淋巴细胞株

第四种淋巴细胞—NKT细胞 通常认为，构成机体免疫系统的淋巴细胞有三种细胞系组成，一是由胸腺产生的T细胞，二是由骨髓分化而来的产生抗体的B细胞，三是自然杀伤（NK）细胞。而新近发现存在第四种淋巴细胞—NKT细胞。1. NKT细胞的发现1986年，克隆成功了NKT细胞的特征性抗原受体基因。将其命名为Va14基因，与其他T细胞抗原受体的（TCR）基因不同，有其独特的结构特征。1987年美国国立卫生研究所的Fawlkes与瑞士的Budd分别领导的两个研究小组报告指出，胸腺细胞中的T细胞通常不能表达受体，仅有部分未成熟T细胞选择表达V-β8.2受体。随后的研究证明这种细胞不是T细胞，考虑是NK细胞的受体，这种细胞集团的数量极少，生理意义不明。1994年，这两个研究小组的研究人员发现，他们报道的细胞为同一细胞，从此NKT细胞的研究引起人们的广泛关注。T细胞识别的抗原是蛋白质，而NKT细胞是别的抗原是α-Gal-Cer即所谓的糖脂质，这是该免疫系统与通常的免疫系统重要的不同点。NKT细胞的分化与T细胞不同的是在胸腺形成前的胎生初期6.5日在胸腺外组织分化。NKT细胞与T细胞比较，机能处于不发达状态。T细胞分化为功能不同的Th1和Th2细胞群，Th1细胞产生INFγ及IL-2，引起迟发行过敏症等细胞性炎症。Th2细胞能产生IL-4和IL-10，参与变态反应及抗体产生等体液免疫反应。而NKT细胞不但能分泌Th1和Th2细胞因子，同时还具有与CD8+伤害性T细胞（cytotox-ic Tlymphocyte,CTL）相同的杀伤靶细胞作用。毫无疑问，NKT细胞在免疫调节系统中占有重要位置。NKT细胞与疾病可能有诸多关系，可能与自身免疫性疾病的发病机制、变态反应的调节、抗肿瘤作用、及抑制寄生虫感染等有关。2. NKT细胞的多样性分化NKT细胞具有T细胞和NK细胞细胞两重性质，既能表达Va14/Ja281特定的T细胞受体又能由CD1介导识别脂质抗原。NKT细胞的分化是否依赖胸腺尚有争议。根据其表达TCR等多种表面抗原的不同，提示NKT细胞存在两个以上细胞群。从CD4/8的表达看，可将其分为（1）CD4-NKT细胞，（2）CD8-NKT细胞，（3）CD4和CD8均不能表达的DN-NKT细胞。第一类的全部和第二类的半数是Va14/Ja281-T细胞。3.人类NKT细胞人末梢血中的DN-NKT细胞V区域，可高度表达Va24/JaQ（这与鼠的Va14/Ja281高度相似）及Vβ11(与鼠Vβ18高度相似)。这种TCR的组合表达可见于DN-NKT细胞和CD4+细胞。而未见于CD8+细胞。小鼠的CD1相当于人的CD1d的Va24/JaQ。此外，人末梢血中1～2%的T细胞能表达抑制性受体，即抑制型NK细胞受体（KIR），而Va24/JaQ+细胞则不能表达。它的NK相关分子是CD16、CD56或CD57，Va24/JaQ+细胞异不能表达这些分子。在小鼠中还可以看到Va24/Ja281+T细胞以外的NKT细胞。人类Va24/JaQ+细胞与KIR+T细胞能形成不同的亚群。且具有不同的功能。4. NKT细胞分化的胸腺依赖性这是目前存在争议的问题，可以肯定地说NKT细胞分化过程中胸腺是有作用的。NKT细胞多见于胸腺及脾脏以外的肝脏和骨髓种，胸腺缺损的小鼠与正常小鼠比较，NKT的分化并不少。将出生三日小鼠的胸腺摘除，虽然NKT细胞的分化显著受到抑制，但此时CD8+NKT细胞的分化未受到影响。由此认为CD8+NKT细胞在胸腺外分化的可能。5. NKT细胞产生细胞因子的意义 NKT细胞是指能够表达NKT细胞标志NKT1.1的T细胞,其机能具有T细胞和NKT细胞双重特征。NKT细胞在TCR和NKR介导下，产生大量的IL-4及INFγ,对肿瘤细胞有细胞伤害作用。 NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，特别是NKT细胞多数表达Va14TCR，识别CD1抗原，而NKR-P1识别各种糖链。 NKT细胞，特别是CD4-NKT细胞，对TCR刺激可产生大量IL-4及IFNγ,同时具有ThO型细胞因子产生能力。NKT细胞不但产生IL-4的主要细胞，而且强力产生IFNγ。IFNγ参与自身Th1诱导，具有极强的Th1诱导能力，从而是IL-2产生亢进。它同时还具有Th2细胞分化抑制功能。IL-12能诱导NKT细胞产生IFNγ。IL-12对TCR的刺激是IFNγ的产生显著亢进。综上所述，NKT细胞不但是IL-4和IFNγ的强力产生细胞，同时参与Th1/Th2分化的抑制，而这些作用都不是单纯的。 虽然NKT细胞能大量产生细胞因子，但仅在机体内保持这种功能。当初一度认为，NKT细胞只是IL-4的产生细胞，而不是Th2分化的必需细胞。并不认为在CD1缺损的小鼠中NKT细胞的分化和对TCR刺激使IL-4产生减少，且对Th2分化必需的IL-4及IgE的产生没有多大影响。但给小鼠投于α-GalCer可使NKT细胞活化，IL-4的产生诱导Th2的应答。有报告指出，同样投于α-GalCer，可使NKT细胞产生IFNγ而致IgE产生低下。由此可见，NKT细胞能产生IL-4与IFNγ两种功能相反的细胞因子。这种微妙的协调作用可能是NKT机能表达的重要特征。NKT细胞的活化通常伴有T细胞、B细胞及NK细胞的活化，这对NKT细胞活化后的免疫应答有较大影响。

美国食品药品监督管理局（FDA）近日批准了Gazyva（obinutuzumab）与苯丁酸氮芥联用治疗初治型慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者。CLL是一种缓慢加重的渐进性血液与骨髓系统疾病。根据美国国家癌症研究所估计，今年将有15680名美国人被确诊患有该疾病，4580人因CLL死亡。Gazyva有助于免疫系统的某些细胞攻击癌细胞，并且需要与另一种CLL治疗药物——苯丁酸氮芥合用。在对重症CLL患者的治疗过程中，Gazyva在安全性和有效性方面表现出显著改善，此外，FDA还授予此药优先审查和孤儿药地位。FDA药物评价研究中心血液/肿瘤部门主管，Richard Pazdur博士说：“FDA对Gazyva的批准意味着对CLL患者疗法的重要补充，同时也反映了突破性疗法认定的优势，此项认定使我们与企业共同合作，加快重要新药物的开发、评估和上市。”此次批准是基于一项涉及356名受试者的随机、开放性、多中心临床研究，评估了Gazyva-苯丁酸氮芥联用组和苯丁酸氮芥单用组的药效。结果表明，联用组患者的无进展生存期得到显著提高（23个月vs11.1个月）。联用组患者的最常见不良反应包括输液反应、白细胞减少（中性粒细胞减少症）、血小板水平降低（血小板减少症）、红细胞数目降低（贫血）、肌肉和骨骼疼痛、发热等。Gazyva的说明书中含有黑框警告，提示Gazyva与乙肝病毒的再活化及一种罕见病有关，该罕见病（进行性多灶性白质脑病）能损伤大脑白质中覆盖和保护神经的物质，这是此类药物（包括其它单克隆抗体）共有的已知风险。Gazyva由罗氏子公司基因泰克上市销售。转自：http://www.hfoom.com/industry/20131106/376.html

我想用透射电镜观察不同类型的淋巴细胞，想问一下固定前的操作有哪些注意的？大概需要多少细胞？（我用流式分离的）离心时要多大的离心力？不知道有没有有经验的老师能给点帮助。谢谢

[font=宋体][font=宋体]稳定细胞，又被称为静止细胞，是那些在生理状态下增殖不明显，处于细胞增殖周期静止阶段的细胞（[/font][font=Calibri]G0[/font][font=宋体]期）。然而，当它们受到组织损伤的刺激时，这些稳定细胞会迅速反应，进入[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成前期（[/font][font=Calibri]G1[/font][font=宋体]期），展现出强大的再生能力。它们是维持组织和器官稳态的关键因素。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]稳定表达细胞株，也被称为稳定转染细胞株，是一种特殊的细胞株。这些细胞能够持续、稳定地表达特定的基因或干扰特定基因的表达。在生物学和医学研究中，稳定表达细胞株被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病模型建立等领域。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]稳定细胞株平台的常见问题解答[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①若想做稳定细胞株，需提供哪些信息？[/font][font=宋体][font=宋体]客户仅需提供目标蛋白的序列信息和希望表达的目标蛋白的区段，义翘神州技术人员会根据客户要求进行表达风险评估和制定表达纯化策略。常见蛋白序列信息来源包括[/font][font=Calibri]UniProt[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]NCBI[/font][font=宋体]等数据库。客户也可直接提供编码目标蛋白的核苷酸序列。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②稳定株细胞如何交付？[/font][font=宋体]采用干冰运输，尽可能减少温度波动对细胞造成的影响。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③单克隆和[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]怎么选择？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]成药蛋白需要单克隆，以便溯源。如只需拿到蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]抗体的话，[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]即可满足。需要提醒的是，通常情况下，[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]产量较单克隆低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④稳定细胞株做重组蛋白，能否根据蛋白活性进行克隆筛选？[/font][font=宋体][font=宋体]是可以的，只要客户有完整的活性检测方法，我们可以提供[/font][font=Calibri]minipool[/font][font=宋体]供客户进行活性检测（或由义翘进行活性检测）。符合客户对活性的要求后再进行后续的实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑤为什么要构建稳定细胞株？[/font][font=宋体]稳定株一个很大的优势是减小重组表达蛋白的批间差异，并且表达量通常比瞬转高。对于成药性抗体来说，构建稳定细胞株是十分必要的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑥为什么稳定细胞株构建周期较长？[/font][font=宋体]稳定株的构建周期长，很大程度是由于要筛选出阳性克隆，并需要对细胞株的稳定性进行检测。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑦制备稳定株表达蛋白的周期大致如何？[/font][font=宋体][font=宋体]如只需要[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]即可，从基因合成到得到纯化后的蛋白，周期一般在[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]周左右。如需引入多步纯化方案，标签切除，以及额外检测服务则周期会根据具体项目情况有所延长。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，同时提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/stable-cell-line-development][b]稳定细胞株构建平台[/b][/url]，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/stable-cell-line-development[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

【序号】：1【作者】： 郭逸君周琛张凡【题名】：CAR-T细胞治疗B细胞淋巴瘤存在的问题及应对策略【期刊】：药物生物技术. 【年、卷、期、起止页码】：2022,29(01)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iJTKGjg9uTdeTsOI_ra5_XXGP-2cCnxHFvyQzX46SmBpJzxoU8YSnqdPFG62NrF4M&uniplatform=NZKPT

十三.流式细胞术在血液学中的应用 淋巴瘤免疫分型 目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法, REAL分类法是以肿瘤发生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地做出检测，在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中常可遇到以下四种情况：①B细胞系淋巴瘤②T/NK细胞系淋巴瘤③淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤④造血细胞以外的肿瘤。REAL分类淋巴瘤的免疫表型见表12.8。*：弱表达或阴性。BLBL :前B原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; BSLL: B-小淋巴细胞淋巴瘤; LPL:淋巴浆细胞样淋巴瘤; MCL: 斗篷细胞淋巴瘤; FCL:滤泡中心淋巴瘤; MZL: 边缘带B细胞淋巴瘤; SMZL :脾MZL ;HCL:毛细胞白血病; PC:浆细胞瘤;DLBL: B-弥漫性大细胞淋巴瘤; BL: Burkitts淋巴瘤; HBLB:高度B细胞淋巴瘤, Burkitts样; TLB L: 前T原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; TPLL: T幼淋细胞白血病; LGLT:大颗粒淋巴细胞白血病, T细胞型[col

现在准备做实验，用的是mouse的成纤维细胞株。想检测其表面的抗原，如果选择抗体的话，有什么要求吗？什么是来源种属？什么是反应种属？具体什么意思，比如mouse anti rat Ab。那个是反应种属啊？我选抗体的时候是不是一定要选择抗mouse的抗体。还是选择mouse 产生的抗体？很搞不明白，请指点，谢谢

非特异性酯酶一固定液 甲醛-丙酮缓冲液(PH=6.6)Na2HPO4 20mg，12 ， 50.39mgKH2PO4 100mgdH2O 30ml丙酮 45ml40%甲醛 25ml固定血细胞用二孵育液4%1．付品红 4g2N盐酸 100ml将付品红加入到2n盐酸中，水浴溶解过滤后，置4℃，保存备用2．4%亚硝酸钠液亚硝酸钠 400mg蒸馏水 10ml3．六偶氮付品红溶液临用前取4%亚硝酸钠溶液3ml，边摇边滴入3ml付品红中，再充分震荡，1min备用4．2%α醋酸萘酯溶液：取2gα醋酸萘酯溶于100ml乙二醇甲醚中，置4℃冰箱，避光保存备用5．M/15PH7.6磷酸缓冲液甲液：KH2PO49.08g溶于1000ml蒸馏水，乙液Na2HPO49.47g溶于1000ml蒸馏水 12H2O，23.882取甲液13ml，乙液87ml，混合即可KH2PO40.59g,Na2HPO412H2O 10.39g-500ml孵育液临用前配制：取m/15，PH=7.6缓冲液89ml，逐滴加入六偶氮付品红液6ml，充分混合后，再滴入2%醋酸萘酯2.5ml，充分混合后调整pH至5.8-6.4以下石蜡切片，冰冻切片可以用4%多聚甲醛固定，先固定与切片后固定均可二石蜡切片1． 将被检组织置于4℃10%中性甲醛钙溶液中固定，过夜2． 移入4℃holt氏阿拉伯胶糖液至少24hr3． 置于4℃50%丙酮1hr4． 转入4℃100%丙酮24hr(换两次)，最后一次留在室温约1-2hr5． 在二甲苯 中透明30min(换两次)6． 56℃浸蜡30-45min7． 切片 置于室温或37℃温箱干燥1-2hr。8． 二甲苯脱蜡，经100%丙酮，50%丙酮各2-3min，然后进入蒸馏水9． 孵育后步骤与血涂片同，但需经50%丙酮及纯丙酮各30s-1min，二甲苯 透明，然后封藏holt氏阿拉伯胶蔗糖液蔗糖30g阿拉伯胶1g100ml用这个酶扩散少些。1%甲基绿染色液用于复染

多维流式细胞仪可同时进行多参数测量，在特定空间内对细胞群进行分析。若要实现该多维空间的合理使用，每个特定参数需提供额外信息来识别细胞群，并确保其动态范围能够最大限度地加以利用。本研究就白细胞的光信号散射情况进行了详细说明，从而促进了多维流式细胞分析的开展。细胞制备技术的提升对获得高分辨率光散射信号至关重要，可以实现粒细胞、单核细胞、颗粒状和非颗粒状淋巴球的完全分离。对搜集前向散射光的角度进行了改进，以提升白细胞的区分度。尽管正交光散射信号能够区分颗粒状和非颗粒状淋巴细胞，但仍无法利用线性或对数函数的形式将分辨率和动态范围显示出来。而在正交光散射信号中应用多项式函数，则可将白细胞全部以高分辨率显示出来。关联前向和正交光散射信号可实现高分辨率光散射与非线性显示的结合，使细胞群呈现等距分布状态。使用这种方式，可将外周血中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱粒细胞、单核细胞、颗粒状和非颗粒状淋巴细胞等都显示出来，占据与正交和前向光散射相关的不同位置。出人意料的是，嗜碱粒细胞是处在了颗粒状淋巴和单核细胞附近而非中性和嗜酸性粒细胞。流式细胞术中的人体白细胞光散射特性主要应用于区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。前向光散射信号与细胞的大小和折光率有关，而正交光散射信号则与细胞的粒度有关。一项对正交光散射信号更进一步的分析显示出了淋巴细胞成分的差异，即非颗粒状淋巴细胞的信号比颗粒状的要低。此外，该方法还显示了白血球的正交光散射信号在不同疾病状态下的变化情况。高分辨率光散射要在最佳角度收集散射参数，并对散射光的收集光路进行优化。改进细胞制备方法对最大限度地实现对细胞群的分离至关重要。改变制备流程可能导致细胞群分辨率的提高或降低。通过光散射，可从测量中排除受损细胞和无核细胞的干扰，从而提高细胞群的分辨率。正交光散射信号的动态范围不允许在相同线性尺度上同时观察淋巴细胞群和中性粒细胞。本研究提供了一种新方法，通过对正交光散射信号进行数字信号处理转换，实现了白细胞群在光散射显示中更加均衡的分布。这种转换提升了淋巴细胞分辨率，实现了细胞的可视化，而动态范围的确定对中性粒细胞的观察也十分重要。因此，重新对细胞群在多维空间进行定位可使细胞群在制备过程中实现完美分离。

[font='times new roman'][size=21px]ODC1[/size][/font][font='times new roman'][size=21px]在[/size][/font][font='times new roman'][size=21px]弥漫大[/size][/font][font='times new roman'][size=21px]B[/size][/font][font='times new roman'][size=21px]细胞淋巴瘤[/size][/font][font='times new roman'][size=21px]治疗中的意义[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]进入二十一世纪以来，淋巴瘤的发病率逐年上升，现已跻身十大最常见的肿瘤之列。据[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2020[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]年全球癌症报告统计，淋巴瘤新发病例约[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]63[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]万，约占所有新发癌症病例的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3.2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]％，死亡病例约[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]28[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]万，约占癌症总死亡人数的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2.8[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]％。其中弥漫大[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]B[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞淋巴瘤（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）约占所有非霍奇金淋巴瘤的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]30%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，是最常见的病理亚型。因其起病具有一定的隐匿性且缺乏快速有效的早期筛查手段，故大多数病例确诊时已为晚期，多伴有远处转移，大约[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]60%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的患者可通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]R-CHOP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]利妥昔单[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]碱和泼尼[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]松）免疫化疗治愈，而复发难治性[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]仍是淋巴瘤治疗领域的一大棘手问题。临床上，患者通常表现为无痛性进行性淋巴结肿大[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]伴结外[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]侵犯表现，一旦确诊，即需积极治疗。传统的化疗和放疗均因作用位点的选择性低而易产生严重的毒副反应，不仅给患者带来生理和心理上的极大痛苦，也往往是治疗失败的主要原因之一。在过去的二十年里，人们对其在流行病学、预后因素和生物学异质性等方面的研究有了跨越式的进展，随着对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]疾病本质理解的逐步深入，以分子事件为基础的更为细化的分类标准蓬勃发展，免疫治疗和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]靶向[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]治疗药物也层出不穷。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2016[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]年，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]WHO[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在淋巴造血系统肿瘤的分类中提出了“双打击淋巴瘤”的概念，为临床工作中的危险分层、预后判断和治疗方案的选择提供了更坚实的依据。尽管在分子机制方面的研究取得了长足的进步，但仍有大约[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]40%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的临床治疗效果仍然不尽如人意，因此，为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]探寻更多的治疗靶点并研制高效低毒的靶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]向药物[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]已成为科学研究中亟待解决的关键问题。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]基因包括[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]定位于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2p25.1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，普遍存在于生物体内，是主要的功能基因。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]基因编码的蛋白产物是多胺生物合成的关键酶，通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]介[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]导鸟氨酸生成腐胺促进多胺的合成。腐胺、精[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]脒[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]和精胺总称为多胺，至今已被发现[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]340[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]余年，是生物体生命活动的重要物质，生物学作用极为广泛，并与肿瘤的发生发展密切相关。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过度表达可引起细胞内腐胺水平升高从而抑制甲基汞诱导的线粒体功能障碍相关细胞凋亡。另有相关报道，由甲基汞引起的线粒体功能障碍和活性氧（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ROS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）生成也可被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]和腐胺的表达升高所抑制。这些结果表明，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的过度表达可能通过增加细胞内腐胺水平途径抑制线粒体[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]介[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]导的细胞凋亡。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bachmann[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等的研究发现，生物体细胞内存在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MYC-ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]轴，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]调节[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的转录和翻译、核糖体功能、蛋白[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]酶体降解、生物钟和免疫等功能是由[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MYC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]基因调控的。大量的研究结果表明，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在大肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等癌细胞中的表达量均显著高于相应的癌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]旁正常[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]组织。本实验室前期利用公共数据库分析了[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]33[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]种肿瘤类型、各种癌细胞系和正常组织中的表达，结果：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在包括[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在内的许多肿瘤类型和细胞系中呈[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]高表达[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]状态，说明[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的恶性发生发展中发挥着重要作用，因此本研究对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]中的生物学功能和分子机制进行了初步探索，旨在为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]诊治提供新思路，为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]DLBCL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的治疗以及改善患者预后提供有力的临床前研究依据。[/color][/size][/font]

白细胞与红细胞在此重新定向。白细胞（WBC）和红细胞（RBC）是血液中的重要组成部分，在生命体延续发展和生物治疗中具有不同的功能。红细胞，又称红血球，含有一种蛋白质称作血红蛋白。当血红蛋白从肺部吸收氧气时，血液呈红色。随着血液流经全身，血红蛋白向人体组织释放氧气。红细胞的生命周期为4个月，其形如圆盘，中间下凹，边缘较厚，呈圆饼状。白细胞，又称白血球，具有更加复杂的功能。白细胞构成了人体抵抗感染的一种防御机制。有多种不同类型的白细胞，其生命周期和功能各不相同。白细胞还能够产生一种特殊的蛋白质，称作抗体，能够识别并吞噬入侵人体的外来异物。 红细胞白细胞物理特征红细胞呈双凹圆盘状，无核。尺寸大约为6-8 μm。白细胞呈不规则性，但有一个核和外缓冲层。生命周期120天。几天，但在健康人体中可存活数天至数年不等。类型：血液中只有一种红细胞在血液中存在许多类型的白细胞，其功能各不相同：嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞（巨噬细胞）、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。循环系统：心血管系统。心血管和淋巴系统总计红细胞700:1白细胞男性每立方毫米460-6200万个；女性每立方毫米4200-5400万个。每立方毫米4000 – 11000个功能：向身体的不同部位提供氧气，并负责运送二氧化碳和其它废物。产生抗体，对感染形成免疫力，有些具有噬菌功能。血液中含量：

十二. 流式细胞术在血液学中的应用 白血病免疫分型其临床意义 目前公认的系列特异性指标是:T淋巴细胞系--胞浆CD3（cCD3）,B淋巴细胞系-- cCD22或cCD79，髓系---MPO 或cCD13,一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。1. ALL的免疫学分型1986年前分为普通型ALL（cALL）、未分化细胞ALL （Null-ALL）、T细胞ALL（ T-ALL） 、前B细胞ALL （PreB-ALL）、B细胞ALL （B-ALL）五型;1986-1994年分为两大类九型(非T-ALL六型,T-ALL三型),九十年代后期有人按临床实用性一般分为B祖细胞ALL、前B细胞ALL、B细胞ALL、T细胞ALL四型。表12.1-表12.4列出ALL的五型、九型（ B[color=blac

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g, IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。【培养原理】CIK培养用细胞因子和抗体：nCD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。nIL-2 (白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。nIFN-g (干扰素-g)IFN-g 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。nIL-1a(白细胞介素-1a)IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。【细胞制备】1．外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。2．CIK细胞的培养及鉴定2.1将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；2.224h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。2.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。2.5CIK细胞质控：2.9.1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；2.9.2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。2.9.3细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。2.9.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素5 Eu)。【步骤简图】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873006_small.jpg 【推荐试剂】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873008_small.jpg 注：Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。【其它相关试剂】 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873009_small.jpg【参考文献】 Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125-2133

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

[b]小鼠胚胎初始淋巴管形成的多步机制[/b]Rene′ Ha¨ gerling1,7, Cathrin Pollmann1,7,Martin Andreas1, Christian Schmidt1,Harri Nurmi2, Ralf H Adams3, Kari Alitalo2,Volker Andresen4, Stefan Schulte-Merker5,6and Friedemann Kiefer1,* [i][b]The EMBO Journal[/b][/i] (2013), 1-16在哺乳动物发育过程中，主静脉血管中的一个内部细胞亚群开始表达淋巴管特异基因，进而发育出初级的淋巴结构，被共同命名为淋巴囊。淋巴内皮细胞的出芽，扩展，膨胀被认为是淋巴内皮细胞从主静脉中产生的基础，但是淋巴管形成的确切机制仍然不为人所了解。使用选择性光片照明显微镜Ultramicroscope来观察进行整体免疫染色的小鼠胚胎，我们观察到细胞分辨率的完整的发育中的血管系统。本文中，我们报道了可以被检测到的最早的淋巴内皮细胞松散的连接在主静脉和浅表的脉管丛。下一步的淋巴内皮细胞聚集导致了两个清晰的，未被预先确认的淋巴结构，背部外周纵向淋巴管和腹侧初级胸导管，它们在后期阶段形成了一个与主静脉的直接连接。我们发现血管内皮生长因子C和基质组分CCBE1对于淋巴内皮细胞出芽和迁移是必不可少的。总之，我们提供了一个明显更加细节化的视角和早期淋巴管发育的新颖模型。[img=,591,756]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal1.jpg[/img]图1. 初始淋巴祖细胞从主静脉中产生。（A-D）受精后9.5/9.75(A,C)和10.5（B，D）天小鼠胚胎血管系统的整体染色。PECAM-1优先染动脉、静脉血管中的内源粘蛋白。Prox1识别的淋巴内皮细胞。（A）中框出了胸颈静脉区，淋巴内皮细胞。DA，背主动脉；ISA，节间动脉；PAAs，咽弓动脉。标尺100um。E 图示箭头穿越一对主静脉之一。静脉内皮细胞，蓝色；发育中的心脏，暗绿；浅表静脉丛的位置被标示出来。CCV，一般主静脉；SV，静脉窦；H，心脏；ISV，节间血管。（F）成对CCV和导流入心脏的SV的三维重构。移开一半对称主静脉后的ISVs和生肌刀（M）。蓝色箭头指示静脉血的流动。（G）胸颈静脉区的横切面。DA，ISA和动脉丛标记红色；CV，ISV和sVP标记蓝色。NT，神经管；DRG,背根神经节；iLECs，初始淋巴内皮细胞。（H-K）整体免疫染色胚胎的图片左侧标注的蛋白分布的光学切片的3维重建。E，受精后几天的发育阶段（H，I，K横切面；J矢状切面）。白色箭头，新出现的iLECs；点线，CV的背根。标尺100um。（L-O）在E10.0和E10.25期间出现的最早iLECs的图解。Prox1+细胞，绿色，黄色为细胞核。以绿色表面表明在CCV移开分支中的Prox1表达区。[img=,591,330]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal2.jpg[/img]图2. 淋巴内皮细胞从CV的出芽伴随着细胞和核的形状改变，以及一个蛋白标记开关的表达。（A,B）整体免疫染色胚胎的CCV中左侧标注蛋白的矢状视图。受精后的发育阶段（E）；iLECs初始淋巴内皮细胞；头盖处，左；尾部，右。标尺100um。CV的上出口，从鳞状到纺锤状的LEC形状改变（箭头指示CV根中的Prox1+ ECs）。白色箭头，iLECs间极薄的连接；红色箭头，照亮的静脉血管中频繁的发现红细胞（但iLECs中从没有）。（B）也可以看到相应的图解1O。（C）在E10.5阶段，出现的iLECs中的VEGFR-3及其联合受体Nrp2水平被上调，而CV和iLECs中的Lyve-1水平保持不变。***P0.001，NS，不显著。（D,E）随着iLECs的出现核的形状从圆形转变为椭圆形。通过核表面重构描述了CCV内部和外部的Prox1+细胞核以及对球率和椭球率做散点图（E）。标尺100um。（F-H）矢状（F）和横切面（G，H）视图中整体免疫染色小鼠胚胎的CCV内部和外部的Prox1+细胞核表面重构。（F，G）通过热成像赋以伪色标记的Prox1表达强度图，例如，最高强度的表达标记为红色，低强度表达标记为蓝色。（H）通过图像的叠加进行细胞的解剖学定位软件包：Imaris Vantage，标尺100um。[img=,591,785]http://qd-china.com//bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal3.jpg[/img]图3. iLECs在节间血管主要分支的水平上浓缩来形成照亮的外周纵向淋巴管（PLLV）。（A-D）每张图所展示蛋白的整体免疫染色胚胎光学切片的矢状图重构。E，受精后的发育天数；头盖的，左；尾端的，右。（A）在iLECs出现的早期阶段，iLECs以扇形模式分布，从CCV向头部和尾部扩展。虚线，iLECs检测的边界。（A-D）iLECs在节间血管第一侧枝的水平上立即浓缩形成PLLV。长的阴影线指示了CCV和SV的位置；短的阴影线，iLECs浓缩和PLLV形成的区域。（E-H）图解iLECs的位置，在E10.5和E10.7阶段出现在CV的背部。CCV之外的Prox1+iLECs以淡绿色标记，CV内的Prox1+细胞和心肌以深绿色标记。在CCV移开的分支中的Prox1表达域（P1ED）以淡绿色表面显示。浅表静脉丛作为iLECs的一个可能的备选来源，其位置标注为蓝色（G，H）。sVP内的Prox1+内皮细胞被标注为红色。sVP，浅表静脉丛；标尺100um。 [img=,591,846]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal4.jpg[/img]图4. CV和PLLV之间的LECs聚集并形成不断增长的更大的被照亮结构并最终形成原始的胸导管。来自整体免疫染色的小鼠胚胎光学切片的图中标注蛋白的（A-C）矢状图和（D）截面图。（A)箭头指示了位于CV和PLLV之间的LECs快速和不断进行的聚集，这导致了更大照明结构pTD的形成（B-D）。（C，D）浅表淋巴管sLECs开始从PLLV背侧和pTD旁边伸展。PLLV和pTD在pTD头盖端连接到一起。（F-H）图示了导致pTD成形的细胞聚集和浓缩事件。（I）在E11.5阶段，sLECs中的VEGFR-3和它的联合受体Nrp2水平上调，而Lyve-1水平与CV和iLECs相比强烈下调。***P0.001。发育阶段（E）；头盖，左，尾端，右。ACV，前主静脉；CCV，一般主静脉；PCV，后主静脉；ISV，节间静脉；PLLV，外周纵向淋巴管；pTD，原始胸导管；sLECs，浅表淋巴结。标尺100um。[img=,591,734]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal5.jpg[/img]图5. 通过最高水平表达的Prox1表征的pTD和CV间新形成的成对的接触点。（A-C）整体免疫染色胚胎的矢状图。新形成中的pTD快速巩固进一个巨大的照明结构，头颅部以U形连接到PLLV（左侧A，B）。CV和pTD间的两个连接表达最高水平的Prox1（箭头）。（B-E）一个总是位于pTD和CV连接间的作为锁骨下动脉的短暂存在的侧枝被星号标记出来。（C）红色箭头：pTD内堆积的红细胞。箭头标注pTD连接端对面的Prox1+细胞。（D，E）通过pTD和CV连接区域的单个平面（光学切片）。（F-H）图示pTD和CV间接触点的发育，接触点处高表达的Prox1+细胞标记为暗绿色和红色的细胞核。标尺100um。[img=,591,963]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal6.jpg[/img]图6. 不同的淋巴内皮细胞群表达不同的标记蛋白组。（A-G）所示发育阶段的免疫染色胚胎的横向冷冻切片。可见的抗原被以每幅图上所标记的相应颜色标记。典型例证标记表达的面板在（I）中汇总。（A）在E10.0阶段的LECs细胞中没有粘蛋白的表达，在E11.0阶段首先被检测到并在E12.0的LECs中变得丰富。注意CV中的Prox1+细胞在所有阶段都是阴性。在E11.5阶段，Nrp2在CV和pTD内中等强度的表达，而CV外的iLECs强烈的表现为阳性。（C）内皮粘蛋白在iLECs中只有短暂的留存。（D）在CV和pTD的Prox1+ ECs中Lyve-1强烈表达，而在展示的sLECs中仅有残留的表达（箭头）。（E）在所有血管结构中，整合蛋白α6有中等程度的表达。（F）在E11.5阶段，神经生长因子Netrin-4在BECs中强烈表达，在CV中很弱的表达，在pTD内中等程度的表达，但在iLECs中（箭头）没有被检测到。（G，H）Unc5B在iLECs（G，箭头）和sLECs（H，箭头）中强烈表达，而在pTD中表达微弱。 (H)来自整体免疫染色的小鼠胚胎的Prox1 (绿) 和Unc5B (蓝)光学切片的矢状重构. (I)在妊娠中期，不同LEC群中标注蛋白的表达。数据来自免疫染色的冷冻切片或整体免疫染色。表示的结构和细胞群： CV, 主静脉 iLECs, 初始LECs (第一轮从CV中出现的纺锤状LE,松散连接的细胞) sLECS, 浅表LECs (从PLLV (背侧)中伸出的LECs) pTD, 初始胸导管. CV*, 对CV背侧Prox1+细胞的表达限制。标尺100um。 [img=,591,781]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal7.jpg[/img]图7. CCBE1缺陷导致的Prox1+细胞从CV分离的失败，并导致初始淋巴结构的快速损失。 (A, B, F, G) 对标注蛋白进行整体免疫染色的野生型(A) 和Ccbe1_/_ (B, F, G)胚胎的3D重构。(A, B)E10.5阶段的矢状图. (B) 在CCBE1-缺陷胚胎中，在CV和初始PLLV中检测到丰富的Prox1+细胞，紧邻浅表静脉丛。与野生型胚胎(A)相比,CCV和PLLV间没有纺锤状的iLECs。 (B, F) Prox1+细胞描绘出CCV和SV的边界, 当非典型的，大的，照明的分支从CV（箭头）中出现。(G) 含大量VEGFR-3+的异形分支从CV（箭头）和ISVs（箭头）中伸展。(C-E)图示野生型(C)和CCBE1-缺陷型(D, E)胚胎中的Prox1+ cells。含大量VEGFR-3+的静脉内皮标注为深蓝色。sVP, 浅表静脉丛。标尺100um。[img=,295,591]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal8.jpg[/img]Figure 8VEGF-C（血管内皮因子C）缺陷的小鼠胚胎中的Prox1+内皮细胞因为不能离开它们起源处的血管从而标记了LECs的静脉来源。E10.75阶段野生型(A, B)和Vegfc_/_型(C-F)胚胎的矢状图3D重构，对标注蛋白做了整体免疫染色。在VEGF-C缺陷胚胎中，Prox1+内皮细胞不能离开静脉血管导致没有出现发育中的淋巴结构。(E, F) 除了CV（箭）中的Prox1+ 细胞, 在腹侧sVP（箭头）处更大的静脉血管中捕获了第二群Prox1t淋巴初始组织 。(G, H) 图示了野生型 (G) 和VEGF-C缺陷型(H)胚胎中的Prox1+细胞。NE, 神经元的Prox1+表达条纹。sVP, 浅表静脉丛。标尺100 um。[img]http://qd-china.com/bio%20application/Lavision%20Ultramicroscope/The%20EMBO%20Journal/The%20EMBO%20Journal9.jpg[/img]Figure 9. 在iLECs外出和淋巴管形成过程中，CCBE1和VEGF-C协同的相互作用。对E10.5阶段所标注蛋白整体免疫染色的野生型(A-C), Vegfct/_ (D-F), Ccbe1t/_ (G-I) 和 Vegfct/_/Ccbe1t/_ (J-L) 胚胎矢状图的3维重构。CCV和ISVs的根部用虚线标注，Prox1+细胞用箭头标注。与野生型同窝小崽相比，Vegfct/_胚胎(A-C)表现出iLECs从CCV中迁出的下降(D, E)。与之相反，Ccbe1t/_胚胎中，受损的ISVs形成被检测到。而且，不典型的，照亮的分支出现在Prox1+和高水平VEGFR-3表达的主静脉根部(G-I). (J-L) 在复合的杂合胚胎中，这种表型非常夸张地表明了VEGF-C 和CCBE1在淋巴管形成过程中的协同作用。标尺100um。

用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。

早就听说flowjo的补偿自动调节功能，上网寻觅一圈都没有找到相应教程，实在忍不了了，就自己在此写个教程，希望能帮助到其他同学，废话不多。上教程，如果大家觉得不错，赏两个叮当，让我有更多的动力在为大家奉献一些小教程。1.样品制备，及数据采集我们实验室是BD公司的流式机，采集软件是cellqust pro，我的习惯都是采集数据以后，转用FLOWJO再继续分析，制图。样品制备同常。下面以脾淋巴细胞CD4,CD8分群来做一简单介绍。数据采集中，仍然要使用阴性管调节 阈值 电压 ，圈定大概的淋巴细胞的门。完成后，收细胞，保存数据为none.001转cd4-pe的单阳样品，不用调节补偿，直接收细胞，保存数据为cd4-pe.002。同样，转cd8-fitc的单阳样品，不用调节补偿，直接收细胞，保存数据为cd8-fitc.003最后上样品和control组，收细胞，保存数据为sample.004，如果有control组，假设为control.005（以上处理跟常规处理的主要区别，就是补偿调节都是0%，即不调节补偿，省去了补偿调节这一步，收细胞的速度是不是快了不是一点两点咧.)2，自动补偿调节将数据导入flowjo，本人用的是win环境下的lfowjo7.6.2xx版，有同学反应，文件不能导入或者导入细胞数是0，同学们可以试试将数据文件夹放在全英文路径下，同时有的从MAC系统拷来的目录，可以试着对文件夹从命名一下，也要是全英文，可能可以解决文件打不开的问题。将以上文件全部拖拽进flowjo，使用NONE.001圈定淋巴细胞门LYM.将门拖拽到allsample让门应用到所有样本上。这时候我们可以先看看sample.004的散点图，因为没有调节补偿，根本不是我们所能使用的图，更化不了象限，所以，我们开始调节补偿。

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

一、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有 非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢 等。二、细胞因子的命名细胞因子按其来源可分为：由单个核吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine)；由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子 (lymphokine)等。按其作用可分为干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。部分由不同细胞分泌的细胞因子，其基因及编码蛋 白与结构清楚者，在免疫调节、造血和炎症中发挥重要作用，又称为白细胞介素(interleukin，IL)。也可以依据结构或者其受体结构分类，我们的 趋化因子目前没有受体产品。三、细胞因子的特征1、低分子量；一般为＜60kD的多肽或糖蛋白。多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。四、细胞因子的分类1、白细胞介素(interleukin，IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。2、干扰素（interferon,IFN)最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。分α、β和g三种类型。3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。包括G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、 GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素 (TPO)等。5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。根据趋化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量，可分为CC、CXC、C、CX3C四个亚家族。6生长因子(growth factor，GF)生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。五、细胞因子的生物学活性1.介导自然免疫、参与抗肿瘤和抗感染2.调节T、B细胞活化、生长和分化，介导细胞免疫和体液免疫3.刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞4.在炎症、感染和内毒素血症中的作用5.在超敏反应和自身免疫病中的作用6.细胞因子通过激活其相应受体（CKR），导致细胞的增殖与分化或分泌某种蛋白质。六、四种蛋白表达体系比较表达细胞优点缺点原核E. coli繁殖快、成本低、产量高遗传背景及基因表达调控机制清楚易于大规模培养，成本低廉蛋白常为包涵体，纯化困难无糖基化（分泌蛋白，细胞膜上蛋白不可用），生物活性不定无翻译后修饰，内毒素含量高酵母Pichia使用简单，表达量高，His-tag便于纯化，一定的翻译后加工可进行糖基化修饰，操作简单，适合大规模生产可诱导表达，也可分泌表达，产物便于纯化有时会出现蛋白切割问题糖基化不能满足要求昆虫High-5产量高 ，翻译后加工与哺乳动物相似对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势无内毒素污染蛋白活性不如哺乳动物适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白哺乳CHO HEK293完善的翻译后加工，活性接近天然蛋白周期长、技术要求高表达产量低

[font=宋体]随着生物技术的快速发展，稳定转染细胞株的构建在基础研究和应用研究中变得越来越重要。这一技术涉及到将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中，从而实现基因的长期表达。然而，这一过程也伴随着一系列的挑战和常见问题。本文将深入探讨稳转细胞株构建的方法，以及在实践过程中可能遇到的问题，旨在为研究者提供实用的指导和建议。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳定转染细胞株构建方法：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、慢病毒感染细胞[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞，包装技术成熟，[/font][font=Calibri]II[/font][font=宋体]代和[/font][font=Calibri]III[/font][font=宋体]代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒，是稳转细胞系构建的首选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制，不适合转录本区域比较长的基因，对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒，病毒表达载体中，是由[/font][font=Calibri]WPRE[/font][font=宋体]元件代替[/font][font=Calibri]PolyA[/font][font=宋体]稳定以达到稳定[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的作用，对部分基因的翻译有一定影响。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、转座子介导的稳转细胞系构建[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]转座子是存在于各种生命细胞内的可移动遗传信息元件，能实现[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]片段在染色体内部[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]之间的转移。工程化的转座子由[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]和转座酶编码基因组成，通过转座酶与[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]结合实现基因转移。将转座子的两个元件分别构建在两个独立载体上，并将目的基因序列替换转座酶序列，与另一个载体共转染目的细胞，实现目的基因在宿主基因组上的整合。与其他技术不同，目的基因在整合酶存在下会持续处于切割—整合状态，实现连续跳跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9 [/font][font=宋体]基因敲入[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]利用[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9[/font][font=宋体]系统，通过[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]修复机制，可将目的基因（如抗性基因和荧光标志）定点敲入细胞基因组。在哺乳动物细胞中，[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]的效率高于[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]。设计特定[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]donor[/font][font=宋体]载体，可在[/font][font=Calibri]AAVS1[/font][font=宋体]位点（人基因组安全港）实现基因定点敲入。此方法稳定、安全，但敲入概率在不同细胞和位点中有所差异，需筛选单克隆以获得稳定细胞系。随着编辑效率提高，此方法将更省时省力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]四、[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]系统，通过融合[/font][font=Calibri]VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]系统对基因进行过表达和干扰[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]通过[/font][font=Calibri]dCas9-VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]激活蛋白实现了多数细胞内源基因的特异性激活，不受基因大小限制。主要优势是应用广泛，但需要三种不同抗性病毒逐次或同时感染细胞。[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]将[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]序列构建在[/font][font=Calibri]lenti[/font][font=宋体]载体中，配合其他两种慢病毒可激活任何基因。主要缺点是筛选细胞时需要三种不同抗性的病毒，部分细胞筛选后表型变化明显。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳转细胞系构建中常见问题解析：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]是否需要进行密码子优化？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于氨基酸密码子的简并性和[/font][font=Calibri]tRNA[/font][font=宋体]的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. Kozak[/font][font=宋体]序列是必须要添加的吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列（通常是[/font][font=Calibri]GCCACCatgG[/font][font=宋体]），真核生物[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]真正的起始密码子位于[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列的保守序列中，其共有序列是[/font][font=Calibri]CCRCCAUGG[/font][font=宋体]，几乎所有[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的翻译起始都依赖于[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点[/font][font=Calibri](IRES)[/font][font=宋体]募集小亚基。[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列通过与翻译起始因子[/font][font=Calibri]eIF[/font][font=宋体]形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]启动子应如何选择？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]启动子表达活性相对较高。而[/font][font=Calibri]EF1a[/font][font=宋体]（延伸因子[/font][font=Calibri]-1[/font][font=宋体]α）启动子更适用于表达长片段的基因。[/font][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]EF1A[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CAG[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CBh[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]稳转细胞系培养体系[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如[/font][font=Calibri]hepG2[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]puro[/font][font=宋体]抗性筛选浓度为[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/ml[/font][font=宋体]，则建议用[/font][font=Calibri]1ug/mL+[/font][font=宋体]完全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者[/font][font=Calibri]HEPES[/font][font=宋体]调节细胞细胞代谢水平，维持细胞增殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]标签放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端还是[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端好？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端有信号肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端；蛋白如果较小，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端，减少蛋白降解；如果下游有[/font][font=Calibri]P2A[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]T2A[/font][font=宋体]等自剪切肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端。如果为了添加[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列，建议加在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. [/font][font=宋体]是否可以构建稳转敲除的细胞系？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，其服务内容详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

十八. 流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定 NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。 LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。 [

基本原理本分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。试剂与器材•外周血单个核细胞（参见实验1）•PBS1×和PBS10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA•胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）•HCl 1mol/l•Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品）•4g/l台盼蓝染液（溶解在PBS液中）•50ml聚丙烯圆锥管•毛细吸管•移液管（1、2、10ml）•CO2孵箱•超净台•有旋转桶转子装置的离心机•PH计操作步骤所有的操作应该在无菌条件下进行一．不同密度Percoll分层液的配制1. Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.42. Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（无Ca2+、 Mg2+）3. Percoll分层液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）4. Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）二．不连续密度梯度制备1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（Ⅱ）（密度=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。三．单核细胞的分离1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度较小的部分）之间的界面中。 （图1）图略(暂时)图1. Percoll非连续性密度梯度离心分离法2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。4. 若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。（参见第一章第一篇第一节）结果本法回收的细胞中单核细胞占70-100%（存活率应大于90%），淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。实验要点1. 为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。2. 所有操作过程应在18-20℃中进行。3. 仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。4. 洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。5. 如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠， 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

生鲜乳中体细胞数(SomaticCellCount，简称SCC)反应生鲜乳卫生状况和奶牛乳房健康的状态。体细胞通常由巨噬细胞、淋巴细胞、脱落上皮细胞和中性白细胞等组成。当乳腺被感染或受机械损伤后，体细胞会上升，受感染乳区的乳汁中大约99%的细胞是白细胞。　　1、高体细胞数对乳制品的影响主要有：(1)牛奶味道变异;(2)牛奶贮存期缩短;(3)乳清量增加、酪蛋白收缩性降低，导致奶酪的产量下降。　　2、引发高体细胞数原因有：(1)可能有隐性乳腺炎发生 发生隐性乳腺炎时，感染牛很少有临床症状，肉眼观察乳汁正常，故常常误将感染乳区的乳作正常牛奶处理，造成生鲜牛奶中体细胞的升高。(2)牛群结构偏老 一般而言，胎次越小的牛只体细胞越低。因为老龄牛只长期接触乳腺炎病原菌，免疫功能下降，有更多的被感染机会。　　3、降低生鲜乳中SCC，重点应从以下方面着手：(1)减少乳房机械性损伤。牛床、运动场、挤奶厅、饲槽、水槽等奶牛活动区域无尖锐物品，机械挤奶时不可过挤，以避免引起乳房损伤。(2)减少病原菌等生物侵袭。加强环境消毒，及时杀灭环境中的有害微生物。(3)日粮营养充足、均衡，提高机体抗感染能力。(4)定期(至少每月1次)进行牛群隐性乳房炎检测，及时进行乳房炎预防。(5)隔离患有传染性乳房炎的奶牛，淘汰患有慢性乳房炎的母牛等。

中科院广州生物医药与健康研究院裴端卿博士和潘光锦博士领导的研究组通过对人的不同组织来源的三个细胞状态（体细胞，体细胞衍生的iPS细胞和iPS细胞分化获得的神经前体细胞）的免疫原性的研究，发现细胞的免疫原性在重编程及分化后仍然具有一定的遗传记忆。这项研究成果7月26日在线发表在学术期刊Plos One上。研究人员主要比对了较为成熟的体细胞（成人皮肤来源的成纤维细胞）和较为幼稚的体细胞（胎儿脐带组织来源的间充质细胞）相应的三个细胞状态的免疫学特性。研究结果表明：由免疫原性较高的体细胞（皮肤成纤维细胞）最终获得的神经前体细胞人具有较高的免疫原性。与之相对的是，由免疫原性较低的体细胞（脐带间充质细胞）最终获得的神经前体细胞，在HLA-I表达、激活淋巴细胞等方面，均会保持较低的免疫原性。这种低免疫原性的神经前体细胞为iPS技术开拓了新的应用领域——异体移植，并且可以通过免疫原性较低的体细胞获得iPS细胞库建立异体移植的治疗模式。 http://www.cas.cn/ky/kyjz/201307/W020130731665880470908.jpg广州生物院发现细胞的免疫原性在重编程中可被遗传记忆

用注射器抽取血淋巴每只蟹0.5mL移入装有0.5mLACD抗凝剂的ePpendorf管中。为什么抽的血和抗凝剂要一样多,谢谢

[b]牛奶体细胞概念的提出[/b]乳汁中细胞计数或者说是白细胞计数在奶牛乳房炎监测中已运用的大概有百多年的历史。体细胞这一概念是在 1910 年由 Prescott 和 Breed首先提出，当时他们建议用“Body cells”，因为当时认为奶中细胞是从上皮细胞脱落下来的。直到1960 年左右，“Somatic cells”已逐渐被人们所普遍接受。[b]牛奶体细胞的组成[/b] 现今我们通常所说的牛奶体细胞主要指白细胞，包括巨噬细胞、淋巴细胞以及多形核白细胞（PMN）。乳中细胞类型研究表明，腺泡上皮细胞，无论是在干奶期还是泌乳期，在乳中很少，仅占细胞总数的7%以下。所以说泌乳期乳中细胞数的增加不是由于上皮细胞的脱落造成的。巨噬细胞是正常乳中的主要细胞，占细胞总数的 30％~70%。[b]牛奶体细胞出现的原因牛奶体细胞[/b]主要是白细胞对乳腺有重要的作用，它对病原微生物的入侵起监视和杀灭作用。巨噬细胞及PMN具有吞噬功能，可以杀死入侵病原微生物，乳中淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，它们在对入侵微生物的特异性免疫中起很重要的作用，病原微生物一旦通过乳头管进入乳腺并在其中增殖，就会引起一系列的炎性反应。此时乳中的细胞就同病原微生物相互斗争，并且产生一系列的炎性因子,而这些炎性因子将导致一系列的病理变化，这些炎性因子包括补体，前列腺素，白三烯、组胺、5-HT（5-羟色胺）、白介素，TNF（肿瘤坏死因子）、白细胞杀菌素以及一些其他细胞因子，典型的症状包括血管通透性增加，血管扩张，血流量增加，水肿，中性粒细胞转移，以及乳腺合成能力降低，并伴有疼痛，发热。在炎症初期乳腺最主要的防御机制就是 PMN 的迁入，正常情况下，PMN 可自由通过毛细血管，而不黏附或很少黏附在血管壁上，一旦出现炎症，黏附分子被大量表达，从而使得 PMN 黏附、迁移并通过细胞间隙而进入乳腺。乳中白细胞和被损伤的组织释放一些因子能吸引 PMN 大量涌入乳中，在炎症初期乳中细胞 90%以上的是 PMN，有报导表明大量要进入乳腺的 PMN 在腺泡外聚集，甚至在某些腺泡受损较严重的地方，PMN 可通过上皮间隙而进入腺泡，因此 PMN 在感染区的大量迁移是造成[b]牛奶体细胞[/b]SCC 大量上升的主要原因，因而有人认为，PMN 迁入的速率是消除感染乃至决定病情的关键因素。 另外，据报道 PMN 也可在乳头导管、乳头池、乳腺池等处透过基底膜而进入乳汁。因此，这些地方被认为是炎症初期机体作出反应并允许 PMN 通过的地方，乳腺以此来抵御微生物的入侵，值得注意的是，在慢性炎症反应过程中，单核细胞也可透入。因此，SCC 增加也是白细胞迁入造成的。乳中 PMN执行吞噬入侵微生物的功能，但是它也可以吞噬诸如脂滴、酪蛋白这样一些物质，而这些物质被吞入后 PMN 吞噬微生物的功能将降低。即便如此，PMN 仍是乳腺中起关键作用的因素，当然它也可以释放一些物质以增加血管通透性和吸引更多的白细胞到炎性部位。在一些顽固性感染病例中，虽然 PMN 数量会有所波动，但总体上是处在一个高水平上，而且即便是将感染的病原微生物清除后，它仍会维持在高水平上直至乳腺修复。还有报道说：微生物被清除后 PMN 在高水平上仍要维持几天、几周甚至更长一点时间。[b]影响牛奶体细胞的因素[/b]据报道，[b]牛奶体细胞[/b]变化受到很多因素的影响，如年龄、乳期、昼夜、挤奶过程，感染等。近年来报道渐趋于一致即认为，感染是引起变化的最主要因素。[color=inherit]1 ）微生物感染的影响[/color] 有研究表明，[b][color=#d92142]体细胞[/color][color=#d92142]S[/color][color=#d92142]CC的主要影响因素就是微生物感染，这不论是在乳区水平、个体还是桶奶水平上都是如此。[/color][/b]有人对感染后的奶牛同其 BTSCC（桶奶 SCC）联系加以分析后认为，BTSCC 之所以发生变化，感染是主要影响因素。感染乳腺的微生物被划分为二大类，即重要微生物及次要微生物，重要微生物一旦感染将使SCC大幅增加，这类微生物包括金黄色葡萄球菌，无乳链球菌及其他一些链球菌，大肠杆菌等；次要微生物包括牛棒状杆菌以及凝固酶阴性的一些葡萄球菌，它们感染后，通常使得感染乳区化正常乳区的 SCC 高出 2～3 倍。现今，许多研究表明，仅用SCC一项来作为衡量乳区感染与否是不可信的，因为常出现假阳性和假阴性的情况。造成这种误差的部分原因可能是感染期间 SCC 的正常波动所致；这种变化在人为用各种病原微生物感染乳腺的实验中得到证实。即在感染的早期阶段数量急剧上升，可以在几小时或几天内达到峰值，（这与感染微生物种类有关）随后由于中性粒细胞的吞噬而适度下降。而 SCC变化范围依感染微生物及转归结果以及牛个体差别而变化很大。有研究表明被感染乳区 SCC 是呈波动态势，在慢性感染乳区，微生物数量及SCC二者均随时间而上下波动，同时未感染乳区SCC也在变化，但始终处在 200,000/mL 以下。另外主要微生物感染后，SCC的变动幅度也由于牛个体不同而不同，所以仅凭 SCC 一项来判别乳区感染与否及微生物种类并不十分可靠。[color=inherit]2 ）年龄、乳期对SCC的影响[/color] 研究者普遍认为，牛奶体细胞SCC 随胎次增加及乳期向后延伸而增加，但 Harmon研究却不同，他将牛群中分成感染牛与未感染牛，结果显示：在未感染牛群中，牛奶体细胞 变化都很小，无论是年龄还是泌乳期影响都很小， Sheldrak等人也证实无论是胎次数目增加，还是不同乳期阶段，它对未感染牛群的 SCC影响都很小，有研究显示，在同一乳期中，从分娩35天到205天截止，SCC数目从35天的83,000/mL 逐渐升到285天的160,000/mL，但是相同的时间内金黄色葡萄球感染的乳区中，SCC的数量却从234,000/mL升至1,000,000/mL。当然，在娩后所有乳区SCC均有增加，但那些未感染的乳区和感染了次要微生物的乳区是SCC分娩后35天均很快的下降。Harmon研究也表明，[b][color=#d92142]在微生物未感染的牛群中，SCC受胎次、泌乳乳期的影响不大。[/color][/b][color=inherit]3 ）应激对SCC的影响[/color]Wells等报道，各种应激因素都能引起SCC上升。但据 Paape 等人报道，无论将牛只放入可以控制环境条件中的隔离室内，还是给牛注射 ACTH 或者是皮质醇类激素，未感染的牛只其SCC只有很小改变或者说是没有改变。Elvinger调查表明，经受热应激的牛只SCC有大量的上升，他们通过将牛圈在可以控温的房间内或予其他的热刺激，未感染牛与感染金黄色葡萄球的牛的SCC分别是145,000/mL和105,000/mL，分析认为造成这种差异的部分原因可能是由于热应激造成的产奶量下将所致，因热应激造成产奶量下降10%～20%也是很常见的。将牛单独圈起这种应激会不会造成SCC上升，LefcourtA M研究表明这一应激虽可使牛的行为有所变化，但对SCC影响甚微。在法国科学家们进行了一项非常有趣的试验，他们将牛组成二组，一组圈起来，另一组在每天早晨挤奶后走上9.6 km，结果显示：走路的一组中受感染的牛其SCC达185,000/mL，而未感染的牛SCC为47,000/mL，这二者SCC都多于另一组牛的SCC。同时显示运动不仅会使奶牛奶量下降，而且使饲料的摄入量也减少，研究者将已感染和由于剧烈运动损伤乳房而造成感染的牛联系起来分析，认为SCC变动与感染的关系很大，表明[color=#d92142][b]各种各样的应激对受微生物感染牛的SCC影响较未感染牛的大。[/b][/color][color=inherit]4 ）季节的影响[/color]据报道，[color=#d92142][b]夏季 SCC 较冬季高，这与夏季临床型乳房炎多是发是吻合的[/b][/color]。研究表明，夏季乳腺对环境中病原微生物易感与牛群中存在大量的大肠杆菌是相一致的。同时也表明了热应激不仅可增加乳腺的易感性而且使得环境中病原微生物的数量也大大增加，热应激本身不能单独使SCC上升，但SCC上升却是由于夏季乳头长时间处于有大量病原微生物的环境中而造成感染和引起临床症状的结果。[color=inherit]5 ）其他因素[/color]奶中SCC有一个正常的变化（如昼夜变化），正常挤奶时间所收集的奶与两次挤奶间隔期间收集的奶SCC也有所不同，一般规律是，末期乳中SCC最多，而挤奶前奶中SCC最低，对同一乳区来说，它们相差多达4~7倍，而且挤奶后，高水平的SCC可持续 4 个小时左右后才开始下降。Brolund 报道饲料改变也影响SCC，他认为个体间差别对 SCC 影响有较大的作用，但后来研究表明，这与感染相比影响很小。[color=#d92142][b]牛奶体细胞作为牛群乳腺的健康与否的一个指标，其优势是显而易见的 ，以月为基准测定牛群SCC可以很好地监控奶汁的质量和乳腺的健康程度。但值得强调的是，传染性病原微生物感染后牛奶SCC数量变化比较明显，而条件性病原微生物感染后，由于其感染恢复快，它们感染后，尤其是在管理良好的牛场即便是转归为临床型乳房炎，它们SCC也能维持在300,000/mL以下，在这样一种情况下，SCC 就不能直观地反映出乳腺的健康状况。[/b][/color]也由于这些病原感染后，高水平的SCC维持时间短，而且它们感染率也很低，无论什么时候均小于10%乳区，但以全年经济收入来说，由条件性病原微生物造成临床型乳房炎引起损失还是比较大的。SCC主要影响因素是微生物感染，而其他一些因素只要不影响到乳腺的健康，它的影响就不是很大，而SCC的上升，是乳腺防御微生物入侵而采取的相应措施，应激等可使已感染到乳腺SCC上升，而对于未感染的乳区来说除了昼夜变化对 SCC 有影响外，其他因素影响都非常小。

[font=宋体][font=宋体]细胞免疫和体液免疫，作为人体免疫系统的两大核心组成部分，各自承担着不同的功能，但同时又紧密相连，共同维护着人体的健康。细胞免疫主要通过[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]淋巴细胞来识别和清除被感染的细胞或癌细胞，而体液免疫则通过[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞产生抗体来中和病毒或细菌。尽管它们在机制和功能上有所区别，但两者在免疫反应中相互协作，共同应对外来的病原体。了解它们之间的区别和联系，有助于我们更好地理解免疫系统的运作机制，并为疾病的预防和治疗提供新的思路。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]一、体液免疫和细胞免疫的作用[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]体液免疫：用于产生抗体来达到保护目的的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞免疫：用于清除细胞内寄生微生物和排斥同种移植物或肿瘤抗原。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]二、体液免疫和细胞免疫的联系[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]体液免疫和细胞免疫各自有独特的作用，又相互配合，共同发挥免疫作用。对于细胞内寄生物，体液免疫首先起作用，阻止寄生物的传播感染，当寄生物进入细胞后，细胞免疫将抗原从细胞释放出来，再由体液免疫最后清除。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]三、体液免疫和细胞免疫的区别[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、起主要作用的细胞不同[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]体液免疫：起主要作用的细胞是[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞免疫：起主要作用的细胞是[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、作用对象不同[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]体液免疫：侵入内环境中的抗原。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞免疫：被抗原入侵的细胞、自身的异常细胞和异体组织器官。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、作用方式不同[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]体液免疫：浆细胞（效应[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞）产生的抗体与相应病原体的抗原特异性结合，并使之发生进一步的变化（如形成沉淀）而被吞噬细胞吞噬，从而抑制病原体的繁殖或对人体细胞的黏附。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞免疫：效应[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞与靶细胞密切接触，并释放穿孔素使靶细胞裂解。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]多重荧光免疫组化（[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]mIHC[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]）服务[/b][/url]，更多详情可以查看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]