明康德新药开发有限公司副总裁陈智胜更直言：“中国生物药平台已非常成熟，在接下来的两到三年里，中国会出现世界上最新的一个单克隆抗体产品。”

由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。流式抗体的选择：1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择蕞基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。3 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE蕞强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响蕞后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。同型对照的选择：流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。同型对照选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。流式抗体使用注意事项：1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术 （采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术 则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。2、直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。3、尽量选择经实验验证的流式抗体，以保证实验结果。

日前，国家科技部公布了56家第二批企业国家重点实验室建设计划名单，华药集团抗体药物研制国家重点实验室位列其中。在抗体药物领域同时获批的还有上海张江生物技术有限公司。　　抗体药物是现代生物制药的核心组成部分，以靶向性好、疗效高、副作用小等优点日益受到重视，凭借快速的市场增长率已成为当今国际生物技术药物发展的主流。我国在此领域与国际先进水平差距巨大，攻克以抗体药物为重点的重大疾病防治和新药创制的关键技术，被列为国家中长期科技发展的战略目标之一。建设抗体药物研制国家重点实验室的目的在于，通过建立起国际水平的抗体药物开发基地，开发出具有自主知识产权的抗体药物及其生产工艺，实现我国在抗体药物开发技术领域的跨越式发展，改变我国生物技术药物低水平重复的局面。　　华北制药集团自1985年以来相继开发出基因工程乙肝疫苗、吉姆欣、吉赛欣、济脉欣等产品，并建成符合国际GMP标准的现代化模块式生物制药产业化基地金坦公司。近年又开发多个生物技术药物，其中重组人源抗狂犬病毒抗体是我国第一个具有自主知识产权的重组人源抗体，作为国家一类新药已获国家药监局临床批文 重组人血白蛋白也已进入临床申报并开始建设产业化基地。目前，华药已建成了较为完整的生物技术药物研发体系，并拥有按照国际标准建设的完整的生物技术药物质量控制及检测平台，为国内生物技术药物研发提供了与国际接轨的通道。

p　　strong01 抗肿瘤药物活体水平药效学评价/strong/pp　　Avastin/Bevacizumab通过特异性结合并阻断VEGF(血管内皮生长因子)抑制肿瘤血管生成，是世界上第一个抗肿瘤血管生成的抗体类药物。Palbociclib(帕博西尼)是针对 CDK4/6 激酶靶点的高选择性小分子抑制剂，辉瑞公司于2015年获得Palbociclib与诺华Letrozole(来曲唑)联合治疗ER+/HER2- 绝经后晚期乳腺癌的FDA药物上市审批。Docetaxel(多西他赛)为紫杉醇类传统化疗药物。/pp　　在2009年Clin Cancer Res杂志发表的文章中，辉瑞肿瘤生物部研发团队就利用IVIS小动物光学成像技术平台，将荧光素酶标记MDA-MB-435 乳腺癌细胞移植入小鼠肾包膜下，建立肾包膜肿瘤疾病活体水平动物药效学评价模型，通过观测给药后光学信号随时间的变化情况，进而评价Palbociclib (PD-991)、Avastin 和 Docetaxel三种不同药物，特定的给药途径、时间、剂量等给药策略对于肿瘤的治疗效果。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/dbd4cf41-f7bb-40ed-86ba-6666a45320cf.jpg" title="1.jpg" alt="1.jpg"//pp　　相对于触诊、肿瘤体积测量等传统方法，利用高灵敏度的生物发光成像技术进行药物评价，可以更灵敏的发现残余病灶点或尽早发现肿瘤的复发，从而更准确的对药 物治疗效果进行判定。并且利用生物发光成像技术进行药效评价的另一独特优势在于，可以明确判断药物是否有效杀死肿瘤活细胞。这是由于生物发光的原理是基于活细胞环境的酶促反应，因此，能够发光的细胞必定是具有活性的，从而避免了传统体积测定方法造成肿瘤体积无变化、内部已出现细胞死亡的检测陷阱。/pp　　针对人类顽疾癌症的治疗，多靶点联合治疗是当前的一个新思路，而小分子药物和生物大分子治疗的联合应用带来的治疗改善，给攻克癌症治疗难题也带来了新曙光。而高灵敏度的生物发光成像技术平台，以其非侵入性、快速、高效、高灵敏度等特点，也为多靶点联合治疗开启了新篇章。/pp　　strong02 免疫检验点抗体药物联合治疗研究/strong/pp　　Michael Lim等人在2017年Clinical Cancer Research杂志上的文章中，首次使用PD-1阻断抗体、TIM-3阻断抗体和传统放疗(stereotacticradiosurgery, SRS) 三种方式联合，在小鼠神经胶质瘤模型上，评价不同组合联合治疗的效果，如下图数据所示，使用三种/pp　　方式联合治疗能显著提高小鼠的生存时间，并且通过IVIS成像系统检测发现，第14天以后治疗组已检测不到GL261-luc2细胞的生物发光信号。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/019afff7-e279-40b5-8c7f-1f30623e10de.jpg" title="2.jpg" alt="2.jpg"//pp　　Ronald Blasberg等人在2016年Molecular Therapy: Oncolytics杂志上发表的文章中，使用PD-1/PD-L1阻断抗体，联合靶向PSMA的人CAR-T细胞，对小鼠前列腺癌模型(Myc-CaP:psma(+))的治疗效果。如下图中结果所示，阻断PD-1/PD-L1，使得hPSMA-CAR-Tcell免疫治疗效果增强，但是治疗反应仅仅是在短期内，表示可能存在其他的免疫调节机制，限制了CAR-T细胞靶向、功能和在hPSMA阳性肿瘤的汇集。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/99b2eeeb-6c1e-48e6-a671-eb9a9b332be7.jpg" title="3.jpg" alt="3.jpg"//pp　　strong03 荧光标记抗体药物靶向分布及代谢研究/strong/pp　　通过近红外荧光探针直接标记单抗药物，经尾静脉注射后，利用小动物活体成像检测荧光信号，而实时追踪抗体药物在体内分布、肿瘤靶向性及代谢情况。/pp　　利用近红外荧光探针直接标记抗体药物Herceptin/Trastuzumab，将XenoFluor 750-Herceptin通过尾静脉注射到HER2/neu阳性的小鼠模型体内。给药前21天使用人源前列腺癌PC-3M-luc细胞株，在免疫缺陷小鼠体内进行细胞原位移植造模，并同时用Spectrum检测生物发光信号，判断肿瘤生长状况。/pp　　XenoFluor 750-Herceptin不同剂量给药后，使用Spectrum连续检测荧光信号72h，可直观看到药物实时分布且靶向肿瘤的情况，并通过软件定量分析/pp　　肿瘤区域的荧光信号后，得到Herceptin的代谢曲线。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/5542361d-205d-469e-a29a-3bf0d2758091.jpg" title="4.jpg" alt="4.jpg"//pp　　Takuo Suzuki等人在2015年 mAbs杂志上发表的文章中，使用一种更先进的基于FRET的方法，分别标记Trastuzumab和Cetuximab，通过小动物活性成像平台检测完整抗体实时分布及抗体被降解的情况。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/c4861b20-13a9-4035-88e1-c515eaecc01b.jpg" title="5.jpg" alt="5.jpg"//pp　　以上这种FRET模型非常适合对抗体完整性、生物分布及稳定性的评价，且对Fc区域介导的ADCC效应及改造机制和抗体偶联药物设计(Antibody-Drug Conjugates, ADC)提供重要有效信息。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/d6daf28b-db0b-421c-89ad-e49cafece935.jpg" title="6.jpg" alt="6.jpg"//pp style="text-align: center "img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/9f1c32a3-dbfd-486a-9cb0-a8a850330df0.jpg" title="7.jpg" alt="7.jpg"//p

p　　2015年9月23日，Abcam plc宣布了一项业界颇具挑战性的抗体验证项目，以满足行业对抗体更高的靶标特异性的苛刻需求。/pp　　《Nature》一篇最近的文章显示，由于有些非特异的和不可靠的抗体存在，全球用于蛋白识别的大约50%的科研经费被白白浪费了。为了提升精准抗体的识别，Abcam通过提供空前规模的经过敲除验证的抗体，来推动行业标准的提高。Abcam称，客户不再需要为这些抗体付出高昂的费用，也让那些原本自己要做敲除验证的客户大大节约了时间和费用。经过此类验证的抗体很多是重组单克隆抗体，专门解决生命科学对抗体特异性和一致性的要求。/pp　　敲除验证使用不表达特定蛋白的敲除细胞株，因此是一个真正的阴性对照。Abcam有Horizon Discovery集团精准敲除验证技术的专有使用权限，确保抗体对靶标蛋白是高度特异的，为科研工作者提供值得信赖的数据，使他们能够放心地选择正确的产品，确保自己的实验结果准确。/pp　　Abcam的CEO Alan Hirzel表示：“我们尽最大努力提供最高质量的产品以及相关的支持数据。我们决定使用这些专有敲除细胞株意味着我们能给研究者更高水平的信心，确信他们正在使用的产品拥有最高水准的特异性。我们期望这些变化能为生命科学客户找回更多被浪费的经费，推动他们的研究工作。”/pp　　“我们现在已经在对常用的抗体使用基于敲除的验证，我们的目标是将这样的验证用于我们所有的产品。使用最新的敲除验证技术，这样大规模的验证已经成为可能。”/pp　　关于Abcam/pp　　Abcam plc是一家提供生命科学研究工具的公司，帮助科学家们能够在分子水平上研究细胞，提高对于健康和疾病的理解和认识。/p

单克隆抗体(mAb)是制药行业增长最快的治疗方法之一，mAb的高阶结构(HOS)影响药物与靶标的结合特异性，从而影响治疗效果和副作用。若储存而导致HOS发生变化，例如蛋白质错误折叠和聚集，会导致稳定性降低、功效丧失或可能的免疫原性。因此，监测HOS对保证mAb疗法的有效性和安全性至关重要。X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱可以提供原子级分辨率，但存在费时费样品的缺点；生物物理技术，如差示扫描量热法(DSC)、动态光散射(DLS)、荧光光谱、红外(IR)光谱和圆二色(CD)光谱只能提供低分辨率的整体构象。焦碳酸二乙酯(DEPC)作为亲电子试剂能够修饰溶剂可接近的亲核侧链（Cys、His、Lys、Thr、Tyr、Ser）和蛋白质的N末端，这些残基产生的羧基化产物具有+72.021Da的质量转移，经过蛋白水解消化、液相色谱分离和串联质谱分析后，可以识别和半定量特定的蛋白质修饰位点。将一种条件（例如天然）与另一种条件（例如加热）进行比较时，特定残基处共价标记程度的变化可用于探测蛋白质的HOS变化（图1）。在这篇文章中，作者使用DEPC共价标记联用质谱，以利妥昔单抗作为单抗药物的模型，以期在远低于mAb治疗药物熔点的温度下能够特异性检测细微HOS变化，并通过活性测定进行验证。图1. DEPC 标记与质谱联用分析单抗药物结构的流程在通过共价标记研究热应力（heat stressed）利妥昔单抗之前，作者使用CD光谱、荧光光谱和动态光散射(DLS)来识别加热对蛋白质结构的干扰。发现当在低于其熔点的温度下加热利妥昔单抗4小时时，这三种技术在45°C或55°C时无法检测到显著的结构变化，而在65°C时仅显示出轻微的变化。随后作者团队使用DEPC CL-MS探测利妥昔单抗的细微结构变化。在45°C压力下的利妥昔单抗样品中发现DEPC标记水平的变化较少，大多数变化是由于蛋白质受热去折叠导致的标记增加（图2），且可变区的变化远少于恒定区。超过70%的标记变化发生在Tyr、Ser和Thr残基处，而发生在His和Lys残基处的标记变化始终小于20%。标记变化表明，45°C时的结构变化主要是局部微环境的变化，而非溶剂可及性差异显著的大结构变化，也就是说修饰位点分散在整个蛋白质结构中，而不是集中在蛋白质的某些区域。图2. 45°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。活性测定能反映一定程度的结构变化对利妥昔单抗活性的影响，从而验证DEPC标记结果。桥接ELISA的结果表明，在预热至45°C后，利妥昔单抗的Fc结合活性没有显著变化（图3a），Fc区域的CDC活性估计在45°C热应激后保持不变（图3b），利妥昔单抗的Fab结合活性估计与对照样品没有差异（图3c）。活性测定结果表明蛋白质在45°C时没有发生显著的结构变化。在Fab和Fc区域中标记变化的残基数量相对较少，主要标记对局部微环境变化更敏感的Tyr、Ser和Thr残基。修饰位点分散在整个蛋白质中，对Fab和Fc区域的构象几乎没有影响，与共价标记质谱联用的测定结果相吻合。图3.使用单抗活性测定验证CL-MS实验揭示的结构变化。Fc区的结构完整性通过(a)测量Fc与捕获抗体结合的利妥昔单抗桥接ELISA和(b)测量补体依赖性细胞毒性的Alamarblue测定来评估。Fab区域的结构完整性通过(c)Raji细胞下拉试验评估，测量Fab与B细胞CD20抗原的结合。55°C加热4h后利妥昔单抗所有结构域的残基修饰程度都发生了显著的变化，尤其是Fab区域的VH和VL结构域。（图4）加热至55°C时，His和Lys残基处发生的标记变化几乎是45°C的两倍，表明蛋白质在这些区域展开；Fab区域标记水平发生显著变化，特别是在VH、VL和CL域。这表明利妥昔单抗的Fab区域存在局部结构变化，据报道这也是IgG1分子中对热应激最敏感的区域。Fc区域中没有观察到类似的发生标记变化的残基聚集，Tyr、Ser和Thr处的大多数标记变化为中度或高度变化，这些结果表明蛋白质拓扑结构可能发生变化。图4. 55°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。尺寸排阻色谱(SEC)测量表明在65°C加热条件下存在高分子量物质。将DEPC CL-MS方法应用于65°C热应力的利妥昔单抗后，发现所有利妥昔单抗结构域的标记发生显著变化（图5），主要体现为标记的减少，这可能是因为蛋白质聚集。利妥昔单抗的Fab和Fc区均发现标记减少的残基簇，活性测定结果显示Fc结合和CDC活性的降低（图3），说明了Fc区特别是CH3结构域的标记变化，与DEPC标记结果一致。图5. 65°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。总结DEPC标记技术的结构分辨率和灵敏度足以探测细微的蛋白质构象变化，该技术与质谱联用可在低于Tm的温度下揭示利妥昔单抗中的细微HOS变化，与经典的生物物理技术互补。总体而言，鉴于CL-MS简便、灵敏的特点，该方法将适用其他抗体药物的结构研究。

SHIMSEN Ankylo Protein A在单克隆抗体（单抗）药物的生产过程中，需要测定细胞培养上清液中的单抗滴度或者浓度，以筛选出高产品的单抗药物。岛津最新推出SHIMSEN Ankylo Protein A色谱柱，采用高交联度PS/DVB基质，键合重组Protein A蛋白，适用于单克隆抗体（mAb）和Fc融合蛋白的高速效价分析。极强耐碱性高载样量吸附低、优异的重现性峰形对称 优异的重现性良好的重现性吸附低、优异的线性高载样量产品信息SHIMSEN Ankylo Protein A(15μm,2.1x30 mm)货号: 380-01215-74立即询价点击立即查看最新药斯卡排行榜

应用专家 赵梦路 抗体药物在免疫、肿瘤治疗等多种应用中发挥越来越重要的作用，研究机构预测到2025年抗体药物市场规模将达到3000亿美元[1]，下图中红色代表2018年使用量最多的10种抗体药物。图1 时间轴显示从1975年开始研发成功的治疗性抗体及应用虽然抗体药物市场巨大，但是每年通过FDA审核并成功上市的治疗性抗体依然非常少，从下图可以看出，上市药物少的很大原因是治疗性抗体药物研发存在流程复杂、体外和体内药效验证困难等原因。图2 治疗性抗体药物临床前研究路线下图可以看出传统药物筛选流程中没有影像学方法，整个研发数据单一，必须拿到上一步的结果方可进行下一步的研究。而影像学方法可以进行高通量筛选，允许同时评估多个抗体分子的效力和毒性，最关键一点是影像学方法在药物筛选早期就可以拿到药物有无毒性作用，可以预测药物在人体的毒副作用，为更好的进行临床研究提供数据支持[2]。图3 药物序列筛选和并行筛选Leica THUNDER 3D极速高内涵活细胞培养成像系统是Leica全新研发的宽场快速高分辨荧光成像系统，拥有成像速度快、分辨率高、应用范围广、光毒性低和Navigator高通量采集与自动化处理数据等优点。 优势一 成像速度快适合高通量快速筛选，视频中使用THUNDER拍摄96孔板，每孔三色荧光成像加10层 Z stack，最终3.5分钟即可全部采集完成。视频1 THUNDER快速多通道荧光数据采集 视频2 THUNDER自定义采集参数和随机性设置高速多通道采集只是获取数据的第一步，自动化分析数据才能高效的获取结果。THUNDER可在Navigator流程中添加自动分析步骤，让数据采集完成自动进入分析流程，最终将结果直接呈现出来，图4 Navigator高通量采集后自动进入分析模块 优势二 高分辨率传统宽场成像虽然可以快速采集数据，但是由于固有的光学结构无法有效滤除非焦信号造成的信号模糊、信噪比差，而点扫描共聚焦又受限于成像速度慢无法满足高通量筛选的需求。THUNDER快速高分辨荧光成像系统，基于宽场成像一次拍照即可达到136nm的超高分辨率成像，THUNDER在满足成像速度的同时具备高分辨率优势，超高分辨率和高信噪比图像使后期结构辨别、弱信号定量分析成为可能。图5 THUNDER分辨细胞核中的DNA损伤位点传统宽场显微镜由于非焦信号干扰和衍射极限的限制，无法分辨300nm以内距离较近的信号。图5中的观察病毒侵入细胞核中造成的损伤位点（黄色点信号），由于THUNDER在XY轴拥有136nm的超高分辨率，因此可以清楚分辨靠的比较近的损伤点，这一THUNDER图像可以进行更加准确的定量分析。图6 神经细胞离体3D培养在药物研究领域，经常需要验证药物分子对细胞结构及存活的影响。THUNDER图像具有高分辨率优势，可以在药物作用早期即可观察到细胞精细结构的改变，从而更灵敏的捕获药物对细胞生长增殖的影响，为后期临床研究提供数据支持。图7 高信噪比图像助力细胞计数分析图像模糊，信噪比不足一直都是图像后期分析的难题，THUNDER技术在细胞高通量计数分析方面，拥有天然的优势，高分辨和高信噪比的图像大大简化了后期分析难度，可以更方便的进行自动分析。 优势三 应用广，适用细胞和模式动物随着技术的进步，抗体药物临床前研究已经不再局限在单细胞水平的疗效验证，而是涌现出越来越多的新技术渗透到活性分子的筛选中。由于抗体药物在离体细胞中的代谢与在体内情况有很大不同，如何缩小作用环境的差距成为时下研究的热点，比如可以通过类器官的构建来研究和体内相似的微环境及渗透屏障，可以在斑马、鱼线虫等模式动物活体水平研究抗体药物在体内环境的靶向性等等。这样一系列复杂的模型都需要一种观察深度大、应用范围广的成像技术，THUNDER恰好可以满足这些需求。视频3 Pseudoislets （pancreatic beta cells）(pancreatic beta cMIN6 cells grown as pseudoislets ells). DAPI (blue), Insulin (Alexa488, green), membrane receptor (Alexa594, red), phalloidin (Alexa647, white).Sample courtesy Dr. Rémy Bonnavion, MPI for Heart and Lung Research, Bad Nauheim视频中胰岛类器官由于具有三维立体结构，所以荧光显微镜无法分辨胰岛素分泌的具体情况，THUNDER高分辨成像解决了这一难题，同时THUNDER拍摄深度深的优点也让整个类器官都可以清楚的观察。视频4 Lung Organoid Mouse lung organoids derived from alveola stem and progenitor cells20x Air through 1mm plastic bottomSample courtesy Dr. Pumaree Kanrai, MPI for Heart and Lung Research, Bad Nauheim (Germany).肺类器官是培养中普通塑料培养板中的样本，从参数可以看出THUNDER成像不仅可以清楚分辨肺泡细胞的位置，而且使用厚底培养容器和长工作距离物镜不影响THUNDER高分辨拍摄，因此THUNDER可以拍摄几乎所有培养容器，覆盖单细胞到大体积类器官样本，具有非常广泛的应用范围。图8 线虫模式动物THUNDER成像图9 线虫体细胞计数自动分析在模式动物成像方面，THUNDER依然可以做到体细胞水平的成像，并且在大尺度深度采集后可以自动进行计数分析，方便评估药物在体内代谢和对体细胞的毒性作用。总结THUNDER是Leica专利的超高分辨、高信噪比快速荧光成像系统，可以覆盖单细胞、组织、类器官和活体动物等大部分研究领域。由于THUNDER具有快速高分辨的特点，因此所以可助力抗体药物临床前研究，可应用于治疗性抗体药物的体外细胞水平药效筛选和体内活性药效验证等试验，可助力抗体药物活性筛选、杀伤效果验证、早期细胞毒性发现等方面研究。针对抗体研究中细胞遇到的细胞、类器官和活体模式动物等样本，THUNDER倒置平台和体视镜平台可以完美的覆盖。而在分子水平，由于传统光学衍射限制，无法直接观察分子间的结合及相互作用强弱，Leica FALCON可以提供FLIM-FRET方案，可以超越衍射极限限制，实现分子水平相互作用检测。基于荧光寿命系统的FRET检测不受荧光染色、漂白等强度因素影响，可以更加精准的检测分子间的相互作用。参考文献：1. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Luet al. Journal of Biomedical Science(2020) 27:1 2. Cellular imaging in drug discovery. NATURE REVIEWS | DRUG DISCOVERY(2006)343:5

p　　随着引领第二次生物医药产品浪潮的“单克隆抗体”的出现，抗体研发的一切正在慢慢改变。在抗体工程药物中，肿瘤抗体药物更是异军突起，独占一半天下，单克隆抗体药物以其独特的作用机制及高效性，在抗恶性肿瘤的治疗中发挥了不可估量的重要作用。目前，单克隆抗体已广泛应用于肿瘤的临床治疗，本文主要从抗体药物的发展、面临的挑战以及如何解决等方面进行了详细的分析。/ppstrong　　抗体药物的前世今生/strong/pp　　和各种重大革命性技术的发展一样，抗体的研究也是经历了漫长岁月。直到Kohler和Milstein在1975年创建了淋巴细胞的杂交瘤技术并获得了专一识别抗原位并与之特异结合的单克隆抗体，才受到了相关领域学者们的高度重视。两位科学家因此被授予1984年的诺贝尔生理学或医学奖。/pp　　然而，由于通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体是鼠源性的，应用于人体不可避免地引起人抗鼠抗体(HAMA)反应，限制了单克隆抗体的临床应用。/pp　　为了克服这种缺陷，20世纪80年代中期研究者们寻求以基因工程技术对鼠源性单克隆抗体进行改造，尝试对其人源化处理。如将鼠源抗体可变区与人抗体恒定区拼接而形成嵌合抗体或将鼠抗体可变区的互补决定区(CDR区)与人的抗体的互补决定区互换构成人源化抗体等。/pp　　以上抗体技术的建立，基本解决了抗体药物异源性的问题，促进了抗体药物的广泛应用。迄今美国FDA已经批准上市了几十种治疗性抗体药物，抗体产业增长迅猛，产生了巨大的社会效益和经济效益。目前国内外处于临床前、临床研究的各类生物技术药物中也以抗体类制品最多，其中则以抗肿瘤抗体药物最多。/pp　　这其中除了单抗之外，新型抗体的开发也各施所长，其中包括双特异性抗体以及抗体偶联药物(ADC)。就开发热点而言，当然要数PD-1/PD-L1单抗、ADC药物、以及双特异性抗体了。目前，全球抗体药物产业已经步入了强劲发展的时代，与此同时，抗体技术的发展也面临着诸多挑战。无论是在抗体靶标和新抗体基因发现，还是在新抗体药物的研发和产品种类等方面，很多问题都亟待解决。在此，小编做了详细的总结。主要分为以下几个方面。/ppstrong　　筛选肿瘤治疗新靶点/strong/pp　　与传统的小分子药物相比，抗体的靶点数量相对要少的很多。这主要首先由于抗体本身的性质。一般来说，抗体分子的分子量较大，结构复杂，绝大多数抗体只能对位于细胞膜表面及分泌出来的分子发挥作用，而对于细胞内的分子则很难产生功效。/pp style="text-align: center "img title="001.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/3fbc9274-4de1-4a6d-acf5-dc8ffbcad09f.jpg"//pp style="text-align: center "strong针对不同靶标的抗体/strong/pp　　目前，在已经批准的抗体药物中仅有27个靶标。其中7个靶标分别有两个或两个以上的抗体药物，共计18个。其中5个靶标(TNF、CD20、VEGF、HER2、EGFR)所对应的抗体药物多数为重磅炸弹药物，共计10个。在2014-2017新上市的抗体中，几个特殊靶点已引发重大波澜，诸如CTLA-4、PD-1/PD-L1等都成了重磅炸弹的诞生地。其中以PD-1/PD-L1为靶点的抗体作为肿瘤免疫治疗中的先锋队更是各个公司追逐的热点。/pp　　多家国际巨头公司已在该领域做了充足的准备，包括辉瑞，安进，赛诺菲，再生元、罗氏、诺华、礼来、阿斯利康等。该靶点也必然引起新一轮的腥风血雨。但总体来说，抗体靶标十分有限，所以说，在研发的候选抗体药物中，新靶点和新适应证抗体是药物研发团队首要追求的目标 其次是老靶点的深度开发。/ppstrong　　降低抗体的免疫原性/strong/pp　　最早通过杂交瘤技术制备的鼠源性单克隆抗体，应用于人体会不可避免地引起人抗鼠抗体(HAMA)反应。随着基因工程技术的发展，研究人员开始对鼠源性单克隆抗体进行改造，尝试对其人源化处理以解决单克隆抗体的这种缺陷。可分为嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。试图通过增加其可变区序列与人胚系基因的同源性来降低它们的预期免疫原性。/pp style="text-align: center "img title="002.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/d4eabd2b-11a8-492c-b317-7b62d2129725.jpg"//pp style="text-align: center "strong鼠源性到完全人源化抗体/strong/pp　　嵌合抗体成功的例子包括罗氏公司的抗 CD20 抗体Rituxan，其用于治疗B 淋巴瘤。它的抗淋巴瘤作用主要来自于补体作用、ADCC作用和诱导肿瘤细胞凋亡。因为人鼠嵌合抗体仅仅消除了鼠源单抗的部分异源性，未经改造的可变区的鼠源序列依然可以诱导人体产生HAMA反应，因此对鼠源抗体可变区的进一步进行人源化改造是必然趋势。/pp　　通过研究大量小鼠抗体可变区序列，截取可变区中与抗原直接接触的序列与人抗体可变区的框架区嫁接，经过亲和力重塑，可在极大程度上保持亲本抗体的特异性和亲和力，同时在人鼠嵌合抗体的基础上进一步消除免疫原性和毒副作用。人源化抗体成功的例子包括罗氏的Herceptin，其用于治疗HER-2过度表达的转移性乳腺癌。/pp　　不容置疑，完全人源化抗体绝对是最理想抗体，其可以达到完全避免鼠源性单抗的种种缺点。目前主要通过抗体库技术以及转基因小鼠技术等方法来进行生产。/ppstrong　　新型抗体药物/strong/pp　　抗体偶联药物(ADC)、双特异性抗体以及PD-1/PD-L1单抗绝对算的上是抗体圈的明星产品了。/pp　　ADC由单克隆抗体与有治疗作用的小分子药物两部分构成，借助抗体实现化学药物对肿瘤组织的靶向递送。ADC 在血液中稳定性高，药物分子不会脱落，因而毒副作用较小，但对肿瘤细胞的抑制作用远远高于裸抗体。这种设计策略既可提高抗体药物的杀伤能力，又提高小分子化学药物的治疗窗。/pp style="text-align: center "img title="003.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/c110a3a2-3d90-4c38-ab72-7b6cdd3ecafa.jpg"//pp style="text-align: center "strong双特异性抗体/strong/pp　　传统抗体药物通过封闭单一信号通路抑制肿瘤生长，临床上易出现抗体药物的耐药性。所以双特异性抗体(BsAb)应运而生，其通过基因工程手段将两个分别靶向不同抗原的抗体片段组合在一起，具有两种抗原结合位点，可以发挥协同作用，进而提高治疗效果。这种结构设计能有效地改善抗体药物在体内的药物代谢动力学过程，增强临床治疗效果。然而，设计出疗效好、稳定性高且利于生产的BsAb仍需深入研究。/pp　　除了ADC和BsAb之外，肿瘤免疫治疗抗体药物也是火的不行。近几年，针对免疫检验点的PD-1/PD-L1单抗治疗不断在癌症治疗中取得突破性进展，尤其在黑色素瘤、肺癌、肾癌及膀胱癌等多种肿瘤的治疗中显示出很好的疗效，初步实现了利用免疫方法治疗肿瘤的梦想。/ppstrong　　抗体组技术和抗体组药物/strong/pp　　抗体组技术是在基因组学和蛋白组学基础上，结合杂交瘤技术及基因工程抗体技术，经过抗体靶标高通量筛选、建立大规模抗体库，最终走向应用。相比传统的单克隆抗体技术相比，抗体库技术，具有库容量大、可筛选种类多、更易获得针对特定抗原表位的高活性单克隆抗体等无以替代的优势。同时抗体库技术在筛选过程中，更为省时、省力、高效、经济。/pp style="text-align: center "img title="004.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/7cd75911-64ed-4a38-aa94-c1179ab902e0.jpg"//pp style="text-align: center "strong抗体库技术/strong/pp　　目前抗体库根据其宿主免疫状态来说，主要分为天然库和免疫库两大类。天然库从理论上来说可以筛选获得可与任何抗原特异结合的的抗体，同时人抗体库可以直接产生全人的抗体V区基因，避免了后续的繁琐的人源化过程，但这些天然抗体基因缺乏体内的重排与突变过程，因而很难获得高亲和的抗体，所筛选的抗体往往需要进一步的亲和力成熟改造，而且同时筛选背景较高，针对特定抗原的抗体丰度低。/pp　　相比较而言，免疫库中则含有大量针对该特定抗原的抗体，其筛选背景大大降低，并且这些抗体基因经过在宿主体内的成熟过程，往往具理想的亲和力。/pp　　小鼠目前依然是最容易进行免疫和其后续进行基因工程操作的动物品种，然而通过小鼠抗体库获得的依然是鼠抗体V区基因，想使其安全用于临床，还必须进行后续的人源化改造。近两年发展的全人抗体的转基因小鼠技术，使得我们可以通过转有全套人抗体基因的转基因小鼠来制备人的免疫抗体库，并从中直接筛选具有治疗价值全人的抗体V区基因，无需人源化的改造。/ppstrong　　国内抗体药物产业如何突破瓶颈/strong/pp　　在全球抗体药物产业强劲发展的浪潮中，国内抗体药物产业也已经实现了从基础研究到产业化的跨越，抗体的产品逐渐增多，市场逐渐扩大。尽管我国抗体药物产业近年来发展迅速，但国产抗体药物的技术水平及市场占有率与国际先进水平仍有较大差距。/pp　　中国抗体药物上市以及原始创新产品开发都面临着严重不足的问题。无论是已上市销售的还是正在注册研究的抗体药物，国内企业在抗体靶标和新抗体基因发现、新抗体药物创制、产品种类等诸多方面都亟待提升。/pp style="text-align: center "img title="005.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/35b205bb-cafe-410d-88f4-0541881c8198.jpg"//pp style="text-align: center "strongCustom mAb/strong/pp　　要实现抗体药物产业发展的突破，应该结合抗体药物相关的产学研医用现状资源禀赋及医疗服务的需求，选定未来重点发展领域及其对应的产品方向，重点支持和引导相关领域目标性抗体药物产品的开发。加强研发平台建设、提升抗体药物自主研发、CRO、CMO及产业化水平，达到与欧美先进国家同步，打破国外医药巨头对我国抗体药物的市场垄断，增强我国在国际抗体药物领域的综合竞争优势。/p

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上的文章，Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting 1。该文章的通讯作者是美国百时美施贵宝的Jason M. Hogan研究员。抗体药物结合表位的测定是药物开发的重要环节。抗体的结合位点决定了它的药理学和药代动力学特性。本文采用化学印迹法结合质谱技术对MICA蛋白上的抗体结合表位进行了测定，单残基水平的分辨率能够展现更精细的结构信息。作者选择了两种包含有双吖丙啶基团的光催化标记试剂TDBA和3-azibutanol（如图1AB中的化学结构式）。在紫外光照射下，双吖丙啶基团会形成较高反应活性的卡宾中间体插入到氨基酸的X-H键中（X=C, O, N, S）中，进而实现较高水平的标记序列覆盖和结构分辨率。值得注意的是，TDBA和3-azibutanol在分子尺寸、极性以及对不同氨基酸的反应活性上都存在差异，因此两种试剂获得标记结果往往能展现一些互补的结构信息。作者首先对MICA与Fab-1的互作表位进行了测定。由于同一条肽段存在多个标记位点，每个位点的标记比例变化也不一样，所以肽段水平的标记往往反映是该肽段连带区域结构平均化的结果。图1AB为MICA与Fab-1结合后标记比例的变化。在MICA α3结构域中，共有34个残基被TDBA试剂修饰(图1A)。在这些残基中，发现18个位点的标记量在与Fab-1形成复合物后显著性地下降，3个位点的标记量显示出增加。如果按照肽段标记水平的变化来看，其中5个位点的结构变化信息则会被掩盖。相较于肽段标记量变化，计算单个残基的标记量变化能将抗体结合表位锁定到更精确的位置。将标记量下降的残基映射到MICA蛋白晶体结构上(图1C)，可以观测到大多数受保护的残基在α3结构域上形成了一个连续的表面。其中一个残基Q278显示出标记量增加，并且靠近TDBA定位的表位，表明它可能位于表位边缘或附近。其余差异标记残基位于远离表位的区域，可能是Fab-1结合时蛋白质结构构象变化导致的结果。在3-azibutanol的实验中，复合物形成后仅显示5个标记量显著性下降的残基和2个增加的残基(图1B)。四个标记量下降的残基R279、Y283、E285和H290在TDBA标记实验也观察到。两种标记试剂的测定结果可以相互验证，同时互相补充。3-azibutanol定位的表位覆盖了TDBA表位中的两个不连续区域(图1D)。整合两种标记试剂定位的表位区（图1E），对比X-射线晶体学测定的表位（图1F）发现大多数通过卡宾化学标记鉴定的表位残基被晶体结构证实，其余残基则位于晶体学表位外围的8 Å范围内。以上结果均说明卡宾化学印记法在测定抗体结合表位上具有较高的准确性。图1 MICA与Fab-1的互作表位测定：A)TDBA, B) 3-azibutanol实验标记量的变化；使用C) TDBA, D) 3-azibutanol 定位的表位；E)整合标记试剂测定的表位；F) X-射线晶体学测定的表位。鉴于此，作者将卡宾化学印记法应用到了其他候选Fab与MICA结合表位的测定上。在实验开始之前，作者首先用生物膜层干涉（BLI）技术对几个Fab在MICA上的竞争结合关系进行了考察。如图2A所示，Fab3、Fab4、Fab5存在着竞争结合，表明它们结合的表位一致或表位之间存在重叠。而Fab1、Fab2与MICA结合相对独立，不受其他Fab的干扰，说明Fab1和Fab2都具有各自单独的结合表位。尽管生物膜干涉能够展现各个Fab结合表位的位置关系，但却无法实现更高分辨的定位。表面标记法则能很好地解决此问题。如图2B-G，通过卡宾化学印迹法的测定6个Fab的结合表位都实现了准确定位，位置接近或重叠的表位则会产生竞争结合，因此更精准地解释了Fab间的竞争关系。此外，作者还将卡宾化学印记法应用到了完整抗体Ipilimumab与CTLA-4结合表位的测定（图3），卡宾化学印迹法依旧展现出较高的分辨率，准确描绘出了Ipilimumab与CTLA-4结合表位轮廓。图2 A）通过生物膜层干涉测定6个Fab的竞争结合关系；B-G）卡宾化学印记法测定6个Fab的表位图3 卡宾化学印记法测定全长抗体Ipilimumab与CTLA-4互作表位总之，使用卡宾化学印迹可以快速定位抗体结合表位，以支持抗体药物的开发。两种标记试剂的使用增加了蛋白复合物表面标记残基的覆盖率，可提供互补结构信息。残基水平的标记细化了相互作用表面并且能够区分与结合表位不相关的远端调控。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting参考文献1. Hogan JM, Lee PS, Wong SC, et al. Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting. Anal Chem. 2023 95(8):3922-3931.