灭克落残留

[font='Times New Roman'] [font=宋体]各位前辈，[/font] [font=宋体]萌新求助。[/font] [/font][font='Times New Roman'][font=宋体]萌新做了盐酸克伦特罗测定，[/font] [font=宋体]在跑测试样的时候，[/font] [font=宋体]得到了如下图谱[/font][/font][font=宋体][font=宋体]。流动相是甲酸酸化过的水和乙腈。[/font] [font=宋体]仪器是[/font][font=Times New Roman]AB[/font][font=宋体]的[/font][font=Times New Roman]api4000[/font][font=宋体]。测试样是[/font][font=Times New Roman]240ppb[/font][font=宋体]的甲醇溶解的克伦特罗标准品和克伦特罗[/font][font=Times New Roman]D9[/font][font=宋体]内标物。 进样量[/font][font=Times New Roman]10[/font][font=宋体]微升， 流动相流速[/font][font=Times New Roman]0.4[/font][font=宋体]毫升每分钟。色谱柱是岛津的[/font][font=Times New Roman]2.0mm X 50mm 1.6[/font][font=宋体]微米。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]质谱图里有四个峰，[/font] [font=宋体]萌新判断第一个是克伦特罗盐酸盐，[/font] [font=宋体]第二个是克伦特罗，[/font] [font=宋体]第三个和第四个是克伦特罗残留。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]请问如何优化条件，[/font] [font=宋体]解决双峰和残留问题呢[/font][font=Times New Roman]? 拜谢 [img=Clenbuterol 240ppb testrun,690,380]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201243121935_6191_5492007_3.jpg!w690x380.jpg[/img][img=Clenbuterol 240ppb testrun 01,690,377]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201245484139_446_5492007_3.jpg!w690x377.jpg[/img][img=Clenbuterol 240ppb testrun parametre,690,223]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201251327903_4534_5492007_3.jpg!w690x223.jpg[/img][img=Clenbuterol 240ppb Gradient Curve,534,187]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201254059976_4411_5492007_3.jpg!w534x187.jpg[/img][/font][/font]

[align=center][b][size=24px]医疗器械环氧乙烷灭菌残留快速检测[/size][/b][/align][img=,690,460]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/02/202002162131118294_7217_1871535_3.jpg!w690x460.jpg[/img]新型冠状病毒（2019-nCoV）肺炎疫情牵动着祖国亿万人民的心。面对此次突如其来的疫 情，南京科捷分析仪器有限公司利用在医疗用品灭菌残留快检方面的优势，开展医疗卫生用 品环氧乙烷灭菌残留快速检测相关工作，整理出检测方案，为需要的厂家和单位提供充足的 设备和技术支持，全力抗击疫情。 一．环氧乙烷的危害和限量 环氧乙烷是一种可刺激体表并引起强烈反应的易燃性气体。在很多情况下,环氧乙烷具有 致突变 性、胎儿毒性和致畸特性,对睾丸功能具有不良作用,并能对体内的多个器官系统产生 损害。在动物致 癌研究中,吸入 EO 可产生几种致瘤性变化,包括白血病、脑肿瘤和乳房肿瘤, 而食入或皮下注射 EO 仅 在接触部位形成肿瘤。1994 年,国际癌症研究机构( IARC)依据 EO 的作用机理,重新将其划分为人类致癌物质(一类)。[img=,690,595]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/02/202002162131520854_8773_1871535_3.png!w690x595.jpg[/img]国标 GB/T16886.7-2015 医疗器械生物学评价 第 7 部分和 ISO 10993-7 对于环氧乙烷 （EO）残留限量提出如下要求： [img=,690,277]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/02/202002162132206083_6393_1871535_3.png!w690x277.jpg[/img]二.检测适用范围 南京科捷环氧乙烷残留快速测定仪主要用于快速检测一次性医用口罩、手套、防护服、医疗 用品包装材料等医疗用品。产品操作简单、结果可靠，已经市场销售多年，客户反馈口碑良 好。适合用户：各种医疗器械、药厂、药检、商检及质检等。 三． 检测指标：环氧乙烷(EO) 四． 试剂：环氧乙烷（EO）标准溶液 五、医疗设备中残留环氧乙烷分析[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱仪[/url]分析流程图示： 样品制备――顶空进样器进样――[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url] 分析――色谱工作站――数据输出 六、医疗设备中残氧乙烷残留分析[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱仪[/url]配置：[img=,690,437]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/02/202002162133000122_4620_1871535_3.png!w690x437.jpg[/img]七、医疗器械中环氧乙烷测定条件(极限浸提法) 色谱柱： 30m*0.32mm*0.25μm 色谱仪柱温：60℃ 汽化室：150℃ FID：200℃ 顶空进样器：样品加热 60℃，阀箱 80℃，管路 120℃。 附 1 标准曲线溶液浓度：1 至 10 ug/mL, 附 2 样品处理：取产品上与人体接触的 EO 相对残留含量最高的部件进行试验。截为 5mm 厂碎片，称取 1.0g 放入 20mL 萃取容器中，精密加入 5mL 水，密封，60℃温度下平衡 40mi 八. 仪器外观：[img=,690,250]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/02/202002162133446337_3354_1871535_3.jpg!w690x250.jpg[/img]九．图谱及其线性： [img=,690,371]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/02/202002162134150457_4745_1871535_3.jpg!w690x371.jpg[/img][img=,690,420]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/02/202002162134159748_3281_1871535_3.jpg!w690x420.jpg[/img]十． 参考依据：GBT 16886.7-2015 医疗器械生物学评价 第 7 部分：环氧乙烷灭菌残留量.

[align=center]蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、[/align][align=center]敌敌畏残留的快速检测[/align][align=center]1　范围[/align]本方法规定了蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测方法。本方法适用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速测定。[align=center]酶抑制（率）法（分光光度法）[/align]2　原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率。3　试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。3.1　试剂3.1.1　丙酮（CH[sub]3[/sub]COCH[sub]3[/sub]）。3.1.2　磷酸氢二钾（K[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]）。3.1.3　磷酸二氢钾（KH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]）。3.1.4　5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（C[sub]14[/sub]H[sub]8[/sub]N[sub]2[/sub]O[sub]8[/sub]S[sub]2[/sub]）。3.1.5　碳酸氢钠（NaHCO[sub]3[/sub]）。3.1.6　碘化乙酰硫代胆碱（ C[sub]7[/sub]H[sub]16[/sub]INOS）。3.1.7　pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL水中，混匀。3.1.8　显色剂：分别取160 mg 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6 mg碳酸氢钠，用20 mL缓冲溶液溶解，4 ℃冰箱中保存。3.1.9　底物：取125 mg碘化乙酰硫代胆碱，加15 mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4 ℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。3.1.10　乙酰胆碱酯酶：4 ℃冰箱中保存备用。3.2　参考物质3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥98%。[align=center]表1 有机磷和氨基甲酸酯类参考物质中文名称、英文名称、[/align][align=center]CAS登录号、分子式、相对分子质量[/align] [table][tr][td] [align=center]序号[/align] [/td][td] [align=center]中文名称[/align] [/td][td] [align=center]英文名称[/align] [/td][td] [align=center]CAS登录号[/align] [/td][td] [align=center]分子式[/align] [/td][td] [align=center]相对分子质量[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]克百威[/align] [/td][td] [align=center]Carbofuran[/align] [/td][td] [align=center]1563-66-2[/align] [/td][td] [align=center]C[sub]12[/sub]H[sub]15[/sub]NO[sub]3[/sub][/align] [/td][td] [align=center]221.25[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]灭多威[/align] [/td][td] [align=center]Methomyl[/align] [/td][td] [align=center]59669-26-0[/align] [/td][td] [align=center]C[sub]5[/sub]H[sub]10[/sub]N[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]S[/align] [/td][td] [align=center]162.23[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]丙溴磷[/align] [/td][td] [align=center]profenofos[/align] [/td][td] [align=center] 41198-08-7[/align] [/td][td] [align=center]C[sub]11[/sub]H[sub]15[/sub]BrClO[sub]3[/sub]PS[/align] [/td][td] [align=center]373.63[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]敌敌畏[/align] [/td][td] [align=center]Dichlorvos[/align] [/td][td] [align=center]62-73-7[/align] [/td][td] [align=center] C[sub]4[/sub]H[sub]7[/sub]Cl[sub]2[/sub]O[sub]4[/sub]P [/align] [/td][td] [align=center]220.98[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]敌百虫[/align] [/td][td] [align=center]Dipterex[/align] [/td][td] [align=center]52-68-6 [/align] [/td][td] [align=center]C[sub]4[/sub]H[sub]8[/sub]Cl[sub]3[/sub]O[sub]4[/sub]P[/align] [/td][td] [align=center]257.44[/align] [/td][/tr][/table]3.3　标准溶液的配制3.3.1　克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准储备液（1000 μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。3.3.2　丙溴磷标准储备液（100 μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。3.3.3　克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准中间液A（100 μg/mL）：精密移取上述标准储备液（1000 μg/mL）（3.3.1）各1mL，分别置于10mL容量瓶中，用丙酮（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/mL的标准液A。3.3.4　克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫、丙溴磷标准中间液B（1 μg/mL）：精密移取标准中间液A（100 μg/mL）（3.3.3）及丙溴磷标准储备液（100μg/mL）（3.3.2）各1 mL，分别置于100 mL容量瓶中，用缓冲溶液（3.1.7）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的标准中间液B。4　仪器和设备4.1　恒温水浴锅。4.2　天平：感量为0.1g。4.3　分光光度计或相应商品化测定仪。4.4　环境条件：温度15℃～35 ℃，湿度≤80%。5　分析步骤5.1　试样的提取5.1.1　整株提取法选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g（精确至0.1g）置于表面皿中，加入10 mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2 min以上，取上清液备用。5.1.2　整体测定法选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取3 g（精确至0.1 g）放入离心管中，加入10 mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50 次，静置2min以上，倒出提取液，静置3 min～5 min，待用。5.2　测定步骤5.2.1　对照液的测定先于反应管中加入3 mL缓冲溶液（3.1.7），再加入适量酶液、0.1 mL显色剂，摇匀后于37 ℃水浴锅中放置15 min。加入0.1 mL底物摇匀，立即测定吸光度，3min后再测定一次，记录反应3min的吸光度值的变化∆ A[sub]0[/sub]。5.2.2　样品液的测定先于反应管中加入3 mL提取液，其他操作与对照液操作（5.2.1）相同，记录反应3 min的吸光度值的变化∆ A[sub]t[/sub]。5.3　质控试验每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。5.3.1　空白试验称取空白试样，按照5.1和5.2步骤与样品同法操作。5.3.2　加标质控试验5.3.2.1　韭菜、芹菜加标实验取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3g（精确至0.1 g）置于表面皿中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B（1μg/mL）（3.3.4），加入10mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2min以上，取上清液备用。其余操作按照5.2步骤同法操作。5.3.2.2　油菜、菠菜加标实验取空白试样，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取5 份试样各3 g（精确至0.1g）放入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1μg/mL）（3.3.4），加入10mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50 次，静置2min以上，倒出提取液，静置3 min～5 min，待用。其余操作按照5.2步骤同法操作。6　结果的表述6.1　结果计算抑制率（%）=[（∆ A[sub]0[/sub]-∆ A[sub]t[/sub]）/∆ A[sub]0[/sub]]×100式中：∆ A[sub]0[/sub][sub]───[/sub]对照溶液反应3 min吸光度的变化值；∆ A[sub]t[/sub][sub]───[/sub]样品溶液反应3 min吸光度的变化值；6.2　结果判定结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。当抑制率≥50%时，表示蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留高于检测限，判定为阳性，阳性结果的样品需要重复检验2 次以上。6.3　质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。7　结论当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。8　性能指标8.1　检测限：敌百虫0.1mg/kg，丙溴磷0.5 mg/kg，灭多威0.2 mg/kg，克百威0.02 mg/kg，敌敌畏0.2 mg/kg。8.2　灵敏度：灵敏度应≥95%8.3　特异性：特异性应≥85%。8.4　假阴性率：假阴性率应≤5%。8.5　假阳性率：假阳性率应≤15%。注：1.性能指标计算方法见附录A。 2.吸光度变化∆ A[sub]0[/sub]值应控制在0.2～0.3之间。具体的酶量，应根据产品说明书上标识的使用量，测定∆ A[sub]0[/sub]值。根据测定值，增加或减少酶量，使∆ A[sub]0[/sub]值控制在0.2～0.3之间。[align=center]检测卡法[/align]9　原理样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留经缓冲液提取，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶（白色药片）有抑制作用，抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚（蓝色），从而导致速测卡颜色深浅的变化。通过空白颜色比较，对样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药进行定性判定。10　试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。10.1　试剂10.1.1　丙酮（CH[sub]3[/sub]COCH[sub]3[/sub]）。10.1.2　磷酸氢二钾（K[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]）。10.1.3　磷酸二氢钾（KH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]）。10.1.4　pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL水中，混匀。10.2　参考物质同3.2。10.3　标准溶液的配制同3.3。10.4　固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（检测卡）。11　仪器和设备11.1　恒温水浴锅。11.2　天平：感量为0.1 g。11.3　环境条件：温度15℃～35 ℃，湿度≤80%。12　分析步骤12.1　试样的提取12.1.1　整株提取法选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g（精确至0.1g）置于表面皿中，加入10mL缓冲液（10.1.4），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2min以上。12.1.2　整体测定法选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取3 g（精确至0.1 g）放入小离心管中，加入10 mL缓冲溶液（10.1.4），振摇50 次，静置2min以上。12.2　测定步骤吸取2 滴左右待测液于白色药片反应区域，在37 ℃恒温装置中放置15 min进行预反应，预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，手捏3 min或置于37 ℃恒温装置3min，保证红色药片反应区域与白色药片反应区域完全叠合发生反应。每次测定需有一个缓冲溶液的空白对照。12.3　质控试验每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。12.3.1　空白试验称取空白试样，按照 12.1 和 12.2 步骤与样品同法操作。12.3.2　加标质控试验12.3.2.1　韭菜、芹菜取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3g （精确至0.1g）置于表面皿中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B（1μg/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。12.3.2.2　油菜、菠菜选取空白试样，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取5份试样各3 g（精确至0.1g）放入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1μg/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。13　结果判定白色药片区域不变色或略有浅蓝色为阳性结果；白色药片区域变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。通过对比空白和样品白色药片区域的颜色变化进行结果判定。目视判定示意图见图1。[img=,524,323]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/04/201904161528477750_5223_2166779_3.png!w524x323.jpg[/img]13.1　无效白色药片区域干燥，表明取样量偏少，检测结果无效。13.2　阴性样品白色药片区域颜色比空白对照卡颜色颜色相当或为天蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留低于方法检测限，判定为阴性。13.3　阳性样品白色药片区域不变色或略有浅蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农残高于检测限，判定为阳性。1.1　质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。2　结论当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。3　性能指标3.1　检测限：敌百虫0.1mg/kg，丙溴磷0.5 mg/kg，灭多威0.2 mg/kg，克百威0.02 mg/kg，敌敌畏0.2 mg/kg。3.2　灵敏度：灵敏度应≥95%3.3　特异性：特异性应≥85%。3.4　假阴性率：假阴性率应≤5%。3.5　假阳性率：假阳性率应≤15%。注：性能指标计算方法见附录A。4　其他葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，采取整株蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为 NY/T 761—2008 《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》。

[align=center]固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量及条件优化[/align][align=left]1、前言 克伦特罗（Clenbuterol）既不是兽药，也不属于添加剂，而是一种激素类物质，俗称“瘦肉精”，该物质能促进动物体内脂肪分解代谢，增加蛋白质合成，提高瘦肉率，然而人体食用高残留量的内脏组织或者累计摄入量超过一定值时便可能引发食物中毒事件。1997 年我国明令禁止在畜牧行业生产、销售和使用克伦特罗，但是非法使用克伦特罗的事件仍时有发生。 目前，现行有效的标准中测定克伦特罗的方法有酶联免疫法、胶体金免疫层析法、液相色谱法和质谱法，针对不同的样品基质和实验室条件可以选择合适的测定方法。国家标准GB/T 22944-2008中采用液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中克伦特罗的残留量，但是实验室没有[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]，关于高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的文献也不多，于是尝试建立固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的方法并对测试条件进行优化。2、实验方法2.1 仪器和试剂 Waters e2695液相色谱仪（主要包括2998光电二极管矩阵检测器，柱温箱，自动进样器，自动脱气四元梯度泵等）；微型漩涡混合仪；12位固相萃取真空装置；12位干浴氮吹仪； Millpore超纯水系统。 甲醇中盐酸克伦特罗标准溶液（250μg/mL，坛墨质检）；甲醇、乙酸乙酯和乙酸为色谱纯；乙酸钠、乙酸铵、磷酸二氢钠、氨水和磷酸为分析纯；实验用水为Millpore超纯水系统制得，18MΩ• cm，25 ℃。2.2色谱条件 色谱柱：CNW Athena C18-WP(250mm×4.6mm ,5μm) 流动相：甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40：60 流速：1.0mL/min 进样体积：20μL 柱温：30℃ 检测波长：210nm3 结果与讨论3.1 检测波长的确定 采用Waters 2998二级管阵列检测器的3D扫描功能，在波长190~400nm范围内对高浓度的克伦特罗标准工作溶液进行测定，并在克伦特罗出峰位置提取光谱图，见下图，从图中可以看出，克伦特罗的最大吸收波长在210nm附近，因此选择210nm作为检测波长，此时克伦特罗的响应值最大。[/align][align=center][img=,690,345]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301354_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2 流动相的选择3.2.1甲醇-水为流动相3.2.1.1 流动相pH值对测定结果的影响 首先参考GB/T 5009.192-2003第二法中的色谱条件，以甲醇-水为流动相进行测试，然而结果并不理想，克伦特罗标准溶液在此流动相下并未出峰，几番尝试后决定更换流动相。看到几个采用质谱测定的标准方法均在流动相中加入了酸，于是仍然以甲醇-水为流动相，往水中加入不同体积的磷酸溶液，考察pH值对克伦特罗测定结果的影响（甲醇：水=30:70），测定结果见下图。[/align][align=center][img=,583,845]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301356_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 从上述测定结果中可以发现，未调pH时色谱图中并没有明显的色谱峰，流动相中加入磷酸后克伦特罗在8min左右出峰；随着磷酸加入量的增加，其出峰时间提前并且峰高与峰面积也随着增加；当进一步提高流动相中磷酸含量时，克伦特罗的出峰时间逐渐延长，但是峰面积保持不变。这可能是由于克伦特罗呈弱酸性，在水溶液中以离子形态存在，降低了在C18色谱柱上的保留行为，而磷酸的加入能够抑制克伦特罗的电离，使其以分子的形态存在，增加克伦特罗在C18色谱柱上的保留，并改善峰形。当pH=3.5时，克伦特罗呈部分解离的状态，因此虽然能够出峰，但是峰面积偏小，而当pH=3.0时，克伦特罗则全部以分子形态存在，峰面积保持不变。随着磷酸加入量的增加，克伦特罗的出峰时间延长，峰展宽变大，峰高变小，方法的灵敏度也随着降低。3.2.1.2 流动相比例对测定结果的影响 流动相中有机相比例对高效液相色谱的分离行为有很大影响，调节流动相比例可以改善待测组分的峰形、出峰时间以及与杂质组分的分离度，因此实验中考察了有机相比例对克伦特罗测定结果的影响（pH=2.8），测定结果见下图。从图中可以看出，提高流动相中甲醇含量对克伦特罗的出峰时间有很大的影响，当流动相中甲醇含量为20%时，克伦特罗的出峰时间为17min左右，而当流动相中甲醇含量为45%时，克伦特罗的出峰时间提前到3min左右，而且与溶剂峰重叠，不利于定性和定量分析。[/align][align=center][img=,578,826]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301359_02_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2.1.3 方法重复性测试 根据上述测试结果，初步决定采用甲醇：水（pH=2.8）=30:70的流动相条件进行测试，然而在测试过程中发现，此流动相条件下克伦特罗的保留时间不稳定，随着进样次数的增加，保留时间不断前移，6针进样后克伦特罗保留时间的相对标准偏差（RSD）值为1.3%。产生保留时间漂移的原因可能有两种（1）色谱柱的性能下降，流动相中加了磷酸，色谱柱平衡所需的时间比较长（这是一根服役了很久的色谱柱）；（2）此流动相条件的缓冲能力弱，在线混合以及样品的加入导致流动相的pH值发生变化，从而保留时间不稳定。于是修改流动相条件，pH值保持不变，将流动相中甲醇的比例由30%提高至40%，重新考察方法的重复性，实验结果见下图。实验表明，甲醇：水（pH=2.8）=40:60时方法具有较好的重复性，连续6针进样，克伦特罗保留时间的RSD值为0.1%。[/align][align=center][img=,589,419]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301401_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2.2甲醇-磷酸盐为流动相 通过上述实验，初步确立了以甲醇-水为流动相测定克伦特罗的高效液相色谱条件，并对部分实验参数进行了优化，然而上述实验结果均是针对克伦特罗标准工作溶液进行的测定，样品成分单一，没有杂质干扰，因此不用考虑杂质与克伦特罗之间的分离度。色谱条件为甲醇：水（pH=2.8）=40:60时虽然解决了方法重复性的问题，但是从色谱图中可以看到，此时克伦特罗的出峰时间较早，仅需3.5min左右就能出峰，而且出峰时间早于溶剂峰，在实际样品分析中很容易受到杂质峰的影响，此方法是否适合测定蜂蜜中的克伦特罗残留量还需进一步验证。 在对蜂蜜样品测定验证之前，先尝试寻找是否有更合适的流动相。以甲醇-水为流动相进行测试时，磷酸的加入对克伦特罗的出峰影响较大，于是尝试改用甲醇-磷酸盐为流动相进行下一步测试。从流动相pH值、流动相比例和方法重复性3个方面对方法进行考察，磷酸盐选用0.02mol/L的磷酸二氢钠，通过磷酸调节流动相的pH值，实验结果见下图。实验表明，以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相时，有机相比例对克伦特罗出峰时间也有很大的影响，pH值的影响较小，因此后续的实验中直接采用甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相，未对流动相的pH值进行调节。当甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40:60时，连续6针进样，克伦特罗保留时间的RSD值为0.1%，测试方法具有较好的重复性，同时，克伦特罗的出峰时间远离溶剂峰，可以减小样品中杂质组分对待测物质测定的干扰。[/align][align=center][img=,597,550]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301403_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2.3甲醇-乙酸盐为流动相 在查阅文献的过程中发现，也有老师采用乙酸盐缓冲溶液对克伦特罗进行测定，于是决定试一下效果。同样，从流动相pH值、流动相比例和方法重复性3个方面对方法进行考察，乙酸盐选用0.02mol/L的乙酸铵，通过乙酸调节流动相的pH值，实验结果见下图。实验表明，采用甲醇-乙酸铵（0.02mol/L）为流动相时，有机相比例对克伦特罗出峰时间有很大的影响，pH值的影响较小，方法的重复性较好，但是此时基线噪音较大，峰高变小，影响方法的检出限。[/align][align=center][img=,581,588]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301405_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 通过上述实验，分别以甲醇-水、甲醇-磷酸盐和甲醇-乙酸盐为流动相，建立了高效液相色谱法测定克伦特罗的方法，并对部分实验条件进行了优化，在实验中发现了各自方法的优缺点，哪种方法更适合蜂蜜中克伦特罗的测定，还需用蜂蜜样品进行验证。3.3 样品前处理 蜂蜜中通常不含有克伦特罗，即使有，其残留值也很小，而且蜂蜜为半固态粘稠样品，无法直接进样测定，因此需要对蜂蜜样品进行前处理。前处理过程主要包含提取、富集、净化和浓缩4个步骤，此次实验蜂蜜中克伦特罗的提取方法参考GB/T 22944-2008：称取约2g蜂蜜样品于50mL离心管中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液（0.2mol/L，pH=5.0），漩涡混匀，蜂蜜完全溶解后备用。 样品中克伦特罗残留量富集、净化的方法有很多种，本次实验分别参照标准GB/T5009.192-2003、SN/T1924-2007、SN/T1924-2011以及GB/T22944-2008，采用CNWBONDWCX(500mg，6mL)、CNWBOND SCX(500mg，6mL)、CNW Poly-Sery MCX(60mg，3mL)和CNW Poly-SeryHLB(500mg，6mL)固相萃取柱对蜂蜜中的克伦特罗残留量进行富集、净化，其中SN/T1924-2007标准已作废，但是标准中所涉及的富集净化方法也曾出现在上海安谱实验科技股份有限公司(以下简称上海安谱）的技术应用文章中，因此对此方法也做了尝试。同时，采用Oasis MCX(60mg，3mL)和OasisHLB(200mg，6mL)固相萃取柱对蜂蜜中的克伦特罗残留量进行富集、净化，简单比较了不同品牌固相萃取柱在净化效果、回收率等性能方面的差异。[/align][align=center][img=,578,358]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301407_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 固相萃取柱所用的填料不同，活化和净化方法也有所区别，具体实验方法如下： （1）WCX固相萃取柱 依次用5mL乙醇和5mL水活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL 乙醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-乙醇溶液（体积比2：98）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。 （2）SCX固相萃取柱 依次用5mL甲醇、5mL水和5mL0.03mol/L盐酸溶液活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液（体积比5：95）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。 （3）MCX固相萃取柱 依次用3mL甲醇、3mL水和3mL 0.1mol/L盐酸溶液活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用3mL 0.1mol/L盐酸溶液、3mL水和3mL50%甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用5mL氨水-甲醇-乙酸乙酯溶液（体积比5：45：50）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。 （4）HLB固相萃取柱 依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液（体积比5：95）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL流动相溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。[/align][align=center][img=,578,190]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301408_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.4 蜂蜜样品的测定3.4.1甲醇-水为流动相 以甲醇-水（pH=2.8）为流动相，测定固相萃取柱净化后的蜂蜜及蜂蜜加标样品，考察该色谱条件对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响。 当甲醇：水（pH=2.8）=40：60时，测定结果见下图。从图中可以看出，蜂蜜样品提取后直接进样测定色谱图中，在克伦特罗保留时间处有一个很大的杂质峰，虽然该杂质峰经HLB固相萃取柱净化后消失，但是实际检测时该杂质峰对克伦特罗仍然存在隐患，如果净化不干净，就可能出现假阳性的结果，同时，在该流动相条件下，样品在2~6min内有许多杂质峰，影响克伦特罗与杂质组分之间的分离度。对比HLB与MCX固相萃取柱净化后测定的色谱图，在此色谱条件下，HLB的净化效果要优于MCX固相萃取柱，蜂蜜样品经HLB固相萃取柱净化后杂质峰明显减少，MCX固相萃取柱净化后仍有杂质组分会对克伦特罗的测定产生干扰。[/align][align=center][img=,581,863]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301411_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 改变流动相比例，测定蜂蜜加标样品经MCX固相萃取柱净化后的样品，改善克伦特罗与杂质间的分离度，实验结果见下图。从图中可以看出，当甲醇：水（pH2.8）=30：70时克伦特罗与杂质组分的分离度较差，不能实现基线分离；当甲醇：水（pH2.8）=20：80时，克伦特罗与杂质组分虽然能实现基线分离，而且附近没有杂峰干扰，但是此时克伦特罗的峰高变小，灵敏度变低，不利于低浓度克伦特罗残留量的检查。[/align][align=center][img=,584,295]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301413_02_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.4.2甲醇-乙酸铵为流动相 以甲醇-乙酸铵（0.02mol/L）为流动相，测定MCX固相萃取柱净化后的蜂蜜加标样品，考察该色谱条件对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响，实验结果见下图。从图中可以看出，当流动相为甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）=60：40时，克伦特罗的测定受到杂质组分的影响很大，克伦特罗出峰时基线较高，而且与杂质组分不能基线分离；当流动相为甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）=40：60时，样品中克伦特罗的灵敏度明显降低。[/align][align=center][img=,586,354]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301414_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.4.3甲醇-磷酸二氢钠为流动相 以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相，当甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40：60时，测定固相萃取柱净化后的蜂蜜及蜂蜜加标样品，考察该色谱条件对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响，实验结果见下图。从图中可以看出，当甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40：60时，克伦特罗与样品中的杂质实现基线分离，其保留时间附近的干扰组分较少，灵敏度能够满足残留量检测的要求。同时，在此色谱条件下，蜂蜜加标样品只需经过简单的提取便能直接测定，给高残留值蜂蜜样品的测定提供了便捷的方法(直接提取进样时的加标量远高于采用固相萃取柱净化时的加标量)。结合上述实验，最终本实验选择采用甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相对蜂蜜中克伦特罗残留量进行测定。[/align][align=center][img=,578,594]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301416_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=center][img=,580,634]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301417_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 找到合适的流动相后，在该色谱条件下对固相萃取柱的净化效果进行考察。从上图可以看出，乙酸钠缓冲溶液提取后直接进样的色谱图中虽然也能检出克伦特罗，但是其加标量较大（约为固相萃取柱方法的20倍，该实验主要是为了考察杂质对待测物质的干扰），实际样品中克伦特罗的残留值远小于此次的加标量，因此实际样品测定时需要采用固相萃取柱对克伦特罗残留量进行富集、净化和浓缩。对比不同填料固相萃取柱对蜂蜜加标样品净化后测定的色谱图可以发现，以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相时，CNWBOND SCX固相萃取柱净化后杂质组分的响应值依然很大，SN/T 1924-2007中采用了C18和SCX固相萃取柱串联的方法进行净化，而本实验仅采用了SCX固相萃取柱进行净化，这可能是导致杂质去除不完全的原因之一；采用其他几种固相萃取柱净化后，色谱图中杂质峰的响应值明显降低，其中采用WCX固相萃取柱净化后的色谱图中杂质少，基线比较平整。对比相同填料不同品牌固相萃取柱净化后的色谱图可以发现，两种品牌的固相萃取柱对杂质去除能力难分伯仲。3.5 标准曲线的绘制 准确吸取1.0mL盐酸克伦特罗标准溶液于25mL容量瓶中，用水稀释成浓度为10.0μg/mL的标准储备溶液。吸取适量体积克伦特罗标准储备溶液，用水稀释配成相应浓度的标准工作溶液，并按上述选定的色谱条件进行测定。以样品峰面积Y(mV)对质量浓度X（μg/mL）作图，得到线性回归方程Y=146893X+311，相关系数R2=0.9991，结果表明：克伦特罗含量在0.10~1.00μg/mL之间时，该方法呈现良好的线性关系。标准曲线见下图。[/align][align=center][img=,581,408]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301418_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.6 回收率的测定 称取约2g蜂蜜样品，共12份，往每份样品中加入0.50mL浓度为1.0μg/mL的克伦特罗标准工作溶液，样品经乙酸钠缓冲溶液提取后，分别采用上述6种固相萃取柱对样品进行净化，每种固相萃取柱做2平行，并以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相进行测定，考察固相萃取柱的回收率，实验结果见下表。测定结果表明，6种固相萃取柱均具有较好的回收率，回收率大于85%，其中MCX和HLB固相萃取柱的回收率明显高于其他两种填料的固相萃取柱；实验中所使用的相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率结果相近。[/align][align=center][img=,690,126]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301420_02_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]4、小结 （1）本实验建立了固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的方法，分别以甲醇-水、甲醇-乙酸盐和甲醇-磷酸盐为流动相，考察了流动相对测定结果的影响。实验结果表明，以甲醇-水为流动相时，流动相对pH值的缓冲能力较弱，克伦特罗的保留时间发生漂移；以甲醇-乙酸盐为流动相时，基线噪音较大，方法灵敏度低；以甲醇-磷酸盐为流动相，方法重复性好，灵敏度较高。 （2）实验中参考不同的标准方法对蜂蜜样品进行前处理，考察了前处理方法对样品净化和回收率影响，同时比较了固相萃取柱性能和品牌对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响。实验结果表明，固相萃取柱性能对蜂蜜中克伦特罗残留量的测定结果有很大的影响，4种不同填料的固相萃取柱中，MCX和HLB固相萃取柱的回收率较高，WCX和SCX固相萃取柱的回收率略低。 （3）实验中考察了WCX和SCX固相萃取柱的回收率较低的原因：WCX固相萃取柱在乙醇淋洗的过程中会有部分克伦特罗被淋洗下来，从而回收率降低；采用SCX固相萃取柱净化时，洗脱液的碱性需要足够强，否则洗脱不完全，但是提高洗脱液的碱性后，杂质也会一同被洗脱下来。 （4）通过此次实验可以发现，流动相条件和固相萃取柱的选择对样品测定具有很大的影响，不同的流动相其洗脱能力不一样，截止波长也会有差别，实验中以甲醇-乙酸铵为流动相时基线噪音明显大于其中两种流动相；同样是MCX净化后的样品，以甲醇-磷酸盐为流动相时测定得到的样品色谱图中杂质要少于其他两种流动相。 （5）液相色谱虽然对克伦特罗具有较高的响应，但是与质谱相比，质谱具有更高的响应，因此对于残留量很低的样品，还是需要用质谱进行验证，液相方法可以作为前期的筛查手段，[/align]