氯霉素残留量

气相色谱-串联质谱检测水产品中氯霉素残留量关键词：氯霉素；气相色谱-串联质谱；残留量；水产品 氯霉素 ( Chloramphenicol，以下简称CAP），是1947年从委内瑞拉链霉菌的培养滤液中分离出的结晶性抗菌素，是第一个采用化学合成法生产的抗生素，具有广谱抗生素的特点，对多种病原菌有较强的抑制作用。在水产养殖业中，常用氯霉素治疗各种传染性疾病， 但同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。研究表明，氯霉素有严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿、早产儿灰色综合症等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性。因此，氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视，欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零允许量”，即不得检出。目前常用GC-ECD、HPLC-UV、ELISA、GC-MS等仪器进行氯霉素残留量的检测，本实验采用串联质谱作为检测器，是最为先进的技术，可提高氯霉素定性与定量的准确性，二级质谱相对于一级质谱，其抗干扰能力更强，可有效消除单级质谱的离子信息少的问题，对样品前处理的要求教低，可准确反映样品中氯霉素的残留量。本次实验采用气相色谱-串联质谱法测定鱼肉中氯霉素，其灵敏度、稳定性、准确度均较高。1材料与方法1.1 材料1.1.1 试验对象：鱼肉组织。1.1.2 主要试剂与材料：乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙腈（Fisher Scientific公司，色谱纯)；BSTFA（衍生化试剂-Supelco)；C18固相萃取柱（安捷伦公司）；氯霉素标准（SIGMA-ALDRICH）1.1.3 主要仪器：气相色谱—质谱联用仪（配电子轰击离子源，安捷伦公司）；均质机（IKA）；离心机（天美）；固相萃取装置（[font

喹诺酮是一类合成抗生素类药物，治疗系统感染疾病，并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来，这些药物在动物组织中的残留已被引起广泛关注。联合国粮农组织、世界卫生组织食品添加剂专家联合委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。 喹诺酮类药物各种残留分析方法，主要包括高效液相法(HPLC)以及与此相关的HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS，另外还有荧光光谱法、毛细管电泳法和酶联免疫法等。样品前处理主要采用SPE、GPC、液液萃取等净化方法；但是目前还没有文献采用QuEchERS方法净化。而且官方所发布标准的检测方法中大多数是LCMS-SPE或者LCMS-LLE。 本方法基于QuEchERS方法原理，采用乙腈提取，然后取出1 mL净化，上机分析。本方法前处理过程简单、方便，并能同时检测马波沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、洛美沙星、双氟沙星、萘啶酸、氟甲喹；节省时间，降低基质效应。回收率达85%以上，保证实验结果的准确性、重现性；本方案方法检出限均为1.0 ug/kg，优于国标方法《GB/T 21312-2007 动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱 质谱法》，可供广大分析工作者使用。1、适用范围 适用于草鱼、猪肉、牛奶、蜂蜜等动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素等药物残留量的测定。本方法检出限0.1ug/kg。2、提取(1) 猪肉、草鱼样品取5.0 g样品与2.0 g氯化钠，搅匀，加5 mL乙腈，涡旋混合1 min，振荡5 min，6000rpm下离心2 min，取 1mL上清液待净化。(2) 牛奶样品取5.0 g样品与2.5 mL乙腈，涡旋混合1 min，加2.0 g氯化钠和2.5 mL乙腈，涡旋混合1 min，6000 rpm下离心2 min，取 1mL上清液待净化。(3) 蜂蜜样品取5.0 g样品，加5 mL水溶解，涡旋1 min，加2.0 g氯化钠和5 mL乙腈，涡旋混合1 min，6000 rpm下离心2 min，取 1mL上清液待净化。 3、净化将1 mL 提取液转移到ProElut QuE 2mL Tube(Cat#：64531)，涡旋混合30 S，10000 rpm下离心1 min，取上清液500 μL于浓缩管中，加水100 μL，涡旋混匀，室温下氮吹至剩余约100 μL溶液，加水定容至500 μL，混匀，过0.22 μm微孔滤膜，进LC-MS/MS分析。 4、分析条件4.1 UPLC 条件：色谱柱：Endeavosil C18，100×2.1 mm，1.8 μm (Cat#：87003)流 速：0.2mL/min进样量：5 μL 柱 温：35 ℃流动相：A： 10 mmol/L乙酸铵 B：乙腈梯度设置 时间/Min. 0 4 4.5 6 6.5 12 A（%） 80 50 10 10 80 80 B（%） 20 50 90 90 20 204.2 质谱条件：电离模式：ESI 扫描方式： 负离子扫描检测方式：多反应监测 电喷雾电压：-4500 V雾化气压力：50 psi 辅助气压力：50 psi气帘气压力：20 psi 离子源温度：500 ℃定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见下表http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211549_556504_1610895_3.jpg5、实验结果 草鱼、猪肉、牛奶、蜂蜜样品中氯霉素类药物的LC-MS/MS检测添加回收结果 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211552_556505_1610895_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211605_556507_1610895_3.jpg氯霉素多反应监测色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211605_556508_1610895_3.jpg甲砜霉素多反应监测色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211605_556509_1610895_3.jpg草鱼空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556510_1610895_3.jpg草鱼加标样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556511_1610895_3.jpg猪肉空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556512_1610895_3.jpg猪肉加标样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556513_1610895_3.jpg牛奶空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211607_556514_1610895_3.jpg牛奶加标样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211607_556515_1610895_3.jpg蜂蜜空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211607_556516_1610895_3.jpg牛奶加标样品总反应监测图

关于《GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》的方法确认 按照《检验检测机构资质认定评审准则》的要求，实验室需要对选定的检测方法进行方法确认，方法确认的目的就是为证实使用的方法能够满足预期用途。笔者参考《GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》的内容进行《GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》的方法确认，并对检测方法确认的相关技术要求与大家进行交流探讨。一、明确标准使用范围 本标准适用于水产品、畜禽产品、畜禽副产品，那就意味着本次方法确认要在此三类产品范围内进行，超出范围的方法确认无任何意义。二、明确方法中对于检测方法的限制 在本方法中，第二法液相色谱-质谱/质谱法贴近于日常检测。因此，如用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]仪器进行日常检测，那则我们做第二法的方法确认资料。三、方法确认记录1、液相和质谱条件 在优化氯霉素类液相条件时，发现一级水对目标物的响应影响非常大，一级水最好现用现配，每天都进行更换。我们实验室发现不同的一级水响应的高低有以下规律：哇哈哈纯净水屈臣氏水密理博一级水。同时在优化质谱条件上，降低干燥气的温度，降低质谱Q1分辨率也能够明显提高目标物的响应。 色谱条件a. 色谱柱：Agilent EclipsePlus C[sub]18[/sub] 2.1mm*50mm，1.8 μm。b. 柱温：40℃c. 流动相及其梯度A：一级水 B：甲醇 [table][tr][td][align=center]时间[/align][/td][td][align=center]A(%)[/align][/td][td][align=center]B(%)[/align][/td][td][align=center]Flow(mL/min)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.00[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1.00[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2.00[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2.50[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2.51[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3.50[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][/tr][/table] d. 进样量：5μL 4.2 MS仪器参数 模式：ESI（-） Gas Temp ：200 ℃ Gas Flow :6 l/min Nebulizer；35psi Sheath Gas Temp：400℃ Sheath Gas Flow :11 l/min Capillary：3500VNozzle Voltage：500V采集离子[table][tr][td][align=center][b]化合物[/b][/align][/td][td][align=center][b]母离子[/b][/align][/td][td][align=center][b]子离子[/b][/align][/td][td][align=center][b]驻留时间[/b][/align][/td][td][align=center][b]提取电压[/b][/align][/td][td][align=center][b]碰撞能量[/b][/align][/td][td][align=center][b]加速电压[/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]氯霉素[/align][/td][td][align=center]321[/align][/td][td][align=center]152[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]130[/align][/td][td][align=center]15[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]氯霉素[/align][/td][td][align=center]321[/align][/td][td][align=center]257[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]130[/align][/td][td][align=center]7[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]甲砜霉素[/align][/td][td][align=center]354[/align][/td][td][align=center]185[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]130[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]甲砜霉素[/align][/td][td][align=center]354[/align][/td][td][align=center]290[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]130[/align][/td][td][align=center]20[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]氟甲砜霉素[/align][/td][td][align=center]356[/align][/td][td][align=center]185[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]120[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]氟甲砜霉素[/align][/td][td][align=center]356[/align][/td][td][align=center]336[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]120[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][/table]2、专属性验证①试剂空白试验：不称取样品，按照流程对试剂进行处理后进样测定。②样品空白试验：称取阴性样品，按照流程对样品进行处理后进样测定。③加标回收试验：称取阴性样品，添加一定浓度的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准液，按照流程对样品进行处理后进样测定。 [img=,225,218]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301133_01_3191420_3.png[/img] [img=,225,218]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301134_02_3191420_3.png[/img] 氯霉素阴性样品色谱图 氯霉素阳性样品色谱图 [img=,225,218]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301143_01_3191420_3.png[/img] [img=,225,218]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301138_01_3191420_3.png[/img] 甲砜霉素阴性样品色谱图 甲砜霉素阳性样品色谱图 [img=,225,218]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301140_01_3191420_3.png[/img] [img=,225,218]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301141_01_3191420_3.png[/img] 氟甲砜霉素阴性样品色谱图 氟甲砜霉素阳性样品色谱图3、方法检出限/定量限确定 根据标准规定检出限计算仪器信噪比是否达到＞3，或根据定量限计算仪器信噪比是否达到＞10。 [img=,625,127]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301145_01_3191420_3.png[/img] 根据谱图显示的信噪比对检出限进行确定 [img=,690,362]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301244_02_3191420_3.jpg[/img] 氯霉素0.1μg/L色谱图,信噪比S/N=424.1，如图所示 [img=,690,362]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301244_01_3191420_3.jpg[/img] 甲砜霉素0.1μg/L色谱图,信噪比S/N=32.2，如图所示 [img=,690,362]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301248_01_3191420_3.jpg[/img] 氟甲砜霉素0.1μg/L色谱图,信噪比S/N=127.6，如图所示4、线性 选取尽量覆盖一个数量级的5个线性点，并使相关系数不低于0.99，但通常情况下不低于0.995 。 如图所示，下结论。 [img=,622,105]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301153_01_3191420_3.png[/img] [img=,673,291]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301153_02_3191420_3.png[/img] 氯霉素在0μg/L~2μg/L浓度范围内线性曲线 [img=,673,291]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301156_01_3191420_3.png[/img] 甲砜霉素在0μg/L~2μg/L浓度范围内线性曲线 [img=,673,291]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301155_01_3191420_3.png[/img] 氟甲砜霉素在0μg/L~2μg/L浓度范围内线性曲线5、精密度/精密度验证 根据27404要求，如图，确定变异系数在范围之内。 [img=,635,295]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301239_01_3191420_3.png[/img] 27404对精密度/重复性的要求 [img=,690,190]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301240_01_3191420_3.png[/img] 方法确认数据6、回收率确认 不同的项目，甚至不同的浓度，对应不同的回收率，在本标准中，参照27404要求，如图，确定回收率范围，下结论判断是否合格。 [img=,627,144]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301241_01_3191420_3.png[/img] 27404对回收率的要求 [img=,690,171]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301241_02_3191420_3.png[/img] [img=,690,149]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708301241_03_3191420_3.png[/img] 方法确认数据7、结论 经证实，本实验室满足《GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》的要求。 以上是个人在国标方法确认的全部过程，欢迎大家一起交流讨论。

随着现代化市场经济的迅猛发展,人们的生活条件得到了改善，对动物源性食品的需求也越来越多，其安全问题也随之越来越重要,其中，氯霉素残留是较为突出的因素之一。那么，氯霉素是什么？其在动物源性食品中的现状又是怎样的呢？动物源性食品 动物源性食品是指来源于动物，可供人类食用的动物产品，包括肉、脂肪、脏器、血液、蛋、奶等。随着国民经济的发展，我国城乡居民的生活水平和健康消费观念的提高，动物源性食品在我国居民食品结构中占有比例越来越大，需求量不断增大，拉动了畜牧业的快速发展。然而，近几年发生的“瘦肉精”“掺假羊肉”“病死猪肉”“三鹿婴幼儿奶粉”等事件使消费者谈“肉”色变，动物源性食品的安全状况已成为当今广受关注的社会话题。氯霉素http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508251507_562769_2984502_3.jpg 氯霉素为白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于水，干燥时稳定。氯霉素的化学结构含有对硝基苯基、丙二醇与二氯乙酰胺三个部分， 因其分子中含有一个不游离的氯，故命名氯霉素，其抗菌活性主要与丙二醇有关。 氯霉素是由委内瑞拉链丝菌产生的一种抑菌性广谱抗生素，它通过与核糖体的50s亚单位结合而抑制细菌蛋白质的合成。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，对立克次体、衣原体也有抑制作用。因其高效廉价，曾在畜牧业中广为应用。然而由于其对造血系统有严重的不良反应，且细菌对氯霉素有发展缓慢的耐药性，所以对其临床应用已经做出严格控制。动物源性食品中氯霉素的现状 国际上对动物源性农产品的兽药残留问题亦广泛关注，世界上许多国家禁止氯霉素使用于生产食品动物,并规定了其在畜产品中的最高残留限量。欧盟、美国等均在其相关法规中规定氯霉素的残留为“零容许量” ,即不得检出。　　我国农业部已将氯霉素从2000年版的《中国兽药典》中删除,作为禁用药品。在2002年底的农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中也明确规定氯霉素禁止使用,在动物性食品中不得检出。现在，氯霉素是动物性农产品的必检指标。动物源性食品中氯霉素的检测 关于动物源性食品中氯霉素的检测，主要使用的标准方法有：GB/T22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》、GB/T20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、GB29688-2013《食品安全国家标准 牛奶中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、GB/T18932.19-2003《蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法》等。食品生产企业和销售单位应把动物源性食品中氯霉素的检测作为原料质控和进货采购验证的一项重要指标进行管理，要求供应商出具相关检测报告，必要时可委托有资质的第三方检测机构进行检测。