利妥昔单抗

曲妥珠单抗是一种抗 Her2 的重组 DNA 衍生的人源化单克隆抗体，它通过将自己附着在 Her2 上来阻止人体表皮生长因子在 Her2 上的附着，从而阻断癌细胞的生长，曲妥珠单抗还可以刺激身体自身的免疫细胞去摧毁癌细胞。随着曲妥珠单抗在临床的广泛应用，对该药物在人体血浆中定量检测的精密度和准确度要求也日益提高。 随着液相色谱和质谱技术以及生物样品分离技术的发展，LC-MS/MS 定量技术在蛋白质定量研究中的应用日益广泛。相对于传统的免疫分析方法（例如 ELISA），LC-MS/MS定量技术提高了蛋白分析的精密度和准确度。基于质谱法的蛋白定量在抗体药物临床前及临床研究中受到越来越多的关注，为了使蛋白质定量技术与药物研究和临床检验更加紧密结合，岛津公司将其超快速液相色谱-质谱联用平台和强大的定量蛋白质组学软件 Skyline集成一体。根据蛋白质序列和用户自定义，Skyline 软件可以用来设计、改善以及优化选择反应监测(SRM)/多反应监测(MRM)、全扫描质谱和串联质谱定量法。Skyline 软件不仅将结果和方法优化结合起来，也为蛋白质定量的研究工作提供了标准化的工作流程。同时岛津研发工程师们为简化复杂生物基质中抗体药物的定量分析工作，对抗体药物前处理过程进行了独特的设计，发明了 nSMOL 前处理试剂包，该方法能够有效富集血浆/血清中的抗体药物，实现 Fab 区域的选择性酶解，提高酶解效率，极大降低了酶解产物的复杂性，对于复杂生物基质中抗体药物的准确定量提供了非常有利的工具。 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060与Skyline软件联用建立血浆中曲妥珠单抗定量分析的工作流程。结合nSMOL前处理技术，实现抗体药物 Fab 区域选择性酶解，从而显著降低了方法开发的复杂程度。在本实验筛选阶段，共有 10 个肽段具有明显的色谱峰，其中 8 条肽段与曲妥珠单抗的 Fab 区域相关，而曲妥珠单抗具有代表性的特异性肽段集中于 Fab 区域，充分体现了 nSMOL 技术的高选择性，从而极大地降低了酶解产物的复杂性，提高方法开发的速度。实验通过 Skyline 软件完成MRM 通道的设计和方法的输出，LabSolutions 基于 Skyline 导出的 MRM 分析方法，进行肽段筛选、碰撞能量优化，最终确认曲妥珠单抗的特征肽段及其对应的 MRM 离子对。基于以上所建立的方法，本文完成血浆中曲妥珠单抗药物的定量分析方法开发，定量特征肽段为IYPTNGYTR（542.80404.70），线性范围为 0.122 μg/mL~125 μg/mL。 了解详情，敬请点击《基于nSMOL 技术和Skyline 软件的曲妥珠单抗LC-MS/MS定量分析方法开发》 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/。岛津官方微博地址http://weibo.com/chinashimadzu。岛津微信平台

2018 年，关于肿瘤免疫的那些事儿6 月：国内首款 PD-1 单克隆抗体药物获批，中国跨入肿瘤免疫时代10 月：诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯艾利森 (James Allison) 与日本科学家本庶佑 (Tasuku Honjo) ，以表彰他们在癌症免疫治疗方面所做出的贡献12 月：国内首款国产 PD-1 单克隆抗体药物获批，开启肿瘤免疫治疗“亲民”时代肿瘤免疫治疗的火爆让单克隆抗体药物（下文简称单抗）的研究越来越受到关注，今天我们就来聊聊单抗的一大特性——电荷异质性。抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白，而单抗是由单一 B 细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。同其它蛋白一样，单抗常常存在广泛的翻译后修饰和降解，如糖基化、碳端赖氨酸丢失、脱酰胺化、二硫键错配、糖化和氧化等。几乎这些所有的翻译后修饰都会直接或间接的引起单抗表面电荷的变化，这就是单抗的电荷异质性。电荷异质性影响单抗的体外及体内的活性、安全性、可行性和质量，在新药研发和生物类似药的开发中都非常重要。电荷异质性的检测通常采用基于电荷分离的技术手段，如离子交换色谱、毛细管等电聚焦（CIEF），以及成像毛细管等电聚焦（iCIEF）等。与主峰 (Main peak) 相比，这些变异体峰通常被称为酸性峰 (Acidic variants) 和碱性峰 (Basic variants) 。大部分的人源 IgGs 具有碱性的等电点，因此，阳离子交换色谱通常被用于分离。在主峰前面的峰通常称为酸性峰，因为其带有的正电荷较少，洗脱较快；在主峰后面的峰称为碱性峰。酸碱峰的鉴定采用离线收集鉴定或多维液相-质谱联机在线鉴定。图 1. 阳离子交换色谱分离酸碱峰示例图毛细管等电聚焦（CIEF）是电荷异质性表征的主要手段，但采用 CIEF 分离时收集馏分用于鉴定非常困难，所以 CIEF 通常用于监控电荷异质性而不能用于表征。质谱检测虽然广泛应用于单抗的表征，但是将 CIEF 和 MS 联机一直是非常大的挑战。质谱在线检测的缺失也限制了 CIEF 在蛋白电荷异质性的表征上的应用。将 CIEF 分离的高分辨特性和质谱的表征能力结合起来是电荷异质性表征迫切需要的技术。Agilent 7100 CE-QTOF 联机的特点无与伦比的毛细管分离的分辨率：甘油改性剂降低非 CIEF 电泳迁移和区带展宽两性电解质：兼顾电泳分辨率和质谱灵敏度质谱友好的阳极液和阴极液优化的鞘流液组成：有效的聚焦、迁移和电喷雾离子化纳流级别的鞘流液流速：基于电渗流技术的纳流鞘流液最大限度提高检测灵敏度优化的 CIEF 运行参数：进样量、电场强度、压力灵敏度高、抗污染的质谱：Agilent 6200 系列 TOF，6500 系列 Q-TOF图 2. Agilent 7100 CE-QTOF 联机图CIEF-MS 的方法可行性及卓越表现采用等电点标记物（pI markers）进行验证，等电点和迁移时间之间具有良好的线性相关性 (R^2=0.99)。此外，CIEF-MS 方法采集的四种单抗的电荷变异体分离的轮廓图也通过成像毛细管等电聚焦紫外方法比对验证一致。pI markers 的绝对迁移时间的相对标准偏差小于 5%（n=4）。贝伐单抗三次进样的相对迁移时间 RSD 小于 1%，绝对迁移时间小于 2.3%，峰面积的 RSD 小于 7%。并且，单抗的电荷变异体可通过质谱直接测得其分子量。CIEF-MS 采集的电荷变异体轮廓分布和 iCIEF-UV 检测具有高度的一致性。iCIEF-UV 通过全柱成像检测去除了等电聚焦后分析物迁移到检测器端的步骤，CIEF-MS 和 iCIEF-UV 检测结果的高度一致性证明了在线 CIEF-MS 分析单抗电荷变异体史无前例的高分辨率。除了高分辨率之外，该方法具有非常好的重现性。CIEF-MS 电荷异质性分析的应用实例大集结贝伐珠单抗的分析CIEF-MS 和 iCIEF-UV 分析得到的酸碱峰比例接近，分别为酸性峰: 主峰: 碱性峰= 23% : 72% : 5% 和 27% : 68% : 5%。除了 CE 的高分离度之外，质谱数据优异的原始谱图是实验分析制胜的关键，尤其是在鉴定跟主峰质量差别很小的变异体时，如在分析一个脱酰胺 (+1Da) 质量差时，一款性能优异的质谱是 CIEF-MS 分析的必备之选。贝伐珠单抗的主峰分子量为 149 202 Da，碱性峰 B1 和主峰之间的质量差为 +128 Da，和碳端赖氨酸 (+128 Da, +1K) 异质性匹配；碱性峰 B2 (?=-17Da) 和氮端焦谷氨酸环化修饰 (-17Da) 匹配；酸性峰 A1 (?= 1Da) 和脱酰胺修饰匹配。酸性峰 A1 和主峰只有 1 Da 的质量差别，虽然我们会担心质谱准确度因素带来的不确定性，但酸性峰的位置和正好 1 Da 的质量差让我们有理由相信酸性峰 A1 是脱酰胺的修饰峰。A2 峰的信号非常弱，可能是高糖基化修饰的峰。图 3. 贝伐珠单抗 CIEF-MS 分析结果图曲妥珠单抗的分析曲妥珠单抗和贝伐珠单抗的电荷异质性分布的差异较大。iCIEF-UV 测得的低含量碱峰在CIEF-MS上未检出，同时其对酸峰的分离效果也优于 CIEF-MS 分离。质谱检测结果清晰的展示了酸性峰中四种主要的糖型变异体。曲妥珠单抗的主峰分子量为148 224 Da，酸性峰 A1 (?m = +1Da) 和酸性峰 A2 (?m = +2Da) 和脱酰胺修饰匹配，并且和 2D CZE-MS 的结果一致。图 4. 曲妥珠单抗 CIEF-MS 分析结果图英夫利昔单抗的分析英夫利昔单抗的三个电荷变异体峰在 CIEF-MS 上有良好的分离。解卷积结果显示两个碱峰为碳端赖氨酸变异体，碱性峰 B1 (?m = +258 Da) 和两个赖氨酸匹配；碱性峰 B2 (?m = +129 Da) 和一个赖氨酸匹配；酸性峰 A (?m = +5 Da) 小的质量偏差显示其可能为脱酰胺的修饰。图 5. 英夫利昔单抗 CIEF-MS 分析结果图西妥昔单抗的分析西妥昔单抗是人鼠嵌合的 IgG-1 单抗，具有高度的微观不均一性，该特性主要源于高度复杂的糖基化修饰。西妥昔单抗重链的 Fab 和 Fc 上各有一个糖基化位点，同时有碳端赖氨酸的不完全剪切，这些高度的异质性会造成分离上的困难。采用 CIEF-MS 实现了八个电荷变异体的良好分离，不仅和 iCIEF-UV 的结果一致，同时也和文献报道一致。但是由于西妥昔单抗复杂的糖基化修饰，通过质谱获得的分子量信息不足以反应修饰的情况。图 6. 西妥昔单抗 CIEF-MS 分析结果图西妥昔单抗亚基水平的分析针对西妥昔单抗这类具有复杂异质性的抗体，通过 IdeS 酶切和 DTT 还原降低其复杂程度，更利于质谱检测。通过高分辨质谱检测，IdeS 酶切后的八个变异体峰及 IdeS 酶切同时 DTT 还原后得到的 11 个变异体都得以检测。研究发现，西妥昔单抗的电荷异质性主要源于 Fc 区末端赖氨酸的异质性、Fd’ 区 N-羟乙酰神经氨酸和可能存在的脱酰胺修饰。轻链上未发现有电荷异质性。图 7. 亚基水平 CIEF-MS 分析流程图安捷伦 CE-QTOF 解决方案不仅兼顾了毛细管电泳的高效分离，离子源接口的高灵敏度和高分离度，也实现了质谱的高灵敏高分辨检测。在完整蛋白分析的层次上增加亚基水平的解决方案，即使是具有高度复杂异质性的抗体分析也能轻松应对。访问安捷伦药典系列文章，了解更多信息。参考文献：1. 安捷伦应用文献 5994-0672EN2. Jun Dai,*,? Jared Lamp,? QiangweiXia,? and Yingru Zhang?, Capillary Isoelectric Focusing-Mass SpectrometryMethod for the Separation and Online characterization of Intact Monoclonal AntibodyCharge Variants. Anal Chem. 2018 Feb 6 90(3):2246-22543. Jun Dai, and Yingru Zhang, AMiddle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometryfor In-depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal. Chem.,2018, 90 (24), pp 14527–14534扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

p　　span style="color: rgb(146, 208, 80) "药物与机体生物大分子结合的部位即药物靶点。当前国际上药物研发领域竞争的焦点之一就是药物靶点的研究和发现。新的药物靶点的发现往往会成为一系列新药发现的突破口，靶点研究对药物研发企业的意义不言而喻。本文对单抗领域TOP10的热门靶点及代表性药品进行盘点与简要分析，如VEGF/VEGFR、TNF-α、CD20、HER2以及白介素家族靶点成员。/span/pp　　span style="color: rgb(255, 192, 0) "药物靶点定义：/span协和医学院药物筛选中心主任杜冠华对药物靶点这样定义：药物靶点是能够与特定药物特异性结合并产生治疗疾病作用或调节生理功能作用的生物大分子或生物分子结构 对物质的结构产生生物效应，在复杂调节过程或作为通路中具有主导作用 病理条件下对物质的表达、活性、结构或特性可以发生改变。/ppspan style="font-size: 18px "strong　　单抗热门靶点TOP10/strong/span/pp　　我们从国内外上市及国内临床三个维度统计了近7年与靶点相关联的药物数/临床试验数总和，得出了关联总数前10的靶点。/pp style="text-align: center "img width="599" height="300" title="A.jpg" style="width: 443px height: 237px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/24aa8bee-9dc0-4490-b61b-db727c57c173.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "　图：关联国内上市单抗药物数TOP10靶点/span/pp style="text-align: center "span style="font-size: 14px "img width="599" height="305" title="D.jpg" style="width: 425px height: 262px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/5479a955-b9de-4c7f-8526-154f8c74b67d.jpg"//span/pp style="text-align: center "　　span style="font-size: 14px "图：关联国外上市单抗药物数TOP10靶点/span/pp style="text-align: center "span style="font-size: 14px "img width="599" height="298" title="E.jpg" style="width: 397px height: 263px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/a31ee332-fbe0-4aeb-9c92-e8ae4654cc00.jpg"//span/pp style="text-align: center "　　span style="font-size: 14px "图：关联国内临床试验数TOP10靶点/span/pp　　span style="font-size: 18px "strong国内上市单抗药品作用靶点榜首：VEGF/VEGFR/strong/span/pp　　国内上市单抗药品作用的靶点，排名第一的是VEGF/VEGFR，对应上市药品数量达到8个，其中国产药品1个，进口药品7个strong。/strong/ppstrong　/strongstrongspan style="color: rgb(255, 192, 0) "　/spanspan style="color: rgb(255, 192, 0) "(一)VEGF/VEGFR靶点主要作用机制：血管生成信号通路/span/strong/pp　　血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF)，是细胞内刺激血管生成的信号蛋白，具备促进血管新生和再生的功能。VEGF通过与细胞膜表面的血管内皮生长因子受体(VEGFR，又称酪氨酸激酶受体)结合，通过一系列信号通路传导产生生物学效应最终导致血管生成。VEGF家族主要包括5种：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE。/pp　　1971年Folkman首次提出了肿瘤性血管生成理论，肿瘤的生长依赖于肿瘤的血管生成。VEGF(VEGFR)靶点抗体通过特异性结合VEGF(VEGFR)，从而抑制下游信号通路，实现抑制血管生成的目的。/pp　　strongspan style="color: rgb(255, 192, 0) "(二)VEGF/VEGFR靶点代表药品/span/strong/pp　　贝伐珠单抗(Bevacizumab)是第一个针对VEGF靶点的人源化的单克隆抗体，具备高亲和力且特异性地结合 VEGF，达到抑制肿瘤血管增生的作用。2004年基因泰克公司的贝伐珠单抗(商品名安维汀Avastin)获得FDA批准上市，用于转移性结肠癌治疗。/pp　　除了实体瘤、湿性黄斑变性(AMD)发病机制中有异常血管生成，针对VEGF血管生成信号通路的靶向药物对该病有明确的治疗效果。上市公司康弘药业(002773.sz)当家品种，康柏西普(商品名朗沐)是我国自主研发的新一代抗VEGF融合蛋白，也是中国首个获得世界卫生组织国际通用名的生物1类新药。/pp　　FDA已经批准的针对VEGF/VEGFR单抗或融合蛋白有贝伐珠单抗、雷珠单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗。雷珠单抗是一种抗VEGF单克隆抗体片段，是由基因泰克公司开发于2006年首次通过FDA批准上市，商品名诺适得(Lucentis)，用于是视网膜黄斑变性治疗。诺适得是基因泰克旗下首个VEGF单抗安维汀的Fab片段，与安维汀的作用机理一致。/pp　　除了单抗药物，作用于VEGFR的小分子药物对其他酪氨酸激酶也有抑制作用，已经上市的有索拉非尼，舒尼替尼等多个品种。上市公司恒瑞医药(600276.sh)明星产品阿帕替尼，作为民族制药企业自主研发的第一个国家1.1类抗癌新药，也是恒瑞第一个拥有自主知识产权的小分子靶向药物，其作用的靶点就是VEGFR。阿帕替尼也是全球第一个治疗胃癌的小分子靶向药物。阿帕替尼能够高度选择性的与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，阻断信号传导，强效抗肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的生长、转移和散播。/pp　　span style="font-size: 18px "strong国产单抗药品作用靶点榜首：TNF-α/strong/span/pp　　TNF-α是国产单抗药物最成熟的靶点，在已上市的10个国产单抗药物中，有3个单抗药靶点是TNF-α。 同时，TNF-α也是全球目前销售额排行首位的药品阿达木单抗作用的靶点。在2017年全球药品销售额前十榜单中，有四款药物靶点是TNF-α，其中三款是单抗药物。/pp　span style="color: rgb(255, 192, 0) "strong　(一) TNF-α靶点主要作用机制：免疫细胞调节/strong/span/pp　　肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)是一种主要由单核/巨噬细胞分泌的细胞因子(细胞信号蛋白)，在系统性炎症的发生发展中有重要作用。/pp　　TNF有两种类型—TNF-α和TNF-fl，两者有相似的生物学特性，其中TNF-fl主要由T细胞产生，目前对其功能研究不多。 TNF-α由157个氨基酸残基组成，其许多生物学活性都是通过细胞膜上受体介导的。/pp　　TNF-α主要功能是调节免疫细胞，作为一种内源性致热源，可以导致发热、引起细胞凋亡，阻止肿瘤发生和抑制病毒复制等。TNF-α功能失调与多种疾病相关联：比如阿尔茨海默症、银屑病、癌症、重度抑郁、肠炎等。/pp　span style="color: rgb(255, 192, 0) "strong　(二) TNF-α靶点代表药品/strong/span/pp　　以TNF-α为靶点的3个国产单抗药物中，最早上市的是中信国健(现改名三生国健)的益赛普，获批时间是2005年，主要用于类风湿性关节炎治疗。最近获批的以TNF-α为靶点国产药物是上市公司海正药业的安佰诺，是一种TNF-融合蛋白单抗产品，同样用于类风湿性关节炎治疗。/pp style="text-align: center "img width="599" height="107" title="F.png" style="width: 548px height: 93px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/a332158e-09a2-414d-b1a7-c5a3c4b8c18e.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "　表：以TNF-α为靶点的国产单抗药物/span/pp　　在TNF-α靶点药物中就有连续6年霸占全球药品销售额排行榜榜首的阿达木单抗(商品名修美乐Humira)。修美乐是由总部位于美国芝加哥的艾伯维公司(AbbVie)于2002年获得FDA的批准上市。生产厂商艾伯维公司财报显示修美乐 2017年全球销售额达到惊人的184亿美元，较上年增长26.9亿美元，增速仍高达17%。修美乐是全人源化单抗药品，也是全球第一个上市的全人源化单抗药物。/pp　　2017年全球药品销售额前十榜单中，除了排名首位的阿达木单抗靶点是TNF-α，排名第二的来那度胺、排名第四的依那西普单抗以及排名第五的英夫利昔单抗的靶点也是TNF-α。其中来那度胺是小分子靶向药。/pp　　英夫利昔单抗(商品名类克)是由强生、默克和三菱田边公司联合开发的全球第一个TNF-α抑制剂，1998年获批FDA批准上市。类克是一种人鼠嵌合单抗，用于类风湿性关节炎、强制性脊柱炎、银屑病等自身免疫性疾病的治疗。2017年类克全球销售额达到77.6亿美元。依那西普是辉瑞和安进公司联合开发，适应症是类风湿性关节炎、强制性脊柱炎，2017年全球销售额78.9亿美元。/pp　　span style="font-size: 18px "strongCD20：B细胞主要生命周期表达的膜蛋白，淋巴瘤治疗重要靶点/strong/span/pp　　CD20为大家所熟悉很多都是通过罗氏的明星产品美罗华。美罗华自从问世以来，其与小分子化疗药物的联用已经成为某些特定类型的非霍奇金淋巴瘤的标准治疗方案。美罗华在商业上的巨大成功也让CD20成为药企最热门的药物开发靶点之一。CD20靶点单抗全球销售规模超过70亿美元，是商业价值较大的药物开发靶点之一。/pp　　span style="color: rgb(255, 192, 0) "strong(一) CD20：主要参与B细胞的增值与分化/strong/span/pp　　CD20(Cluster of Differentiation 20)是位于B淋巴细胞表面的一种跨膜磷蛋白。B淋巴细胞是由骨髓内多能干细胞分化而成，是负责体液免疫的功能细胞，其发育经过祖B细胞(Pro-B)，前B细胞(Pre-B)，不成熟B细胞(Immature B)以及成熟B细胞(Mature B) 几个阶段。CD20在造血干细胞、祖B细胞以及成熟的浆细胞上并不表达，主要出现在前B细胞到成熟B细胞阶段。/pp　　非霍奇金淋巴瘤B细胞来源的比例占比达到70%，抗CD20的抗体可直接抑制B细胞 生长并诱导其凋亡。CD20在人体细胞中的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗B淋巴细胞瘤的主要靶点。虽然CD20的功能尚不完全清楚，但有证据表明抗CD20单抗杀伤B细胞来源肿瘤的作用机制主要有三种：抗体依赖的细胞毒作用，补体依赖的细胞毒作用，以及抗体与CD20分子结合引起的抑制细胞生长， 改变细胞周期以及凋亡等直接效应。/pp　　span style="color: rgb(255, 192, 0) "strong(二)CD20靶点代表药品/strong/span/pp　　以CD20为靶点的单抗药物可以分为三代，第一代利妥昔单抗(商品名美罗华)、替伊莫单抗(商品名泽娃灵)，第二代奥法木单抗(商品名Arzerra)以及第三代阿妥珠单抗。利妥昔开创了靶向治疗B细胞淋巴瘤的先河，属于人鼠嵌合单抗 第二代的奥法木单抗是人源化单抗，第三代单抗Fc段被修饰。/pp　　在研数据显示，目前有十几个厂商正在开展针对CD20靶点的单抗研发，单抗研发领域实力较强的几家悉数参与：包括复星集团旗下的复宏汉霖、沃森生物参股的嘉和生物以及向港交所递交上市申请的信达生物、上市公司海正药业、华兰生物等。/pp　　美罗华1997年获得FDA的批准在美国上市，是全球第一个被批准用于非霍奇金淋巴瘤的单抗药物，2000年在国内获批上市。美罗华2017年全球销售额59.7亿美元，位居全球药品销售榜单第8位。在利妥昔单抗类似物的研发竞争中，三生国建的进度最快，已经完成临床研究，正在申报上市。/pp style="text-align: center "img width="594" height="336" title="A.png" style="width: 431px height: 247px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/15f3397f-7610-4177-abf9-1410313e0fd1.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "　图 美罗华全球销售额(单位：亿美元)/span/pp　　奥法木单抗(商品名Arzerra)是第一个全人源化单抗，2009年通过FDA的批准上市。Arzerra 2016年全球销售额5700万美元。受依鲁替尼的竞争，Arzerra 2016年的销售额相比2015年下滑19%。除了奥法木，第二代CD20单抗药物还包括罗氏开发的人源化单抗奥瑞珠。奥瑞珠是首个在多发性硬化领域获得突破性疗法的产品。第三代抗CD20单抗的Fc段经过了糖基化修饰，通过修饰可以提高抗体的特异性以及与抗原结合的亲和力。第三代抗CD20单抗阿妥珠单抗由罗氏研发成功并于2013年获得FDA批准上市。/pp　　span style="font-size: 18px "strongHER2：乳腺癌药物经典靶点，预后重要指标/strong/span/pp　　HER2是迄今为止乳腺癌研究较为透彻的基因之一，HER2基因的过度表达不仅与肿瘤的发生发展关系密切，也是临床预后的重要指标。/pp　span style="color: rgb(255, 192, 0) "strong　(一)HER2:生物学作用通过启动信号通路导致细胞增殖/strong/span/pp　　HER2(人表皮生长因子受体 2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。大约15%~30%乳腺癌和10%~30%的胃癌会发生HER2基因扩增或过度表达。/pp　strongspan style="color: rgb(255, 192, 0) "　(二)HER2靶点代表药品/span/strong/pp　　目前国内上市的以HER2为靶点的单抗药物只有1个，就是知名度极高的罗氏生产的赫赛汀，化学名曲妥珠单抗。以HER2为靶点的国内上市药品中还有一个小分子药物，是葛兰素史克公司生产的泰立沙，化学名拉帕替尼，2013年通过CFDA审批上市。泰立沙2007年获得FDA的批准在美国上市。/pp style="text-align: center "img width="599" height="145" title="B.png" style="width: 528px height: 115px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/ece5967d-c7a6-470a-851c-f75a104bd7cb.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="font-size: 14px "表：在FDA获批的HER2靶点药物/span/pp　　赫赛汀是最早上市的HER2靶向药物，主要适应症是HER2阳性乳腺癌。赫赛汀1998年获FDA批准在美国上市，2000年在欧洲上市，2001年在日本上市，2002年中国上市。2017年赫赛汀全球销售额71.44亿美元，位居全球药品销售排行榜第5位。/pp　　span style="font-size: 18px "strong白介素/白介素受体家族靶点成员/strong/span/pp　　白介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，白介素是目前发现种类最多，调控作用最广泛的一类细胞因子。第一个白介素分子(IL-1)1977年被发现，此后陆续发现了40多种白介素分子。以白介素家族成员为靶点的药物包括融合蛋白、抗体等多种形式。国内上市单抗白介素靶点主要是IL2R和IL-6R。/pp　　span style="color: rgb(255, 192, 0) "strong(一)IL2R与IL6R生物学作用：免疫调节重要功能因子/strong/span/pp　　IL2R(interleukin-2 receptor)是一种三聚体蛋白，在淋巴细胞等免疫细胞膜表面表达，通过与IL2结合发挥生物学作用。IL2R通过三种形式与IL2结合：通过α链、β链或γ链。这三种IL2R链都是跨膜并延伸到细胞膜内，具有向胞内传递生化信号的作用(α链不参与信号传导)。IL2和IL2R对于免疫系统有重要的调节功能，通过直接作用于T细胞在免疫耐受和维持正常免疫功能方面发挥功能。IL6是一种多功能细胞因子，可以调节细胞生长、分化，并参与免疫应答的生化过程。IL6及其受体的失调与多种疾病的发生有关，比如多发性骨髓瘤、自身免疫性疾病、前列腺癌等。/pp　span style="color: rgb(255, 192, 0) "strong　(二)IL2R与IL6R靶点代表药品/strong/span/pp　　IL2R靶点国内上市的药品只有1个，诺华公司生产的巴利昔单抗，商品名舒莱，用于预防肾移植术后器官排斥反应。巴利昔单抗通过与IL2R的α链特异性结合阻断了IL2与IL2R的结合。IL2R在激活的T淋巴细胞表面表达。IL2通过与IL2R结合，介导了T淋巴细胞的活化并引发一系列的病理过程，这一过程恰恰是移植手术后细胞免疫导致的排异反应的关键机制。巴利昔单抗1998年获得FDA批准上市。/pp　　IL6R靶点国内上市的药品也只有1个，罗氏公司生产的托珠单抗，商品名雅美罗，用于类风湿性关节炎的治疗。雅美罗最早于2005年在日本上市，2010年通过FDA审批在美上市，2013年获得进口注册引入国内。/pp/p

p　　随着原研生物药专利到期及生物技术的不断发展，以原研生物药为基础开发的生物类似药进入发展快车道。A股上市公司复星医药最新公告称，控股子公司复宏汉霖一款用于非霍奇金淋巴瘤治疗的生物类似药，近期获国家食药监总局药品注册审评受理。在业内看来，该药有望冲刺2015年《生物类似药研发与评价技术指导原则(试行)》发布后国内第一个上市的生物类似药。在国家鼓励生物类似药研发的政策红利下，中外药企纷纷加速在中国的市场布局。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "国内空白有望被打破/span/strong/pp　　据上述指导原则介绍，生物类似药是指在质量、安全性和有效性方面与已获准注册的参照药(通常为原研产品)具有相似性的治疗用生物制品。由于生物类似药可以更好地满足公众对生物治疗产品的需求，有助于提高生物药的可及性和降低价格，许多国家都十分重视生物类似药的研发和管理工作，全球已有20余个国家或组织制定了生物类似药相关指南。/pp　　不过，由于生物结构和技术生产远比化学仿制药复杂，生物类似药在全球范围内属于起步阶段，尤其是抗体类生物类似药，欧美国家批准的不超过10个，在中国还是空白。/pp　　近期，复星医药控股子公司复宏汉霖生物宣布，公司研制的利妥昔单抗注射液(一款生物类似药，即重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体注射液)获国家食药监总局药品注册审评受理。该药为复宏汉霖自主研发的大分子生物类似药，主要适用于非霍奇金淋巴瘤、类风湿性关节炎的治疗。/pp　　公开资料显示，2003至2013年间，恶性淋巴瘤的发病率约为6.68/10万，位列所有恶性肿瘤发病率第八位。从疾病分类上看，淋巴瘤通常分为两大类：霍奇金氏淋巴瘤(占所有淋巴瘤的10%)和非霍奇金氏淋巴瘤(占所有淋巴瘤的90%)。/pp　　截至2017年10月30日，在中国境内(不包括港澳台地区)上市的利妥昔单抗注射液仅有上海罗氏制药有限公司的美罗华。据咨询机构IMS统计，2016年利妥昔单抗注射液在中国境内销售额约为15亿元。不过，利妥昔单抗的高昂费用(平安证券研报显示其中标价在3400元/0.1mg、16000元/0.5mg以上)让很多患者无法承担，也有不少患者家庭因为治疗背上非常沉重的经济负担。/pp　　值得注意的是，一旦国产利妥昔单抗上市，质优价廉的生物类似药将迅速覆盖有实际用药需求但是不能负担药价的患者。中国临床肿瘤学会基金会理事长秦叔逵表示，随着生物类似药在国内不断上市，既为临床医生提供更好的选择，也让更多的患者能够接受治疗。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "中外药企抢占生物类似药市场/span/strong/pp　　统计显示，2016年全球销售排名前十大药品中有7个生物药，其中6个是单抗，单抗之王修美乐(阿达木单抗)的销售额达160亿美元，这样的市场空间吸引了中外药企的关注。/pp　　相比2013-2015年是非单抗生物药专利的集中到期时间， 2016-2020年将迎来单抗生物药的专利到期高峰，全球范围内生物类似药的大市场即将来临。值得注意的是，除了国内的复宏汉霖、中信国健、信达生物等药企，安进、诺华(山德士)、辉瑞等跨国医药巨头也是生物类似药市场的重要参与者。/pp　　从各大公司的在研管线看，生物类似药研发集中在阿达木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗等专利已经或即将过期的大品种单抗上。市场预计，2020年全球生物类似药市场空间可达350亿美元。/pp　　与化学仿制药相比，生物类似药的技术门槛和投资门槛都要高出很多。复星医药公告显示，截至2017年9月，针对利妥昔单抗已投入研发费用约2.9亿元。自2010年成立以来，复宏汉霖累计投入约8.64亿元用于单抗产品的开发，除了利妥昔单抗(HLX01项目)，公司的HLX02项目(罗氏赫赛汀的生物类似药)已经在欧盟波兰以及乌克兰展开乳腺癌三期临床研究。/pp　　除了自己干，也有国内药企选择与国外巨头联手。近日，先声药业和美国安进宣布启动生物类似药战略联盟，一次性将多个单抗品种的生物类似药引进中国，进行共同研发和商业化，这是中美药企在生物类似药领域第一次展开较大规模的合作。/pp　　双方的合作药物，包括治疗类风湿疾病的阿达木单抗和治疗肿瘤的贝伐珠单抗。这两款生物类似药是美国FDA批准的各自品类的第一款生物类似药。安进中国区总经理张文杰表示，这项合作融合了安进公司长期以来在生物药研发和生产方面的专长和优势，以及先声药业在风湿免疫、肿瘤疾病领域的本土开发注册经验和强劲的市场推广能力。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "药审改革不断激发市场创新活力/span/strong/pp　　生物类似药在国内的蓬勃发展，得益于国内不断推进的药审改革。/pp　　近年来，国家食药监总局相继实施药品上市许可持有人制度试点、化学药注册分类改革、仿制药质量和疗效一致性评价、优先审评审批、临床试验数据自查核查等一系列重大举措，在医药行业掀起了一股改革浪潮。/pp　　生物类似药是改革的重点。2015年《生物类似药研发与评价技术指导原则(试行)》发布，对生物类似药的申报程序、注册类别和申报资料等相关注册要求进行了规范。2016年的《药品注册管理办法(修订稿)》提出，“药品上市申请的审批，应当重点关注：生物类似药与原研药质量和疗效的类似”。/pp　　国内医保也为生物类似药打开了大门。2017年4月人社部发布通告，确定了2017年国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录谈判范围。在44个药品中，涉及单抗的有7个，显示出医保部门对单抗类药物临床价值的充分认可。/pp　　复星医药表示，目前已在美国硅谷成立了三个医药研发实验室，与国内的上海、重庆连接成无缝合作的全球研发网络。基于这个研发网络，目前复星在肿瘤、自身免疫性疾病方面，有8个产品获11个全球临床批件。肿瘤药龙头恒瑞医药也在持续加码研发投入，财报显示2017年上半年公司累计投入研发资金7.8亿元，同比增长60%，基本形成了每年都有创新药申请临床的良性发展态势。/pp　　中国医药创新促进会执行会长宋瑞霖指出，监管部门的新政激发了整个医药行业的活力，同时推动了本土企业国际合作和国际企业加快进入中国市场的步伐。通过在合作中推动监管水平与国际水平接轨，将提升我国生物医药行业的整体水平。/ppbr//p

治疗性单克隆抗体结构相对小分子更加复杂。不仅仅是序列影响蛋白活性，同时蛋白的翻译化修饰也会影响。常见的修饰包括脱酰胺、二硫键、末端赖氨酸丢失和糖基化修饰，糖基化修饰是相对复杂的特殊翻译后修饰，包括N糖修饰和O糖修饰，N糖基化修饰主要发生在蛋白质一级结构中的特征性序列NXT(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)，修饰存在一定规律，O糖修饰可以与任何含有羟基基团的氨基酸连接，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)是最常见的修饰位点，因此更加复杂。糖型结构会显著影响治疗效果，是单抗药物质量监测的重要关键质量属性。 抗体生物类似药在面临生产和临床过程中，需要保证质量的一致性，糖基化分析是重要的关键分析流程。糖修饰异质性会间接影响药效，因此需要在多批次生产过程中，保证工艺和质量的稳定性。N糖根据不同的连接方式使得N-糖基化的五糖核心结构分为高甘露糖型、杂合型和复杂型3 种类型，FDA，EMA 等生物类似药指导原则都鼓励研发单位采用最新的分析技术手段，对生物类似药和原研药的糖基化修饰位点、程度以及寡糖的组成进行深入比较分析，例如可以利用岛津液相以及质谱等设备可进行由浅入深的糖型修饰分析，进而对产品生产过程中严格监测。岛津在糖基化分析方面有三大护法守护。下面一一道来。 岛津抗体糖型分析质控解决方案 第一护法-高分辨质谱LCMS-9030 LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪使高速度、高灵敏度的四极杆质谱与TOF技术的紧密结合。融合岛津先进工程技艺的DNA，打造出速度与出色性能兼备的全新一代高分辨质谱仪，以优异表现轻松胜任定性和定量分析挑战。对完整蛋白以及亚基水平的糖型进行初步分析。 第二护法-MALDI-MSMALDImini-1 MALDImini-1数字离子阱（DIT）体积极小，功能强大，可实现质谱多级的检测。针对糖肽分析、抗体化学修饰位点、未知生物分子结构分析，蛋白质、多肽、翻译后修饰肽等都有专向解决方法。 第三护法-高效液相色谱系统Nexera Bio 从完整蛋白或者亚基水平分析，利用质谱可快速的分析带有糖基化修饰蛋白分子量。可以分析简单的糖型结构，速度比较快，重现性较好，但是精细的糖型结构也不能很好的监测清楚，所以可以搭配糖肽水平和游离寡糖水平一同研究。 首先，第一步从完整蛋白水平，利用岛津LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪从完整分子量水平分析抗体的糖修饰情况如下表所示，鉴定并分析相关糖型的分布。 不同糖型抗体形式分子量测定结果与理论对比 第二步可以从糖肽水平分析，通常抗体通过使用蛋白酶酶切后，产生分子量大约为0. 5 ～ 5 kDa 的小肽，采用色谱或电泳分离后再进行MALDI-MS 或ESI-MS 分析。利用质谱分析糖肽序列、寡糖组成，岛津MALDI-TOF和MALDI-数字离子阱质谱可以分析相关糖肽组成分析。 例如针对血清糖蛋白，使用MALDI-离子阱质谱分析得到的衍生N-聚糖谱图，如下图所示：血清糖蛋白N-聚糖质谱解析谱图 第三步可以从游离寡糖层面分析，药典相关要求，针对游离寡糖的分析通常有三种方法: （第一法）亲水相互作用色谱法、（第二法）毛细管电泳法、（第三法）高效阴离子色谱法，通过N-糖苷酶F对单抗N糖进行酶切后，使用2-氨基苯甲酰胺( 2-AB) 或2-氨基苯甲酸( 2-AA) 对寡糖进行标记即可进行糖型分析。针对唾液酸分析，岛津超高效液相色谱结合荧光检测器建立了抗体中唾液酸Neu5Ac 和Neu5Gc 含量测定，结果如下图所示： 唾液酸液相分析定量标准曲线 单抗糖基化是作为重要的翻译化修饰，宿主细胞培养工艺过程会影响不同的修饰构成，岛津不仅可以提供糖基化质量分析质控方案，同时针对培养工艺优化以及工艺残留物监测，提供特色的培养监测在线和离线分析解决方案，为了更好地把握产品质量，力图让产品质量更加稳定和安全。虽然生物类似药与原研药批次糖基化修饰结构差异依然存在，但在生物类似药相似性评价和适应症外推的征途上还有许多路要走，岛津依旧陪伴左右。

p　　单克隆抗体的生产方式赋予了它们复杂且具有异质性的分子特点。通常需要借助多种正交分析技术才能全面表征各种变体。 在本应用纪要中，我们使用质谱这种强大的工具对阿达木单抗进行了表征。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "简介/span/strong/pp　　Humira® (阿达木单抗)是一种FDA和EMA批准的抗TNFα抗体，被用于治疗多种炎症性疾病，包括类风 湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、银屑病和克罗恩病。它是2014年销量最高的单克隆抗体产品，全球销售额超过130亿美元。/pp　　阿达木单抗是由CHO细胞表达的完全人重组抗体。 和所有通过重组DNA技术制备的蛋白质一样，其最终产品是不同变体的混合物。我们必须全面表征产品的异质性，因为这会影响其安全性和功效。/pp　　质谱是目前被广泛使用的生物药物表征技术之一。得益于硬件和软件的创新，该技术现已得到常规应用。在本应用纪要中，我们将使用质谱对Humira® 进行不同水平的表征。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "完整阿达木单抗的表征/span/strong/pp　　利用质谱分析单克隆抗体最简单的方式就是测定完整蛋白质的分子量。该检测可提供有关蛋白质鉴定和糖基化谱图的有用信息。/pp　　测定时需要对抗体脱盐，去除制剂缓冲液中的非挥发性盐类。脱盐步骤可使用超滤装置离线完成，但该过程非常耗时。配备反相色谱柱的液相色谱是一种替代方法：盐类在死体积内洗脱并被导入废液，然后用乙腈水溶液梯度将单克隆抗体洗脱到质谱仪的离子源中。/pp　　典型分析条件如表1所示。应当注意，考虑到传质限制，须采用较高的柱温以改善峰形，进而提高MS灵敏度。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表1：阿达木单抗完整质量数测定的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/83d0cd65-f7b9-4177-b0f7-5ff513e8505b.jpg" title="1_副本.jpg"//pp　　所得电喷雾质谱图为包络迹线，其中包括不同电荷态的蛋白质。使用MaxEnt® 算法进行去卷积处理，得到更容易解析的谱图(见图1)。通过去卷积谱图可轻松确定糖基化谱图。/pp　　在阿达木单抗上观察到的主要糖型为G0F/G0F和G0F/G1F，质量精度通常低于20 ppm。/pp　　如果需要测定不含糖基的蛋白质的分子量，为了简化谱图，可进行去糖基化。通常采用PNGase F酶去糖基化，但反应时间相当长(需要数小时甚至过夜)。为了加快分析速度，我们选用了Rapid PNGase F酶(纽英伦生物技术公司)。在50 ° C下温育10～15 min后， 获得完全去糖基化的抗体。该反应可在大多数制剂缓冲液中直接进行，无需更换缓冲液。对应的质谱图如图2所示。由于质谱图得以简化，我们可轻松观察到其它修饰，例如C端赖氨酸剪裁。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/da262e93-2bdb-4c3b-b5df-dfcf6b1eb709.jpg" title="2_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图1：完整阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt® 去卷积质谱图(B)。/span/ppstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "/span/strong/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/175a864c-b84f-4c37-bd2f-de937b179ade.jpg" title="3_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　strong　span style="color: rgb(0, 112, 192) "/span/strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "图2：N-去糖基化阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt® 去卷积质谱图(B)。/span/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "IdeS酶解后的阿达木单抗亚基分析/span/strong/pp　　尽管完整质量数测定(经过或不经过去糖基化处理)已经能够快速简单地鉴定抗体及确定糖基化分布，高分离度对于色谱分离和质谱测定而言通常也很有价值。/pp　　完整抗体的大小(约150 kDa)限制了分离度。还原二硫键可得到轻链和重链，但在低丰度变体的测定中，重链(约50 kDa)仍然是一个问题。/pp　　IdeS酶(Genovis，商品名FabRICATOR® )是采用质谱法表征单克隆抗体时的重要工具。酶解并还原二硫键之后得到的肽段(见图3)分子量约为25 kDa，因此可采用LC/MS分析，而且色谱分离度和质量精度极佳。 此外，样品制备仅需不到一小时。该方法通常被称为 “自中而上”策略。/pp　　或者，也可使用IdeS和Rapid PNGase F(后者须在还原条件下反应)进行连续酶解，获得去糖基化的肽段。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b21e335e-8fd8-445a-a855-c340edabcbd1.jpg" title="4_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图3：用IdeS酶解mAb之后还原二硫键/span/pp　　为了大限度提高色谱分离度，我们优化了分析条件。 最关键的参数是色谱柱的性质以及流动相中所用的改性剂。 使用不同色谱柱获得的色谱图如图4所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d4c71121-5a2b-4cc0-b26d-53ba57dfce8f.jpg" title="5_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图4：使用不同HPLC色谱柱分离经IdeS酶解和二硫键还原所得的阿达木单抗肽段的结果比较/span/pp　　由图可观察到明显差异，购自Thermo的MabPac RP色谱柱所得的结果最佳。我们在该色谱柱上测试了两种改性剂： 甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)，以及这两种改性剂的混合物。/pp　　最佳分析条件如表2所示。图5展示了用IdeS酶解阿达木单抗之后，还原或不还原二硫键所得的色谱图。测得分子量的质量精度低于1 Da。得益于良好的色谱分离度，我们还可分离并定量各种变体，例如N端焦谷氨 酸、无糖基化变体或氧化物质。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表2：阿达木单抗亚基分析条件/span/pp style="text-align: center"br//pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/6afe117f-4c86-4523-8404-641d94e12497.jpg" title="无标题_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图5：经IdeS酶解和DTT还原的阿达木单抗样品的LC/MS分析结果/span/pp style="text-align: left "　　该方法还可用于研究抗体氧化。我们使用不同浓度的H2O2 进行了强制氧化研究。在20 ° C下温育45分钟后， 用IdeS酶解样品，然后用DTT还原，最后通过LC/MS 进行分析。所得液相色谱图如图6所示。/pp　　不同峰的质谱鉴定非常简单直接。可明确测得Fc/2和 F(ab’)2 区域的氧化物质浓度增加。/pp　　在稳定性研究中，这种分析方法非常适用于监测单克隆抗体的氧化。亚基水平的分析能够粗略定位氧化位点。更精确的定位可通过肽图分析实现。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/e3b20720-c738-41e3-91c0-9912e87e02a5.jpg" title="6_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="color: rgb(0, 112, 192) "　图6：色谱图随H2O2 浓度增加发生的变化/span/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "通过UPLC-UV-MSsupE/sup肽图分析对阿达木单抗进行鉴定和目标纯度分析/span/strong/pp　　肽图分析策略涉及使用特定的蛋白酶(例如胰蛋白酶) 得到小分子肽，再利用LC与UV和/或MS检测联用的方法分析所得的肽混合物。/pp　　随着液相色谱和质谱技术不断进步，采用肽图分析法分析单克隆抗体现在已经能够达到接近100%的序列覆盖率，同时详尽表征翻译后修饰。 如今，人们在常规分析中使用亚2 µ m色谱柱获取高分离度肽图，而借助高分辨率质谱则能够以低于 5 ppm的质量精度实现肽的鉴定。/pp　　除了质量测定以外，还可使用MSE模式记录碎片数据。 在MSE采集模式下，仪器每秒交替采集低能量和高能量谱图，因此几乎可以同时获得分子质量和序列信息 (图7)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/fbe321ec-3274-4d6b-acb9-2fe1c51b3e85.jpg" title="7_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图7：MSE采集模式的原理。/span/pp　　过去MS检测通常仅用于方法开发，但随着功能强大且经过验证的软件被开发出来，质谱法现在也被应用于常规分析中。/pp　　放大后的阿达木单抗肽图分析基峰离子(BPI)色谱图如图9所示。这些数据使用表3所列的分析条件获得。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/4fac9c35-d14d-446a-89bb-bbf9abfa6226.jpg" title="yaji_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表3：阿达木单抗肽图分析的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d1e374ea-bc16-4db0-a1c8-2da8667c190f.jpg" title="8_副本.jpg"//pp　　使用UNIFI软件解决方案(沃特世)基于分子量对每个峰进行鉴定(质量数容差5 ppm)，进而计算出序列覆盖率 (图8)。 必要时，可使用碎片数据(MSE)确证胰蛋白酶肽的鉴定结果。图10展示了碎片离子谱图的一个示例(MSE-高 能量)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b0cc8c39-7298-4968-af6d-87b4ec76d53a.jpg" title="9_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图8：利用UPLC-UV-MSE对阿达木单抗进行肽图分析并采用UNIFI软件解决方案处理数据之后所得的序列覆盖图/span/pp　　肽图分析法还可用于评估单克隆抗体的纯度。完整质量数测定和亚基分析能够提供单克隆抗体纯度的大体情况，肽图分析法则能够进行目标纯度分析。可评估的主要修饰包括：/pp　　■ 脱酰胺化/pp　　■ 氧化/pp　　■ 糖基化/pp　　■ N端焦谷氨酸/pp　　■ C端赖氨酸截断/pp　　即使UPLC肽图的分离度再高，色谱分离度通常也不足以通过UV检测对修饰进行相对定量。因此，我们使用MS数据进行定量分析。该过程可使用UNIFI等软件解决方案完全自动化地完成。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/daf3b1a7-ab1b-4c9c-ac80-08dea0ac6ed9.jpg" title="10_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图9：阿达木单抗的肽图(BPI色谱图)/span/pp　　使用该方法分析阿达木单抗样品，获得了如下结果：/pp　　■ 序列覆盖率：100%(质量数容差10 ppm)。/pp　　■ 使用更苛刻的标准(质量数容差5 ppm， 至少以2b/y碎片离子确证鉴定结果)所得的序列覆盖率仍然非常高(93%)。/pp　　■ 重链上2.9%的N端谷氨酸以焦谷氨酸形式存在。/pp　　■ 大部分重链都不含C端赖氨酸(89%)。/pp　　■ 在轻链的152N上观察到了显著的脱酰胺化。/pp　　■ 观察到的主要糖型为G0F、G1F和G2F，相对强度分别为75%、23%和2%(基于糖肽EEQNSTYR)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/93a63c98-dd03-4921-a7cf-236379984a3c.jpg" title="11_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图10：阿达木单抗轻链T1肽的高能量MSE谱图(带标注)/span/pp　　利用UPLC与荧光检测和高分辨率质谱检测联用的方法对阿达木单抗进行N-糖分析/pp　　大多数治疗性单克隆抗体都是IgG类抗体，在重链的Fc 区氨基酸297N处有一个糖基化位点(见图11)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/30b15311-c672-40c6-aa50-920177aaee2e.jpg" title="12_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图11：单克隆抗体中常见的N-糖/span/pp　　糖基化是单克隆抗体的一项关键品质属性，因为Fc区 域的N-糖特征可影响抗体与Fc受体的结合，从而调控 ADCC和ADCP活性。末端半乳糖对于补体依赖性细胞毒性(CDC)也很重要。最后，糖基还会影响治疗性抗体的安全性。/pp　　因此，必须采用灵敏且可重现的方法来表征单克隆抗体的糖基化以及批次间一致性。得益于优异的分离度和重现性，使用亚2 µ m色谱柱分析2-AB标记的N-糖成为了表征单克隆抗体的首选方法。不同游离寡糖的相对定量通常采用荧光检测法。/pp　　该方法的两个缺点是样品制备时间长(通常为2～3天)， 且很难鉴定低丰度游离寡糖。/pp　　我们对方案进行了优化，将样品制备时间缩短为不到一天，并结合高灵敏度MS/MSE和荧光检测建立了自动化MS工作流程。包括数据处理和报告在内的整个流程可在24小时内完成(见图12)。表4汇总了分析条件。/pp　　阿达木单抗的UPLC/FLUO色谱图如图13所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/448b85af-dfca-4b58-a3af-3513a8a0c928.jpg" title="13_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图12：N-糖分析工作流程/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表4：阿达木单抗游离N-糖的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/df32e840-8042-4c12-a9a9-bffa7781485a.jpg" title="Ntang_副本.jpg"//pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/8bd603a8-3e4d-4b31-8107-a23999844b42.jpg" title="15_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图13：阿达木单抗N-糖分析所得的UPLC/FLUO色谱图/span/pp　　鉴定不仅基于游离寡糖的分子量，还基于“葡萄糖单元 ”(GU)校准。大多数情况下，将这两种方法相结合都能准确鉴定N-糖。必要时，可使用MSE模式下采集的碎片数据来确证鉴定结果，或者在两个假定结果之间做出选择。GlycoWorkbench应用程序可用于解析碎片谱图。带标注的MSE谱图示例如图14所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/3092e407-ec1b-42c8-b670-c1ca726e5f52.jpg" title="16_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图14：分析阿达木单抗样品中的2-AB标记G0F游离寡糖所得的高能量MSE谱图(带标注)/span/pp　　检出的主要N-糖(占所有检出N-糖的95%)列于表5中。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表5：阿达木单抗样品中检出的主要N-糖/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/de10208a-c2b3-41e2-91a2-acf08569e5c8.jpg" title="17_副本.jpg"//pp　　有趣的是，使用本应用纪要所列的不同方法测得的要糖型比率非常一致(仅考虑所有方法都能检出的糖型，即G0F、G1F和G2F)，如表6所示。/pp　　表6：使用不同方法获得的阿达木单抗糖型测定结果比较/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/753139b8-e6e8-4a94-9a6e-a0411df6303b.jpg" title="18_副本.jpg"//pp　　strong注：本文引自Quality Assistance的应用文章。/strong/ppbr//p

与传统小分子药不同，单抗类蛋白药是非均一性的结构复杂的大分子，因此使这类原研药或仿制药的研发与质控工作难度增大。通过液相色谱-质谱联用技术（LC/MS），结合蛋白分子量的测定、异构体、氨基酸修饰、糖基化修饰以及聚集情况分析等多种检测手段，可对单抗类药物进行全面的结构表征。 在文献《Physicochemical and Functional Comparability Between the Proposed Biosimilar Rituximab GP2013 and Originator Rituximab》中提到了将利妥昔单抗与其生物类似药（GP2013）之间，针对各项物化性质和功能性指标进行了对比分析试验。 利用尺寸排阻色谱法（SEC）的分子空间结构不同的原理可对抗体的多聚体、抗体片段以及PEG蛋白等进行有效分析。在该文献中，对原研和仿制药样品的非均一性分析（抗体聚集情况分析）时使用了TSKgel G3000SWXL色谱柱（请参照该文献2.12 SEC,CE-SDS,AF4部分）。 硼酸盐亲和色谱法多用于对糖或糖蛋白等生物分子进行分离。该文献中，使用了亲和色谱柱TSKgel Boronate-5PW对GP2013样品中糖基化和未糖基化的抗体异构体进行了分离。（请参照该文献2.13 Boronate Affinity Chromatography部分） 在该文献2.14 Glycan Analysis部分中，通过N-糖苷酶F来释放单克隆抗体Fc部分上的糖链，并对游离的N-末端糖链进行2-AB荧光标记后进行糖基化分析。其中使用到了TSKgel Amide-80（2.0 mm ID X 15 cm，3 um）色谱柱用来分离2-AB标记的糖链。 TSKgel Amide-80亲水相互作用（HILIC）色谱柱适用于亲水性低分子、核酸以及糖类等化合物的分离分析。在单抗药物分析应用上，TSKgel Amide-80常用来分析结合在抗体上的糖链的结构差异性。 为了满足广大色谱工作者对抗体药高效分析的需求，东曹公司作为分离纯化产品的生产商，不断致力于开发出在色谱分离度、灵敏度以及分析速度上具有革命性提升的色谱柱产品。特别是在对抗体药物质量控制中的HPLC检测方法上可以提供完备的解决方案。

2014年12月19日，上海——科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）近日推出在线二维液相色谱法分析单抗样品的解决方案。 生物制药被誉为21世纪的金苹果，其利用现代生物技术（组织提取、发酵和细胞培养等等）为人类健康带来诸多良药。通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物，已经成为生物制药领域的一个重要方面。单克隆抗体药物专一性强，疗效显著，尤其是在癌症的治疗过程中发挥重要的作用，成为今年来研究的热点药物之一。但在单克隆抗体药物的每个生产过程中，必须采用合适的方法进行产品的纯化和质量控制，测定其效价、聚集体和电荷亚型变体等。其中，聚集体和电荷亚型变体会在药品的生产、存储和运输过程中产生，这些副产物会产生与主产品不同的药效，有时会引起严重的副作用。因此必须对这些副产物进行严格的质量控制，从而更好地保证患者的用药安全。赛默飞推出的方案基于Ultimate 3000 DGLC 双三元液相色谱系统，一维使用MabPac Protain A亲和色谱柱对单抗溶液进行分离，通过阀切换将收集到loop环（或者富集柱）中的单抗样品转移到二维，利用SEC色谱柱将样品中的聚体和单抗进行分离，从而实现全自动在线二维液相分离单抗药物的目的。该方案可以实现单抗药物的全自动滴度分析和聚体分离，节约时间，提高工作效率，同样该方法也适用于全自动滴度分析和电荷异构单抗分离。更为重要的是该方法可以整合不同分离原理的液相色谱方法，为生物制药和蛋白分析建立一个方法开发平台，从而让 Ultimate 3000 DGLC 双三元液相色谱更好地为生物制药行业服务。下载应用文章请登陆：www.thermo.com.cn/Resources/201410/2095520813.pdf ---------------------------------------------------------------------关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有员工约50,000人。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于Thermo Scientific、Life Technologies、Fisher Scientific和Unity? Lab Services四个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过3800名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站www.thermofisher.cn

大家好，本周为大家分享一篇发表在Journal of the Ameican Society for Mass Spectrometry上的文章，Top-Down Characterization and Intact Mass Quantitation of a Monoclonal Antibody Drug from Serum by Use of a Quadrupole TOF MS System Equipped with Electron-Activated Dissociation1，通讯作者是来自美国宾州葛兰素史克的John F. Kellie博士。　　最近，SCIEX开发了一种新的Q-TOF质谱系统，该系统具有允许调节的电子能量，能够将快速ECD作为电子激活解离(EAD)技术的一种操作模式，并能实现灵敏的大蛋白检测和定量。此外，通过采用一种新的trap-and-release特性，促进TOF加速器(Zeno阱)中心离子的空间质量聚焦，提高了碎片离子检测的占空比和信噪比(S/N)。本研究使用这个新型质谱仪器，对从血清中提取的一种生物治疗性单克隆抗体(mAb)进行了LC-MS分析，并进行了完整质量的检测、定量和亚单位表征实验。　　样品处理和数据分析的流程如图1所示。简单来说，将研究的治疗性单抗药物注射到恒河猴中，使用自动免疫亲和试剂盒从猴血清中免疫捕获抗体。完整的单抗和还原的轻、重链进行LC-MS分析，并选择重链和轻链进行MS/MS分析和片段离子测定。在SCIEX OS软件中使用完整单抗和还原轻链的MS1数据进行定量。通过ProteoWizard文件转换处理亚基的片段离子数据，然后使用MASH软件套件中的THRASH脱同位素算法进行处理。最后将去卷积质量列表导入ProSight PC进行表征。　　图1. 从血清中免疫捕获GSKmAb的LC-MS样品分析及数据处理流程。治疗性单抗轻链的Top-down MS示例数据如图2所示。抗体亚基达到电荷态分辨率 ，通过去卷积计算平均质量为23197 Da。对于碎片离子，实现了同位素分辨率，从中可以确定碎片离子质量(图2C)。在图2B中，使用SCIEX的内部研究软件，MS/MS谱显示了可能匹配的片段的叠加。图2C展示了去卷积后的片段离子的代表性数据。为了确定匹配的片段离子，使用THRASH脱同位素算法生成了高达30000 Da的精确质量。　　　　图2. 从血清中免疫捕获和TCEP还原后GSKmAb轻链的表征分析示例。该Q-TOF仪器同时配备了EAD和CID功能，虽然两种解离方式可以在一次注射中进行，但作者进行了两次单独的注射。一次注射用于ECD MS/MS，第二次注射用于CID MS/MS。亚基的MS/MS覆盖率如图3A所示。ECD和CID结合时，轻链有49%的氨基酸残基被裂解。对于重链(图3B)，获得了21%的残基覆盖率。　　　　图3. 使用CID和EAD的组合对(A)轻链和(B)重链的表征结果。在这里，b-和y离子用蓝色钝角表示，c-和z离子用红色直角表示。接着，作者介绍了使用提取离子色谱图累积面积和去卷积质谱图累积面积两种方式的完整抗体定量研究。这里，将不同水平的mAb作为标准物质添加到血清中，建立2 ~ 50 μg/mL范围内的浓度与测定面积的线性关系。选取了两个电荷态的离子提取色谱和去卷积质量峰进行面积的累积(图4A, B)。MS数据显示，定量下限时(LLOQ=2 μg/mL)，观察到完整的单抗电荷态分布的S/N约为4。对于定量上限(HLOQ=50μg/mL)，观察到的S/N约为50(图4C, D)。在这里，校准曲线显示出良好的线性响应(所有数据的r2≥ 0.97)，完整单抗定量的准确度和精密度值在15%以内。　　　　图4. 完整单抗定量示例数据，使用基于XICs和去卷积数据的两种不同的定量方法。　　本文介绍了自上而下的数据处理工作流程，这对于从MS/MS数据中获取信息至关重要。在XIC或去卷积质量水平上的生物分子定量也得到了证明，并表明这两种方法都足以从血清中测定单抗浓度。最后，作者预期这类能够实现完整蛋白质表征的多功能质谱系统将被更广泛地用于生物样本分析。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Top-Down Characterization and Intact Mass Quantitation of a Monoclonal Antibody Drug from Serum by Use of a Quadrupole TOF MS System Equipped with Electron-Activated Dissociation

8月19日，记者从中科院微生物研究所获悉，来自该所等单位的研究人员合作研发出一种能够靶向多种冠状病毒入侵受体ACE2的阻断型单克隆抗体h11B11。该抗体能够有效预防和治疗新型冠状病毒及其突变株感染宿主细胞及模式动物，并在非人灵长类动物中展现出良好安全性。同时，作为新冠肺炎病毒入侵宿主的受体的拮抗剂，该抗体表现出优越的广谱性和中和活性，可应对目前流行的各种变异株。相关成果在线发表于《自然通讯》杂志。新型冠状病毒变异株不断出现，且传播速度越来越快。这给新冠病毒的预防控制带来了巨大挑战，亟需研发出可以应对病毒各种变异株的有效疗法。中和抗体疗法已被证明有效，但变异株的出现，则单一位点的单抗必然失效，广谱中和抗体的研发必须提上日程。幸运的是，近日我国科学家已经成果分离出一株人源化的基因工程单克隆抗体（h11B11），该抗体针对人血管紧张素转化酶 2 (ACE2) 受体。所谓单克隆抗体，是一种免疫球蛋白分子，属于生物药物。新冠肺炎疫情暴发后，靶向病毒表面蛋白的单克隆中和抗体成为潜在的有效治疗新冠肺炎的手段，它通过与新冠病毒结合，抑制病毒的活性，保护细胞免受侵害。相比小分子药物，单抗药物机理清晰，对靶点的选择性高、特异性强。好的单抗药物可以高效率击中靶点，减少副作用。该研究成果对新冠肺炎病毒的抗体治疗，尤其针对目前多种变异株具有重大临床应用价值。经过多种冠状病毒的假病毒和真病毒中和评价，该抗体被证实对新冠病毒及其突变株病毒均具很好的抑制活性。同时，该抗体与微生物研究所早期开发的新冠治疗性抗体CB6联合使用能协同提高中和活性。CB6治疗性抗体是一款靶向新冠肺炎病毒S蛋白RBD的抗体，由微生物研究所高福院士团队和严景华研究员团队联合研发，目前已在美国、欧盟、印度等国家获得紧急使用授权。华中科技大学生命学院杜艳芸博士、中国科学院微生物研究所博士后史瑞、北京大学张莹博士为论文的共同第一作者；中国疾病预防控制中心谭文杰研究员、中国食品药品检定研究院王佑春研究员、华中科技大学生命学院王晨辉教授和中国科学院微生物研究所严景华为本文共同通讯作者。

仪器信息网讯 罗氏制药近期宣布，旗下佳罗华（英文名：Gazyva，通用名：奥妥珠单抗）已获得中国国家药品监督管理局（NMPA）正式批准，1类创新药利司扑兰口服溶液用散获批上市。据悉这两款药物分别用于淋巴瘤、脊髓性肌萎缩症治疗！罗氏新一代单抗新药获批，助力淋巴瘤一线治疗罗氏制药中国6月3日宣布，旗下佳罗华（英文名：Gazyva，通用名：奥妥珠单抗）已获得中国国家药品监督管理局（NMPA）正式批准，与化疗联合，用于初治的II期伴有巨大肿块、III期或IV期滤泡性淋巴瘤成人患者，达到至少部分缓解的患者随后的单药维持治疗。据悉，佳罗华一线治疗方案的获批为我国滤泡性淋巴瘤（FL）患者带来了治疗新选择，作为全球首个经糖基化改造的Ⅱ型人源化抗CD20 单克隆抗体，奥妥珠单抗的创新结构和机制可加强肿瘤细胞杀伤力，以实现患者无进展生存率的提升。该项研究结果表明，经过34.5个月中位随访观察，与对照组标准治疗方案相比，奥妥珠单抗联合化疗方案可使进展/复发或死亡风险显著降低34%。近年来滤泡性淋巴瘤在中国的发病率不断升高，而这类肿瘤通常很难被治愈。大多数患者会经历反复复发，且每经复发，治疗难度即升级，越发加重身心压力影响治疗。2020年《中国滤泡性淋巴瘤患者生存状况白皮书》调查所显示，滤泡性淋巴瘤患者深受反复治疗的困扰，怀有对复发的恐惧，较难回归正常社会生活。北京大学肿瘤医院党委书记、淋巴瘤科主任朱军教授表示，“近年来，滤泡性淋巴瘤一线治疗的探索虽然在一路推进，成果却始终不如人意。基于此，奥妥珠单抗的到来不仅有望实现患者对于降低复发和死亡风险、获得更好生活的心愿；其更能为后续治疗带来积极的影响。因而对于该疾病治疗领域而言，这次批准具有里程碑式意义。”罗氏新药利司扑兰在华获批 用于治疗脊髓性肌萎缩症6月17日，国家药监局官网显示，罗氏旗下神经创新药物艾满欣（通用名：利司扑兰）口服溶液用散获批，用于治疗2月龄及以上患者的脊髓性肌萎缩症（SMA）。截至目前，利司扑兰已在包括中国在内的超过40个国家及地区获批，且在全球范围内，已有超过3000位SMA患者接受利司扑兰治疗。SMA的主要发病原因是患者SMN1基因的缺失或突变，导致全身功能性SMN蛋白表达不足，进而影响患者的运动、呼吸、吞咽以及脾脏、心脏、胰腺等多器官，甚至威胁生命。SMA是导致婴儿死亡的最常见遗传疾病之一，重症SMA患儿如不进行有效治疗，80%患儿会在一岁内死亡，很少能存活超过两岁。2018年5月，SMA被列入第一批纳入目录的121种罕见病之一。中华医学会儿科分会内分泌遗传代谢学组副组长、北京大学第一医院主任医师熊晖教授指出，SMA患者越早诊断，越早开始有效治疗，预后越好，甚至在症状前开始治疗，有希望达到同龄非患病儿童的状态。“利司扑兰的获批，意味着SMA的治疗进入了口服治疗的新阶段。”中华医学会儿科分会罕见病学组组长、复旦大学附属儿科医院主任医师王艺教授表示，通过提高全身功能性SMN蛋白水平，利司扑兰可逆转疾病的自然进程，为患者带来多重获益，包括改善运动功能、无事件生存、呼吸和吞咽等。诊断淋巴瘤的通常方法第一，要有明确的病理诊断，目前为止主要的是靠切除活检，而且尽量切除完整的淋巴结或者淋巴组织，现在的病理检查手段已经不局限于显微镜下看细胞了，还包括了流式以及分子病理等等，病理诊断的手段越来越多。第二，分期的诊断，以影像学的为主，最常用的是CT、增强CT的检查，但是对于某些特殊的类型比如弥漫大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，它本身是可以治愈的，对PET高度敏感，所以对于这两种类型推荐在主要的治疗节点选用PET-CT的检查。第三，骨髓的检查，包括骨髓细胞学、骨髓活检等等，因为淋巴瘤的诊断还包括预后分型，所以对于乳酸脱氢酶，对于是否有结外部位受侵，需要特别注意，最常见的结外受侵的部位是胃肠道，所以对于有些特殊的病人可能还涉及到胃镜甚至肠镜的检查。脊髓性肌萎缩症检查方法1.对称性进行性近端肢体和躯干肌无力肌萎缩，不累及面肌及眼外肌，无反射，亢进感觉缺失及智力障碍。2.家族史符合常染色体隐性遗传方式。3.血清肌酸激酶（CK）：患者血清CK水平正常或少数轻中度升高。4.肌电图显示广泛神经源性损害。5.肌活检显示神经源性病理改变。6.基因检测：多重连接探针扩增法（MLPA）、实时荧光定量 PCR（qPCR）、PCR限制性酶切分析法（DHPLC）和变性高效液相色谱等检测SMNl基因第7或第7、8外显子纯合缺失突变。MLPA、qPCR和DHPLC可用于SMNl和SMN2基因拷贝数检测，酶切法可以用于sMNl基因外显子7、8的纯合缺失检测；SMNl基因测序用于检测SMNl基因内是否存在微小突变。

Bevacizumab是重组人源化人血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体，作为美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药，可用于转移性结直肠癌以及非鳞状非小细胞肺癌治疗等。在中国，超过10家贝伐珠单抗生物类似药在研发上市过程中，面对生物类似药分析，充满技术挑战，贝伐单抗生物类似药表征是质量控制关键点之一，分析过程中，抗体肽图分析方法尤为关键，今天我们就聊一聊贝伐单抗生物类似药肽图分析技术方法。 肽图分析（peptide mapping）是研究抗体药物结构组成的重要技术之一，抗体通过酶切处理后，利用色谱结合岛津高分辨Q-TOF质谱LCMS-9030分析，不仅可以对蛋白质氨基酸序列进行分析，同时可以对于相应肽段的翻译化修饰（PTM）进行分析。通过岛津反相HPLC方法分离不同性质的肽段，后续肽段通过高分辨质谱进行一级和二级扫描，通过监测的母离子和子离子匹配相应的肽段氨基酸序列以及存在的修饰。肽图分析是抗体蛋白药物质量控制的重要手段，岛津高分辨质谱可以完成相关所有的分析检测项目。 分析仪器及色谱柱方案 01分析仪器 LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪使高速度、高灵敏度的四极杆质谱与TOF技术的紧密结合。融合岛津先进工程技艺的DNA，打造出速度与出色性能兼备的全新一代高分辨质谱仪，以优异表现轻松胜任定性和定量分析挑战。 LCMS-9030 02液相色谱柱 ● 反相肽段分析专用色谱柱● 寿命长，耐压高，出峰稳定Shim-pack GISS-HP,3um，150*3.0 mm 应用实例 以bevacizumab 生物类似药为例，进行peptide mapping分析，将抗体蛋白通过胰酶酶切后，通过反相色谱质谱分离后进入高分辨Q-TOF质谱进行一级全扫描和二级扫描，高分辨数据提取分析匹配相应的肽段序列，完整流程如下图所示。 图. 利用岛津LCMS-9030抗体测序基本流程以及举例 岛津分析bevacizumab 生物类似药序列分析，通过Shim-pack GISS-HP色谱柱（3um，150*3.0 mm），可以高效分离酶切后的轻重链肽段，最后用LC-MS 9030 进行一级和二级扫描，最佳参数色谱质谱参数如下表所示。 图. 利用岛津LCMS-9030抗体测序详细参数 通过软件分析高分辨数据，进而匹配生物类似药的重链和轻链序列，完成整个抗体的肽图分析。因篇幅有限，以重链肽段序列部分数据进行展示，匹配覆盖率100%，可以说明岛津LCMS-9030 Q-TOF质谱在抗体肽段分析方面具有强大的实力。部分序列分析结果见下图所示。 图.bevacizumab 生物类似药重链测序结果展示（部分展示） 结合前述案例，岛津建立高分辨质谱LCMS-9030针对抗体药物进行肽图分析完整策略，此外对于分子量分析、翻译化修饰、二硫键分析、糖基化分析，LCMS-9030可以完成所有相关抗体药物关键质量属性检测，为用户节能增效，创造最大价值。

在美丽的金鸡湖畔“2017全球视野下中国抗体产业发展之路”大会盛大召开，集结近400位药物抗体领域的大咖巨头齐聚一堂以全球视野来探讨我国抗体药物产业，对从发现、开发、临床研究、产业化到专利和生命周期管理等一系列过程进行系统的疏理探索出真正适合中国国情的抗体药物发展之路。在“中国单抗药物产业发展如何惠及百姓健康”专题讨论中，赛默飞中国区战略客户总监许兴国先生与信达生物制药（苏州）有限公司董事长俞德超、 前FDA大分子CMC资深审评员Audrey Jia、药明生物技术有限公司副总裁李锦才、丽珠医药集团副总裁傅道田及同写意新药英才俱乐部理事长朱迅共同参与讨论。赛默飞中国区战略客户总监许兴国先生参与“中国单抗药物产业发展如何惠及百姓健康”专题讨论赛默飞中国区战略客户总监许兴国先生表示：“科学领域服务的世界领导者，赛默飞旨在帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。赛默飞提供的制药和生物制药解决方案专注制药生产的每一个环节，可以满足GMP/cGMP生产质量管理标准要求，这有助于药企加速新药研发、临床试验进程、降低运营成本，并实现高效生产。创新是赛默飞的DNA，引导技术发展的重要根基,目前每年投入8亿美金于研发。心系中国生物制药企业客户, 助力国内产业发展, 于2016年底揭幕的赛默飞中国生物制品开发实验室，为中国客户量身定做创新的产品和解决方案。在展台区域，参会嘉宾不仅能与赛默飞技术人员充分交流, 并能索取丰富的资料, 包括: 从前期研发、工艺开发、生产到贯穿单抗药物整个生命周期的工艺质量监测方案。现场赛默飞展台 赛默飞生物制药各个环节全流程解决方案：研发阶段: 提供从药物靶点筛选、构建表达、体外筛选等方案及实验室研发设备与耗材工艺开发放大: 提供细胞株筛选、培养工艺、一次性技术、纯化工艺、制剂罐装工艺质量监测: Orbitrap高分辨质谱、CE/HPLC/IC-MS联用、生物制药数据处理软件提供贯穿单抗药物整个生命周期的解决方案，包括抗体药表征、杂质辅料检测和分析等，此外赛默飞也提供病毒和微生物检测、工艺在线检测等方案智能解决方案: Watson LIMS实验室数据管理系统、变色龙色谱数据系统确保实验室数据管理有效、合规。超强工艺设备兼容性的控制硬件和软件系统SmartFactory实现批生产自动化控制售后服务: 从传统的服务例如:专家在线技术支持、现场/返库维修、零配件供应、保修服务计等,转变提升对药厂企业提供多元化、定制化服务，为实验室人员节省宝贵时间，并提高仪器利用率等。1、为保证内容正常显示，图片请使用本地上传。2、新闻内容不得添加电话、邮箱、QQ、网址、二维码等任何联系方式，新闻底部会自动添加联系我们的功能。

贝伐单抗是重组的人源化单克隆抗体。2004年2月26日获得FDA的批准,是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。本文应用 SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)将贝伐单抗的重链和轻链进行分离,使用电转印方法将 SDS-PAGE膜上的样品转移到PPSQ使用的PVDF膜上,使用蛋白质测序仪PPSQ-53A对贝伐单抗进行N-末端氨基酸序列分析。实验结果显示测定的重链和轻链的N-末端氨骏序列与理论相符,验证了方法的准确性,表明此方法适合抗体药N-末端的氨基酸序列分析。本文可作为分析抗体药N-末端氨基酸序列分析时的参考。 了解详情，敬请点击《蛋白质测序仪PPSQ-53A分析贝伐单抗N-末端氨基酸序列》关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。

p　　阿法拉伐近日宣布，截至7月，阿法拉伐的高速碟片离心机已广泛用于90%以上的国内单抗药物生产企业中。/pp style="text-align: center "img width="600" height="332" title="Q.jpg" style="width: 441px height: 254px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/b7373ddf-c48a-47a8-b57c-9ad59e28df79.jpg"//pp　　《我不是药神》全国热映，让人们再次关注到了社会上的特殊群体 -- 白血病患者的生存现状，治疗慢性粒细胞白血病的药物价格昂贵，让仿制药的贩卖商和白血病患者们都铤而走险，徘徊于触犯法律的边缘。影片中的抗癌药物“格列卫”是一种化学制剂的抗肿瘤药物，虽然具有靶向性，只消灭有害的癌细胞，但毕竟是化学合成的药物，有一定的副作用。现实中，我们和电影中的程勇一样，相信会越来越好。现实也的确如此，梦想已经照进现实。/pp　　中国的生物制药产业发展迅猛，技术创新不断涌现。生物工程制备的药物是一种大分子蛋白药物，通过生物细胞表达的药物，产品更单一，副作用更微小。国内的生物制药企业正大天晴、石药欧意均已研发生产了治疗多种癌症的单克隆抗体药物。/pp style="text-align: center "img width="600" height="199" title="W.jpg" style="width: 441px height: 160px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/831bb7a8-04a7-4b17-aba9-6a88809041a4.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "阿法拉伐高速碟片离心机在单克隆抗体药物分离应用中“柔和有度”/span/pp　　strong在生产单克隆抗体药物的过程中，哺乳动物细胞会经过分离和培养液澄清纯化工艺-细胞培养- 离心分离- 深层过滤- 进一步纯化，工艺中会用到一款阿法拉伐核心产品 -- 高速碟片离心机 CF 系列，/strong离心分离工序后，进入后续深层过滤的膜包数量会大幅减少，从而降低了生产成本。在离心分离工艺中，strong客户时常担心的问题在于：1)由于哺乳动物的细胞无细胞壁，对剪切力非常敏感 2)培养液蛋白含量丰富易产生气泡。因此对离心机的分离性能要求非常高。/strong在分离时，细胞一旦破碎，核酸及杂蛋白就会释放，以及气泡的产生都会严重影响下游深层过滤和层析，最终影响抗癌药物的质量和疗效。/pp style="text-align: center "img width="600" height="533" title="R.jpg" style="width: 426px height: 308px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/64a31659-5acb-4345-903a-f97f963344c5.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="font-size: 14px "阿法拉伐高速碟片离心机/span/pp　　保障生命的安全，尤其是用药的安全，本身是一件严肃的事。strong阿法拉伐 CF 系列高速离心机具有独一无二的下进料专利设计，这让加速剪切力变得缓慢而柔和，最大可能地保证了细胞的完整性。/strong同时又以较高的分离因素运行，更好地去除培养过程中因细胞自溶产生的少量碎片。strong其独特的全密封设计，杜绝了气泡产生的可能性，同时又隔绝了空气，这让离心过程温升小，保持蛋白的活性。并且，配备了CIP 在位清洗及 SIP 在线蒸汽灭菌，实现了360度无死角清洗。/strong可以说，这款离心机全方位守护了高品质的单抗药物的生产，通过“柔和有度”的低剪切分离技术，最大程度降低了下游的纯化难度，确保目标蛋白的活性。/pp /p

p　　strong中国首个肺癌免疫治疗PD-1单抗药物Opdivo(欧狄沃，纳武利尤单抗注射液)的价格公布了。中国O药上市建议零售价：40mg/10ml 4591元(RMB)，100mg/10ml 9260元(RMB)。/strong/pp style="text-align: center "strongimg width="598" height="401" title="1.jpg" style="width: 428px height: 250px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/5a14dbdc-444e-40d6-9295-869b7501666c.jpg"//strong/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 176, 240) font-size: 18px "strong亲民价格/strong/span/pp　　很多患者可能还是会疑惑，那么这个价格较之之前国外用药，或者是港澳台用药便宜了多少呢?我们一起来算算吧。/pp　　PD-1/PD-L1单抗注射剂是按照患者体重来计算用药量的，所以价格也是和患者体重有关。那么按照这样，大家可以参照下面的表格，来看看对比。/pp　　先来看看所有PD-1/PD-L1抗体在国外的价格吧/pp style="text-align: center "img width="599" height="444" title="2.jpg" style="width: 436px height: 278px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/97a861fc-efb5-483f-8bbf-703c0d74aac5.jpg"//pp　　下面是常用的两种药物澳门购药和国内的价格对比/pp style="text-align: center "img width="599" height="202" title="3.jpg" style="width: 442px height: 137px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/f91d37cc-e144-457e-a8db-0342b51e8d2d.jpg"//pp　　也就是说，中国的O药较之前港澳的价格足足降低了一半。但是这个价格确实对于很多家庭来说是很困难的。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 176, 240) font-size: 18px "strong赠药与医保/strong/span/pp　　那么这次的也提到了关于赠药和医保的政策，仍然在谈判，相信不久的将来会有好消息。另外，关于是否进入医保，也在商讨。如果不能进入医保的话，就会有相关的赠药政策，而且所有符合条件的患者均可以从用药第一天开始计算!大家一定要记得留好购药的发票哦!/pp　　span style="color: rgb(0, 176, 240) "温馨提醒：/span/pp　　要特别注意的是，未来赠药的人群，必需是O药说明书上面的适应症的患者：strongEGFR阴性和ALK阴性、既往接受过含铂方案化疗后疾病进展或不可耐受的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)成人患者。/strong/pp style="text-align: center "　span style="font-size: 18px "strongspan style="color: rgb(0, 176, 240) "　如何购买?/span/strong/span/pp　　O药将在2018年8月28号开始售卖，因为医院采购药品的周期和流程比较长，新药上市时不能很快的进到医院，新药上市后会先在DTP药房进行销售。/pp　　据我们了解，O药上市后将同时覆盖大约五十个城市，每个城市有1-2家药店销售，具体城市包括北京、石家庄、唐山、大庆、哈尔滨、长春、大连、沈阳、济南、青岛、烟台、威海、太原、西安、天津、乌鲁木齐、东莞、佛山、湛江、广州、深圳、珠海、成都、泸州、重庆、合肥、安阳、洛阳、南阳、郑州、武汉、长沙、常州、淮安、南京、南通、苏州、泰州、无锡、徐州、盐城、连云港、扬州、上海、福州、厦门、杭州、宁波、绍兴、台州、温州等。/pp　　去外地购药的患者应该注意，O药需要保证strong2-8℃贮存和运输/strong，否则会影响药品质量。/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) "strongspan style="font-size: 18px "　　专家说/span/strong/span/pp　　strong国内肺癌专家吴一龙教授/strong也曾表示：“与传统治疗方式不同，免疫肿瘤治疗并不直接作用于肿瘤本身，而是通过激活患者自身的免疫系统来抗击肿瘤，具有毒副作用小、疗效持久等特点。作为国内首个获批上市的免疫肿瘤(I-O)治疗药物，欧狄沃™ 为医生及患者提供了全新的治疗选择，在中国有望成为非小细胞肺癌二线治疗的新标准。”/pp　　“在全球大多数国家和地区，纳武利尤单抗注射液已成为二线非小细胞肺癌的标准治疗。作为中国目前唯一获批用于肺癌治疗的PD-1抑制剂，纳武利尤单抗注射液的上市毋庸置疑将成为中国癌症治疗领域的里程碑，有望填补国内免疫肿瘤治疗的空白，为更多中国晚期非小细胞肺癌患者带来长期生存的希望。”/pp　　“要实现‘健康中国2030’的目标，做好肺癌这一中国第一癌症的防治工作显得尤为重要。我们既要促进创新药物的可及，同时也需要切实提升创新服务的可及，通过探索创新性的医疗模式，真正做到以患者为中心。”/pp/p

p style="text-align: justify "　　近年来，肿瘤免疫治疗(Immunology Oncology Therapy， I-O)已成为晚期恶性肿瘤治疗的重要手段之一。肿瘤免疫治疗并不直接攻击癌细胞，而是通过激活人体自身免疫系统来抗击肿瘤，具有良好的安全性及耐受性。PD-1/L1 抗体药物作为肿瘤免疫治疗的代表药物，在晚期恶性肿瘤治疗中取得了巨大的成功。虽然患者用药后初始应答相对较慢，但是一旦从 PD-1/L1 抗体的治疗中产生应答，可以明显提升一部分患者的长期生存率。br//pp style="text-align: justify "　　正常情况下，人体内的T细胞可以监测并清除肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞非常狡猾，其表面的PD-L1/PD-L2可以与T细胞表面的PD-1结合，影响T细胞功能，使癌细胞躲避免疫系统的攻击。PD-L1配体除了与PD-1结合外，还能以受体形式与CD80配体结合，抑制T细胞活性。/pp style="text-align: justify "　　从2014年，全球首款PD-1抑制剂Opdivo问世开始，到2018年年底，FDA批准了6款 PD-1/L1 单抗药物，三款PD-1抑制剂：默沙东的 Keytruda 、 BMS 的 Opdivo、赛诺菲(Sanofi)和再生元(Regeneron)联合开发的Libtayo 三款PD-L1抑制剂：罗氏的 Tecentriq、辉瑞和默克联合推出的Bavencio 以及阿斯利康的 Imfinzi。在中国，国家药品监督管理局CDE批准君实生物的特瑞普利单抗和信达生物/礼来制药联手开发的信迪利单抗注射液(商品名：达伯舒® )。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/0d9d46cd-aeb3-4e96-8f77-c556d0d06ab7.jpg" title="1.jpg" alt="1.jpg"//ppspan style="text-align: justify "　　2014年7月4日，BMS的Opdivo在日本获批，成为全球首个获得监管机构批准的PD-1抑制剂。截止到2018年12月25日，Opdivo在FDA和中国的获批历史如下。/span/pp style="text-align: justify "　span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　FDA获批历史/strong/span/pp style="text-align: justify "　　2014年12月22日/pp style="text-align: justify "　　经治转移性黑色素瘤/pp style="text-align: justify "　　2015年3月4日/pp style="text-align: justify "　　经治转移性鳞状非小细胞肺癌/pp style="text-align: justify "　　2015年10月1日/pp style="text-align: justify "　　与Yervoy® 联合用于BRAF野生型转移性黑色素瘤的治疗。/pp style="text-align: justify "　　2015年10月9日/pp style="text-align: justify "　　经治转移性非鳞状非小细胞肺癌/pp style="text-align: justify "　　2015年11月23日/pp style="text-align: justify "　　抗血管生成治疗进展的晚期肾细胞癌/pp style="text-align: justify "　　2015年11月23日/pp style="text-align: justify "　　BRAF野生型转移性黑色素瘤一线治疗/pp style="text-align: justify "　　2016年1月23日/pp style="text-align: justify "　　转移性黑色素瘤(不限BRAF突变状态)/pp style="text-align: justify "　　2016年1月23日/pp style="text-align: justify "　　与Yervoy® 联合用于转移性黑色素瘤的治疗(不限BRAF突变状态)。/pp style="text-align: justify "　　2016年5月17日/pp style="text-align: justify "　　晚期经典霍奇金淋巴瘤/pp style="text-align: justify "　　2016年11月10日/pp style="text-align: justify "　　头颈部鳞状细胞癌(二线)/pp style="text-align: justify "　　2017年2月2日/pp style="text-align: justify "　　经治转移性尿路上皮癌(一种膀胱癌)/pp style="text-align: justify "　　2017年8月1日/pp style="text-align: justify "　　单药用于既往接受化疗(氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康)后疾病进展的高微卫星不稳定性(MSI-H)或 错配修复缺陷(dMMR)的转移性结直肠癌儿童(12岁及以上)和成人患者/pp style="text-align: justify "　　2017年9月22日/pp style="text-align: justify "　　索拉菲尼治疗进展的肝细胞癌/pp style="text-align: justify "　　2017年12月20日/pp style="text-align: justify "　　累及淋巴结或转移性黑色素瘤完全切除后的辅助治疗/pp style="text-align: justify "　　2018年4月16日/pp style="text-align: justify "　　与Yervoy® 联合用于中高危晚期肾细胞癌的治疗(一线)/pp style="text-align: justify "　　2018年7月10日/pp style="text-align: justify "　　与Yervoy® 联合用于既往接受化疗(氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康)后疾病进展的高微卫星不稳定性(MSI-H)或 错配修复缺陷(dMMR)的转移性结直肠癌儿童(12岁及以上)和成人患者。/pp style="text-align: justify "　　2018年8月16日/pp style="text-align: justify "　　既往接受过铂类化疗和至少一种其它疗法后疾病进展的转移性小细胞肺癌(SCLC)患者/pp style="text-align: center "strong中国获批详情/strong/pp　　6月15日，国家药品监督管理局批准Opdivo在中国上市，用于治疗表皮生长因子受体(EGFR)基因突变阴性和间变性淋巴瘤激酶(ALK)阴性、既往接受过含铂方案化疗后疾病进展或不可耐受的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)成人患者。这是中国首个也是目前唯一在中国获批用于肺癌治疗的PD-1抑制剂。目前国内售价：100mg 约9260 40mg 约4591./pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/c9e3d865-78b0-4c44-8cfd-e35c0ad9de43.jpg" title="2.png" alt="2.png"//pp style="text-align: justify "　　2014年9月4日，美国FDA批准默沙东的Keytruda用于黑色素瘤的治疗，成为FDA首个批准上市的PD-1抑制剂。截止到2018年12月25日，Opdivo在FDA和中国的获批历史如下。/pp style="text-align: justify "　　2014.09.04/pp style="text-align: justify "　　用于已经接受过Ipilimumab(伊匹单抗)治疗但仍有进展，或对Ipilimumab和BRAF抑制剂双重耐药的BRAF V600基因变异的晚期黑色素瘤患者。Keytruda成为FDA首个批准上市的PD-1抑制剂。/pp style="text-align: justify "　　2015.10.02/pp style="text-align: justify "　　肿瘤表达PD-L1(TPS≥1%)、含铂化疗期间或之后疾病进展的转移性非小细胞肺癌(NSCLC)。/pp style="text-align: justify "　　2015.12.18/pp style="text-align: justify "　　一线治疗晚期(不可切除或转移性)黑色素瘤。/pp style="text-align: justify "　　2016.08.05/pp style="text-align: justify "　　用于含铂化疗后疾病进展的复发性/转移性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者。/pp style="text-align: justify "　　2016.10.24/pp style="text-align: justify "　　一线治疗PD-L1表达强阳性(≥50%肿瘤细胞表达PD-L1)，EGFR和ALK突变均为阴性的转移性非小细胞肺癌。/pp style="text-align: justify "　　2017.03.15/pp style="text-align: justify "　　难治性经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma ,cHL)，或者三次以上主要疗法治疗后疾病复发的成人与儿童患者。/pp style="text-align: justify "　　2017.05.10/pp style="text-align: justify "　　联合培美曲塞+卡铂一线治疗转移性非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)，不受PD-L1表达的限制。/pp style="text-align: justify "　　2017.05.18/pp style="text-align: justify "　　(1)一线治疗：不适合含顺铂(cisplatin)化疗方案的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者，该适应症是基于肿瘤缓解率和缓解持续时间加速批准 /pp style="text-align: justify "　　(2)二线治疗： 接受含铂化疗期间或化疗后病情进展、或接受含铂化疗新辅助治疗或辅助治疗12 个月内病情进展的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者。/pp style="text-align: justify "　　2017.05.23/pp style="text-align: justify "　　里程碑式的批准：治疗成人及儿童的不可切除或转移性、微卫星高度不稳定(microsatelliteinstability-high，MSI-H)或错配修复缺陷(mismatch repair deficient，dMMR)的实体瘤患者。/pp style="text-align: justify "　　2017.09.22/pp style="text-align: justify "　　复发性局部晚期或转移性胃癌/胃食管结合部腺癌，且肿瘤表达PD-L1的患者(经FDA批准的检测试剂检测)。/pp style="text-align: justify "　　2018.06.12/pp style="text-align: justify "　　复发或转移性宫颈癌宫颈癌患者，病情在化疗中或化疗后出现进展，肿瘤表达PD-L1(CPS≥1)。/pp style="text-align: justify "　　2018.06.13/pp style="text-align: justify "　　用于治疗难治性原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)的成人和儿科患者，至少使用两线治疗后仍旧复发。/pp style="text-align: justify "　　2018.08.20/pp style="text-align: justify "　　联合培美曲塞和卡铂一线治疗转移性非鳞状非小细胞肺癌(NSqNSCLC)，EGFR和ALK突变均阴性。/pp style="text-align: justify "　　2018.10.30/pp style="text-align: justify "　　与卡铂和紫杉醇或白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)联合应用成为转移性鳞状NSCLC患者的一线治疗方案。/pp style="text-align: justify "　　2018.11.09/pp style="text-align: justify "　　用于治疗先前接受过索拉非尼(Nexavar)治疗的肝细胞癌(HCC)患者。/pp style="text-align: justify "　　2018.12.19/pp style="text-align: justify "　　FDA加速批准K药用于治疗复发的局部晚期或转移性Merkel细胞癌(MCC)。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/b3a5ebf5-979b-4b88-8c24-43f750fae53a.jpg" title="3.png" alt="3.png"//ppspan style="text-align: justify "　　2018年12月17日，国家药品监督管理局有条件批准首个国产PD-1单抗——特瑞普利单抗注射液(商品名：拓益)上市。这是我国企业独立研发、具有完全自主知识产权的生物制品创新药品，也是国内批准的首款国产PD1单抗。用于治疗既往标准治疗失败后的局部进展或转移性黑色素瘤。特瑞普利单抗注射液可以通过双重作用机制抑制肿瘤。目前价格尚未公布，传言价格会明显下调，值得期待。/span/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/6593596d-5f75-4f6a-9767-66c5c1d561c2.jpg" title="4.png" alt="4.png"//pp style="text-align: justify "　　2018年12月27日，国家药品监督管理局正式批准信达生物和礼来制药联手开发的PD-1抑制剂——信迪利单抗注射液(商品名：达伯舒® )上市，针对的适应症是至少经过二线系统化疗的复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤的治疗。这是国内批准的第二款国产PD1单抗。价格依然让人期待。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/3d2c1da8-4049-46d7-93bb-240d3000ad4b.jpg" title="5.png" alt="5.png"//ppspan style="text-align: justify "　　阿特珠单抗是罗氏制药PD-L1药物，2016年5月18日成为FDA批准的首个PD-L1抑制剂。/span/pp style="text-align: justify "　　2016年5月18日/pp style="text-align: justify "　　Tecentriq(atezolizumab)获得FDA批准用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌，成为FDA批准的首个PD-L1抑制剂。/pp style="text-align: justify "　　2016年10月18日/pp style="text-align: justify "　　FDA批准Tecentriq用于治疗铂类化疗后疾病进展转移性非小细胞肺癌患者。/pp style="text-align: justify "　　2017年4月17日/pp style="text-align: justify "　　FDA批准Tecentriq用于无法化疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌。2018年8月16号，FDA对其中的细节进行了修改。/pp style="text-align: justify "　　2018年12月6日/pp style="text-align: justify "　　FDA批准 Tecentriq与bevacizumab (Avastin)、卡铂和紫杉醇(ABCP)联合使用，作为转移性非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)患者的一线治疗药物，排除EGFR/ALK突变的患者。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/24844936-34ff-4b30-af23-ab32c3b4e605.jpg" title="6.png" alt="6.png"//ppspan style="text-align: justify "　　Bavencio(avelumab)为全人源化的PD-L1单抗，由辉瑞和默克联合推出。2017年3月23日成为FDA批准的第二个PD-L1抑制剂。/span/pp style="text-align: justify "　　2017年3月23日/pp style="text-align: justify "　　FDA批准Bavencio用于12岁及以上患有转移性Merkel细胞癌(MCC)的成人和儿科患者，这是第一个用于MCC的PD-1药物。/pp style="text-align: justify "　　2017年5月9日/pp style="text-align: justify "　　FDA批准Bavencio用于治疗晚期或转移性尿路上皮癌(UC)患者，患者之前接受过铂类化疗，或者接受铂类化疗作为新辅助治疗或辅助治疗后12个月内疾病进展。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/961ada6c-9e38-4a5e-ae6a-5cb80983f57a.jpg" title="7.png" alt="7.png"//pp style="text-align: justify "　　Imfinzi(通用名durvalumab)是阿斯利康的PD-L1抗体，2017年5月1日成为FDA批准的第三个PD-L1抑制剂。/pp style="text-align: justify "　　2017年5月1日/pp style="text-align: justify "　　FDA批准Imfinzi用于以含铂类药物化疗或化疗后疾病进展的患者，或术前术后以含铂类药物化疗的12个月内疾病进展的患者。/pp style="text-align: justify "　　2018年2月16日/pp style="text-align: justify "　　FDA批准Imfinzi用于治疗无法手术切除的局部晚期(III期)非小细胞肺癌，在接受标准含铂的同步放化疗(CRT)后，未发生疾病进展的患者，/pp style="text-align: justify "　　PD-1与PD-L1药物各有优劣，PD-1抑制剂无法阻断PD-L1与CD80的结合，而PD-L1抑制剂无法阻断PD-1与PD-L2的结合。随着科学家和医务工作者们对于肿瘤机理和药物治疗的不断改进和创新，新的PD-1/PD-L1也将会陆续诞生。为了使患者获得更高的生存获益，研究人员也在积极探索PD-1/L1单抗与化疗、放疗、抗血管靶向治疗和其他免疫治疗的联合治疗方案。/p

p style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/e109bf33-d65f-4f78-833b-8cb20f1aa172.jpg" title="白帆生物新单抗生产基地开工仪式正式启动.jpg" alt="白帆生物新单抗生产基地开工仪式正式启动.jpg" width="546" height="364" style="width: 546px height: 364px "//pp style="text-align: center "strong白帆生物新单抗生产基地开工仪式正式启动/strong/pp　　2019年3月22日，白帆生物科技(上海)有限公司新单抗生产基地开工仪式在上海临港举行，此生产基地由赛多利斯与白帆生物合作打造，是集研发、临床、生产和销售为一体的上海最大的单抗产业化基地之一，强强联合将加速中国单抗药物的产业化和商业化进程，实现中国单抗制药产业的飞跃发展。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/5b5a722e-6f55-4b46-9f29-453a9a43d7cd.jpg" title="白帆生物执行董事总经理邹洵开幕致词.jpg" alt="白帆生物执行董事总经理邹洵开幕致词.jpg" width="549" height="366" style="width: 549px height: 366px "//pp style="text-align: center "strong白帆生物执行董事总经理 邹洵 开幕致词/strong/pp　　“白帆生物作为专业从事单抗药物生产和销售的高科技企业，此次在临港奉贤智造园投资建设单抗产业化基地，是宝船张江研发中心的进一步延伸。此举将完善公司在单抗产业内的布局，打造一个从研发、小试/中试、临床到商业化生产的全产业链平台，建成后的生产总规模可达12000L。”白帆生物执行董事总经理邹洵表示，“ 通过与赛多利斯的深入合作，白帆生物倾力打造的‘无交叉抗体工厂— NONCROS™ 平台’，既可满足多产品共线生产的合规要求，又可使生产效率和性价比达到最高水平。从而助力中国生物制药事业的发展，早日生产出疗效好、价格低的单抗药物，造福于民。”/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/629ee7cf-d42d-4202-a3af-c8c6e98a05be.jpg" title="赛多利斯执行董事René Fá ber在开幕仪式发表演讲.jpg" alt="赛多利斯执行董事René Fá ber在开幕仪式发表演讲.jpg" width="543" height="354" style="width: 543px height: 354px "//pp style="text-align: center "strong赛多利斯执行董事René Fá ber在开幕仪式发表演讲/strong/pp　　“赛多利斯作为行业先进理念和创新技术的引领者，始终致力于为生物制药企业提供安全、创新、经济的一体化解决方案，同时将质量源于设计理念运用于早期工艺开发至商业化生产的各个阶段，帮助客户加速研发进入临床的步伐、保障稳健生产工艺，大力支持中国抗体药物的快速发展。”赛多利斯执行董事René Fá ber表示，“白帆生物与赛多利斯已有多年的合作经验，此次的深度携手整合了赛多利斯在生物制药领域的先进技术和创新理念以及白帆生物丰富的制药工艺研发经验，进一步开创了国内单抗药物发展的新局面。同时，赛多利斯未来将有更多技术产品实现本地化生产，立足于中国市场需求，更好地服务中国客户，从而助力中国单抗制药产业更快发展。”/pp　　白帆生物此次开工建设的“无交叉抗体工厂NONCROS™ ”单抗生产平台中，赛多利斯设计搭建了一条200L单抗生产中试线以及两条2000L商业生产线。其中产品涉及高通量平台，玻璃罐和不同规模的一次性细胞培养平台，一次性技术平台以及下游分离纯化平台，同时搭配赛多利斯独有的冻融技术解决方案，完整涵盖了工艺开发、中试放大和商业化生产的各个阶段。完美的产品组合和先进的平台技术，确保可重复使用生物反应器和一次性使用生物反应器之间完美工艺转移，加速工艺开发过程，缩短产品生产周期，实现安全、投资、效益三者的最佳平衡，助力NONCROS™ 无交叉抗体生产平台高效数字化运行，提高药物产量和服务效率。/pp　　近年来中国生物制药行业迅速发展，赛多利斯作为生物工艺完整解决方案的提供者，关注生物制药的每个环节，同时致力于化科学为解决方案“turning science into solutions”的理念，满足生物制药工业科技快速变化的要求，从而加速中国生物制药行业的研发与产业化，促进中国制药行业的创新与发展。/pp　　strong关于赛多利斯斯泰帝/strong/pp　　赛多利斯斯泰帝 (Sartorius Stedim Biotech) 是国际领先的生物制药行业设备和服务的供应商，为全球生物制药的开发与生产提供安全、及时、经济的一体化解决方案。作为完整解决方案的供应商， 赛多利斯斯泰帝提供几乎涵盖生物制药工艺所有步骤的产品组合。公司致力于推广一次性使用技术和增值服务，满足生物制药行业快速发展的技术需求。公司总部位于法国欧巴涅，在巴黎的欧洲交易所上市 因其位于欧洲、北美和亚洲的生产与研发中心以及遍布全球的销售网络而享誉世界。/ppspan style="text-decoration: underline " /spanbr//pp style="text-align: center "strong仪器信息网生命科学官微“span style="color: rgb(0, 112, 192) "3i生仪社/span”上线啦!关注了解更多生命科学干货资讯！/strong/pp style="text-align: center "img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/a75cb2a1-2473-4c33-823f-8cfd8dfc0b66.jpg" title="qrcode_for_gh_91d290758d40_258.jpg" alt="qrcode_for_gh_91d290758d40_258.jpg"//p

FDA授予阿斯利康单抗MEDI8852治疗A型流感感染的快车道地位英国制药巨头阿斯利康（AstraZeneca）及旗下全球生物制剂研发部门MedImmune近日宣布，FDA已授予单克隆抗体MEDI8852用于治疗A型流感病毒住院患者的快车道地位（Fast Track designation）。FDA的快车道项目，旨在加速开发及审查用于治疗严重疾病并填补未满足医疗需求的新药。目前，MEDI8852正处于Ib/IIa期临床开发，调查单剂量静脉注射MEDI8852作为单药疗法或联合奥司他韦（oseltamivir），用于由A型流感病毒导致的急性、无并发症流感成人患者的疗效和安全性。最近，在健康成人受试者中成功完成的一项I期研究表明，MEDI8852具有可接受的安全性和药代动力学属性，支持了该药用于流感患者治疗的进一步临床开发。此次快车道地位，也是自2014年以来，阿斯利康在感染性疾病治疗领域收获的第4个快车道地位，突显了该公司在该领域的研发实力。目前，旗下MedImmune在感染性疾病领域正在推进的大多数临床开发项目均获得了此荣誉。2015年4月，FDA授予MEDI8897快车道地位，这是一种单抗药物，用于预防婴儿中由呼吸道合胞病毒（RSV）引发的严重呼吸道疾病。2014年9月，FDA授予MEDI3902快车道地位，该药用于预防由铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）引起的医院获得性肺炎，这是一种高度耐药菌，可在住院患者中导致严重的疾病。2014年底，FDA授予MEDI4893快车道地位，该药用于ICU患者预防由金黄色葡萄球菌（S.aureus）引发的肺炎，该病菌也往往是多药耐药菌。MEDI8852是一种实验性人IgG1κ单克隆抗体（mAb），通过输液给药。MEDI8852的前驱分子由Humabs BioMed公司从人的记忆B细胞中分离获得，MedImmune进行了进一步的优化，增强了其中和能力。MEDI8852能够结合至血凝素蛋白（hemagglutinin）茎部的一个区域，这在A型流感病毒所有亚型中均高度保守。目前，MEDI8552正开发用于因A型流感住院的患者。尽管该药正在开发作为一种季节性流感的治疗药物，但可以预期的是，它也有望用于预防流感大流行。当前，流感病毒感染仍然是全球健康和世界经济的一个严重威胁。每年的流行病学调查结果显示，在全球范围内，大约300-500万严重病例，25-50万死亡病例，而在流感大流行期间，死亡率可能更高。鉴于耐药性的出现，抗病毒药物较短的治疗窗口，以及广泛的交叉保护性疫苗的缺乏，对能够有效治疗流感方面的新药方面，仍存在着重要的远未满足的医疗需求。

p　　生物医药产业是高新科技产业，随着生物医药产业的快速发展，我国生物制药产业也进入了快速上升期，而单克隆抗体药物和细胞免疫治疗技术在整个产业中无疑是最为重要的组成部分。目前生物制药产业发展面临人才短缺的挑战，而我国高等专业教育尚不能满足生物制药产业发展的需求，大部分生物医药相关专业毕业生缺乏该产业急需知识和技能而面临就业难。在职职工专业教育是生物医药产业正常运营的基础保障，更是各国药政机构监管的重点。中国蛋白药物质量联盟将针对我国生物医药产业发展现状和国际产业技术的发展进步，特别是各国药政监管要求，推出生物制药产业技术系列职业培训。本期设为单抗及重组蛋白研发生产技术和工艺。/pp　strong　单抗及重组蛋白研发生产技术和工艺/strong/pp　　根据数据统计，2015年全球药品市场规模近 10700 亿美元，2016 年全球药品市场规模11080 亿美元，2017年全球药品市场规模约为 11290 亿美元。在未来五年内，全球药品支出将会上升30%，2018年将达到11700亿美元，2022 年可达约14400亿美元。2016年全球最畅销药物榜单中生物专利药占据主要地位，仅销量前10种药物年销售额超800亿美元。单抗及重组蛋白药物等生物药的市场需求巨大，形成鲜明对比的是，我国单抗及重组蛋白药物研发能力的薄弱，研发技术壁垒高，我国单克隆药物技术和国外先进水平有很大差距。单抗及重组蛋白的巨大市场需求和国内现阶段的技术发展水平，促使我们必须降低新药的研发风险，增强单抗及重组蛋白药物的研发生产技术能力。/pp　　strong一、主办单位/strong/pp　　中国蛋白药物质量联盟/pp　　strong二、培训时间/strong/pp　　时 间：2018年09月11日 PM 1:30-5:30/pp　　地 点：北京兴基铂尔曼酒店，北京亦庄荣华南路12号(三楼巴黎厅)/pp　　(晚餐：下午5:30-8:00 北京兴基铂尔曼酒店 一楼餐厅)/pp　strong　三、培训目标人群/strong/pp　　本次培训旨为生物医药产业的技术研发负责人、蛋白药物研发及生产业务骨干温故知新 为职场新人、在校大学生以及对单抗及重组蛋白研发生产技术和工艺感兴趣的相关人员夯实基础。/pp　　strong四、培训主讲人及题目/strong/pp　　1、strong李荣皓博士/strong，珠海恺瑞生物科技有限公司董事长兼创始人。李荣皓博士从1984年开始使用无血清细胞培养技术，曾涉足CHO细胞培养及重组蛋白生产工艺优化、多种原代细胞及干细胞等无血清细胞培养，在无血清细胞培养技术应用方面具有很深的造诣。此次培训班李博士将重点介绍其在美国Genentech等公司工作期间所积累的CHO细胞培养液开发以及其它细胞无血清培养技术的应用经验，并与听众互动，共同探讨听众有关重组蛋白表达细胞、干细胞、T细胞、疫苗生产细胞以及原代细胞等多种类型细胞的无血清培养技术问题。和大家一起分析和讨论技术细节。/pp　　strong主讲题目：重组蛋白药研发及生产中的无血清细胞培养技术/strong/pp　　2、strong史艳轻/strong，美国贝克曼库尔特有限公司，应用工程师。从事颗粒特性产品应用近六年，有丰富的样品颗粒分析和检测经验。/pp　　strong主讲题目：颗粒分析技术在单抗药物研发和质控领域相关方案/strong/pp　　3、strong滕希/strong，伯乐生命科学产品(上海)有限公司技术支持经理，毕业于中国农业科学院，专业是生物技术，曾在华大基因从事分子生物学方向应用相关研究现就职于美国Bio-Rad公司，在定量PCR、数字PCR等技术应用领域有着丰富的经验。/pp　　strong主讲题目：质量控制检测PCR技术介绍/strong/pp　　4、strong刘彬/strong，Bio-rad资深应用解决方案专家。毕业于大连理工大学，先后从事与北京韩美、北京诺和诺德，目前就职与Bio-Rad公司，有着十多年蛋白质纯化经验。/pp　　strong主讲题目：NGC下一代层析系统介绍及蛋白残留的验证/strong/pp　　5、strong孙乐/strong，博士，北京千人计划专家、北京师范大学兼职教授以及北京AbMax生物科技公司创始人。孙博士具有超过30年的抗体研究及抗体药研发经验，早在1989年即赴美以博士后身份与曾经同Jennifer Mather博士共同开创近代无血清细胞培养技术的David Barnes博士开展合作科学研究，积累了丰富的无血清细胞培养、胚胎干细胞以及表皮生长因子信息传递等领域的研究经验。孙博士后成为美国Upstate Biotech公司的研发总监，负责开发生物科技热门研究领域包括癌症研究的研发试剂，以每年推出200多款产品的高速帮助公司迅速成长为行业知名生物试剂公司。2000年孙博士离开Upstate Biotech，并先后于2000年在美国巴尔的摩市创办A& G Pharmactuticals公司、2004年在北京创办Welson Pharmaceuticals 以及2006年创办AbMax公共并担任公司董事长及CEO至今。AbMax利用独有的抗体产生技术开发低免疫原性及高稳定型抗体，为客户提供新一代抗体药研发服务，成为抗体新药研发技术领域提供了一个重要的发展方向。/pp　　strong五、会议议程/strong/pp style="text-align: center "strongimg title="微信图片_20180830095700.png" alt="微信图片_20180830095700.png" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201808/uepic/6395b3b0-bb4b-464d-ac62-23323ef93d4d.jpg"//strong/ppstrong　　六、注册事宜/strong/pp　　培训说明：本次培训免费，中国蛋白药物质量联盟证书(自愿)500元/人。获取更多资讯，敬请联系中国蛋白药物质量联盟秘书处：/pp　　联系人：/pp style="text-align: left " 蒋老师/pp style="text-align: left "　　手 机：+86-15900209767 邮 箱：jiangxiaowan@126.com/pp style="text-align: left "　　李老师/pp style="text-align: left "　　手 机：+86-18322696168 邮 箱：a href="mailto:781494221@qq.com"781494221@qq.com/a/pp style="text-align: center "img title="微信图片_20180830095820.png" alt="微信图片_20180830095820.png" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201808/uepic/5fd3b98f-92d8-418e-ae25-a74ef4bcb54f.jpg"//pp　　/pp /p

ADCC简介IgG抗体要发挥功能，除了需要Fab区域（Fragment of antigen binding）识别并特异性结合抗原， 还需要其可结晶区域（Fragment crystallizable,Fc）来发挥IgG的效应功能（二级功能），如靶向细胞的杀伤等。Fc区域主要介导以下三类活动：通过结合表达在Natural killer (NK)等免疫细胞表面上的FcγR（Fcγ receptors）激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）通过结合血清补体C1q激活补体依赖的细胞毒性作用（Complement-dependent?cytotoxicity，CDC）通过结合新生儿Fc受体（Neonatal Fc receptor ，FcRn）延长抗体半衰期。今天我们主要关注ADCC，其不仅是机体通过抗体清除被病毒或其他病原物感染细胞的主要途径，也是目前治疗性抗体发挥临床效果的（Mechanism of Action ，MOA）核心机制之一[1]。因此，对于抗体新药研发和改造，仿制药开发和研发过程中抗体质量及功能的分析，都离不开ADCC的检测。同时，在生物药和免疫调节药物的临床试验中，ADCC活力也是必须的ex vivo指标之一。在此，我们以ADCC检测为切入点，向大家展示珀金埃尔默的DELFIA技术平台是如何助力抗体制药的。图片引用自参考资料[1]基于DELFIA技术的ADCC检测从细胞水平来说，ADCC本质上属于免疫细胞介导的杀伤。因此，常见的针对细胞杀伤（注意不是细胞活力）的检测方式，如经典的51Cr释放法，LDH检测，和Calcein 释放法等都可以用于ADCC检测。从原理上，这些方法可分为直接的检测靶细胞在效应免疫细胞作用下的裂解程度，如51Cr释放法；和间接的检测效应细胞的活化，如NFAT-RE-luc报告基因法和监测剩余的细胞活力来评估细胞杀伤，如化学发光法等。间接法的缺点是不能直接模拟体内ADCC过程。利用DELFIA技术的DELFIA EuTDA（货号AD0116）细胞毒法属于直接检测法，更能反映ADCC的MOA。与51Cr释放法形式类似，DELFIA EuTDA细胞毒法利用荧光放大配体BATDA特异的标记靶细胞。BATDA能迅速进入细胞，并在水解作用下形成亲水的TDA留在细胞内，并在靶细胞裂解下释放，和DELIFA Eu试剂相结合形成强荧光、稳定的螯合物EuTDA用于检测。更详细的原理介绍可参考我们的微信端公众号[2]和应用材料[3]。图片引用自参考资料[3]作为放射性检测的替代方法，更为安全的DELFIA EuTDA细胞毒法在ADCC活力检测中具有众多优势。相较于无法区分非特异死亡的LDH检测，EuTDA法不受效应细胞死亡和裂解的影响，降低背景的同时提升了检测的窗口和稳定性。相较于Calcein，BATDA能有效标记脆弱细胞，迅速被细胞摄取和在细胞裂解下完成高效的释放，为ADCC检测提供了稳定的检测窗口和易于标准化等优势。同时，EuTDA细胞毒法不受效应细胞限制，灵活支持利用多种原代免疫细胞（如PBMC和NK细胞）和更为稳定的改造细胞系的ADCC检测。从检测模式上EuTDA方法为时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence，TRF），因此拥有TRF本身的众多优势，包括不受来源于培养基和血清等的背景荧光干扰，高稳定性和重复性等。此外，靶向红外区的检测能有效避免检测样本来带的干扰，并为多重检测打下基础。最后，对自动化和小型化的支持已让EuTDA法逐渐成为大分子药物研发中ADCC检测的标准方法[4]。在此，我们通过几个经典案例向大家介绍基于DELFIA技术的ADCC检测是如何助力大分子药物研发的。单抗研发领域之Fc区域改造在谈到Fc区域改造之前我们先得进一步了解ADCC通路的关键成员。单克隆抗体通过其Fc区域募集表达IgG受体FcγR的NK细胞等的多种免疫细胞。人的FcγR包括FcγRI(CD64，高亲和力)，FcγRII(CD32，低亲和力)和FcγRIII(CD16，低亲和力)。Fc和FcγR的相互作用会引发一系列的免疫活动和多种免疫细胞的活化，达到靶细胞杀伤的效果。同时，也不是所有的FcγR都会激活免疫反应，例如FcγRIIb就是一个抑制性IgG受体。早期基于小鼠的研究证明FcγR参与了Rituximab and Trastuzumab的药效。反过来，FcγRIIIa的多态性（高亲和力(V158)活低亲和力(F158)）和单抗药物的临床效果之间存在相关性。因此，Fc/FcγR之间的相互作用是抗体药效的关键调控者。而通过改造Fc区域调节其和FcγR之间的亲和力也成为抗体研发的一个有力切入点。在此，我们向大家介绍抗体改造的先河研究[5]。在结构解析的基础上，该研究引入AlphaScreen高通量筛选平台，通过竞争法鉴定出FcγRIIIa高亲和力的Fc区域变体。AlphaScreen的亲和力结果进一步由Biacore SPR 确认。除了检测变体和FcγRIIIa之间的亲和力，AlphaScreen还用于确认变体和抑制性IgG受体FcγRIIb之间的亲和力，从而获得变体和RIIIa/RIIb的相对亲和力比值。结果显示A330L 突变和S239D/I332E相结合能提高对激活性FcγRIIIa的亲和力的同时降低和抑制性受体FcγRIIb之间的亲和力，显著提升RIIIa/RIIb的相对亲和力比值（4-9, 针对Trastuzumab）。在亲和力筛选的基础上，研究利用DELFIA EuTDA-based cytotoxicity assay（货号AD0116）在细胞水水平探究变体对ADCC的提升。以不同FcγRIIIa基因型的PBMCs为效应细胞，Her2+ SkBr3为靶细胞，研究证明改造的变体能有效提升ADCC（2-3个数量级），与亲和力数据趋势一致（下图左）。进一步的研究证明变体能有效引发针对HER-2不同表达水平的细胞株的ADCC。针对几乎没有抗原表达的MCF7细胞系，变体依然具有客观的ADCC活力（下图右）。除了基因水平多态性外，Fc区域的糖基化也影响其和FcγR的亲和力。尤其是岩藻糖的缺失会提升IgG1和FcγRIIIa之间的亲和力。因此，除了突变外，改造Fc区域的糖基化修饰也是提升治疗性抗体ADCC活力的一个途径。以由罗氏研发的Lumretuzumab单抗（RG7116）为例[6]。RG7116一方面阻断HER3的激活并下调HER3的表达。进一步通过罗氏去岩藻糖修饰的GlycoMab技术改造，RG7116和FcγRIIIa之间的结合亲和力提高50倍。基于DELFIA技术的ADCC检测证明，糖基化改造显著提升RG7116的ADCC活力（下图左）。同时，对比不同HER3表达量的细胞系，研究清晰地表明HER3受体表达丰度和RG7116介导的ADCC活力之间的正相关联系（下图右）。在动物模型上，基于多种低免疫细胞浸润的小鼠皮下瘤模型，研究发现RG7116仅通过靶向HER3就能发挥抗癌作用。进一步利用高免疫细胞浸润的异种原位移植A549肺癌小鼠模型，研究证明糖基化改造有效提升小鼠的生存周期。临床一期试验进一步证明RG7116的临床疗效。一方面，RG7116有效抑制了肿瘤细胞膜HER3的表达。同时，相较于未糖基化改造的抗体，RG7116升高外周NK免疫细胞的活化程度[7]。免疫治疗领域之首个PD-1抗体： Nivolumab著名的O药Nivolumab（英文商品名: Opdivo），于2014年底获得FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤，成为第一个获批的PD-1抑制剂，标志着免疫治疗时代的开启。四年后，Nivolumab也成为中国首个获批的PD-1单抗针对晚期非小细胞肺癌，商品名“欧狄沃”。虽然同是单抗药物，PD-1抑制剂与常见的靶向药物作用机制不同。PD-1抗体主要用于阻断PD-1和其配体PD-L1的相互作用，而不是杀伤PD-1阳性细胞，也就是抗肿瘤效应细胞。在Nivolumab的体外表征分析研究中，DELFIA Cell Cytotoxicity Kit（货号AD0116）被用于确认Nivolumab是否会诱导ADCC产生。以活化的PBMCs为效应细胞，高表达PD-1的CD4阳性细胞为靶细胞，研究人员确认IgG4亚型的nivolumab不会诱发ADCC效应[8]。后续的实验进一步证明nivolumab不能介导CDC，因此nivolumab的引入不会清除PD-1阳性细胞群体。除了nivolumab外，其他的PD-1单抗，包括默沙东的Keytruda、百济神州的BGB-A317及恒瑞的SHR-1210,都为弱ADCC活性设计。然而，同样是免疫检查点抑制剂，CTLA-4单抗Ipilimumab则需要其ADCC活性来杀伤Treg细胞发挥作用，强调了不同作用机制对抗体ADCC活性的要求也有区别[9]。结语ADCC活力的检测不仅能协助解析单抗药物的MOA，也推动对于NK细胞功能的研究及开辟新的抗肿瘤策略。作为成熟的细胞杀伤检测工具，DELFIA EuTDA（货号AD0116）细胞毒法不仅可用于评估抗体的ADCC和CDC活力，还能用于检测ACT，CAR-T和CAR-NK等疗法中免疫细胞的杀伤能力。为了助力免疫治疗的开发，我们近期推出“珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台”，加速您的研究和药物开发进程。针对ADCC和CDC等细胞杀伤检测，珀金埃尔默提供涵盖试剂-耗材-仪器-应用的完善解决方案。除了DELIFIA平台，我们提供金标准放射性检测方案及强大的多模式检测平台，胜任常见LDH检测、Calcien 释放和化学发光法等多种方法。试剂耗材查询与购买欢迎登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，搜索货号AD0116，在线下单。登入路径：参考资料参考资料[1] Deyev SM, Lebedenko EN. Modern Technologies for Creating Synthetic Antibodies for Clinical Application.Acta Naturae. 2009 Apr 1(1):32-50.[2] 科研干货|免疫细胞如何杀伤肿瘤细胞. https://mp.weixin.qq.com/s/-jW77oFnXusb9h6e-AKQBg[3] A Simplified, Gentle Cell-Labelling Method for Non-Radioactive Cytotoxicity Assays. PerkinElmer application note[4] An Automated DELFIA ADCC Assay Method using a CD16.NK-92 Cell Line. Biotek application note[5] Lazar GA, et al.Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14 103(11):4005-10.[6] Mirschberger C, et al. RG7116, a TherapeuticAntibody That Binds the Inactive HER3 Receptor and Is Optimized for Immune Effector Activation. Cancer Res. 2013 Aug 15 73(16):5183-94.[7] Meulendijks D, et al. First-in-Human Phase I Study of Lumretuzumab, a Glycoengineered Humanized Anti-HER3 Monoclonal Antibody, in Patients with Metastatic or Advanced HER3-Positive Solid Tumors.Clin Cancer Res. 2016 Feb 15 22(4):877-85.[8] Wang C, et al. In Vitro Characterization of the Anti-PD-1 Antibody Nivolumab, BMS-936558, and In Vivo Toxicology in Non-Human Primates. Cancer Immunol Res. 2014 Sep 2(9):846-56.[9] Romano E, et al. Ipilimumab-dependent cell-mediated cytotoxicity of regulatory T cells ex vivo by nonclassical monocytes in melanoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12 112(19):6140-5.关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

正常机体之所以能保持健康状态，具有抵御和自我战胜疾病的能力，是由于生物体内部不断产生各种与生物体代谢紧密相关的调控物质，如蛋白质、酶、核酸、激素、抗体、细胞因子等，通过它们的调节作用使生物体维持正常的机能。根据这一特点，我们可以从生物体内提取这些物质作为药。生物药物提取方法：1）蛋白质类药物分离提取方法：沉淀法（盐析、有机溶剂、等电点）；按分子大小分离（超滤、透析、层析、离心）；电荷（离子交换、层析、电泳、等电聚焦）；亲和层析法（酶与底物、抗原与抗体、激素与受体）。2）核酸类药物的分离提取方法：核酸类药物生产方法提取法和发酵法。3）糖类药物的分离提取方法非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，用水或盐。降解法适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖，酶解。分离用沉淀和离子交换。4）脂类药物的分离提取方法提取，用有机溶剂将所需成分从原料中溶解出来醇、氯仿、甲醇、水。纯化，沉淀法、层析法、离子交换法。5）氨基酸类药物的分离纯化方法分离方法：沉淀法（溶解度差异），吸附法（吸附能力差异），离子交换法（所带电荷不同）。生物药物的检测： 生物药物具有原料中的有效物质含量低、稳定性差、易腐败等特点，故生物药物的研发和生产过程中，理化检验指标和生物活性检验指标的检测至关重要。 2015年7月2日，仪器信息网将邀请瀚盟生物技术副总监付淑军老师、海正药业分析实验室主任李镭老师携手安捷伦、赛默飞、SCIEX、布鲁克等知名检测仪器厂商工程师与网友一起在线探讨&ldquo 生物制药检测及评价技术&rdquo 。本次会议用户可免费在线报名参加。报名日程安排如下：9:30 生物样品分析的一般原则及常见问题&mdash &mdash 付淑军（瀚盟生物技术副总监）10:20 安捷伦科技最新Glycan Mapping色谱柱在生物制药分析中的应用&mdash &mdash 米健秋（安捷伦）11:10 赛默飞在单抗分析方面的最新技术和方法&mdash &mdash 胡学桥(赛默飞)14:00 CE及CESI-MS技术在生物药分析中的应用&mdash &mdash 陈鸿序（SCIEX）14:40 布鲁克ESI/MALDI质谱助力生物制药发展&mdash &mdash 刘先明（布鲁克）15:20 单克隆抗体药物检测技术进展&mdash &mdash 李镭（海正药业分析实验室主任）请 扫描 或 长按并识别下方二维码 即可在线报名，会场容量有限，报名从速！报名及参会免费！

继今年 2 月初，MP Biomedicals 发布两款潜在 SARS-CoV-2 Spike 蛋白单克隆抗体后，近日再次传来好消息，MP 单克隆抗体系列又添新成员--Anti-coronavirus (SARS-CoV-2) (B) Spike S2，其有别于 Anti-coronavirus (SARS-CoV-2) Spike S2，可识别 Spike 蛋白 S2 亚基的不同位点。单克隆抗体可适用于多种应用场景，包括 Western blot、免疫沉淀、ELISA 实验、快速测试和流式细胞分析等。SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 的基本结构，相信大家已经不再陌生。其基因组编码四种结构蛋白，即 Spike (S 蛋白), Envelope (E 蛋白), Membrane (M 蛋白) 及 Nucleocapsid (N 蛋白)。Spike 蛋白是宿主中和抗体的重要作用位点，是疫苗设计的关键靶点。Spike 蛋白含有两个亚基，S1 和 S2。其中 S1 定义了宿主范围和病毒的特异性，从而识别并与受体宿主细胞的受体结合；S2 则含有膜融合过程所需的基本原件。图 1 新冠病毒 SARS-CoV-2 基本结构实验数据表明，在 65 ng 至 4.0625 ng 的系列稀释分析中，MP 公司针对 SARS-CoV-2 Spike 蛋白的单克隆抗体表现出高灵敏度和高亲和力。图 2 SARS-CoV-2 spike 蛋白（S1 + S2）与两种抗 SARS-CoV-2 抗体之间相互作用的 Slot-Blot 分析【单克隆抗体】【重组蛋白】自新冠疫情爆发后，MP 公司迅速做出反应并与时间赛跑，新加坡研发团队凭借长达 16 年对冠状病毒的研究经验，截止目前，除可提供上述三种对 SARS-CoV-2 Spike 蛋白有高度识别能力的鼠源单抗外，还可为广大科研工作者提供五种大肠杆菌和 HEK293 细胞表达的 SARS-CoV-2 重组蛋白。

p　　span style="color: rgb(0, 112, 192) font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai font-size: 14px "近年来，流式细胞仪市场“动作”频繁。2018年9月，安捷伦以2.5亿美元收购国产流式制造商ACEA，被业内称“靠谱国产品牌又少一个”。2018年10月，Luminex同意以7500万美元收购默克的流式细胞仪部门(于2019年1月完成此项收购)，将Amnis和Guava品牌收入囊中，从而扩大了Luminex在生命科学研究中的领域。2019年1月，中生苏州自主研制的流式细胞仪已在吉大一院投入临床使用。2019年2月，达科为与必达科共同推出Exflow品牌流式细胞仪。2019年2月，国产厂商赛雷纳也推出流式细胞仪新品。2019年，唯公科技研发的Easycell系列流式细胞仪也将获证上市。此外，博奥生物、竞天生物等国产厂商也于近年纷纷发布流式细胞仪产品。/spanbr//ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai font-size: 14px "　　目前国内流式细胞仪厂商已达20余家，流式细胞仪技术不断发展，仪器不断小型化, 融合微流控、显微成像技术，未来应用前景十分广阔。流式细胞仪的发展已有数十年，为何各厂商近年纷纷选择布局流式细胞仪市场?流式细胞仪市场有什么样的特点?为了对我国流式细胞仪市场发展情况作必要解读和评价，仪器信息网邀请strongNamocell中国地区负责人陈科立/strong谈一谈对流式细胞仪的看法。/span/ppa href="https://www.instrument.com.cn/zt/liushixibaoyi" target="_blank"span style="font-family: 宋体,SimSun text-decoration: underline "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) font-size: 14px text-decoration: underline "点击进入span style="color: rgb(255, 0, 0) font-size: 14px text-decoration: underline "“进击的”流式细胞仪/span专题，解锁更多流式行业信息！/span/strong/span/a/pp style="text-align: center "img width="474" height="355" title="24138c9caa723496bb2962246374e2e.jpg" style="width: 474px height: 355px " alt="24138c9caa723496bb2962246374e2e.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/c67d8283-ac6d-479b-aeb7-ff3d2f7ccb9b.jpg"//pp style="text-align: center "strongNamocell中国地区负责人陈科立/strong/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong仪器信息网：您认为流式细胞仪的中国市场与全球市场有哪些不同?请您谈谈流式细胞仪在中国的市场前景以及未来机遇。/strong/span/pp　　strong陈科立:/strong流式细胞仪在中国的市场潜力是非常大的，从一个侧面也可以反应出来，那就是多个国产的品牌都开始进入这个市场，与国外品牌竞争市场份额。未来在中国的流式市场还是有比较大的增长空间。在科研领域，国家每年投入的科研经费依旧维持在一个比较大的体量，并且稳步增长，尤其已生物医药作为发展重点 在临床方面，随着相应试剂盒的不断丰富，临床检测项目不断向二级医院扩展，市场对流式仪器的需求量大大增加 在工业领域，生物医药行业的不断发展，新公司不断增多，对很多具备研发能力的公司来说，流式也成为“标配”项目。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong仪器信息网：贵公司的流式细胞仪技术特点是什么?看好的细分市场领域哪些?/strong/span/pp　　strong陈科立:/strongNamocell的仪器结合了流式细胞术的经典原理以及微流控芯片的技术优势，使得仪器的操作更加简便，分离的细胞具有更好的活性。相比于传统的流式分选仪，Namocell采用更小的鞘液压力(不到2 psi)，这样在分选的过程中对细胞的损伤极小，分选出来的细胞具有非常好的活性，可进行单细胞培养 Namocell采用了一次性分离芯片，从加样、检测、分离都在这个芯片上完成，可以完全避免样品间交叉污染 操作简便，只要半小时培训即可上机熟练操作，相比传统流式分选仪，无需专人维护。/pp　　目前Namocell主要关注的细分市场集中在单细胞测序领域以及单抗药物的开发领域。在单细胞测序领域，Namocell可以很好的作为例如10X等高通量单细胞测序的一个技术补充，在样品数量极少或者长片段DNA测序的情况下，能够发挥出极大的作用 在单抗开发领域，Namocell可以在前期抗体筛选，中期细胞株构建等环节给用户带来非常大的帮助。目前在这两个领域已经有了一些重量级用户，例如：哈佛、斯坦福、麻省理工、Genentech、FivePrime、上海交大、中科院上海生科院等。/pp style="text-align: center "img width="495" height="233" title="30019f47a85ce53560d19a1201fec99.png" style="width: 495px height: 233px " alt="30019f47a85ce53560d19a1201fec99.png" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/1fdb6ebb-b71a-49f2-b1e0-e0172d33e4ee.jpg"//pp style="text-align: center "strongNamocell流式细胞仪/strong/ppstrong　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "仪器信息网：请介绍贵公司流式细胞仪技术的发展历史。/span/strong/ppstrong　　陈科立:/strong Namocell是一个非常年轻的公司，2010年成立于美国的硅谷，借助与斯坦福的密切合作发展至今。公司自主研发的微流体单细胞分选平台，使复杂的单细胞分选变得极其简单快速，极大地推动了单细胞分析在基础研究和临床的上应用。我们的产品已在细胞株的选育，单克隆抗体的筛选，细胞基因编辑，癌症液体活检，癌症免疫治疗，产前基因筛查，噬菌体展示，单细胞基因组等多方面得到广泛的应用。目前Namocell已经与美国哈佛大学、斯坦福大学、马萨诸塞州总医院癌症研究中心等科研院所以及Genentech、Five Prime Therapeutics、Juno等生物公司有着广泛合作。/pp style="text-align: center "span style="text-decoration: underline " /span strong欢迎广大流式圈内人士加入span style="color: rgb(0, 112, 192) "“流式细胞仪用户交流群”/span。在群里你可以和各路大神零距离沟通，不定期会有福利!/strongspan style="color: rgb(192, 0, 0) "(若二维码过期，请添加小编微信拉你进群)/span/pp style="text-align: center "img width="189" height="252" title="微信图片_20190402101139.jpg" style="width: 189px height: 252px " alt="微信图片_20190402101139.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/ac3190fd-d59c-45af-80b6-00ad93785913.jpg"//pp以下是小编微信二维码，添加小编微信好友，备注上单位及姓名，小编会拉你进交流群的哦~心动不如行动，快快加入吧!/ppbr//pp style="text-align: center "strong/strong/pp style="text-align: center "img width="162" height="162" title="群主二维码.jpg" style="width: 162px height: 162px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/13c13f39-6e9a-44fc-aef0-4e4747a0f0a8.jpg"/br//pp style="text-align: center "strong仪器信息网生命科学官微span style="color: rgb(0, 112, 192) "“3i生仪社”/span上线啦!关注了解更多生命科学干货资讯！/strong/pp style="text-align: center "img width="160" height="160" title="新 公号icon.jpg" style="width: 160px height: 160px " alt="新 公号icon.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/d0de24d5-b7a9-442b-8c79-a168d5938257.jpg"//p

大咖亲授|“生物药表征与质控的关键环节”系列讲座di一场-单抗表征新进展飞飞 赛默飞色谱与质谱中国关注我们，更多干货和惊喜好礼Biopharmacy生物药大咖亲授 中国生物药的发展正处在历史分水岭，如何接轨国际，创造属于中国的di一，无论是冲刺真正属于中国的first in class，还是研发具有临床特色的me-too，在全力加速的同时，如何保证“高质量”发展，仍然是生物药企业的核心议题。只有全面夯实研发与质控的各个关键环节，才能在角力竞速的同时，确保核心竞争力全面ling先。生物药表征的关键环节和关键要素有哪些？又有哪些全球zui佳实践和前沿应用？作为生物药表征方案的ling导者，赛默飞在全球范围邀请生物药专家大咖现身说法，讲述他们与关键环节的诸多故事与应用，提供给您更直接的沟通机会，全面助力您高“质”高速实现生物药研发突破！Sara Carillo, Ph.D.应用开发团队负责人NIBRT 爱尔兰国家生物工艺研究所简介：Sara Carillo博士是爱尔兰国家生物工艺研究所（NIBRT）的表征与可比性实验室应用开发团队负责人。Carillo博士于2013年在那不勒斯大学完成了化学科学博士学位，曾致力于细菌糖复合物的结构表征。Carillo博士于2015年加入Jonathan Bones博士在NIBRT的研究小组，致力于CHO细胞糖原和生物治疗药物表征。主题Multiple Levels of Confident Biopharmaceutical Characterization using a New Hybrid Quadrupole-Orbitrap Platform Dan Bach Kristensen, Ph.D.首席科学家Symphogen简介：Dan Bach Kristensen拥有生物学博士学位和化学学士学位。Dan专门从事蛋白质化学和质谱分析，最初活跃于日本的蛋白质组学研究领域，后来又拓展至丹麦的蛋白质组研究领域。在过去的15年中，Dan一直在生物制药行业中从事分析与开发工作，涉及从早期发现到注册的各个环节。临床适应症包括出血性疾病，中性粒细胞减少，自身免疫性疾病和肿瘤等。Dan目前是Symphogen的首席科学家，该公司专门研究用于癌症治疗抗体的开发。主题Alternative strategies for peptide mapping of challenging monoclonal antibodies in clinical development 时间：4-28日下午1:30-3:00扫码报名 他山之石可否攻玉？报名并留下您最想了解的问题，看看大咖如何解答你的疑惑，助力您在生物药表征和研发中实现加速与突破。

背景介绍 抗体药物是全球生物药领域中增长最快的细分领域之一，FDA批准上市的抗体药物已超100种。单克隆抗体药物在临床治疗、体外诊断等医学领域应用更加广泛，适应症不断扩大，特异性、均一性、靶向性不断完善。抗体类药物凭借有效、精准、个性化的优势，已经迅速成为全球制药开发的热点。同样，抗体筛选技术也在不断突破发展，先后出现了杂交瘤单克隆抗体技术、抗体库展示技术、单B细胞克隆技术等。 然而三种抗体筛选技术路线在筛选出特异性强和亲和力高的抗体之前都面临着工作量大、周期长的困境，在竞争激烈的抗体药物开发赛道下，对于药企来说时间成本是最为看重的，上海汉赞迪是国内为数不多的自动化设备制造商之一，可提供多种类型设备和自动化解决方案助力抗体药物开发。抗体筛选技术路线 目前抗体筛选技术大致可分为三类，杂交瘤技术，包括小鼠、大鼠、仓鼠和家兔等杂交瘤技术；抗体库技术，包括噬菌体展示抗体库、无细胞分子展示抗体库（核糖体展示、mRNA展示和DNA展示抗体库）和细胞表面展示抗体库（细菌表面展示、真菌表面展示、酵母表面展示和哺乳动物细胞表面展示）、单B细胞克隆三大类，如图1所示。图1 抗体筛选方式及流程示意图杂交瘤技术以小鼠杂交瘤最为常用，体外抗体库展示技术以噬菌体为代表，以下介绍三种技术路线的详细流程：01小鼠杂交瘤制备图2 小鼠杂交瘤制备单克隆抗体流程详细流程：1. 小鼠经免疫全部完成后，在无菌条件下去除脾脏，并完成脾淋巴细胞的制备2. 选择与免疫动物相同品系的骨髓瘤细胞进行体外培养 3. 将两种细胞按一定比例混合后加入PEG进行融合4. 放入HAT培养基中进行培养，去除未融合的细胞、融合的B淋巴细胞、融合的瘤细胞，仅保留杂交瘤细胞5. 利用特定的方法如ELISA等，筛选能产生抗体的杂交瘤细胞6. 进行杂交瘤细胞单克隆化已确保得到分泌抗体稳定且完全同质的单克隆，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。最常用的为有限稀释法，如按0.5个细胞/孔进行铺板，尽可能保证每个孔能生长的为单个细胞，通常需要经过2-3轮单克隆化7. 利用特定的方法如ELISA、流式细胞法、功能实验等，筛选能产生与所需抗原结合的抗体的杂交瘤单克隆细胞8. 杂交瘤单克隆细胞冻存可用于后续生产鼠源抗体，包括腹水法或体内培养法9. 另一方面，需对目标杂交瘤细胞所表达的抗体经常测序鉴定，以便于进一步研究优化，即图2右侧展示的流程:a. 抽提杂交瘤单克隆细胞中的总mDNA；b. 反转录获得cDNA；c. 以cDNA为模板，进行PCR扩增得到重链和轻链片段；d. PCR产物进行TA克隆构建到表达载体里；e. 将载体进行测序，得到DNA序列，并翻译成氨基酸序列，得到抗体的全长序列；f. 同时载体可进一步转染至相应细胞内用于生产相应抗体。 在整个杂交瘤抗体制备过程中，小鼠免疫后进行血清抗体效价检测（ELISA），融合后进行亲和力初筛（ELISA），单个杂交瘤细胞筛选（有限稀释法或FCM），单克隆抗体功能实验（ADCC/CDC等）以及后续需要进行的提取和质粒构建实验都有着重复性操作、工作量大和人为操作误差等问题，汉赞迪的实验室自动化工作站，可以整合离心机、酶标仪、洗板机、细胞成像仪等各类设备完成自动化、高通量各实验模块的工作，大大提高实验效率和结果一致性。02噬菌体展示技术图3 噬菌体展示技术制备抗体流程详细流程1. 进行动物免疫：若使用天然库或合成文库则此步骤不需要进行2. 血清效价测定：若使用天然库或合成文库则此步骤不需要进行3. 淋巴细胞的分离纯化4. 总mRNA的提取 5. 第一链cDNA反转录合成及轻链、重链可变区（scFV DNA）扩增6. scFV DNA和噬菌体载体酶切、连接（重组质粒构建）7. 转染大肠杆菌，重组噬菌体制备8. 库容量的滴定9. 噬菌体抗体库淘选10. 获取特异性和亲和力较高的抗体序列11. 建表达载体和筛选稳定高表达细胞株 噬菌体文库构建过程中，血清抗体效价检测（ELISA），RNA提取，PCR体系构建、质粒构建后纯化（磁珠法）、库容量的滴定（梯度稀释），噬菌体淘选（ELISA或磁珠）、特异性和亲和力测定中板复制、液体转移等，后续工程菌株构建中表达载体构建、表达产物检测、单细胞分离都有着工作量大、人为易失误等问题，汉赞迪的实验室自动化设备，既可以单机使用解决实验中繁琐和耗时的步骤也可以整合各种模块自动化、高通量完成实验流程，可极大提升实验效率。03单B细胞克隆技术图4 单B细胞制备抗体流程详细流程1. 从免疫的动物或人体获取外周血单个核细胞2. 进行抗原特异性结合B细胞分选3. 单细胞PCR技术扩增lgG抗体重链和轻链可变区基因4. 质粒构建和转染5. 表达、筛选抗原特异性抗体 单个B细胞克隆技术，用流式细胞仪进行单个B细胞分选需进行实验体系制备，抗体序列克隆构建重组质粒，工程菌株生产的抗体进行筛选（ELISA）使用以移液工作站为核心的自动化设备完成高重复性的实验步骤，可加快实验进程并获得可重复性的结果。 此外，汉赞迪也在单克隆抗体药质控阶段提供相应自动化方案，在抗体生产中，经各种纯化工艺得到的抗体原料药必须符合特定的要求和期望的规格，抗体原料药的规范也有助于设计净化过程，确认最终生产工艺，因此对不同纯化阶段，不同批次的抗体药的质控包括效能、宿主蛋白残留检测、蛋白A残留检测、宿主核酸残留检测、内毒素检测、微生物限度检测势在必行，而移液工作站通过整合不同功能模块的自动化检测系统能够高效的、标准化的完成对抗体药的质控。汉赞迪抗体筛选实验自动化解决方案 众所周知，生命科学实验室普遍面临着实验耗时长、通量低、效率低、稳定性差、安全隐患、数据追踪性差等问题，而流程自动化可大大降低或避免上述问题，汉赞迪在单模块形式自动化、工作站形式自动化、管线形式自动化以及机器人形式智能化等不同自动化程度均有相应的解决方案。▼ NEMO E9 移液工作站图5 PCR体系构建NEMO E9移液工作站及台面布局 NEMO E9是一款灵活、高性能、高通量的自动化移液工作站，共有9个板位，体积小巧，节省空间，可放于通风橱、生物安全柜、超净工作台内；96通道移液头，可有效应用于孔板间的复制、样本或试剂的分装、转移、稀释等实验操作，非常适用于展示库和单B细胞抗体筛选过程中抗体DNA可变区序列大批量扩增体系构建，可将实验人员从大批量、重复移液的实验中解放出来。▼ 全自动化酶联免疫吸附检测平台图6 全自动化酶联免疫吸附检测平台 全自动化酶联免疫吸附平台以高通量移液工作站为核心在其周边整合酶标仪、洗板机和孵育室可实现无人值守、全自动完成ELISA实验流程，可大大提高检测的通量和结果的一致性，也可通过协作机器人再整合上储板栈进一步提升通量，加快阳性抗体的筛选速度。▼ 高通量蛋白质药物发现和筛选平台图7 高通量蛋白质药物发现和筛选平台 高通量蛋白质药物发现和筛选平台是以大肠杆菌和酵母作为宿主细胞表达蛋白药物的筛选和鉴定的全流程自动化解决方案，其实现了菌种的单克隆化，培养，离心及后续的高通量分子、蛋白表达及亲和力的鉴定，具有样本跟踪和数据追溯的功能，实现无人化值守，是蛋白药物研究和发现的加速器。小结 目前治疗性单克隆抗体药物已经成为生物制药中增长最快的领域，单抗药物是制药企业全球药物研发布局的重要一环，国内外多个药企已介入其中，而药物研发的速度决定企业是否能占得先机，以移液工作站为核心的自动化设备可加速药物研发的进程，助力药企抗体药开发。

单克隆抗体(mAb)是制药行业增长最快的治疗方法之一，mAb的高阶结构(HOS)影响药物与靶标的结合特异性，从而影响治疗效果和副作用。若储存而导致HOS发生变化，例如蛋白质错误折叠和聚集，会导致稳定性降低、功效丧失或可能的免疫原性。因此，监测HOS对保证mAb疗法的有效性和安全性至关重要。X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱可以提供原子级分辨率，但存在费时费样品的缺点；生物物理技术，如差示扫描量热法(DSC)、动态光散射(DLS)、荧光光谱、红外(IR)光谱和圆二色(CD)光谱只能提供低分辨率的整体构象。焦碳酸二乙酯(DEPC)作为亲电子试剂能够修饰溶剂可接近的亲核侧链（Cys、His、Lys、Thr、Tyr、Ser）和蛋白质的N末端，这些残基产生的羧基化产物具有+72.021Da的质量转移，经过蛋白水解消化、液相色谱分离和串联质谱分析后，可以识别和半定量特定的蛋白质修饰位点。将一种条件（例如天然）与另一种条件（例如加热）进行比较时，特定残基处共价标记程度的变化可用于探测蛋白质的HOS变化（图1）。在这篇文章中，作者使用DEPC共价标记联用质谱，以利妥昔单抗作为单抗药物的模型，以期在远低于mAb治疗药物熔点的温度下能够特异性检测细微HOS变化，并通过活性测定进行验证。图1. DEPC 标记与质谱联用分析单抗药物结构的流程在通过共价标记研究热应力（heat stressed）利妥昔单抗之前，作者使用CD光谱、荧光光谱和动态光散射(DLS)来识别加热对蛋白质结构的干扰。发现当在低于其熔点的温度下加热利妥昔单抗4小时时，这三种技术在45°C或55°C时无法检测到显著的结构变化，而在65°C时仅显示出轻微的变化。随后作者团队使用DEPC CL-MS探测利妥昔单抗的细微结构变化。在45°C压力下的利妥昔单抗样品中发现DEPC标记水平的变化较少，大多数变化是由于蛋白质受热去折叠导致的标记增加（图2），且可变区的变化远少于恒定区。超过70%的标记变化发生在Tyr、Ser和Thr残基处，而发生在His和Lys残基处的标记变化始终小于20%。标记变化表明，45°C时的结构变化主要是局部微环境的变化，而非溶剂可及性差异显著的大结构变化，也就是说修饰位点分散在整个蛋白质结构中，而不是集中在蛋白质的某些区域。图2. 45°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。活性测定能反映一定程度的结构变化对利妥昔单抗活性的影响，从而验证DEPC标记结果。桥接ELISA的结果表明，在预热至45°C后，利妥昔单抗的Fc结合活性没有显著变化（图3a），Fc区域的CDC活性估计在45°C热应激后保持不变（图3b），利妥昔单抗的Fab结合活性估计与对照样品没有差异（图3c）。活性测定结果表明蛋白质在45°C时没有发生显著的结构变化。在Fab和Fc区域中标记变化的残基数量相对较少，主要标记对局部微环境变化更敏感的Tyr、Ser和Thr残基。修饰位点分散在整个蛋白质中，对Fab和Fc区域的构象几乎没有影响，与共价标记质谱联用的测定结果相吻合。图3.使用单抗活性测定验证CL-MS实验揭示的结构变化。Fc区的结构完整性通过(a)测量Fc与捕获抗体结合的利妥昔单抗桥接ELISA和(b)测量补体依赖性细胞毒性的Alamarblue测定来评估。Fab区域的结构完整性通过(c)Raji细胞下拉试验评估，测量Fab与B细胞CD20抗原的结合。55°C加热4h后利妥昔单抗所有结构域的残基修饰程度都发生了显著的变化，尤其是Fab区域的VH和VL结构域。（图4）加热至55°C时，His和Lys残基处发生的标记变化几乎是45°C的两倍，表明蛋白质在这些区域展开；Fab区域标记水平发生显著变化，特别是在VH、VL和CL域。这表明利妥昔单抗的Fab区域存在局部结构变化，据报道这也是IgG1分子中对热应激最敏感的区域。Fc区域中没有观察到类似的发生标记变化的残基聚集，Tyr、Ser和Thr处的大多数标记变化为中度或高度变化，这些结果表明蛋白质拓扑结构可能发生变化。图4. 55°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。尺寸排阻色谱(SEC)测量表明在65°C加热条件下存在高分子量物质。将DEPC CL-MS方法应用于65°C热应力的利妥昔单抗后，发现所有利妥昔单抗结构域的标记发生显著变化（图5），主要体现为标记的减少，这可能是因为蛋白质聚集。利妥昔单抗的Fab和Fc区均发现标记减少的残基簇，活性测定结果显示Fc结合和CDC活性的降低（图3），说明了Fc区特别是CH3结构域的标记变化，与DEPC标记结果一致。图5. 65°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。总结DEPC标记技术的结构分辨率和灵敏度足以探测细微的蛋白质构象变化，该技术与质谱联用可在低于Tm的温度下揭示利妥昔单抗中的细微HOS变化，与经典的生物物理技术互补。总体而言，鉴于CL-MS简便、灵敏的特点，该方法将适用其他抗体药物的结构研究。

p style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "说到抗体药物，主要是指单克隆抗体及其相关的大分子蛋白类生物药物。2019年全球药物销售排行榜的前15名中就有8个是单克隆抗体药物，其中艾伯维公司的阿达木单抗（修美乐）已连续8年蝉联榜首。/span/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "单克隆抗体药物因具有更高的靶向性，可直达病变细胞，具有减少正常细胞受损，减少副作用等独特优势，一直是近几年来药物研发的热点。与小分子药物的原研药和仿制药情况一样，抗体药物在专利到期后，一般会迎来大批的生物类似药上市。包括目前国产已经上市的生物类似药：复宏汉霖的利妥昔单抗（汉利康），百奥泰生物的阿达木单抗（格立乐），海正药业的阿达木单抗（安健宁）和齐鲁制药的贝伐珠单抗（安可达）。其中的利妥昔单抗和贝伐珠单抗都是抗肿瘤生物类似药。另外我国还有将近400个在研的生物类似药。/span/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "随着越来越多的单抗生物类似药的研发和上市，建立稳定可靠的生物基质样品中抗体药物生物检测方法对阐述其药代动力学，药效动力学及毒理学等方面的性质至关重要。尤其像在药物上市后临床使用阶段的治疗药物监测过程中，抗体药物的生物分析方法建立对临床合理用药具有重要的指导作用。/span/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "2020年4月28日，由中国药理学会、中日友好医院发起，中国药理学会CTDM-GP项目组、中国药理学会治疗药物监测研究专业委员会、《中国医院用药评价与分析》杂志主办的“抗肿瘤生物类似药治疗药物监测专家共识线上发布会”成功召开。为广大临床药师和医师在临床真实世界如何开展抗肿瘤生物类似药治疗药物监测（TDM）提供技术指导，以强化抗肿瘤生物类似药在临床中的个体化用药策略，推动安全有效使用。/span/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun text-indent: 2em "《抗肿瘤生物类似药治疗药物监测药学专家共识（2020版）》中明确提到推荐建立液相色谱-质谱分析方法（LCMS）测定贝伐珠单抗、曲妥珠单抗和利妥昔单抗的血药浓度，并进一步评价血清、血浆与全血样本的测定差异性。其推荐程度最高等级“强”这一列中，专家比例高达74.65%。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/4a7ece57-8cc7-457f-8e9c-9045c3933df9.jpg" title="21.png" alt="21.png"//pp/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "针对抗肿瘤生物类似药物的生物分析方法开发，岛津除了可以提供LCMS分析仪器，更有基于纳米表面分子导向限制性酶解技术（nSMOL,nano-Surface and Molecular Orientation Limited Proteolysis）的定量试剂盒产品提供！/span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/bb077e01-6f29-4dad-95f7-0447bfa6bf5c.jpg" title="22.png" alt="22.png"//pp/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "nSMOL 技术可在近生理条件下，完成对抗体药物的选择性酶解，并获得与之相应的特征性肽段组分。其工作原理是利用抗体树脂对样品中单克隆抗体药物进行捕获，之后通过蛋白酶纳米颗粒对树脂上抗体成分进行限制性酶解，得到多肽片段。/spanspan style="font-family: 宋体, SimSun "该酶解主要针对抗体的 Fab 区域，Fab 区域外余下部分不受酶解作用且仍保留在原树脂上（如下图所示）。因此，nSMOL 技术不仅能够保证获得特异性的抗体序列片段，而且限制性酶解技术大大降低了样品的复杂性，缩短样品前处理时间，提高了检测灵敏度。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/cbd0bbc9-2957-4f4b-a7d1-7429a7260e60.jpg" title="23.png" alt="23.png"//pp style="text-align: center"img style="" src="https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/8904d059-e668-47b7-8b86-2a3feab64929.jpg" title="24.png"//pp/pp/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "针对抗肿瘤抗体药物，岛津公司开发了针对人血浆中曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、利妥昔单抗等单克隆抗体药物，基于nSMOL技术的定量分析方法，研究成果已在多个国际期刊中发表。另外针对自身免疫性疾病治疗用抗体药物（英夫利昔单抗、阿达木单抗、尤特克单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、依那西普、阿巴西普），岛津开发了基于nSMOL技术的同时定量检测方法。/span/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "对于生物药LCMS定量方法的开发，岛津同样可以提供针对定量肽段定制13C，15N高品质稳定同位素标记的服务，以及针对高通量样品处理的96孔前处理填料板！/span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/c5f44149-61ab-4727-a083-4b5f2a780e44.jpg" title="25.png" alt="25.png"//pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "/spanbr//pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun "br//span/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: right "span style="font-family: 宋体, SimSun "供稿人：岛津（上海）实验器材有限公司 市场部 周可鹏/span/pp/pp style="line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify "span style="font-family: 宋体, SimSun " /span/ppbr//p

2007年8月27日，密理博美国总部正式宣布发售ArthroMAB单克隆抗体组合试剂盒，用于关节炎小鼠造模。这些模型用来进行抗炎症的治疗方法的快速筛选和评价。ArthroMAB技术通过在软骨关节表面上形成免疫复合物引起关节炎的发生。ArthroMAB组合包含识别胶原质的四种不同的单克隆抗体。该产品可以快速诱导不同鼠系的小鼠（如Balb/C–CIA resistant, DBA/1, B10.RIII）的四肢产生严重的关节炎。与传统的胶原质诱导造模的方法相比，ArthroMAB试剂盒（包括抗体组合和细菌脂多糖）可以在几天之内迅速诱导产生严重的关节炎，缩短了原先几周的造模周期，并且造模成功率接近100%，所以测试动物的数量可以大大减少。更重要的是，与其他造方法相比，ArthroMAB组合可以使同批小鼠几乎同时患上关节炎，所以缩短了疗程，也简化了评估研究的过程。密理博生命科学部提供革新的研发工具、技术服务和生物试剂，让您从事的生命科学研究和药物研发工作更加完美出色。自从2006年收购Chemicon、Upstate和Linco品牌后，产品线迅速拓宽，使密理博成为当今市场上产品种类最齐全的策略性供应商。了解密理博更多产品信息，请登陆密理博全球官方网站：www.millipore.com，或拨打密理博中国客服热线：800-820-0865。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Internal Fragment Ions from Higher Energy Collision Dissociation Enable the Glycoform-Resolved Asn325 Deamidation Assessment of Antibodies by Middle-Down Mass Spectrometry。本文的通讯作者是罗氏集团的Tilman Schlothauer和Feng Yang。　　治疗性单克隆抗体(mAb)分析中翻译后修饰(PTMs)的表征是一个主要的挑战，单个PTM通常采用bottom-up的方法进行分析，但PTM之间的关联性信息丢失 middle-down方法提供了分辨率、位点特异性和蛋白型异质性的良好平衡，其表征工作流程主要依赖于末端片段离子。内部片段离子的纳入提高了序列覆盖率和PTM分辨率，使其成为一种有前途的方法。先前，糖工程单克隆抗体的研究表明，一组有限的高甘露糖、乙酰氨基葡萄糖和糖基化蛋白型不同程度地影响了PTMs的敏感性质，如脱酰胺和氧化。Asn 325的脱酰胺是一种功能相关PTM，在传统bottom-up方法中由于其较短的肽段和较高的亲水性而经常被忽略，目前没有研究调查Asn 297糖型对Asn 325脱酰胺敏感性的影响。在这篇文章中，作者提出了一种纳入内部片段的middle-down工作流程，在糖型解析层面上评估mAb上Asn 325脱酰胺修饰。　　图1. 糖型解析的Asn 325脱酰胺的middle-down分析流程。(A) IdeS酶切后的Fc/2序列，及相关的糖基化(Asn 297)和脱酰胺(Asn 325)位点。(B)工作流程示意图，包括样品制备、RP-LC亚基分离、MS1电荷态选择、四极杆糖型分离、MS2内部片段搜索，以及基于提取的单同位素质量离子色谱(未修饰与修饰)的定量策略。　　图2. Asn 325脱酰胺鉴定中内部片段SNKAL的定性评价。未修饰(对照)、热应力样品(8w, 40°C)、HC Asn 325 Asp序列突变体的代表性MS2谱图叠加，以及修饰的内部片段离子SDKAL的模拟单同位素质量。*表示未修饰的SNKAL的+1同位素对修饰的SDKAL的单同位素具有足够的分辨率。　　本研究使用标准IgG1单抗(G1m17, Km3)和突变体(HC Asn 325 Asp)。对于热应激，标准单抗在40°C的配方缓冲液中孵育2、4和8周。在IdeS酶切之前，将10%的突变单抗插入标准单抗中，生成加标样品。抗体经IdeS酶切、还原后，用标准RPLC流程分析(图1B) 针对Asn 325脱酰胺位点周围的内部片段离子的覆盖率，作者对HCD碰撞能量和捕获气体参数进行了优化。共分配了覆盖Asn 325的7个内部片段离子，根据片段强度和定量精度，与bottom-up分析确定的目标脱酰胺值相比，选择SNKAL作为Asn 325的代表性特征离子。SNKAL对无应力对照组的特异性通过包含Asp 325的序列突变体(N325D)得到证实，该突变体在未修饰的Asn 325的单同位素质量处没有片段离子(图2)。因此，排除了其他片段离子的中性丢失引起的歧义或重叠。Asn 325对照、Asp 325突变体和分离的糖型(G0F、G1F、G2F)的MS2具有高度可比性。修饰后的单同位素质量和未修饰的Asn 325的第一个同位素之间获得了足够的分辨率(图2)。　　使用middle-down MS对所有糖型的相对脱酰胺评估与bottom-up分析确定的水平一致(图3)。与热应力持续时间无关，单个糖型(G0F、G1F和G2F)的middle-down脱酰胺评估没有显著差异(图4)。Asp 325突变体的插入实验证实了middle-down策略评估单个糖型脱酰胺水平差异的能力。由于未修饰的Asn 325单抗和Asp 325单抗之间的糖型相对丰度的差异，与总加标量(10%)相比，蛋白型(糖型% ×脱酰胺%)混合的比例不同。因此，在加标样品中，G0F的脱酰胺率低于10%，而由G1F和G2F的脱酰胺率高于10%(图4)。Middle-down脱酰胺评估的精度取决于糖型丰度和脱酰胺水平，单个样本的相对标准偏差范围为2.8%至16.4% (n = 9)，样本间中位相对标准偏差为7.4% (n = 16)。总蛋白型丰度和相对标准偏差显示出明显的相关性，并证明了middle-down方法的敏感性，允许在0.2%的相对丰度下评估蛋白型。　　图3. middle-down工作流程对Asn 325脱酰胺定量分析的能力评估。在2w、4w和8w热应力(40°C)下，应力样品bottom-up和middle-down(所有糖型)分析的相关性。数据点表示middle-down分析的技术重复的中位数(n = 9, 3天内重复3次)。误差条显示95%置信区间。CTRL显示n = 3时无应力样品的背景水平。　　图4. Asn 325脱酰胺的糖型解析水平的middle-down分析。从2w, 4w和8w热应力样品和10% Asp 325加标样品中提取所有糖型和分离糖型(G0F, G1F, G2F)的相对脱酰胺结果。技术重复的中位数和95%置信区间为n = 9时[G2F在2w (n = 4)和4w (n = 8)时除外]。ns =不显著。*表示假定值范围(* 0.05, ** 0.01, **** 0.0001)。　　本文引入了一种新的middle-down策略，通过利用HCD碎片的内部碎片离子来分析单克隆抗体Fc中的PTM动力学，将复杂性降低到Fc/2亚基水平，并保留了相关的蛋白质形态完整性，同时获得了bottom-up方法的分辨率和位点特异性，并成功地证明了IgG1抗体的Fc半乳糖基化变体不会影响热应激下Asn 325脱酰胺的程度。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Internal Fragment Ions from Higher Energy Collision Dissociation Enable the Glycoform-Resolved Asn325 Deamidation Assessment of Antibodies by Middle-Down Mass Spectrometry