末知蛋白质溶液

有奖问答：当调节溶液pH值，使蛋白质分子的正、负离子数目相等，此时溶液的pH值即为该蛋白质的？

请教：双缩脲反应测定蛋白质含量时，绘制标准曲线时需要标准蛋白溶液，标准蛋白溶液要用什么蛋白质？我见有用酪蛋白的，可以用胶原蛋白吗？谢谢……

我将需要浓缩的蛋白质溶液在-20℃下冷冻20h后在室温下冷却，结果蛋白质形成絮状析出，而且析出的蛋白质能用砂芯过滤器过滤得到比较干的滤饼。这样等到的蛋白质变性了吗？低温可使蛋白质浓缩凝胶析出，这样的蛋白质与之前没处理的蛋白质溶液相比变性了吗？

工厂生产时,怀疑盐酸溶液中有蛋白质,我应该怎么判定和测定呢?

请问核磁在蛋白质溶液中有什么应用，至少需要多少MHz？

我是做蛋白质SDS-PAGE电泳的。蛋白质样品用碘乙酸溶液处理后如何除去过量的碘乙酸？1、取约1 mg的总蛋白样品放入离心管中，加入1ml 6M 的尿素溶液，得到1 mg/mL的蛋白溶液。2、加入20微升1M的巯基乙醇到上述离心管中，震荡混合5秒钟。3、将上述离心管恒温在37oC条件下反应1小时 (以还原蛋白中的双硫键)。4、加入25µ L 1M新鲜配制在1M NaOH中的碘乙酸，在避光、室温条件下放置30 分钟。（烷基化将巯基保护起来） 接下来我准备做SDS-PAGE还原电泳，我不清楚样品中的过量碘乙酸对电泳有没有影响？应该怎么除掉？求高人指点！[em0808][em0808][em0808][em0808][em0808]

请教各位高手：含有蛋白质的溶液如何进行吸收光谱试验?我的是 Ca2+和清蛋白的水溶液，在吸收光谱测量含量时，偏差较大，估计清蛋白的影响，请问有什么办法消除白蛋白的影响么？谢先！！

请教大家：对保存在PBS溶液中的蛋白质样品，要进质谱。但是不知通过什么样的前处理方式，才能去掉蛋白质溶液中的磷酸盐呢？谢谢！

请问杭州哪里可以测定溶液态蛋白质的三维荧光光谱，用于测定蛋白质与其他分子作用后的构象变化。

能不能用NMR来测定蛋白质水溶液中氢键强度的变化抑或说，在蛋白质的变性过程中，氢键强度能不能够测定？并且能用某种试剂完全屏蔽氢键的作用吗。。

分析化学和生物学科之间的交叉越来越多，大家在用电泳分离蛋白质、多肽的时候都用的什么缓冲溶液？您分离的是那类的蛋白质、多肽？

（一）蛋白质的盐析 取1.5mL蛋白质溶液，加入等体积饱和硫酸铵溶液（浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合均匀后，静置数分钟，球蛋白即析出呈絮状沉淀（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵），用滤纸滤取上清液，滤液中再加入固体硫酸铵粉末至不再溶解，析出的即为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 （二）蛋白质的沉淀 1．用重金属盐沉淀蛋白质 取三支试管，各加1mL蛋白质溶液，分别各加3滴6%醋酸铅溶液、3滴2%硫酸铜溶液和3滴1%硝酸银溶液，观察蛋白质沉淀的析出。 2．用有机酸沉淀蛋白质 取二支试管，各加1mL蛋白质溶液，并加5%醋酸溶液使之呈酸性（该沉淀反应最好在弱酸中进行）。然后分别滴加饱和苦味酸、饱鞣酸溶液，直至沉淀产生为止。 用10%三氯醋酸溶液、3%磺柳酸溶液进行类似实验（用量同前），观察现象。

如何利用红外光谱测定溶液中蛋白质的二级结构？有哪些注意事项？谢谢 ！期待您的回复！

曲拉通X-114溶液分析蛋白质应选用那种分析柱，我用C8柱，但是谱图基线不稳定，可能是强保留性物质，请专家高手为小弟分析原因，看选择那种柱子合适！ 十分感谢！

一、样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：1. 减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。2. 空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋 内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。3. 冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液 用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。4. 吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。5. 超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵 压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1381571714_small.jpg 用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。二、干燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。三、贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

蛋白质纯化及复性 重组蛋白在大肠杆菌（E. coli）高效表达时，往往以不溶的、无活性的蛋白聚集体，即包涵体(inclusion body)的形式存在于细胞内。必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂（如7.0mol/L盐酸胍、8.0mol/L脲）溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。 目前重组蛋白生产中普遍存在的问题是：（1）复性效率低。传统的复性方法稀释法和透析法。稀释复性法对样品几十倍，甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大，给后续的分离纯化带来很大的困难，而且复性过程中需要较大的复性容器。透析法耗时较长，而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀，复性效率低，通常蛋白质的活性回收率只有5~20%，而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白，需要进行进一步的分离纯化。（2）工艺路线烦琐，生产周期长。在传统的重组蛋白质分离纯化工艺中，大多采用经典的软凝胶分离介质，由于这种介质的颗粒较大，分离效率较差，因此常常需要采用多种不同模式的色谱操作联用对目标蛋白质进行纯化，才能得到纯度符合一定标准的目标蛋白质。另外，这种色谱介质的耐压性很差，只能在流速较低的情况下进行操作，分离纯化时间较长。分离纯化步骤多和分离时间长使得蛋白质的质量回收率和活性回收率很低。而且在传统的重组蛋白质生产工艺中，蛋白质的复性和纯化是生产过程中两个独立的单元操作，也在很大程度上制约着生产效率。（3）生产成本高，设备投资大。由于复性和分离纯化分别单独进行，而且分离纯化步骤多，每一步都需要有与之配套的设备，致使设备投资大，生产成本高。随着生产规模的增加，这种弊端会愈来愈严重。 1991年耿信笃教授首先将高效疏水相互作用色谱(HPHIC)用于变性蛋白的复性，很好的解决了上述问题，现已成功用于重组人干扰素-g(rhIFN-g)、重组人干扰素-a(rhIFN-a)、人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人胰岛素原(proinsulin)、重组牛朊病毒(prion)等重组蛋白以及溶菌酶和核搪核酸酶等标准模型蛋白的复性与同时纯化中。目前，排阻色谱法、离子交换色谱法和亲合色谱法也已用于蛋白质的复性和同时纯化中。与传统的稀释法及透析法比较，用色谱法进行蛋白复性的优点是：①在进样后可很快除去变性剂；②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附，可明显地减少、甚至完全消除复性过程中蛋白质聚集体和沉淀的产生，从而提高蛋白质复性的质量和活性回收率；③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；④便于回收变性剂，以降低废水处理成本。简言之，色谱法复性可以提高蛋白质的活性和质量回收率，将蛋白复性和纯化集成在一步操作完成，缩短了操作步骤和生产时间，减少了设备投资，使生产成本大大降低，已经引起了全世界范围内许多生化研究者和重组蛋白药物生产厂家的关注。由于高效液相色谱（HPLC）分离效率高，往往在一步操作中便可得到纯度符合要求的蛋白质，而且分离速度快，在应用方面具有更大的优势。

cn，（n-2）个小试管进行养晶，可能结出单晶。此法之主要缺点在于蛋白质的消耗量大。（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白质溶液包在半透膜（membrane）内，浸入盛有化学药品的器皿中，半透膜能让小分子进出，却不会让蛋白质等大分子通过，则器皿中沉淀剂、盐类和有机溶液等化学药品会穿过半透膜，与蛋白质起作用，直到膜之内外的浓度梯度（concentration gradient）降到零为止。此法的好处在于，器皿中化学药品之浓度可作连续之调整，ph值的范围也可探讨。坏处是膜之内外浓度差异减少时，平衡速率也随之降低。（4）微量透析法（microdialysis）:把半透膜的体积缩小，绑在比钮扣略大的衬架上，架体之凹槽内注入蛋白质溶液，包覆半透膜的体架放入盛有化学药品的器皿，其养晶原理与大量透析法相同，只是使用蛋白质和化学药品的量放得少。注意凹槽内不得留有气泡，否则膜外的化学药品为气泡所阻止而无法透过气泡，渗入膜内的蛋白质溶液。

《从稀释水溶液中萃取和浓缩蛋白质》（Extraction and Concentration of Protein from Dilute Aqueous Solution）应用领域：生物/生物科技目标分析物：牛血清白蛋白BSA样品基质：水萃取柱：BAKERBOND spe™ Wide-Pore Butyl (C4), 500 mg, 6 mL安全防护设备：护目镜和防护面罩，手套，实验服，B型灭火器，通风橱样品制备：配置20mL BSA溶液（1mg/1mL），以0.025M pH=7磷酸缓冲溶液为溶剂小柱活化：加入10mL甲醇活化，5mL 0.5M pH=7磷酸盐缓冲溶液活化，6mL 0.025M pH=7磷酸盐缓冲溶液平衡，保持过程中小柱始终处于润湿状态上样与清洗：关闭真空泵，加入5mL 0.025M pH=7磷酸盐缓冲溶液，装上75mL储液器，缓慢抽出20mL的样品，用4mL0.025M pH=7磷酸盐缓冲溶液淋洗，移去储液器洗脱：用2 X 0.5mL 异丙醇：水：三氟乙酸 60:40:0.1，收集洗脱液分析方法：UV您也可以点击下载英文原版应用文献：http://jtbaker.instrument.com.cn/down_172268.htm

一，蛋白质（包括酶）的提取　　大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。1、pH值　　蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。2、盐浓度　　稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。（二）有机溶剂提取法　　一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

蛋白质纯化　蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。　　是当代生物产业当中的核心技术。该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。常用技术有：　　１、沉淀，　　２、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。　　３、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。　　４、层析：　　a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。　　　b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。　　５、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。

大家好,使用毛细管电泳时,样品都要过滤的,可是我提取的蛋白质量很少,怎么过滤啊?我的毛细管已经堵过一次了!有做蛋白质电泳的朋友,帮帮我吧!我的QQ:419817903欢迎一起讨论哦谢谢![em04]

[color=#444444]在用蛋白质进液相和凝胶色谱的时候是怎样让蛋白质溶解的啊？我看到用碱液可以让蛋白质溶解，那一般多少ph的碱液或者说多少浓度的碱液可以让蛋白质溶解呢，谢谢[/color]

纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。浓缩、干燥及保存一、样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：1. 减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。2. 空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。3. 冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。4. 吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。5. 超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。二、干燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。三、贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。1. 样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。2. 一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。3. 贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

双缩脲试剂（biuret reagent）是由双缩脲试剂A(NaOH)和双缩脲试剂B(CuSO4)两种试剂组成.双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液；双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在。具体方法是：先将双缩脲试剂A加入组织样液，振荡均匀（必须营造碱性环境），再加入双缩脲试剂B，摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验蛋白质，与蛋白质接触后的颜色呈紫色

再传些上来[em09510][img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=183555]蛋白质.doc[/url]方法3这个方法（通常称为布拉德福德法）是基于当蛋白质与酸性蓝90燃料结合时在波长470nm-595nm之间有一个吸收峰。酸性蓝90燃料很容易与蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的残基结合导致对于不同蛋白质试验具有特异的反应。因此作为参考物的蛋白质必须测定的蛋白质相同。有相对较少的干扰物，但是最好避免试验样品中的洗涤剂和两性电解质。强碱性样品可能会干扰酸性试剂。使用标准蒸馏水来配置此方法中用到的缓冲液和试剂。试验溶液.将待测蛋白质的参考物质溶解在描述的缓冲溶液中配制成浓度在标准曲线范围内的溶液。参考溶液.用描述的缓冲溶液溶解待测蛋白质的参考物质。用相同的缓冲溶液来稀释这个蛋白质溶液制的不少于5个参考溶液，溶液的蛋白质浓度在一个合适的范围内均匀分布在0.1mg/ml和1mg/ml之间。空白.用使用的缓冲溶液来制备测试溶液和参考溶液。酸性蓝90试剂.溶解0.10g酸性蓝90标准试剂在50ml标准酒精溶液中。加入100ml磷酸标准溶液，用标准蒸馏水稀释至1000ml，混匀。过滤此溶液，室温条件下储存在棕色瓶中。储存期间，燃料发生缓慢的沉淀。使用前过滤试剂。步骤.每个测试溶液和空白的参比溶液取0.100ml，加5ml酸性蓝90试剂。倒转混匀。防止发泡，发泡会导致重复性较差。测定标准溶液和待测溶液595nm处的吸光度（2.5.25），把空白作为补偿液体。不要使用石英（二氧化硅）分光光度计比色皿，因为石英会和这些染料结合。计算.吸光度与蛋白质浓度的关系是非线性的；然而，假如，制备标准曲线的浓度范围足够小，后者将接近线性。以标准溶液的吸光度对蛋白质的浓度作图，再线性回归得到标准曲线。从标准曲线和待测溶液的吸光度来计算得到待测溶液的蛋白质浓度。方法4这个方法（通常被称为喹啉酸法或者BCA法）这个基于蛋白质与铜离子反应生成亚铜离子。喹啉酸试剂用于检测亚铜离子。很少物质会干扰这个反应。当存在干扰物质的影响时可以通过稀释来最小化干扰，但必须使得待测的蛋白质的浓度足够精确测量。或者，在方法2中给出的蛋白质凝结的的程序可能被用于去除干扰物质。因为不同的蛋白质种类可能给出不同的颜色反应强度，参考蛋白质和待测蛋白质必须相同。使用蒸馏水R来制备此法中用到的所有缓冲溶液和试剂。测试溶液.用描述的缓冲溶液溶解适宜数量的待测物质制得浓度在参考溶液浓度范围内的溶液。参考溶液.用描述的缓冲溶液溶解蛋白质的参考物质。用同一缓冲稀释部分该溶液制得不少于5个参考溶液，制的的溶液蛋白质浓度均匀分布在10μg/ml-1200μg/ml之间的合适的范围内。空白.使用缓冲溶液来制备测试溶液和参比溶液。BCA试剂.溶解10g的二钠试剂R，20g碳酸钠一水合物R，1.6g酒石酸钠R，4g氢氧化钠R，和9.5g碳酸氢钠R在蒸馏水（R）中。如果有必要，用氢氧化钠溶液R或者碳酸氢钠溶液R调节pH至11.25，用蒸馏水R稀释至1000ml，混匀。步骤.分别将0.1ml的参比溶液，待测溶液，和空白溶液与铜-BCA试剂混合。在37℃条件下反应30min，注意时间，允许混合物冷却至室温。在反应中点60min内，562nm处用石英比色杯测定参考物质和待测物质的吸光度（2.2.25），用空白溶液作为补偿溶液。待溶液冷却至室温后，颜色强度逐渐加深。计算.吸光度对蛋白质的浓度的关系不是线性的。然而，假如，制备标准曲线的浓度范围足够小，后者将接近线性。以参比溶液的吸光度对蛋白质的浓度作图，再线性回归得到标准曲线。从标准曲线和待测溶液的吸光度来计算得到待测溶液的蛋白质浓度。方法5这个方法（通过常称为缩二脲法）基于铜离子与蛋白质在碱性溶液中的反应而引起的545nm处的吸光度的变化。这个试验在IgG与白蛋白之间差异不大。氢氧化钠和缩二脲试剂的加入作为一个联合试剂，在氢氧化钠加入后不充分的混合，或者在氢氧化钠溶液的加入和缩二脲试剂的加入之间额外的时间将会使得IgG样品比白蛋白样品较高的反应。三氯酸原理用于减小干扰物质，也可以用于测定待测溶液中蛋白质的含量，在浓度小于500μg/ml的情况下。使用蒸馏水R来制备所有此试验中用到的缓冲溶液和试剂。待测溶液.用9g/l的氯化钠溶液R溶解适宜数量的待测物质制的浓度在参比溶液浓度范围内的溶液。参比溶液. 用9g/l的氯化钠溶液R溶解待测蛋白质的参比物质。用9g/l的氯化钠溶液R稀释部分此溶液制的不少于3个参比溶液，这一列溶液的蛋白质浓度均匀分布在0.5mg/ml-10mg/ml之间的适宜范围内。空白.使用9g/l的氯化钠溶液R。缩二脲试剂.用10ml的蒸馏水溶解3.46g的硫酸铜，冷却（溶液A）。用80ml的热蒸馏水溶解34.6g的柠檬酸钠R20.0g的无水碳酸钠R。冷却（溶液B）。混合溶液A和溶液B，用蒸馏水R稀释至200ml假如试剂发生浑浊或者包含任何沉淀，不要使用此试剂。步骤.在一个待测溶液中加入等体积的60g/l的氢氧化钠R，混合。立刻加入相当于0.4倍体积待测溶液的缩二脲试剂，迅速混匀。在15℃-25℃的条件下放置不少于15min。90min内加入缩二脲试剂，在最大吸收波长545nm处测定参比溶液和待测溶液的吸光度（2.2.25），用空白溶液作为补偿液体。在蛋白质浓度计算中，任何产生混浊或者沉淀的溶液都是不被接受的。计算.吸光度对蛋白质浓度的关系接近线性在参比溶液指定的蛋白质浓度范围内。以参比溶液的吸光度对蛋白质浓度作图，利用线性回归做标准曲线。计算标准曲线的相关系数，一个好的系统产生的标准曲线的相关系数不少于0.99.从标准曲线和待测溶液的吸光度来测定待测溶液中的蛋白质浓度。干扰物质.为了家少干扰物质的影响，蛋白质可以按以下步骤进行沉淀：加入0.1倍体积的500g/l三氯酸溶液R到1倍体积待测样品溶液中，取走上清液，用较小体积的0.5M的氢氧化钠溶解沉淀。用制得的溶液来制备待测溶液。方法6荧光法是基于o-邻苯二醛对蛋白质的化学衍生反应。它与蛋白质的伯胺基发生反应（N-末端氨基酸和θ-氨基的赖氨酸残基）此法的灵敏度可以通过在加o-邻苯二醛之前按水解蛋白质来增加。水解可以使组成氨基酸的α-氨基可以和邻苯二醛试剂反应。此法需要非常少量的蛋白质。伯胺，例如三（羟甲基）氨基甲烷和氨基酸缓冲溶液，与邻苯二醛反应的必须避免或者替换。高浓度的氨水与邻苯二醛反应。氨与邻苯二醛反应产生的荧光不稳定。自动化程序的使用来标准化这个程序可以增加测试的准确性和精密度。待测溶液.用9g/l氯化钠溶液R溶解适宜数量待测物质制的浓度在参比溶液浓度范围内的溶液。在加邻苯二醛试剂之前调节8-10.5。参比溶液.溶解蛋白质的参比溶液杂9g/l的氯化钠溶液R中。用9g/l氯化钠溶液R稀释部分此溶液制的不少于5个参比溶液，参比溶液蛋白质浓度均匀分布在10μg/ml和200μg/ml之间的适宜范围内。在加邻苯二醛试剂之前调节8-10.5。空白溶液. 用9g/l氯化钠溶液R。硼酸盐缓冲液.用蒸馏水R溶解61.83g的硼酸R，用氢氧化钾R调节pH10.4，用蒸馏水稀释至1000ml，混匀。邻苯二醛储备溶液.用1.5ml的甲醇溶解1.20g的邻苯二醛试剂R，加入100ml的硼酸缓冲溶液，混匀。加0.6ml300g/l 十二烷基醚聚乙二醇23溶液R，混匀。室温下储存，3星期内使用。邻苯二醛试剂.在5ml的邻苯二醛储存溶液中加入15μl的2-巯基乙醇R。至少在使用前30min内植被。24h内使用。步骤.将0.1ml的邻苯二醛试剂与10μl待测溶液和每个参比溶液混合，室温摁下放置15min。加入0.5M的氢氧化钠3ml混匀。在激发波长340nm和发射波长440和455nm处测得参比溶液和待测溶液的荧光强度（2.2.21）。因为照射荧光强度降低，对一个给定的样品的荧光强度只测定一次。计算.荧光强度与蛋白质浓度的关系是线性的。用参比溶液的荧光强度对蛋白质浓度作图，线性回归得到标准曲线，根据待测溶液的荧光强度得到待测溶液的浓度。

22．1蛋白质测定的原理测定样品中粗蛋白质含量，首先应该按照标准方法的规定，称取一定量样品按照规定的消化方法进行消化，使样品中的有机态氮在浓硫酸加热作用下转化为无机态的铵盐消化溶液。通过将消化溶液置于蒸馏装置中加碱蒸馏后使氨全部逸出，逸出的游离氨被硼酸澄澈直接吸收后以盐酸标准滴定溶液滴定至终点并定量计算。根据滴定手段的不同又不可分成两种方式：带有自动滴定装置的蛋白质测定仪对接收溶液自动滴定；人工对接收溶液进行滴定。22．2蛋白质测定中的测量不确定度对粗蛋白质测定过程进行测量不确定度的评估，首先必须对盐酸标准滴定溶液标定过程进行评估，计算并得出标定过程中的相对标准不确定度。其次，根据滴定方式的不同对样品测定过程中的测量不确定度进行评估，最终将上述两个过程的不确定度分量进行合成。22．3盐酸标准滴定溶液标定过程中测量不确定度的评估a.计算公式和数学模型假如标定0.5mo1/L盐酸标准滴定澄澈，根据计算公式，盐酸标准滴定溶液浓度c(HCl)为：式中：0.0530系1.00mL盐酸标准滴定溶液（浓度1mo1/L）相当型为： b.数学模型中各分量相对标准不确定度的评估1Na2CO3的摩尔质量M（Na2CO3）的不确定度uIUPAC于1997年发布的元素相对原子质量见表22——1。表22——1元素相对原子质量扩展不确定度标准不确定度Na22.989 7700.000 0020.000 001C12.0110.0010.000 5O15.999 40.000 .3[font=Times New Ro

目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。[align=center]原理][/align][align=center]双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲[/align][align=center]反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。[/align][align=center]双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。[/align][align=center]操作][/align][align=center]（一） 绘制标准曲线[/align][align=center]（二） 未知样品蛋白质浓度的测定 [/align][align=center]　1．取12支试管[/align][align=center]6支分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准[/align][align=center]　　　6支分别加入1毫升不同稀释浓度的待测液（两两相同）。[/align][align=center]　2．分别加水补足到2毫升。[/align][align=center] 3．分别加入4毫升双缩脲试剂在室温/37℃下放置30分钟。[/align][align=center][

蛋白质为复杂的含氮有机化合物，是各种氨基酸以肽键连接而成，各类食品的蛋白质含量很不均匀，蛋白质含量是评价食物营养价值的重要指标之一。在食品中蛋白质含量测定方法中最常用最基本的方法是凯氏定氮法，在GB/T5009.5-2003中也将其定为法定检测方法，凯氏定氮法有常量凯氏氮法和微量凯氏定氮法。采用经典的凯氏定氮法比较费时费力，采用模块式消化、全自动凯氏定氮仪测定食品中的蛋白质，该方法比经典法快速，且数据准确可靠。1 材料与方法1．1 仪器与试剂1．1．1主要仪器：KjeltecTM2300型全自动凯氏定氮仪，DS-20消化炉及排废装置(均为瑞典FOSSTECATOR公司生产)，样品磨，电子天平(准确至0.0001克)。1．1．2主要试剂：浓硫酸；硫酸钾；硫酸铜；盐酸标准溶液0.1027mol/L；氢氧化钠溶液400g/L；1％溴甲酚绿和0.7％甲基红混合指示剂；1％硼酸吸收溶液；硫酸铵；蔗糖。所用试剂均为优质品。1．2 测定方法称取适量样品放入消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及约12mL浓硫酸慢慢摇动将样品浸湿。把消化管放入已预热至42℃的加热模块中，将抽气泵打开到最大。5min后，关小抽气泵至酸雾刚好充满排废罩，在试管中形成冷凝环。约60min样品消化至透明蓝绿色液体，取出冷却至室温。将消化管放入2300型自动凯氏定氮仪，关上安全门，待仪器自动蒸馏、滴定、计算并打印结果。2 结果与讨论2．1 精密度取3种蛋白质含量不同的样品，每种样品平行测定6次，从测定结果可见，该仪器的精密度良好（见表1）。表1 仪器精密度测定样品名称 蛋 白 质 含 量(g/100g) 平均值(g/100g) 相对标准差(RSD%)纯牛奶 3.18 3.17 3.20 3.19 3.18 3.18 3.18 0.34大豆 31.25 31.46 31.38 31.53 31.62 31.39 31.44 0.41螺旋藻粉 67.54 67.78 67.58 67.64 67.69 67.82 67.68 0.16

[size=4][center]Bradford法[/center][/size][B]具体操作步骤:（一）实验原理 [/B]双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。　　1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用，生成125I+，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。　　2．方法以标记蛋白质抗原为例。　　（1）反应液组成：蛋白质2～5μg溶于磷酸缓冲液10～25μl中，加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl)；　　（2）在室温保温7min；　　（3）加入H2O2200ng(10μl)；　　（4）过7min再加入H2O2(3μl)；　　（5）保温7min后，加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应；　　（6）10min后加入NaI载体溶液1ml ；　　（7）按常规方法分离纯化。　　3．注意事项　　（1）LPO质量好坏，可直接影响标记率，LPO应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。　　（2）LPO用量应小于总蛋白质用量的1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。　　（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。　　（4）碘化反应在pH4.0～8.5较宽范围内均可进行，最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。　　（5）H2O2应保持低浓度，如高于0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。