纳米复合物

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　蛋白质大多都是通过组装成蛋白复合物来执行特定的生物功能，因而表征内源性蛋白复合物的结构和动力学将有助于生命过程的理解。蛋白复合物在其组装、翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)和非共价结合等方面是高度动态的，在native状态下通常以低丰度存在，这给研究其结构和动态性的传统结构生物学技术(如X-ray和NMR)带来了巨大的挑战。非变性Top-down质谱(nTDMS)结合了非变性质谱和Top-down蛋白组学的优势，目前已发展成蛋白复合物结构表征的有力工具，可以保留蛋白质亚基-配体间的非共价作用和PTMs等重要信息。然而，由于内源性蛋白复合物自身的低丰度特性，导致对其的分离纯化和检测非常困难，所以nTDMS目前仅限用于过表达的重组或高丰度蛋白质的表征。在本研究中，作者开发了一种非变性纳米蛋白质组学(Native nanoproteomics)技术平台，通过使用表面功能化的超顺磁性纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)直接富集组织中的蛋白复合物，然后再利用高分辨质谱表征其结构和动态性。这里选用心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)异源三聚体复合物(~77 kDa)作为研究对象。cTn三聚体复合物是调节横纹肌肌动蛋白收缩的Ca2+离子调节蛋白，由TnC、cTnI和cTnT这3个亚基组成。其中，TnC是Ca2+结合亚基，cTnI是抑制肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的亚基，而cTnT细丝锚定亚基。TnC与Ca2+的结合，以及cTnI 亚基的磷酸化，会共同引起细丝上的分子级联事件，诱导心肌收缩所必需的肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的形成。传统结构生物学技术不能有效捕获cTn复合物高度动态的构象变化，并且先前研究用的cTn复合物是由原核细胞表达的，缺乏PTMs的信息。因此，作者开发了native纳米蛋白组学的方法，以实现对人内源性cTn复合物结构和动力学的全面表征。作者首先使用肽功能化的超顺磁性氧化铁NPs富集了人心脏的内源性cTn复合物，同时优化了非变性蛋白提取缓冲液(高离子强度LiCl溶液，生理pH)。富集到的cTn复合物中的3种亚基的含量比例为1:1:1，真实反应了肌节cTn异源三聚体复合物的组成。作者也发现含有750 mM L-Arg，750 mM咪唑和50 mM L-Glu(pH 7.5)的溶液对蛋白复合物的洗脱效果最好，并且不会破坏亚基间的相互作用。该富集方法具有很好的重现性，proteoforms信息得到很好保留，且可以直接用于化学计量分析。总的实验流程如图1所示，洗脱后的cTn复合物经体积排阻色谱(Sze-exclusion chromatography，SEC)除盐和交换至醋酸铵溶液中，随后对cTn复合物进行多种nTDMS分析：1)在线SEC监测复合物 2)超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)表征复合物的化学计量比和proteoforms 3)捕获离子淌度质谱(TIMS-MS)解析调控复合物构象变化中的非共价作用的结构动态性。　　图1. 用于表征人心脏中内源性cTn复合物的native纳米蛋白组学平台。　　为了全面表征内源性cTn复合物，作者使用FTICR-MS进行proteoforms测序和复合物表征。图2展示了native状态下检测丰度最高的cTn复合物的电荷态(19+)，其中包含了4种独特的proteoforms，这些复合物主要带有单磷酸化的cTnT、单磷酸化和双磷酸化的cTnI，以及结合了3个Ca2+的TnC。这些结果表明人cTn复合物在肌节中以结构多样化的分子组成存在，具有高度异质的共价和非共价修饰，可产生一系列不同的完整复合物。　　图2. FTICR-MS分析展示的cTn复合物状态。红色方框中是最高丰度电荷态(19+)的放大谱图，理论同位素分布(红色圆圈)可以与谱图很好叠加，说明结果具有高质量精度(质量偏差在2 ppm 以内)。　　作者接着对cTn复合物进行complex-up分析，以研究复合物的化学计量比及其组成。图3a~3b分别显示的是完整cTn三聚体复合物，以及经CAD碎裂后的蛋白亚基谱图。但这里没有检测到cTnI单体，可能是因为cTnI和TnC在native状态下的亲和力很强，且cTnI单体带的电荷不多，导致其在高m/z区域出峰，所以不易被检测到.随后，作者又对解离出的亚基进行complex-down分析。图3c展示了检测到的cTnT的多种proteoforms：未磷酸化的 cTnT、单磷酸化的cTnT(p cTnT)和 C 端 Lys 截断的磷酸化cTnT(pcTnT [aa 1-286])，CAD碎裂谱图也发现cTnT的C端较N端更易暴露在外界溶剂中。图3e则是cTn(I-C)二聚体的谱图，共检测到6种具有不同数量Ca2+结合和磷酸化的proteoforms。二级谱图可将cTnI的两个磷酸化位点准确定位在Ser22和Ser23，同时发现cTnI序列两端都较内部区域更易暴露于溶剂中。但还无法通过nTDMS准确推断Ca2+结合和磷酸化是如何影响cTn复合物的稳定性。作者在此也没有优化FTICR-MS在非常高m/z范围的离子检测，所以也会遗漏带少量电荷的cTn复合物信息。　　图3.nTDMS表征人心脏来源的cTn复合物。(a~b)完整cTn复合物和经CAD碎裂后的亚基谱图 (c~d)cTnT单体及其代表性的CAD碎裂谱图 (e~f)cTn(I-C)二聚体及其代表性的CAD碎裂谱图。　　人TnC蛋白含有3个钙结合EF-hand基序(结构域 II~IV)。结构域 II与Ca2+结合的亲和力较低，是触发心肌收缩的调控域。结构域 III 和 IV则与Ca2+具有强的亲和力，在心肌舒张和收缩时均始终保持与Ca2+充分结合，但结构域 II只有在收缩时才被Ca2+占据。这里观察到了TnC分别与0、1、2和3个Ca2+结合的情况，通过CAD碎裂也进一步定位了TnC与Ca2+结合的具体氨基酸序列(图4)。研究发现结构域 II的骨架最容易发生碎裂，而结构域 III的骨架最难碎裂。目前结构域 II~IV的序列在UniprotKb中分别对应65DEDGSGTVDFDE76、105DKNADGYIDLDE116和141DKNNDGRIDY152。这里分别将与1、2和3个Ca2+结合的TnC隔离出来进行CAD碎裂(m/z分别为2312、2316和2321)，可以更准确地将结构域 III、II和IV的序列分别定位到113DLD115、141DKNND145和73DFDE76(图4c)，表明非变性纳米蛋白组学方法在定位非共价金属结合方面具有高分辨能力。　　图4.nTDMS定位 TnC与Ca2+结合的结构域。(a)FTICR-MS隔离与不同数量Ca2+结合的TnC单体 (b~c)与两个Ca2+结合的TnC的CAD碎裂谱图，蓝色、红色和黄色方框分别对应结构域 II 、III和IV。　　Ca2+与TnC的结合会对cTn复合物的功能和构象有着很大影响。cTn复合物的核心区维持着构象的稳定，但当Ca2+与TnC发生结合时，其柔性区会经历广泛的构象变化，复合物结构会从“closed”状态转变成“opened”状态，这会促进肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用，最终导致心肌收缩。然而，传统结构生物学技术很难捕获cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化。因此，作者使用离子淌度质谱来分析cTn复合物的构象变化。TnC亚基和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体的淌度分离谱图如图5所示。与0~3个Ca2+结合的TnC的碰撞截面(Collision Cross-Section，CCS)值分别为1853、1849、1829和1844 Å2(图5a~5b)，TnC构象比IMPACT预测的更为紧凑，但cTn(I-C)二聚体的CCS值与预测的非常接近(图5c~5d)。作者推测TnC与两个Ca2+结合会形成更致密的构象，是因为在静息舒张时Ca2+与结构域 III 和 IV充分结合。当第三个 Ca2+与结构域II结合时，TnC转变为“opened”构象，使其N端与cTnI的C端相结合，进而引发心肌收缩(图5e)。cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化也是如此(图5f)。　　图5.TnC单体(a~b)和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体(c~d)的离子淌度分离谱图 (e~f)TnC和cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化。　　最后，作者通过添加EGTA来剥离cTn复合物中的Ca2+，以进一步研究Ca2+在维持复合物结构稳定性上的作用。图6b~6c是没有EGTA孵育时的cTn复合物的TIMS-MS谱图。cTn复合物的CCS值与理论预测值非常符合。随着EGTA孵育浓度的增加(25、50和100mM)，Ca2+逐渐被螯合，cTn复合物的结构也越来越舒展，体现在平均电荷态逐渐增加，以及逐渐在较低m/z范围内出峰，这表明cTn复合物构象的稳定性丢失与EGTA浓度的增加相关(图6d~6f)。虽然100mM EGTA孵育也不敢保证Ca2+的完全剥离，并且cTnI的存在又会增强TnC与Ca2+的结合，但TIMS-MS为我们研究cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化提供了一种切实可行的分析手段。　　图6.cTn复合物与EGTA孵育时的构象变化。(a)cTn复合物的构象随EGTA孵育浓度的增加发生改变 (b~c)cTn复合物的TIMS-MS谱图 (d~f)cTn复合物与不同浓度EGTA(25、50和100mM)孵育的谱图和CCS分析。　　总的来说，本研究开发了一种可用于内源性蛋白复合物富集和结构表征的非变性纳米蛋白组学方法，以获取其组装、proteoforms异质性和动态非共价结合等方面的生物信息。本文采用的功能化NPs可被灵活设计成选择性结合特定的靶蛋白，在富集和洗脱过程中可以很好保持其近似生理条件下的存在状态。更为重要的是，功能化NPs与nTDMS的整合可以作为一种强有力的结构生物学工具，可以作为传统技术的补充，用于内源性蛋白复合物的表征。　　撰稿：陈昌明 编辑：李惠琳文章引用：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics　　参考文献　　Chapman EA, Roberts DS, Tiambeng TN, et al. Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics. Nat Commun. 2023 14(1):8400. Published 2023 Dec 18. doi:10.1038/s41467-023-43321-z

癌症的治疗一直是医学科学家研究的前沿方向，靶向治疗作为一种定向杀灭癌/肿瘤细胞的治疗方法，俨然成为癌症治疗的研究热点。简单来说，靶向治疗就是在细胞分子水平上，针对已明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特定选择致癌位点相结合，杀死特定的肿瘤细胞，但不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，因此又被称为“生物导弹”。 在这种“生物导弹”研究中，生物可降解聚合物纳米粒子经常作为药物的载体应用于靶向治疗。纳米颗粒的一个优势是，他们利用肿瘤发生过程中，肿瘤区域的血管和淋巴具有增强的渗透和截留(EPR)特性，允许纳米的颗粒通过血管壁。进入肿瘤区后，通过溢出，这些粒子可以实现封装药物释放，并杀灭肿瘤细胞。安德烈斯贝罗大学（Santiago, 智利），Luis A.Velasquez教授在《Biomaterials》杂志上发表文章，结合物理化学特性和生物分析对可生物降解的聚羟基丁酸戊酯（PHBV）-紫杉醇（paclitaxel）复合物纳米颗粒癌症细胞株的吸收、释放和细胞毒性进行了详细研究。分子模拟显示复合物纳米颗粒具有高水亲和力的界面和多孔纳米结构，具有48小时窗口期的毒性保护，228~264nm颗粒尺寸范围让它们具有适当的EPR被动靶向的效果，其-6~8.9 mV的负电性也适合生物环境允许的颗粒细胞的内吞作用，并完成癌症细胞内的药物释放，对IIIc浆液性卵巢癌细胞有很好的治疗效果。Time-dependence of the NP-Taxel size and surface-polymer structuresduring Taxel liberation processes observed using LVEM. 0 (A), 1 (B), 2 (C), 3(D), 4 (E) and 5 (F) days 该研究过程中，低电压透射电子显微镜LVEM 5起到了非常关键的作用。Velasquez教授应用的纳米颗粒为有机聚合物，组成为C，H，O，N等轻质原子的分子，这些分子对电子的散射能力较弱。常规透射电子显微镜的加速电压通常为80~300kV，有机分子在不通过重金属染色的情况下，电子束大部分透过了样品到达荧光屏，无法呈现高对比度的形貌图像。然而，重金属染色后的样品由于和重金属的络合作用造成有机分子的畸变，以至于观察到的形貌不是天然状态，影响研究结果的后续分析和结论的准确判断。Velasquez教授借助低电压显微镜LVEM 5对样品进行观察，由于加速电压小（约5kV），未经染色的样品可以得到高对比度清晰的TEM图像，实现生物有机分子纳米结构的天然状态下的检测。低电压显微镜LVEM 5呈现的图像有效帮助Velasquez教授完成聚羟基丁酸戊酯（PHBV）-紫杉醇（paclitaxel）复合物纳米颗粒针对卵巢癌细胞治疗过程的机理及动力学问题的分析和研究。 相关产品：LVEM5 超小型透射电子显微镜: http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100980/C157727.htmLVEM25小型低电压透射电子显微镜:http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100980/C234215.htm

蛋白质复合物是高度动态的实体，在组装、翻译后修饰和非共价相互作用方面表现出巨大的多样性，使它们能够在各种生物过程中发挥关键作用。天然状态下蛋白质复合物的异质性、动态性和低丰度给使用传统结构生物学技术进行研究带来了挑战。基于此，美国威斯康星大学麦迪逊分校葛瑛教授团队近期开发了一种天然纳米蛋白质组学策略，用于直接从人体心脏组织中富集内源性心肌钙蛋白 (cTn) 复合物并随后进行天然自上而下质谱分析。在非变性条件下，使用肽功能化的超顺磁性纳米粒子对 cTn 复合物进行富集和纯化，以实现 cTn 复合物的同位素解析，揭示其复杂的结构和组装。此外，nTDMS 阐明了 cTn 复合物的化学计量和组成，定位 Ca2+ 结合域，定义 cTn-Ca2+ 结合动力学，并提供蛋白质形态的高分辨率图谱。这种天然纳米蛋白质组学策略为内源天然蛋白质复合物的结构表征开辟了范例。（论文链接：）这一研究为深入了解心脏组织中内源性蛋白质复合物的神秘世界提供了一种前所未有的工具和方法。这不仅有助于揭示心脏疾病的分子机制，还为未来开发相关治疗方法提供了重要的基础。这项创新的纳米蛋白质组学技术将为生物医学研究开辟新的可能性，为科学家们提供了更深层次的洞察力，以探索蛋白质相互作用的微妙之处。

近日，北京大学未来技术学院分子医学研究所研员陈雷课题组发现了钠漏通道NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80复合物的冷冻电镜结构及UNC79-UNC80调节NALCN-FAM155A的机制。这一研究于5月12日发表在《自然-通讯》上。　　神经细胞的静息膜电位（Resting Membrane Potential, RMP）影响着神经细胞的可兴奋性，对于维持神经细胞正常的生理功能至关重要。钠漏通道NALCN（Sodium Leak Channel, Nonselective）介导了神经细胞的钠漏电流，能使静息膜电位更加去极化，从而提高神经细胞的可兴奋性。　　NALCN在哺乳动物中高度保守，与电压门控钙离子通道（CaV）和电压门控钠离子通道（NaV）同源性较高。且参与了诸多与神经系统相关的重要的生物学过程，包括呼吸节律的调节、痛觉感知、生物钟的调节和快速动眼睡眠等。　　“在人群中，NALCN的单点突变会引起多种严重的神经发育遗传疾病，包括精神运动发育迟缓和具有特征面相的小儿肌张力低下症及四肢和面部先天性挛缩、肌张力低下和发育迟缓症等。尽管NALCN通道有着如此重要的功能，但其工作机制仍不清楚。”陈雷告诉《中国科学报》。　　在2020年，陈雷研究组曾解析NALCN-FAM155A亚复合体的高分辨率结构，阐明了NALCN的钠离子选择性、胞外钙离子阻塞和电压调节特性的结构基础，发现了在NALCN通道中独有的位于II-III linker上的CIH螺旋可以结合在其胞内结构域上。但是UNC79和UNC80的结构以及它们是如何激活NALCN的并不清楚。　　先前的研究表明，UNC79和UNC80容易与NALCN-FAM155A亚复合体发生解离。在本项研究中，作者们在NALCN的C末端融合了GFP，UNC80的N末端融合了与GFP高亲和力结合的纳米抗体以稳定UNC79/80与NALCN间的相互作用。　　经过同源蛋白筛选等步骤，研究人员确定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A, UNC79和UNC80亚基组成的复合体为研究对象，并在克服了样品制备、数据处理等困难后，通过单颗粒冷冻电镜技术获得了整体分辨率为3.2埃的四元复合物的电子密度，并搭建了原子模型。　　结构显示，UNC79和UNC80均由富含螺旋的结构组成，这些螺旋进一步的组装成HEAT重复或ARM重复等超螺旋结构。UNC79的N端与UNC80的C端、UNC79与UNC80的中间铰链区以及UNC79的C端与UNC80的N端均存在着紧密的相互作用，形成钳子状的复合体，整体形状类似于无穷号“∞”。 进一步的研究发现，NALCN主要通过胞内loop区与UNC79-UNC80发生相互作用的：NALCN胞质侧的I-II linker中的一段β-发卡结构（UNIM-A）与UNC79发生相互作用，II-III linker中的一段loop-螺旋结构（UNIM-B）以及一段L型螺旋结构（UNIM-C）与UNC80发生相互作用。作者们将NALCN与UNC79/80发生相互作用的基序命名为UNC Interacting Motif (UNIM)。　　陈雷介绍，该项研究还发现，UNC79, UNC80和FAM155A三个附属亚基对于NALCN能够正确的转运到细胞膜上是必不可少的。“这有可能是因为这些互作使UNC79/80遮挡了NALCN胞质侧loop上的内质网滞留信号，从而促进NALCN上膜。另外，这些互作也释放了CIH对NALCN的自抑制，使其激活。这为深入理解NALCN复合体的工作机制奠定了基础。”他说。

p /pp style="text-align:center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/859a4489-caf9-42a5-8abc-7feca5114b48.jpg" title="20180720.jpg"//pp style="text-align: center " 图 ORC通过弯曲DNA来进一步加载DNA复制解旋酶MCM2-7的过程模式图/pp 在国家自然科学基金项目(项目批准号：31761163004、31725007、31630087)等资助下，北京大学生命科学学院高宁教授课题组与香港科技大学戴碧瓘教授课题组合作，解析了酿酒酵母ORC结合DNA复制起始位点3-Å 分辨率的冷冻电镜结构。研究成果以 “Structure of the Origin Recognition Complex Bound to DNA Replication Origin”(结合有复制起点DNA的起点识别复合物结构)为题，于2018年7月4日以长文(Article)形式在Nature(《自然》)上发表。北京大学高宁教授和香港科技大学戴碧瓘教授、翟元樑博士为共同通讯作者。高宁课题组博士后李宁宁、博士生程稼萱以及戴碧瓘组博士后林伟熙、翟元樑为共同第一作者。/pp DNA复制起始在真核生物细胞中受到严格而精密的调控。DNA复制启动因子(ORC，Origin Recognition Complex)首先结合到DNA复制起点，以加载DNA复制解旋酶MCM2-7复合物到DNA上，随后MCM2-7被激活，DNA双链被解螺旋，从而启动DNA复制。所有真核生物都是利用由6个亚基组成的ORC来标记DNA复制起始的位点，在维持基因组稳定性过程中的重要作用，其功能缺失突变与肿瘤的发生发展也密切相关。/pp 虽然在不同的真核生物中，ORC的蛋白质序列高度保守，但是ORC对DNA复制起点序列的选择性在不同物种间差别很大。酿酒酵母的ORC可以识别特异的DNA复制起点，而人源细胞ORC结合的DNA序列却没有序列特异性，主要依赖染色体结构识别复制起点。而由于一直缺少ORC结合DNA状态的高分辨结构，ORC序列识别差异背后的分子机制长期以来难以解释。/pp 高宁研究员课题组解析的3-Å 分辨率ORC-ARS305 DNA复合物结构发现，ARS305包含一段ARS高度保守序列(ARS Consensus Sequence, ACS)和一段B1元件序列，长度为72 bp。在这个结构中，ORC的六个亚基通过与磷酸骨架的非特异性以及与碱基的特异性相互作用环绕DNA，并在ACS和B1位点使DNA发生弯曲。该结构的一个关键特征是Orc1的保守碱性氨基酸区域(Orc1-BP，basic patch)深深地插入ACS的小沟中进行序列特异的碱基识别。另外，酵母特有的具有物种特异性的位于Orc4 Wing Helix结构域(WHD)中的Helix Insertion(Orc4-IH)嵌入ACS的大沟中，与相应的碱基形成疏水相互作用。更重要的是，在ACS区域形成的这些碱基特异的相互作用的碱基都非常保守。此外，在B1区域中，也有类似的来自Orc2和Orc5的碱性氨基酸区域插入到大沟和小沟中，与碱基相互作用，并使DNA弯曲。因此，酿酒酵母ORC高度序列特异性主要是通过ORC亚基的大沟、小沟插入基序与ACS保守碱基之间的特异性相互作用实现的。序列比对分析显示，所有真核生物Orc1的N端都具有类似酿酒酵母的Orc1-BP 然而Orc4-IH却只在酿酒酵母中存在。这些发现，很大程度上解释了不同物种ORC识别起始DNA特异性差异背后的原因。/pp 此高分辨率结构不仅为理解酵母ORC如何识别和结合序列特异性的DNA复制起点提供了分子基础，同时也从分子机制角度阐明了ORC如何通过弯曲DNA来进一步加载DNA复制解旋酶MCM2-7的过程。/p

大家好，本周为大家分享一篇李惠琳课题组最近发表在Mass Spectrometry Reviews上的综述，Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes1。结构生物学的快速发展极大地促进了蛋白结构表征工具的开发。其中，基于质谱的分析方法凭借其快速、灵敏、高通量的优势从中脱颖而出。相比于原子水平的高分辨结构表征工具如X-射线晶体学、核磁共振（NMR）、冷冻电镜（Cryo-EM）等，基于质谱的分析方法能够有效地补充蛋白动力学结构变化的信息，并且不受蛋白纯度、分子量大小的限制。而相较于低分辨的蛋白表征工具如圆二色光谱、动态光散射等，基于质谱的分析方法能够提供更高的肽段或残基水平分辨率，获取额外的序列、翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）、局部空间结构等信息。常见的结构质谱包括：氢氘交换质谱（hydrogen‐deuterium exchange MS, HDX-MS）、交联质谱（cross‐linking MS, CX-MS）、表面标记质谱（covalent labeling MS, CL-MS）等。已有相当多的文献对这些方法进行了详细的介绍2,3，在此不再赘述。而此篇综述将重点介绍非变性至上而下质谱（native top‐down MS, nTDMS）在蛋白及其复合物结构表征中的应用。在过去的十年，非变性质谱（native MS, nMS）特别是nTDMS发展迅速。nMS作为一个桥梁将蛋白质组学与结构生物学相连，其保留非共价相互作用的特性使其广泛用于蛋白复合物四级结构表征，如推断亚基组成、化学计量比、亚基排布等。然而，对于一些深层次的结构信息，如氨基酸序列、PTMs、配体结合位点、亚基结合界面等，仅靠单一的nMS是无法获取的。与之对应的，变性条件下的自上而下质谱（TDMS）能够在完整蛋白水平下直接获得序列以及PTMs信息，虽然有助于PTM的准确定位以及蛋白、蛋白异质体（Proteoform）的鉴别，但却丢失了涉及非共价相互作用的高级结构信息。受限于质谱仪器的发展，在早期，nMS与TDMS通常在两个独立的实验中进行，随着质量分析器以及多种活化/碎裂方式的开发，nMS与TDMS的能够有效的结合，充分发挥各自的优势，在实现多层次结构信息获取的同时，也在不断挑战更加复杂的生物体系，如核糖体、膜蛋白、内源蛋白混合物等。实验设计nTDMS已成为表征蛋白质和复合物的初级到高级结构的重要工具。随着蛋白质样品的大小和复杂性的增加，用于nTDMS的仪器不仅需要符合某些特定标准，还需要不断提高其性能以满足这些增加的需求。nTDMS分析中几个关键的步骤包括：样品前处理、ESI离子化、二级碎裂、质量检测以及数据处理。样品前处理为了维持蛋白的自然状态，通常需要在生理环境中进行nMS分析。然而，缓冲液中的非挥发性盐会产生大量盐簇并与蛋白离子形成非特异性加合物，从而抑制离子信号、降低检测的准确度和灵敏度。因此，样品前处理过程中最重要的环节就是除盐。然而适当的离子强度有助于维持蛋白的三维结构，所以通常的步骤是对蛋白进行缓冲液置换，将蛋白置换至醋酸铵或碳酸氢铵等挥发性盐溶液中。目前已开发了多种在线或离线的除盐方法，详细内容的可在综述原文中查看，此处不再赘述。除了使用非挥发性缓冲盐，减小ESI喷针孔径大小也可以提高系统耐盐能力。碎裂/活化方式二级碎裂方式是实现nMS到nTDMS的关键。常见的活化方式按照原理可分为三类：基于碰撞（CID, SID）、基于电子（ECD, ETD, EID等）以及基于光子（UVPD, IRMPD）的活化/碎裂方式。值得注意的是，CID与IRMPD都属于慢加热的活化方式，能量累积的非常慢，以至于在发生碎裂之前已经进行了能量重排，一些较弱的或者不稳定的键会优先发生断裂，最终导致非共价相互作用在活化的过程中被破坏。而SID、ExD与UVPD则属于快加热的活化方式，碎裂发生在能量重排之前，非共价相互作用得以在这一过程保留下来，碎片化程度受到非共价相互作用的限制，因此可被用于表征蛋白的空间结构。此外，将多种活化方式的结合或与离子淌度技术串联也是获取多层次结构信息的关键。质量检测与变性条件下的质谱分析相比，蛋白复合物在天然环境下通过电喷雾电离产生的电荷数相对较少，因此需要具有较大m/z 范围的质量分析仪（高达m/z = 20,000 Da甚至更高）。最初，nMS分析高度依赖基于飞行时间（time of fight, TOF）质量分析器，因为TOF具有理论上无限的m/z范围。近年来，高分辨质量分析器如轨道阱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）为生物大分子的nTDMS分析带来了新的活力。在综述中，我们简要介绍了每种质量分析器的最新进展，并重点强调了FTICR和Orbitrap在nTDMS分析中的发展和应用。数据处理除了基本的硬件设施，配套的数据处理软件也十分重要。nTDMS数据处理流程通常包括以下4个步骤：同位素峰选取、去卷积、数据库搜索、验证和可视化。正文中，我们对每个步骤进行了简要描述，并重点介绍用于数据库搜索和异质体鉴别的软件。多层次结构信息的获取得益于多种活化/碎裂方式的开发，nTDMS分析可同时获得多层次的结构信息（图1）。主要有以下两种策略：第一种策略，完整蛋白复物（MS1）首先被CID或SID碎裂至亚基（MS2），亚基可进一步碎裂肽段（MS3），在MS1及MS2中可获蛋白复合物结合计量比、拓扑结构、蛋白异质性等信息，在MS3阶段则可获取蛋白序列、PTMs定位以及异质性来源等信息。第二种策略则是完整蛋白复合物（MS1）直接被UVPD或ExD碎裂成肽段（MS2），受益于UVPD以及ExD独特的碎裂方式，发生碎裂的区域主要位于蛋白复合物的表面可及区，而未发生碎裂的区域可能位于蛋白复合物的核心区域或参与亚基相互作用界面。不同的碎裂情况反映不同的空间结构，带有配体的肽段碎片可以用于配体结合位点的定位。综述中，我们详细阐述了如何利用nTDMS获得蛋白复合物的多层次结构信息以及如何将碎片信息与结构信息相关联。图1. nTDMS可提供的多维度结构信息复杂生物体系中的应用蛋白质的空间结构决定了其生物功能，而蛋白质-蛋白质/配体相互作用是大多数生物进程的基础。通过突变、翻译后修饰、或者与金属、小分子配体、蛋白质、DNA、RNA等分子发生共价或非共价的相互作用，蛋白质功能在活细胞中不断受到调节。随着MS仪器、方法的不断开发和数据处理软件的逐渐成熟，nTDMS已被广泛应用于各种生物系统，从小蛋白质、蛋白质-配体复合物到大分子组装体，如膜蛋白、蛋白酶体、核糖体、病毒衣壳，甚至是内源性蛋白混合物。它们中的许多都是极具挑战性的体系，即便是采用NMR、X-射线晶体学或Cryo-EM等生物物理方法分析也是非常困难的。因此，来自nTDMS的见解对于理解这些蛋白质和复合物至关重要。在这里，我们总结nTDMS在所有生物体系中的应用实例，旨在全面了解nTDMS在解决生物学问题方面的潜力。小蛋白的结构表征和区分最初，nTDMS主要用于50 kDa以下单体蛋白的结构表征，大部分的研究都是围绕蛋白质气相结构与溶液相结构对比展开的。根据nTDMS的碎裂情况，推断蛋白的气相空间结构，并与NRM获得的溶液结构进行对比。此外，如果在二级碎裂前增加离子预活化有助于蛋白分子的展开，以便研究蛋白气相展开路径以及获取蛋白质内部空间结构信息。得益于碎片离子对蛋白空间结构的高度敏感性，nTDMS还被用于区分不同蛋白亚型、蛋白突变体的结构差异。蛋白-小分子配体相互作用随后，nTDMS应用到了蛋白-配体复合物中，不同的配体类型适合不同的活化/碎裂方式，除了金属离子、RNA/DNA等以静电作用为主的蛋白配体能够在CID活化时存活，大部分复合物的碎裂都需要选择ECD或UVPD等方式。nTDMS可用于蛋白-配体结合计量比、亲和力、结合位点、作用机制、结构动力学/变构效应的研究。它是一种强大的结构表征工具，其在抑制剂筛选、酶催化监控、RNA-蛋白质互作机制的应用实例在正文中已有详细的介绍。蛋白-蛋白相互作用随着仪器设备的快速发展，nTDMS已应用到更大的体系如蛋白-蛋白复合物，通过组合不同的活化/碎片化技术，在一次实验中可以获得多层次的结构信息。nTDMS可以帮助区分不同的蛋白异质体，并在完整复合物、亚基、肽段三个水平上确定异质性的来源。蛋白的异质性与其生物学功能密切相关，通过调整蛋白的异质性可以实现蛋白功能的转变，具体的应用案例已在正文详细介绍。除此之外，nTDMS还可以用作蛋白-蛋白复合物结合界面、气相展开以及深层次结构探索。治疗性抗体和抗原-抗体复合物在过去的几十年中，治疗性抗体已成为最受欢迎的候选药物之一，它们的高特异性和低副作用促进了治疗性抗体的快速增长。在综述中，我们还详细地介绍了nTDMS在治疗性抗体和抗原-抗体复合物体系中的应用。nTDMS可用于抗体可变区的测序、具有不同药物计量比（DARs）的抗体耦联药物的结构表征、以及抗体-抗原复合物中互补决定区及抗原表位区的鉴别。膜蛋白无论是对于传统的结构表征工具如：X-射线晶体学、NMR还是nTDMS，膜蛋白的结构表征一直以来面临着诸多困难。膜蛋白具有低丰度以及低溶解性等特点，最常见的方法是利用与nMS兼容的膜模拟物如：去污剂胶束、纳米微盘等去溶解膜蛋白，在nTDMS分析时再将膜蛋白从胶束中释放出来，释放出的蛋白可在nTDMS中进一步碎裂获取结构信息。具体的实验流程和应用实例可在综述正文中查看。大分子组装体正文中，还介绍nTDMS在极具挑战性的大分子组装体如：核糖体、蛋白酶体、病毒衣壳中的应用实例，这些生物体系普遍存在的问题是分子量非常大（接近MDa），且具有较高的异质性。对这些大分子机器进行nTDMS分析要求仪器具有较高的质量范围以及分辨率。大分子机器的结构表征充分说明nTDMS方法无论在深度还是广度上都有极大的提升。Native top-down MS蛋白质组学值得注意的是，当质谱前端结合非变性分离技术，如native GELFrEE，尺寸排阻色谱，毛细管区带电泳，离子交换色谱等，nTDMS还可以在靶向模式或发现模式下用于复杂蛋白质组的高通量分析，如内源性蛋白混合物。nTDMS分析最大的优势在于它能区分不同的蛋白异质体，并对每种蛋白异质体进行结构表征，这是其他在肽段水平进行分析的结构质谱法如：HDX-MS, CL-MS所无法实现的。总结与展望总之，在这篇综述中我们重点介绍了nTDMS的最新进展和在不同生物体系中的应用，强调通过nMS与TDMS结合可以获得额外的多层次结构信息。新技术的出现以及仪器的进步使nTDMS能够应用于结构生物学中日益复杂的生物样本体系，包括蛋白质配体、多聚蛋白复合物、大分子组装体和内源性复合物。尽管这样，nTDMS分析仍面临着的挑战，包括但不限于前端的样品分离、离子化、去溶剂化、高质荷比分子传输、异质性样本的分析以及软件的开发。未来nTDMS将与其他的一些结构表征方法相结合以获取更加全面的结构信息。正文中对未来发展趋势进行了讨论并提到了其他一些令人兴奋的创新技术如：基于MALDI离子源的质谱成像技术用于蛋白原位分析、电荷检测质谱（CDMS）用于异质性样本分析，多重技术的结合将为蛋白质复合物的nTDMS研究开辟新的道路。我们希望这篇综述能让读者更好地理解nTDMS提供的独特结构信息，并推动该方法的广泛应用。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. 参考文献1.Liu RJ, Xia SJ, Li HL. Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. Mass Spec Rev. 2022 e21793. https://doi.org/10.1002/mas.217932.Britt HM, Cragnolini T, Thalassinos K. Integration of mass spectrometry data for structural biology. Chem Rev. 2022 122(8):7952-7986. 3.Liu XR, Zhang MM, Gross ML. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: fundamentals and applications. Chem Rev. 2020 120(10):4355-4454.

Nature Communications：纳米红外研究无机纳米颗粒-聚合物复合材料界面效应布鲁克纳米表面事业部 魏琳琳 博士英文题目：Nature Communications: Unraveling bilayer interfacial features and their effects in polar polymer nanocomposites摘要以聚合物为基体，无机纳米粒子为填料的聚合物纳米复合材料具有优异的力学、电学和热学性能。纳米颗粒和聚合物之间的界面效应通常被认为是实现这些性能增强的关键因素。然而，如何理解界面效应以及界面微区的结构与性能是聚合物纳米复合材料领域长期面临的基础性难题。近期，来自武汉理工大学、清华大学、伍伦贡大学等学校的科学家们将Bruker的光热诱导纳米红外技术与其他先进技术相结合，直接探索纳米颗粒-聚合物纳米级界面区域。研究发现无机纳米颗粒与聚合物基体的界面存在强极性构型的“双界面层”结构，包括10纳米厚的内层和大于100纳米的外层界面。分子动力学及相场模拟结果表明纳米颗粒表面电势以及颗粒间距的协同作用是形成界面极性构型的关键作用机制。这项研究的结果有助于阐明界面处的相互作用机制，并为制备纳米复合材料以获得最佳性能提供有价值的见解。利用无机纳米粒子/聚合物复合材料的高极性“双界面层”行为，科学家们在具有超低无机填料含量的纳米复合材料中获得了显著增强的介电及压电性能。相关研究成果以Unraveling bilayer interfacial features and their effects in polar polymer nanocomposites为题，发表在Nature Communications上。实验内容实验选择典型的铁电聚合物PVDF作为基体，填充TiO2纳米颗粒。其中PVDF膜层的厚度低于纳米颗粒的直径，使TiO2能够暴露在膜层表面（图1 a）。图1b，c 样品表面和横截面的SEM图像显示颗粒表面存在约10nm的包裹层。HADDF和碳成像图（图1d，f）进一步表明10nm的结合层富含碳元素，为有机碳链键合在纳米颗粒表面。采用布鲁克nanoIR3纳米红外系统进一步研究了界面区域的化学结构（图1 e f）。采用PVDF极性构象的波数（866cm-1）和非极性构象的吸收波数（766cm-1）进行红外成像，分别对应图1f中图和右图。红外成像图显示纳米颗粒周围存在100nm以上强极性构象区域。压电力显微镜（PFM）采集平行于膜平面和垂直于膜平面的L-PFM图像及面外V-PFM图像，结果显示颗粒的L-PFM呈现一半亮一半暗的结构，V-PFM呈现全亮的结构。表明纳米颗粒/聚合物的内层界面区域内偶极子的极化方向垂直于纳米颗粒表面。综合以上的观测结果，作者揭示了无机纳米颗粒与聚合物基体的界面存在强极性构型的“双界面层”结构， 由10nm的极性偶极子内层界面的和100nm强极性构象的外层界面组成。 图1 直接观测无机纳米颗粒与聚合物基体的“双界面层”结构作者采用nanoIR3纳米红外系统进一步研究了纳米颗粒的间距对界面效应的影响（图2）。距离较远的纳米颗粒会形成强极性构象结构界面（图2 b左图）；距离相对较近的纳米颗粒，其界面区域相互重叠，将抑制极性构象的形成（图2 b中图）；纳米颗粒相互连接时，界面区域也倾向于相互合并（图2 b右图）。FTIR检测不同TiO2纳米颗粒含量的宏观材料中极性构象的比例（840 cm&minus 1/766 cm&minus 1及 1279 cm&minus 1/766 cm&minus 1峰强比），TiO2纳米颗粒含量0.35%时极性构象最多，继续增加纳米颗粒含量，由于纳米颗粒间距变小，界面区域相互重叠使极性构象含量降低。分子动力学及相场模拟表明极性构象界面的形成取决于纳米颗粒表面电势以及颗粒间距的协同作用。图2 纳米颗粒/聚合物复合材料界面极性区域采用纳米叠层设计（Al2O3/PVDF/ Al2O3）表征单一界面层的贡献。纳米叠层纳米复合材料的介电常数εr与PVDF的膜厚具有很大的相关性，并随着PVDF膜厚的减小而增加。由于界面极性层的影响，纳米叠层纳米复合材料显示出比Al2O3（εr~9.8）和PVDF（εr~7.8）更高的εr。而Al2O3 (15 nm)/PVDF (10 nm)/Al2O3 (15 nm)/PVDF (10 nm)/Al2O3 (15 nm)，包含两层内层界面层结构，表现出86 J/cm3的超高介电能量密度，远高于文献报道的纳米复合材料的介电能量密度。同时具有76%的能量效率，与大多数介电聚合物或纳米复合材料相当。图3 内层界面层增强复合材料介电性能 总结借助于布鲁克纳米红外系统，直接观测到纳米颗粒-聚合物复合材料的极性界面构象，并研究了颗粒间距对极性构象的影响。结合其他科学工具的结果，本文的工作促进了对聚合物纳米复合材料中界面基础科学问题的理解，可为高性能极性聚合物复合材料的设计与开发提供指导，并推动介电储能、电卡制冷、柔性压电传感等高新前沿技术领域的发展。 本文相关链接：Unraveling bilayer interfacial features and their effects in polar polymer nanocomposites [J] Nature Communications volume 14, Article number: 5707 (2023)https://www.nature.com/articles/s41467-023-41479-0

大家好，本周为大家分享一篇来自Angewandte Chemie - International Edition的文章：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors[1]，文章的通讯作者是牛津大学化学系的Carol V. Robinson教授。　　非变性质谱(Native MS)是结构生物学中一个成熟的工具。在电喷雾电离过程中使用非变性缓冲液可以保存多组分蛋白质复合物之间的非共价相互作用，以及它们的配体、辅因子或其他结合蛋白。它可以用于探究蛋白质复合物的相互作用和功能，因为结合事件导致质量变化，可以在质谱仪中跟踪和剖析。然而，由于膜蛋白的疏水性，使得它们在传统的非变性质谱缓冲液中不溶且容易聚集，因此在非变性质谱中呈现出独特的挑战。目前采用的方法是将蛋白质复合物溶解到膜类似物中，例如：去垢剂、纳米脂质盘、两性聚合物等，再将这些膜类似物通过碰撞激活去除。其中去垢剂是应用的最广泛的一种。然而由于碰撞激活的能量在应用中受到限制，该方法并不能在质量分析前很好地去除去垢剂。此外，在非变性质谱条件下，键的断裂也受到非共价相互作用强度的影响(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-去垢剂剂以及去垢剂胶束内的相互作用)。　　基于光子的方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)已被证明有利于可溶性蛋白质及其复合物的Top-Down质谱分析。与此同时，基于光子的膜蛋白Top-Down模式的应用正在兴起。原理上，激光束路径中的离子被连续地驱动到振动激发态。因此，在基于光子的方法中，能量储蓄通常与前体离子的电荷状态和分子量无关。然而，电荷状态和分子量仍然会影响肽键解离需要的输入能量。先前报道的通过UVPD对79 kDa的五聚体的大电导机械敏感通道(MscL)Top-Down的断裂得到了令人印象深刻的54%的序列覆盖。然而，对于氨通道(AmtB)一个127 kDa的同源三聚体，通过碰撞激活和UVPD两种不同的方式破碎，仅实现了20%的序列覆盖率。事实上，相对较低的序列覆盖率是由于大分子量以及三聚体中增加的非共价相互作用影响的结果。尽管这些工具能够在非变性状态下实现Top-Down质谱分析，但其在膜蛋白表征中的应用仍不广泛。这就要求建立一种能使低电荷密度的高分子量蛋白质稳定地产生蛋白质序列离子的方法，而膜蛋白嵌入异质膜或膜类似物则使这一问题更加复杂。虽然IRMPD之前被用于从去垢剂中释放膜蛋白，但使用IRMPD对非变性的膜蛋白进行测序的研究相对较少。　　图1. (A)改进的Orbitrap Eclipse Tribrid的原理图，其中包括一个红外激光器直接进入四极线性离子阱(QLIT)的高压细胞。离子化的蛋白质胶束被转移到高压QLIT中，在那里整个离子群受到红外光子的照射，然后被转移到Orbitrap进行质量分析。通过调节激光输出功率(W)和照射时间(ms)，可以使膜蛋白从去垢剂胶束中完全解放出来。(B)三聚氨通道(AmtB)在3.0 W输出功率和200ms辐照时间下的非变性质谱。(C)在3.3 W输出功率和200ms辐照时间下AmtB的非变性质谱。　　因此，作者利用改进的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，与连续波远红外(IR) CO2激光器连接，使光束聚焦到双四极杆线性离子阱(QLIT)的高压池中(图1A)。红外激活可以有效地去除蛋白质复合物中的去垢剂胶束，随后通过IRMPD使得膜蛋白碎片化。在这种安排下，由纳米电喷雾电离产生的蛋白质复合物被转移到高压池中。在转移到Orbitrap进行检测或m/z分离和随后的碎片化之前，整个离子群将受到943cm-1红外光子的照射。利用红外的方法去除去垢剂胶束，红外激光有两个可调控参数:激光输出功率(高达60瓦)和照射时间(毫秒到秒)。因此，可以更好地控制从蛋白质胶束中释放膜蛋白，确保非变性复合物的保存，同时完全去除包裹复合物中的去垢剂。通过对激光输出功率和照射时间的优化，作者发现红外激活的参数是高度可调的，不同的激光功率和照射时间的组合也可以产生分辨率相当的谱图。其中例如在3.3 W下照射200 ms时，可以得到多个电荷态的三聚体峰(~6500 m/z)，也可以观察到三聚体与脂质结合的峰，而且对于图谱中的单体也能观察到与脂质结合的峰(图1C)。作者还对不同的去垢剂产生分辨率较高的图谱所需要红外参数进行了评估，从而评价了这几种去垢剂得到高分辨率图谱的难易程度(图2)。　　图2. 红外辐射去除膜蛋白离子中的去垢剂是高度可调的。增加激光输出功率对三种常用的MS兼容去垢剂(C8E4, G1和DDM) AmtB三聚体峰外观的影响。辐照时间固定为200 ms，激光输出功率分别为2.1、2.4、3.0和3.6 W。去垢剂在真空中按易去除的顺序显示，这是由完全释放膜蛋白复合物所需的激光输出功率决定的，从而在m/z光谱中产生良好分辨的电荷状态峰。为了探究IRMPD分离蛋白质和去垢剂胶束的机制，作者对三种不同的去垢剂：四聚乙二醇单辛醚(C8E4)、树突状低聚甘油(G1)和十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的溶液相和气相红外光谱进行了表征，并利用密度泛函理论(DFT)计算得到了C8E4头部基团的红外谐波光谱，用来验证所得到的红外吸收光谱会受到振动耦合的影响，对于质子化的去垢剂离子，氢键和富氧去垢剂内的质子共享可以改变观察到的振动频率。结果表明C8E4胶束的溶液相吸收光谱包含一个与预期激光波数943cm-1重叠的显著带，这就解释了为何较低的激光能量可以将去垢剂胶束和蛋白质复合物分离。而在谐波光谱中在预期的激光波数处的确产生了峰，并推测该峰来自于O-H伸缩、C-C伸缩，C-H弯曲和C-O伸缩振动的耦合。而G1和DDM的最大吸收则偏离了943cm-1的预期波数，作者认为这是不同去垢剂氢键作用的结果。而蛋白质在真空中的红外吸收能力较弱，由此推测在IRMPD的过程中，去垢剂是主要的吸收对象。所以仅需要较低的能量就可以使蛋白质从复合物中剥离而不至于破坏蛋白质的非共价作用。完整的蛋白质离子还支持串联质谱的实验，为了得到蛋白质的序列信息，作者分离了m/z在6674处(电荷态为+19)的AmtB三聚体蛋白，并将其置于高激光输出功率(9 W)下照射5 ms，在m/z 1750~4000之间产生密集的多电荷态离子片段，并得到了26%的序列覆盖，这优于之前基于碰撞激活的方法(20%的序列覆盖率)。此外，在MS2的谱图中并没有观察到单体的峰，这说明共价键的断裂比蛋白质的展开和亚基的分离更快，这种效应也在之前的可溶性蛋白和膜蛋白研究中呈现。为了探究位点裂解的偏好，作者将片段离子丰度通过电荷态进行了归化一，发现了高频的断裂位点来自于经典的选择性断裂位点X|P和D|X，而剩余的断裂往往发生在A|G、F|G和V|G的位点，说明N端到甘氨酸有更高的断裂偏好。为了观察断裂的位置和蛋白质的二级结构之间的关系，作者沿着氨基酸序列构建了每个片段相对于原点位置的相对丰度图，多个电荷态的离子则通过归化一的方法进行求和。(图3)由此观察到了大多数的片段断裂出现在跨膜区域的α-螺旋处，其中8号α-螺旋的T|P和V|G，以及6号α-螺旋的L|G和F|G断裂产生了丰度最高的几个片段。此外，将这些片段的相对丰度映射到三聚体的结构上发现，片段来自于蛋白质的内部而非表面。分子动力学的研究表明了其中的机制，在高温下蛋白质的跨膜区域的α-螺旋保持了稳定的结构，而非跨膜区域的α-螺旋则失去了大部分的螺旋结构。先前的研究表明了α-螺旋外侧的质子化的氨基酸可以稳定α-螺旋的结构。由此，作者推测质子不光可以稳定蛋白质的螺旋结构，而且可以沿着蛋白质的骨架迁移来诱导电荷远程破碎。　　图3. 三聚体AmtB的IRMPD。(A)在m/z 6674处分离19+电荷态离子阱后，IRMPD后观察到的碎片离子MS2谱。多重带电碎片被高亮显示 来自相同地点的重复片段用虚线分组。为了清楚起见，许多指定的离子没有注释 (B)片段丰度相对于裂解原点(残基数)的条形图，其中丰度表示来自每个位点的片段归化一强度之和。条形图的颜色强度表示每个片段的加权平均电荷。将AmtB的拓扑域叠加在条形图上 α-螺旋跨膜区域用黄色方框表示，编号为1到11。跨膜区由质周环和细胞质环连接，用灰色线表示。(C)主干裂解位点覆盖在AmtB (PDB: 1U7G)的结构上。蓝色和红色阴影区域分别代表b型和y型离子。颜色强度对应于所分配片段的丰度。从气相分子动力学模拟中得到的高温(500 K)下的跨膜螺旋快照用虚线圈标出。为了验证这一个推测，作者又对另外两种GPCR蛋白：β -1-肾上腺素能受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)用IRMPD进行了MS2图谱的测定，结果也观察到了片段离子相似的二级结构定位，在跨膜结构区域有着高丰度的片段，但是在二硫键相连的螺旋中并没有观察到丰富的离子片段。并再次利用分子动力学模拟研究了两种GPCR的结构对断裂的影响。在500 K下的最终结构中显示，两种GPCR中都保留了α-螺旋特征，并与观察到的裂解位点密切相关。此外，还对这两种蛋白进行了HCD和IRMPD的比较分析。对于β1AR, IRMPD产生的片段离子平均分子量为8866 Da，高于HCD产生的5843 Da。IRMPD产生的片段离子也保留了更高的平均电荷(4.7 + vs 3.6+ z)。最终，IRMPD的碎片化导致β1AR的序列覆盖率更高，为28%，而HCD为17%。在A2AR中也观察到类似的趋势，IRMPD的覆盖率为19%，而HCD为9%。　　总的来说，作者证明了可以在改进的Orbitrap Eclipse质谱仪的高压QLIT下，通过红外照射可以完全释放一系列去垢剂胶束中的膜蛋白。然后，通过增加激光输出功率，获得直接从膜蛋白及其复合物中释放的序列信息片段离子，证明红外光去除去垢剂是通用的和高度可控的，为保存和鉴定膜蛋白和配体之间脆弱的非共价相互作用构建了一个可靠的方法。而且还对片段离子的产生机制做了阐述，即质子可以通过沿蛋白质骨架迁移来稳定和诱导连续的肽键裂解。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors　　参考文献　　Lutomski, C.A., El-Baba, T.J., Hinkle, J.D., et al. Infrared multiphoton dissociation enables top-down characterization of membrane protein complexes and g protein-coupled receptors[J]. Angewandte Chemie-International Edition，2023.

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上文章，High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是美国基因泰克公司的Wendy Sandoval研究员。　　癌症疫苗是通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统。常见的策略是通过对病人的肿瘤细胞样本进行基因测序来寻找特征性抗原肽，该抗原肽会与I类主要组织相容复合体(MHCI)相结合并呈递至CD8+细胞表面，通过与CD8+细胞表面受体相结合从而诱导免疫反应。为了实现整个过程，研究人员通常会结合基因测序和计算机预测结果设计多个候选抗原肽，每个候选肽都需要通过实验测试来确认它与MHCI分子的结合能力以及相关免疫原性。此外，考虑到编码MHCI的基因具有多态性，候选抗原肽还需要与不同等位基因编码的MHCI分子进行测试。因此，本文开发了一种高通量方法，利用非变形质谱快速筛选候选抗原肽并表征形成的肽-MHCI复合物(pMHCI)。　　pMHCI复合物中抗原肽的体外载入一直以来都是难点，因为MHCI复合物(包括HLA和β2M亚基)本身并不稳定，需要长度为8~10的多肽链载入到MHCI的凹槽以保持完整。本文则通过利用紫外光裂解肽-MHCI复合物(UV-MHCI)的肽交换实现抗原肽的载入，具体步骤如图1A所示，通过紫外光照，UV-MHCI中的高亲和肽被切割转为低亲和肽段，该低亲和力肽段极易发生肽交换，通过监测新的pMHCI复合物的形成实现对候选肽的评估。目前常用的检测pMHCI形成的工具包括ELISA、TR-FRET以及2D-LC-MS。然而这些方法仅能提供有限的信息关于肽交换、pMHCI分子质量，对形成的pMHCI复合物无法进一步的表征。事实上，pMHCI复合物对后续诱导免疫反应至关重要。　　图1. 癌症疫苗的免疫监测的示意图：A) 筛选流程，B检测方法。　　为了确认非变性质谱(nMS)能否用于pMHCI复合物表征以及肽交换率的检测，作者对UV-MHCI以及6个标准肽段进行了考察(图2)。未经UV照射的UV-MHCI MS谱图(图2A)可以观察完整的UV-MHCI复合物以及丢掉紫外光裂解肽的MHCI。MHCI复合物被认为是气相解离产生的，因为没有活性肽的稳定作用，MHCI很难存在于溶液相中，溶液中没有MHCI，“空壳”的MHCI只有可能是质谱中UV-MHCI的气相裂解产生的。图2B证实了这一观点，经紫外光照射后，紫外光裂解肽由高亲和力转为低亲和力，从MHCI上脱落，MHCI解离成HLA和β2M亚基，谱图中能观察到HLA和β2M亚基信号。确认了MHCI是由peptide-bound population产生的信号，作者开始用该方法去定量标准肽的肽交换率。如图2C为UV-MHCI与标准肽孵育并过夜UV照射得到的谱图，仅观察到完整的pMHCI以及“空壳”MHCI的信号，说明实现了100%的完全肽交换。如图2D，肽交换率随孵育时间改变，2小时孵育时间足以实现最大肽交换。　　图2. nMS表征UV光照A)前B)后的UV-MHCI复合物，C)nMS测定UV-MHCI与标准肽的肽交换率，D)标准肽肽交换率随时间的变换情况。　　为了提高分析通量，减少样本消耗，作者在nMS基础上开发了SEC-nMS和CZE-nMS系统。作者用SEC-nMS系统测定了50个候选肽的交换率，说明该系统能够进行中或大规模的数据采集。相比较SEC-nMS而言，CZE-nMS系统具有更高的灵敏度和通量，样品体积消耗从微升减少至纳升，分析时间也缩短为2 min(图3A)。检测信号与进样量呈线性关系，注射体积为3 nL时，最低检测限为6 ng(图3BCD)。作者测定了67个候选肽跨越4种等位基因编码的MHCI分子的肽交换率(图3E)。此外，通过将UV-MHCI复合物同时与四种以上的候选肽进行孵育可在单个实验中同时检测它们的相对肽交换率以及与MHCI结合的亲和力(图3F)。作者还提出Vc50这个概念，即导致50%的pMHCI复合物发生解离的碰撞电压，可作为评估pMHCI复合物稳定性的重要参数。　　图3. 使用CZE-MS系统高通量分析pMHCI复合物　　除了检测pMHCI复合物的形成，测定肽交换率，nMS还可以对形成的复合物进行进一步的结构表征。如图4所示，native top-down的分析策略可获得多层次的结构信息。本文使用的Orbitrap Eclipse “Tribrid” 质谱，图4A为完整pMHCI的MS1谱图，图4B为施加源内电压(SID)促使蛋白解离为亚基，图4C是将14+ pMHC单独分离出，为后续HCD活化做准备。图4D为pMHCI复合物经HCD解离后的MS2谱图。图4E和图4F则分别为对肽段以及HLA亚基进行top-down测序的结果。这些多层次的结构信息能够帮助区分HLA亚型、阐明候选肽的序列，包括一些PTMs、二硫键信息。这些结构细节可能会影响候选肽与MHCI分子间的亲和力甚至是后续T细胞受体的识别。　　图4. Native top-down分析策略获得pMHCI复合物的多层结构信息　　总之，本文将非变性质谱(nMS)与分子排阻(SEC)或毛细管电泳(CZE)分离技术相结合用于高通量筛选pMHCI复合物中的候选肽。该方法能够直观确认pMHCI的完整性，Vc50可作为评估复合物气相稳定性的重要指标，通过native top-down分析策略可获得多层次的结构信息。以上所有确保了后续临床T-细胞实验的正常进行。　　撰稿：刘蕊洁　　编辑：李惠琳　　原文：High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Schachner LF, Phung W, Han G, et al. High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 10.1021/acs.analchem.2c02423. doi:10.1021/acs.analchem.2c02423

2005年11月17日华盛顿 DC消息 ——通用电气医疗集团（GE Healthcare）今天在华盛顿 D.C.的IBC生命科学高内涵分析（IBC Life Sciences’High Content Analysis）会议上推出了Micronucleus Formation Module。这种应用于In Cell 1000和In Cell 3000活细胞图像分析测定系统的新软件，可供在药物开发前期节省时间和资源地筛查药物的基因毒性。通用电气医疗集团 Discovery Systems的产品开发副总裁 John Burczak 说道：“这种软件的推广将对药物及其开发过程有很大帮助。该技术能让一些公司在开发工作的前期识别复合物所具有的损害DNA的活力，而不是在药物研发过程结束时再检测这些复合物，从而即节省时间又省钱。”这种微核分析（micronuclei assay）能识别由基因毒性复合物所引起的DNA损伤，并且是美国食品药品管理局（FDA）新药批准过程种最决定性的分析。用这种由FDA所强制规定的手工方法，每种化合物要花费多达两周才能得到分析结果，因此它仅仅用在药物开发较后期的步骤中。当与In Cell 3000活细胞图像分析测定系统一起使用时，该软件能在10 分钟以内完成对一块96孔板微核检测的成像和分析工作。因而让这种关键的基因毒性检测能在复合物的前期步骤中完成，以消除这些具有基因毒性的潜在复合物。Burczak 说道：“Micronucleus 软件使In Cell活细胞图像分析测定系统成为研究工作者准确和高效进行大规模基因毒性筛查最理想的工具。通用电气医疗集团致力于为基于细胞的高内涵药物的筛选和研究工作提高软件分析能力。”

作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合物等形式行使其特定的生物学功能。近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员张丽华、研究员赵群等研制了一种基于糖苷键的质谱可碎裂型交联剂，显著地提高了交联信息的检索通量和鉴定准确度，同时具有良好的两亲性和生物兼容性，实现了活细胞内蛋白质复合物原位交联和规模化精准解析。相关成果发表在《德国应用化学》上。大连化物所供图　　细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合物结构和功能至关重要。而化学交联技术，尤其是原位化学交联质谱技术具有规模化分析蛋白复合物原位构象和相互作用界面的优势，已成为活细胞内蛋白质复合物解析的重要技术。但是，目前活细胞原位交联面临着细胞扰动大、交联肽段谱图复杂程度高等问题。因此，如何实现活细胞低扰动下的原位快速交联是蛋白质原位构象和相互作用精准解析的先决条件。　　本工作中，团队基于糖分子的高生物兼容性和糖苷键的质谱可碎裂特征，将糖苷键引入到功能交联剂的骨架设计中，筛选并获得了高生物兼容性的海藻糖作为骨架分子，研制了质谱可碎裂型交联剂——海藻糖二琥珀酰亚胺酯。该交联剂较目前已报道的可透膜型化学交联剂，展示了更加优异的细胞活性维持能力，可在低扰动状态下实现细胞内蛋白质复合物的高效交联。　　在此基础上，低能量的糖苷键—高能量的肽键的质谱选择性碎裂模式，可以将“工字形”的交联肽段数据分析降幂为常规交联剂片段修饰的线性肽段数据检索，极大地降低了交联肽段谱图分析的复杂性，显著地提高了交联肽段的鉴定效率与准确度。

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

center/centerp　　strong科研进展/strong/pp　　2018年5月25日，生命中心PI施一公教授研究组就剪接体的组装机理与结构研究于《科学》(Science)杂志以长文形式再次发表重大研究成果。这篇题为《完全组装的酿酒酵母剪接体激活前结构》(Structures of the Fully Assembled Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Before Activation)的论文报道了酿酒酵母剪接体处于被激活前阶段的两个完全组装的关键构象——预催化剪接体前体(precursor pre-catalytic spliceosome，定义为“pre-B复合物”)和预催化剪接体(pre-catalytic spliceosome，定义为“B复合物”)。这两个整体分辨率分别为3.3-4.6埃和3.9埃的高分辨率三维结构首次展示了在剪接体组装过程中 pre-mRNA的5’剪接位点和分支点(BPS)的识别状态与动态变化，回答了剪接体激活前pre-mRNA的5’剪接位点和分支点识别机理，以及激活过程中5’剪接位点和分支点如何逐步进入活性位点、剪接体如何逐步组装并通过结构重组最终完成激活等重要问题。/pp　　RNA剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一。上世纪70年代，科学家们首次发现真核生物基因的不连续性，从而表明遗传信息从DNA转移到RNA上之后，需要经历有效遗传信息的 “剪断”与重新“拼接”，这种有效遗传信息的拼接与“无效”遗传信息的去除，被称为RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，随着物种的进化，含有内含子的基因数量增加，发生RNA剪接的频率也相应增高，使得一个基因编码多个蛋白质成为可能。RNA剪接的本质是两步转酯反应，这种看似简单的化学反应在细胞中难以自行发生，而负责执行这一化学反应的是细胞核内一个巨大且高度动态变化的分子机器——剪接体(spliceosome)。在剪接反应过程中，多种蛋白质-核酸复合物及剪接因子按照高度精确的顺序发生结合和解聚，依次形成预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合物)以及至少8个状态的剪接体pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS复合物。/pp　　由于剪接体高度的动态性和复杂性，获得不同状态的剪接体的高分辨率三维结构被公认为世界难题。在这种巨大的挑战下，施一公教授率领研究组迎难而上，经过7年的努力，终于在2015年首次报道了裂殖酵母剪接体3.6埃的高分辨率结构，首次展示了剪接体催化中心近原子分辨率的结构。这一重大研究成果对RNA剪接机理的研究产生革命性影响。自2015年第一个剪接体结构发表以后，施一公研究组相继解析了酿酒酵母剪接体复合物处于6个不同状态的高分辨率结构，分别是3.8埃的预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.5埃的激活状态复合物Bact complex、3.4埃的第一步催化反应后复合物C complex、4.0埃的第二步催化激活状态下的C* complex、3.6埃的完成两步转酯反应后状态下的P complex，以及3.5埃的内含子套索剪接体ILS complex的结构。这些已解析的剪接体基本覆盖了整个RNA剪接循环，从分子层面揭示了剪接体催化RNA剪接两步反应的工作机理，同时为理解剪接体的激活和解聚等过程的发生提供依据。然而，想要清楚解释剪接体是如何逐步组装并完成激活的机制仍有困难，而最新发表的这篇文章所解析的两个关键状态的剪接体，则弥补了领域内对这一部分研究的缺陷。/pp　　本文报道的处于激活前的两个完全组装的剪接体结构，从复合物的提纯、样品的制备到结构的解析，每一步都十分具有挑战。预催化剪接体前体(pre-B complex)由U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP组成，目前被认为是组成蛋白最多、分子量最大的剪接体，该状态结构复杂，但各组分之间的相互作用并不紧密，使得该复合物在提纯过程中十分容易解聚。在最新发表的这篇《科学》文章中，施一公研究组对提纯方案多次探索，最终优化出一套可以获得稳定的、性质良好的pre-B complex样品。随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP部分分辨率高达3.3埃、3.6-4.6埃以及3.4埃的冷冻电镜结构，并搭建了原子模型(图1)。/pcenterimg alt="图1" src="http://p3.ifengimg.com/fck/2018_21/ba9a2db2fe902a0_w550_h630.jpg" height="630" width="550"//centerp style="text-align: center "　　strong图1 酿酒酵母预催化剪接体前体和预催化剪接体的三维结构/strong/pp　　该文解析的pre-B complex结构是目前世界上已解析的唯一一个同时包含五种核糖核蛋白(snRNP)剪接体结构，它由68个蛋白和6条RNA组成。在该结构中，首次观察到了剪接体组装早期U1 snRNP对5’剪接位点的识别，以及五种核糖核蛋白之间的相互作用界面。与此同时，该文还报道了处于pre-B complex之后的另一个完全组装的剪接体，即预催化剪接体B complex的高分辨率三维结构。结合B complex的结构信息，通过结构对比，可以清楚的看到在组装过程中，pre-mRNA的5’剪接位点由一开始被U1 snRNP识别，而后由于构象变化被转移并与U6 snRNA配对，这一步的变化为剪接体激活提供了结构基础。除此之外，分支点的动态变化、剪接体的各组分所经历的结构重组与构象改变也都清晰的呈现出来。在文章最后，根据pre-B的结构特征，作者还大胆推测了最早期的不完全组装的预剪接体(pre-spliceosome，定义为“A 复合物”)的三维结构模型(如图2)。这两个关键状态剪接体结构的解析，为揭示剪接体组装初期如何识别5’剪接位点和分支点、如何进行结构重组以及如何完成剪接体的激活等问题的机理提供了最直接、有效的结构证据，也将为更高等真核生物可变剪接的研究提供结构基础与理论依据。/pcenterimg alt="图2" src="http://p3.ifengimg.com/fck/2018_21/3ac0a90b5e6dd9b_w550_h672.jpg" height="672" width="550"//centerp style="text-align: center "　　strong图2 酿酒酵母预剪接体三维结构的预测与剪接体组装并激活的模型/strong/pp　　截至目前为止，施一公研究组在酵母中一共解析了9个不同状态的剪接体高分辨的三维结构(如图3)，从组装到被激活，从发生两步转酯反应到剪接体的解聚，这9 个状态的剪接体完整覆盖了剪接通路，首次将剪接体介导RNA剪接的过程串联起来，为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息。/pcenterimg alt="图3 施一公研究组解析的酵母剪接体结构汇总（图片来源: Shi Lab）" src="http://p3.ifengimg.com/fck/2018_21/f2e159672c130e9_w550_h388.jpg" height="388" width="550"//centerp style="text-align: center "　　strong图3 施一公研究组解析的酵母剪接体结构汇总(图片来源： Shi Lab)/strong/pp　　生命中心PI施一公为本文的通讯作者 清华大学生命学院三年级博士研究生白蕊、医学院博士后万蕊雪以及生命学院博士后闫创业为该文的共同第一作者 清华大学冷冻电镜平台的雷建林博士为冷冻电镜数据收集提供了帮助。电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台，计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心(北京)的支持。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心及国家自然科学基金委的经费支持。/pp　　原文链接：/pp　　http://science.sciencemag.org/content/early/2018/05/23/science.aau0325/pp　　相关论文链接：/pp　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466/pp　　http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159/pp　　http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629/pp　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291/pp　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235/pp　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full/pp　　http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6/pp　　http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3/p

p　　近期，中国科学院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所研究员吴正岩课题组与上海交通大学医学院教授邹多宏团队合作，利用磁性氧化铁与硅酸锰纳米复合物制备出一种对肿瘤微环境响应的纳米磁共振造影剂和药物递送系统，相关工作已被生物材料期刊Biomaterials 接收发表(DOI: 10.1016/j.biomaterials. 2018.12.004)。/pp　　纳米诊疗一体化是当前研究肿瘤个性化治疗的主要研究方向之一，但是现有的纳米诊疗体系对病灶组织识别度差，对肿瘤微环境响应不足，使纳米诊疗剂难以精确观察和高效治疗肿瘤组织。对此，研究团队基于肿瘤微环境低pH值和谷胱甘肽高表达的特性，合成了对肿瘤组织pH和谷胱甘肽敏感的硅酸锰多孔纳米球，在其表面沉积磁性氧化铁纳米颗粒，制备出磁性氧化铁与硅酸锰的纳米复合物。该纳米复合物在正常组织和血液中，不会发挥造影功能，而一旦进入肿瘤组织，即可释放出锰离子，发挥高效肿瘤T1磁共振造影功能。同时，该纳米复合物装载的抗癌药物顺铂也释放出来，与锰离子和磁性氧化铁协同杀死癌细胞，达到肿瘤协同治疗效果。/pp　　该研究工作得到国家自然科学基金、中科院青年促进会项目、安徽省重大专项、安徽省自然科学基金等的资助与支持。/pp style="text-align: center "img title="W020181219620098020563.png" alt="W020181219620098020563.png" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/4e531ec7-7d15-4248-b1c2-7d6dec45a79d.jpg"//pp/p

蛋白质作为生命活动的执行者,通过自身结构的动态改变,以及与其他蛋白质相互作用组装为蛋白质复合物,调控各种生物学过程。因此,如何实现蛋白质复合物的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。化学交联结合质谱(CXMS)技术作为蛋白质复合物解析的新兴技术,利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质分子内或分子间的氨基酸残基以共价键连接起来,再利用液相色谱-质谱联用对交联肽段进行鉴定,实现蛋白质复合物的组成、界面和相互作用位点的解析。该技术具有分析通量高、灵敏度高、可提供蛋白质间相互作用的界面信息、普遍适用于不同种类和复杂程度的生物样品等优势,已成为X射线晶体衍射、低温冷冻电镜、免疫共沉淀等蛋白质复合物研究技术的重要补充。化学交联位点的鉴定覆盖度和准确度决定着该技术对于蛋白质复合物结构的解析能力。目前,为了实现蛋白质复合物的高覆盖度交联,研究人员发展了可用于共价交联赖氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基、精氨酸(R)的胍基以及半胱氨酸(C)的巯基等多种活性基团的新型交联剂。进而,为了提高低丰度交联肽段的鉴定灵敏度,体积排阻色谱法、强阳离子交换色谱法,及亲和基团富集策略被提出用于交联肽段的高选择性富集,如可富集型化学可断裂交联剂——Leiker,与不具备富集功能的交联剂相比,通过亲和富集可以将交联位点鉴定数目提高4倍以上。胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)的酶切位点与胰蛋白酶互为镜像,可特异地切割赖氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特点,电荷主要分布在交联肽段的N端,在碰撞诱导裂解(CID)和高能诱导裂解(HCD)模式下产生以b离子为主的碎片离子,与胰蛋白酶酶切肽段以y离子为主的碎片离子互为镜像补充,为胰蛋白酶酶解肽段在质谱鉴定中b离子缺失严重的问题提供了很好的解决办法。由于具有较高的酶切特异性和酶活性,镜像酶已经成功地应用于蛋白质C末端蛋白质组鉴定、磷酸化蛋白质组研究、甲基化蛋白质组鉴定等方面,然而在CXMS中的应用仍未见报道。为进一步提高对蛋白质复合物结构及相互作用位点的解析能力,本文发展了LysargiNase与胰蛋白酶联合酶切的方法,基于镜像酶正交切割的互补特性,通过产生赖氨酸及精氨酸镜像分布的交联肽段,以增加特征碎片离子数量和肽段匹配连续性,从而提升交联肽段的谱图鉴定质量,达到提高交联位点的鉴定覆盖度和准确度的目的。通过分别对牛血清白蛋白及大肠杆菌全蛋白样品的交联位点鉴定结果的考察,评价该策略对单一蛋白样品和复杂细胞裂解液样品蛋白质复合物表征的应用潜力。蛋白质样品制备称取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作为缓冲体系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。大肠杆菌细胞(种属K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培养基培养24 h,然后于4 ℃以4000 g离心2 min,收集细胞沉淀。细胞沉淀采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后,悬浮于细胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制剂)中,冰浴超声破碎180 s(30%能量,10 s开,10 s关)。匀浆液于4 ℃以20000 g离心40 min,收集上清,采用BCA试剂盒测定所得蛋白质含量。稀释大肠杆菌蛋白裂解液至蛋白质含量为0.5 mg/mL。化学交联样品制备以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)为溶剂配制浓度为20 mmol/L 的BS3交联剂母液 将交联剂母液加入牛血清白蛋白的缓冲溶液及大肠杆菌蛋白裂解液中,使交联剂的终浓度为1 mmol/L,在室温条件下反应15 min 通过添加终浓度为50 mmol/L的淬灭溶液NH4HCO3进行交联反应淬灭,并在室温下孵育15 min 在冰浴条件下,将交联样品逐渐滴入8倍体积的预冷丙酮中,于-20 ℃静置过夜 在4 ℃条件下,以16000 g转速离心,去除丙酮,然后将交联蛋白用预冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室温挥发掉残余的丙酮 以8 mol/L尿素溶液复溶蛋白质沉淀 将牛血清白蛋白交联样品以5 mmol/LTCEP作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原 将大肠杆菌样品以5 mmol/LDTT作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原,避免大肠杆菌蛋白在酸性条件下发生变性 添加终浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室温下反应30 min 以50 mmol/LNH4HCO3稀释样品至尿素浓度为0.8 mol/L后,将样品均分为两份,一份以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈50:1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,另一份加入终浓度为20 mmol/L的CaCl2,以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈20:1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃温度下酶解过夜。液相色谱-质谱鉴定及数据搜索上述所有样品经过除盐,使用0.1%甲酸(FA)溶液复溶,用超微量分光光度计测定肽段浓度,进行反相高效色谱分离和质谱分析。牛血清白蛋白样品采用Easy-nano LC 1000系统偶联Q-Exactive质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA) 流动相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~10 min, 2%B~7%B 10~60 min, 7%B~23%B 60~80 min, 23%B~40%B 80~82 min, 40%B~80%B 82~95 min, 80%B。Q-Exactive质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 300~1800,分辨率为70000(m/z=200),自动增益控制(AGC)为3×106,最大注入时间(IT)为60 ms,母离子分离窗口为m/z 2。MS/MS扫描的分辨率为17500(m/z=200),碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量(NCE)为35%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms,仅选择电荷值为3~7且强度高于1000的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。大肠杆菌样品采用EASY-nano LC 1200系统偶联Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液 流动相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~28 min, 5%B~16%B 28~58 min, 16%B~34%B 58~77 min, 34%B~48%B 77~78 min, 48%B~95%B 78~85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 350~1500,分辨率为60000(m/z=200), AGC为4×105, IT为50 ms,母离子分离窗口为m/z 1.6。MS2扫描的分辨率为15000(m/z=200),碎裂模式为HCD, NCE为30%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms。仅选择电荷值为3~7且强度高于2×104的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。质谱数据文件(*.raw)采用pLink 2软件(2.3.9)对交联信息进行检索和鉴定。使用从UniProt于2019年4月27日下载的牛血清白蛋白序列和大肠杆菌序列,搜索参数如下:酶切方式为胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端) 漏切位点个数为3 一级扫描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5 二级扫描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5 每条肽段的质量范围为500~1000 Da 肽段长度的范围为5~100个氨基酸 固定修饰为半胱氨酸还原烷基化(carbamidomethyl [C]) 可变修饰为甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白质N端乙酰化(acetyl [protein N-term]) 肽段谱图匹配错误发现率(FDR)≤5%。映射胰蛋白酶与LysargiNase酶解样品的交联位点在牛血清 白蛋白晶体结构(PDB: 3V03)的映射 LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品的交联位点对及单一交联位点的互补性LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品共同得到的交联位点鉴定打分比较b+/++与y+/++离子碎片分别在α/β-肽段的碎片覆盖度LysargiNase与胰蛋白酶酶解的交联肽段质谱图大肠杆菌样品中LysargiNase与胰蛋白酶酶切鉴定蛋白质复合物信息互补性带点击了解原文：https://www.chrom-china.com/article/2022/1000-8713/1000-8713-40-3-224.shtml

美国科学家主导的国际科研团队在最新一期《科学》杂志撰文指出，他们利用人工智能和进化分析，绘制出了真核生物的蛋白质之间相互作用的3D模型，首次确定了100多个可能的蛋白质复合物，并为700多个蛋白质复合物提供了结构模型，深入研究蛋白质相互作用有望催生新的药物。　　研究负责人之一、美国西南大学人类发育与发展中心助理教授丛前（音译）称，研究结果代表了结构生物学新时代的重大进步。　　丛前解释说，蛋白质通常成对或成组工作，形成复合物，以完成生物体存活所需的任务。虽然科学家已经对其中一些相互作用开展了深入研究，但许多仍是未解之谜。了解蛋白质之间所有的相互作用将揭示生物学的许多基本方面，并为新药研发提供参考。　　但半个世纪以来，鉴于许多蛋白质结构的不确定性，科学家们很难了解这些相互作用。2020年和2021年，深度思维公司和华盛顿大学戴维贝克实验室独立发布了两种人工智能技术“阿尔法折叠”和RoseTTAFold，它们使用不同的策略预测蛋白质结构。　　在最新研究中，丛前等人通过对许多酵母蛋白复合物建模，扩展了人工智能结构预测工具箱。为了找到可能相互作用的蛋白质，科学家们首先搜索相关真菌的基因组，寻找发生突变的基因，然后使用上述两种人工智能技术来确定这些蛋白质是否可以3D结构结合在一起。　　他们确定了1505种可能的蛋白质复合物，其中699个结构已被表征，验证了其方法的实用性；另外700个复合物目前获得的数据有限，剩下106个从未被研究过。为更好地理解这些很少被描述或未知的复合物，团队研究了类似的蛋白质，并根据新发现的蛋白质与此前已知蛋白质的相互作用，确定了新发现蛋白质的作用。

p　　记者从中国科学技术大学了解到：近日，中国科学技术大学蔡刚团队与南京农业大学王伟武团队合作，在DNA修复的关键蛋白ATR激酶研究方面获得重大突破，在国际上首次在亚纳米尺度上描绘出ATR激酶的三维结构。通过获知这种蛋白对DNA损伤的响应机制，有望指导抗癌新药开发。国际权威学术期刊《科学》12月1日发表了该成果。/pp　　据了解，人体细胞通过不断分裂来修补和替换受损组织，每一次的分裂都需要重新“复印”一次细胞的“遗传蓝图”。随着DNA的复制，会不可避免地发生“错印”，这种损伤若是得不到修复，就会导致细胞的死亡或癌变。/pp　　一旦感受到DNA损伤的迹象，一种叫做ATR激酶的蛋白质就会活化细胞固有修复系统。作为机体负责维持细胞稳态的六大蛋白质激酶之一，ATR激酶负责启动细胞对DNA损伤和复制压力的修复。/pp　　ATR激酶是如何响应DNA损伤的，又如何活化修复系统的?解析ATR激酶的活化机制，一直是现代生命科学领域的核心问题之一。/pp　　据论文通讯作者、中国科学技术大学蔡刚教授介绍，他的团队利用电子显微镜，在0.39纳米的精度下构建了酵母中Mec1—Ddc2复合物的原子模型。这种复合物与人体内的ATR激酶和它的信号通路伴侣蛋白ATRIP，具有很高的结构相似度。/pp　　蔡刚说，对Mec1—Ddc2复合物进行数据收集、图像处理和三维重构的方法，可以获得近原子级别精度的三维结构，有助于阐明人类ATR—ATRIP复合物的结构和分子机制。/pp　　据了解，ATR激酶被视为潜在的癌症治疗靶点。处于待激活状态的ATR激酶，一旦检测到DNA损伤迹象，会迅速被激活。高分辨率的结构信息揭露了ATR激酶的调控位点，阐明其调控机制，有望指导新型癌症治疗药物的开发。/pp　　蔡刚教授和他的团队目前正在对酵母Mec1—Ddc2复合物及人类ATR—ATRIP复合体的不同激活阶段进行成像，期望开发特定性更强和效率更高的ATR激酶抑制剂，以便探索优化癌症治疗的可能性。/pp/p

前言 /PROTAC表征难题重要靶点和候选药物的亲和力筛选非常具有挑战性。当您的亲和力筛选项目涉及到PROTAC二元和三元复合物，片段化合物库及固有无序蛋白时，需要进行样品固定的SPR技术和样品消耗量大的ITC技术的检测难度会大大增加，而这些应用则是Dianthus所擅长的。光谱位移技术（Spectral Shift）光谱位移技术是通过荧光发射光谱的蓝移或红移来检测分子间的结合。Dianthus可以为您解决哪些表征难题？Dianthus是一个基于微孔板的亲和力筛选平台，使您能够克服其他生物物理方法带来的挑战。避免这些常见的障碍，让您的PROTAC项目继续推进。1通过固定二元复合物的方法来进一步研究三元复合物，二元复合物的稳定性会受到影响。答Dianthus直接在溶液内进行检测，结合平衡状态可控。因此，在表征三元结合的过程中二元复合物可保持稳定。2在再生过程中，共价分析物几乎不可能从传感器芯片上完全去除。答在单独的孔中直接在溶液中检测分子间相互作用，使得您的亲和力分析更简单、无压力且更经济实惠。3其他检测方法难以测量warheads这样的小分子的亲和力。答光谱位移技术不依赖于分子量，因此您可以使用 Dianthus 对片段化合物进行初步筛选，还可以在后续亲和力优化中筛选PROTAC 候选物。4靶点和配体的样品量有限答使用Dianthus进行亲和力筛选无需耗费时间进行大量方法开发，检测时的样品消耗量很低，将极大节省所有的样品量。选择Dianthus表征PROTAC候选物Dianthus 是基于微孔板且无微流体系的亲和力筛选平台，您可通过 gRPC 框架轻松将其集成到任何自动化设置中。无需定期维护，您的项目不会因停机而延迟。Dianthus 随时准备好为您效劳 —— 7天24小时不间断。点击图片下载PROTAC电子书，了解更多技术难题

p　　金属有机复合物、自组装超分子化合物、短链双链DNA等，在食品、药物、蛋白质分析等领域都具有极其重要的作用，但是由于这些化合物“热不稳定”，一直是质谱检测的难题，进口仪器也无能为力。/pp　　近日，由广州禾信仪器股份有限公司独立研制开发的具有完全自主知识产权的金属有机复合物高分辨飞行时间质谱仪MOC-TOFMS悄然上市，快速打破行业的寂静。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/58303cb5-664f-4984-992b-09fbe716dd98.jpg" title="001.jpg"//ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　工作原理/strong/span/pp　　液体样品经过电喷雾离子源电离产生离子，在电场牵引下通过低压分子离子反应器MIR，随后离子在射频四极杆RFQ里进一步碰撞冷却聚焦，再经直流四极杆DCQ及离子光学透镜LENS调制后，由高分辨飞行时间质量分析器进行检测分析。/pp　　整套系统采用专利大气压接口，可以同时控制离子束能量分散和离子束与背景气体碰撞能量的大小，是目前全球少数的极柔和离子传输器之一。该技术与垂直引入反射式飞行时间分析器相连，整机性能完全媲美进口冷喷雾电离质谱仪器。/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　特点与优势/strong/span/pp　　1) 柔性大气压接口专利技术，有效传输热不稳定分子离子 /pp　　2) 三级差分真空系统，极大提高仪器灵敏度 /pp　　3) 紧凑式“V”型飞行时间质量分析器，最优尺寸分辨比。/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　应用领域/strong/span/pp　　药物研究、生物医学研究、环境与食品安全、功能材料研究、催化机理研究等。/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　应用案例/strong/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "分析目的：/span鉴定金属有机复合物合成产物的分子结构，为合成路线提供数据支撑。/pp　span style="color: rgb(0, 112, 192) "　待测样品1：/span/pp　　目标化合物分子式：Csub246/subHsub276/subFsub24/subNsub4/subOsub46/subPsub12/subPtsub4/sub/pp　　目标化合物结构式：/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/fae951cf-2cd5-4de3-80c2-57b1601a2b05.jpg" title="002.png"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) " strong分子离子分子式最大丰度质荷比m/z/strong/span/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/3bf16853-b73c-47ac-85ce-bd489f0f1b31.jpg" title="004.png"/　/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　分析结果：/span/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/9bcb5748-33d3-4a9a-91fa-c6d72cd30981.jpg" title="005.png"//pp　span style="color: rgb(0, 112, 192) "　待测样品2：/span/pp　　目标化合物分子式：(Rhsub8/subAgsub2/subCsub120/subHsub132/subOsub16/subNsub8/subCsubl8/sub)sup6+/sup(SOsub3/subCFsub3/sub)sub6/sub (Csub6/subHsub4/subBrsub2/sub)/pp　　目标化合物结构式：/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/95eef5c7-e06a-4f3c-99ec-e6d0b3aabdab.jpg" title="003.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong[M-4OTf]sup4+/sup模拟质谱图[M-3OTf]sup3+/sup模拟质谱图/strong/span/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/b267942d-cacf-4bfb-9b66-8d2dd100bbc8.jpg" title="006.jpg"//pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "分析结果sup(1)/sup：/span/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/1df41db8-cc21-4301-9d85-436bb55b0085.jpg" title="007.jpg"//pp　　注：(1) Wen-Ying Zhang, et al. Facile Separation of Regioisomeric Compounds by a Heteronuclear Organometallic Capsule [J]. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138 (33), pp 10700–10707/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　小结：/strong/span/pp　　测试结果表明，用MOC-TOFMS对金属有机复合物检测有利于产生高价态准分子离子峰，适合热不稳定的金属有机复合物的精确质量检测。/ppbr//p

导体材料是信息交互、电能传输和力、热、光、电、磁等能量转换的基础性材料，在航空航天、新能源汽车、电力线路等领域具有重要应用价值。随着大功率器件的发展，对轻量化、大载流、高导电性材料的需求越来越迫切。单根单壁碳纳米管（SWCNT）拥有极高的载流能力和电导率，载流能力比传统金属铜高出2~3个数量级，电导率更是银的1000倍以上。然而，当SWCNT组装成宏观薄膜的时候，由于碳管间电子/声子散射的影响，载流能力和电导率会显著降低，从而制约SWCNT薄膜在大功率器件领域的应用。 针对上述问题，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所研究员康黎星等提出并研制了新型大载流、高导电碳纳米管复合薄膜材料。研究团队采用化学气相输运法将CuI均匀高效地填充到SWCNT管腔中，制备出CuI@SWCNT一维同轴异质结。SWCNT对CuI具有保护作用，保持了CuI的电化学活性，使其能够在恶劣的酸性环境和长期电化学循环下保持稳定性。研究通过电学测量发现，CuI@SWCNT薄膜相较于SWCNT薄膜具有更优的电导率和更强的载流能力，其载流能力提升4倍，达到2.04×107 A/cm2，电导率提升8倍，达31.67 kS/m。  SWCNT填充CuI后，SWCNT中电子流向CuI，导致SWCNT的费米能级降低；同时，CuI@SWCNT一维范德华异质结中SWCNT的结构未被破坏，载流子依然保持高效的传递速率，进而使得CuI@SWCNT薄膜具有更高的导电性和载流能力。CuI@SWCNT复合薄膜在未来高功率电子器件、大电流传输等应用中具有潜力。 相关研究成果以CuI Encapsulated within Single-Walled Carbon Nanotube Networks with High Current Carrying Capacity and Excellent Conductivity为题，发表在《先进功能材料》（Advanced Functional Materials）上。研究工作得到国家重点研发计划和国家自然科学基金等的支持。

01前言Thermal shift assay（TSA），也被称为差示扫描荧光法（DSF）是表征蛋白热稳定性的常用方法之一，广泛应用于蛋白配体互作表征，突变体、缓冲液、去垢剂筛选等领域。但DSF的实验操作较繁琐，需要根据蛋白的特性及去垢剂兼容性选择合适的染料，优化蛋白和染料的比例，在配制样品时还要考虑染料自带的有机溶剂对蛋白的影响。替代性技术：nanoDSF技术时下被行业深度认可的无标记的TSA验证方法-也称nanoDSF技术，可解决DSF技术的局限性，样品无需加染料就可以直接上机检测了。下面我们一起通过用户的文献案例来进一步了解。02NanoTemper用户应用案例解读检测样品：Cas9，gRNA使用仪器：PR系列蛋白稳定性分析仪涉及技术：nanoDSF技术https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.106399CRISPER - Cas9介导的基因编辑能够帮助人们在动物和细胞模型中实现广泛的靶向敲除(KO)或敲入(KI)，例如单点或多点KO、点突变、报告基因KO或KI等。然而，CRISPR-Cas9的切割效果和准确性仍是基因编辑面临的主要挑战，它们特别受到核糖核蛋白复合物 (RNP)的组装配比的影响。2023年3月，法国南特大学的研究人员近期发表了研究成果：Excess of guide RNA reduces knockin efficiency and drastically increases on-target large deletions，作者借助PR系列蛋白稳定性分析仪搭载的nanoDSF技术，一种无需标记和固定化的方法，证明了Cas9和gRNA的等摩尔比是形成RNP复合物的最佳条件。研究结果作者通过CRISPR/Cas9 KI将双等位纯合子GFP hiPSCs转化为BFP表达细胞，通过细胞表型分析证明在Cas9的最佳浓度为0.4 mM时，增加ssODN浓度有助于降低KO率，提高KI率，而增加dgRNA对KO和KI没有影响。0.4 mM的Cas9、等摩尔Cas9/gRNA比例和2 mM的ssODN是在hiPSC中实现高效GFP到BFP转换的最佳选择。 在此之前，有一些研究曾表明过量的gRNA对于靶向切割有帮助，而本文作者的实验结果则与之产生了矛盾。于是作者使用NanoTemper公司的nanoDSF技术建立了一套体外实验方法学，用来评估RNP复合物的形成效率，从而佐证他们的结论。通过nanoDSF这种无标记技术，可在升温过程中检测蛋白中的色氨酸和酪氨酸的自发荧光。随着升温，仪器同步采集在350 nm和330 nm处的最大发射光位移，并自动拟合出蛋白的热展开曲线。NanoDSF能够检测蛋白的构象变化导致的热稳定性差异，并由熔解温度(Tm)来表征蛋白的热稳定性。由于Cas9是一种含有色氨酸和酪氨酸残基的变构酶， 因此利用nanoDSF技术可以简单、直观地检测导致Cas9重排的RNP复合物的形成。 为了确定hiPSC中使用的dgRNA靶向GFP位点(dgRNA GFP)形成RNP复合物的有效性，作者使用恒定浓度的Cas9 (0.75 mM)与一定浓度范围内的dgRNA, 通过nanoDSF检测，作出升温诱导的蛋白变性曲线检测 (图1A)。根据一阶导数，可以确定Cas9单独的Tm(TmCas9 = 43.2C)，以及Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 的Tm：1/1 时TmRNP = 49.6 C、1/2 时TmRNP = 50.0 C、1/3时 TmRNP = 49.9C、1/5 时TmRNP = 49.8 C (图1B)。相比只有Cas9时， Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 时的Tm都有明显增加，但Cas9/dgRNA不同摩尔比之间的Tm并没有显著差异（图1C）。这反映了RNP复合物的形成情况。另外，当Cas9/dgRNA为等摩尔比时，是检测不到游离Cas9的。因此，可以认为Cas9/dgRNA等摩尔比是形成RNP复合物的最优条件。图1作者在大鼠胚胎上使用点突变模型来验证等摩尔Cas9/dgRNA是否能得到最佳的KI率，以及过量的dgRNA是否会影响KI效率。 他们先使用nanoDSF检测大鼠胚胎中Cas9过量、等摩尔Cas9/dgRNA或dgRNA过量这几种情况下，RNP复合物的形成情况(图2A)。在所有条件下，添加dgRNA靶向的环氧化物水解酶2基因(dgRNA rEphx2)，与单独Cas9相比，Tm都显著增加，表明RNP复合物的形成 (图2B)。 在Cas9/dgRNA摩尔比为 5/1和2/1时，可以看到变性曲线中包含了两个热变性峰，分别可表示为TmCas9和TmRNP。与单独Cas9相比(TmCas9 = 43.2℃)， TmCas9对这两种RNP的比例差异不显著(TmCas9 RNP 5/1 = 43.0℃ TmCas9 RNP 2/1 = 43.3℃, p分别= 0.4809和0.9353)，而TmRNP为(TmRNP RNP 5/1 = 48.0℃ TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃, p 都= 0.029)。这些结果表明，在两个条件下，RNP复合物已经形成，而游离Cas9仍然存在。当等摩尔比(RNP 1/1)或dgRNA rEphx2过量(RNP 1/2, 1/3和1/5)时，只观察到一个热变性峰(TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃ TmRNP RNP 1/2 = 49.9℃ TmRNP RNP 1/3 = 49.8℃ TmRNP RNP 1/5 = 49.7℃)，这些Tm之间差异不显著。此外，与dgRNA rEphx2相比，RNP 1/1比例的TmRNP与RNP 2/1比例的TmRNP显著不同(TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃, p = 0.0206)，与单独Cas9也显著不同 (TmCas9 Cas9 = 43.2℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7C, p0.0001)。这说明大多数Cas9形成了RNP复合体，RNP 1/1和dgRNA过量。由此同样佐证了作者的结论，等摩尔比Cas9/gRNA这个条件限制了游离Cas9，可能也限制了游离dgRNA，最终有效形成RNP复合物。图203关于PR系列蛋白稳定性分析仪德国NanoTemper公司自2014年推出PR系列蛋白稳定性分析仪，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光，无需标记即可检测蛋白Tm值，快速精确评估蛋白在不同条件下的热稳定性变化。2020年NanoTemper推出新一代PR Panta仪器，并于2022年整合四大技术模块nanoDSF/Backreflection/DLS/SLS，可实时同步评估蛋白热稳定性，胶体稳定性，聚集体与粒径等信息，为科研人员在蛋白质量控制、复合物分析、化合物筛选、制剂优化等方面提供强大助力。今年年初，公司凭借自身不断创新的科学技术，推出新品型号：PR Panta + 机械臂自动上样器，这款新品拥有独立且包罗万象的系统，包含机械臂、外框架、计算机和监视器。可装载多达4个384微孔板，用于检测所有蛋白质候选分子热变性、胶体稳定性和化学变性的全自动操作。可针对高通量或配方筛选实验场景，无需手动即可完成多达1536个样品的检测。PR系列产品

丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒，属于黄病毒科。HCV感染大多数早期无明显症状，长期感染可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至发展为肝癌，严重危及患者生命健康。在临床诊断方面，抗体血清学检测和实时荧光定量PCR检测被认为是诊断HCV感染的金标准。由于检测方法的限制，抗体血清学无法对处于感染窗口期的丙肝病毒进行检测。实时荧光定量PCR由于操作相对繁琐、人员专业化程度要求高和设备昂贵等因素，极大地限制了丙肝病毒早期诊断的应用推广。因此，建立一种灵敏度高、特异性强的HCV RNA检测新方法，对丙肝病毒早期诊断具有重要意义。 　　为获得更为直观的检测方式，尽可能摆脱传统检测手段的诸多限制，中科院苏州医工所韩坤课题组以石墨烯量子点/银纳米颗粒复合物为基础，设计了可视化的HCV检测新方法。在室温条件下，通过原位生长的方式制备石墨烯量子点/银纳米颗粒复合物，该复合物既解决了银纳米颗粒的易团聚的问题，又可作为显色基底实现直观的信号输出。当有靶标HCV RNA存在时，通过DNA行走策略，触发催化发卡环自组装反应，可将葡萄糖氧化酶偶联至发卡环末端。葡萄糖氧化酶可催化产生过氧化氢，将淡黄色的石墨烯量子点/银纳米颗粒复合物转化为无色透明。该策略在HCV RNA检测时，检测限低至24.84 pM，在HCV RNA的早期诊断方面具有潜在应用。 图：基于分子自组装和石墨烯量子点/银纳米颗粒复合物的HCV RNA的可视化检测方法 　　该研究成果“A visual method for determination of hepatitis C virus RNAs based on a 3D nanocomposite prepared from graphene quantum dots”发表在一区杂志Analytica Chimica Acta上（(2022), 1203, 339693），李夷飞为第一作者，韩坤研究员和苏州大学附属第一医院陈祖涛主任为共同通讯作者。论文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2022.339693 　　该项工作得到国家自然科学基金（31500805）、中国科学院青年创新促进会（2015261）、“江苏省333高层次人才培养工程”和苏州市科技计划项目（SYG201508）等项目的经费支持。 　　此外，围绕HCV的窗口期诊断的需求，团队前期将碳基纳米材料的特殊性能和生物传感策略有机结合，发展了多种基于碳基纳米材料的HCV核酸的检测方法。如：基于氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附力的显著差异，构建了一种核酸辅助的磁性石墨烯与铜纳米颗粒的纳米复合物体系，实现HCV亚型核酸的电化学灵敏检测。基于葫芦脲和亚甲基蓝的主客体作用以及核酸外切酶III的信号放大，进一步降低检测限。 　　上述方法为HCV的早期诊断提供了新思路，下一步该团队将进一步提高检测结果的灵敏性和稳定性，推动该技术在丙型肝炎的早期诊断和筛查中的转化应用。

p style="text-align: justify "　　近日俄亥俄州立大学化学和生物化学系的span style="font-family: times new roman "VickiH. Wysocki/span教授课题组在AC上发表了一篇文章，题目为span style="font-family: times new roman "Surface-InducedDissociation of Noncovalent Protein Complexes in an Extended Mass RangeOrbitrap Mass Spectrometer/span。/pp style="text-align: justify "　　获取蛋白质复合物的四级结构信息，对于理解其生物功能来说至关重要。与传统的CID/HCD通过多次碰撞沉积能量以实现解离相比，strong表面诱导解离/strong(span style="font-family: times new roman "Surface induceddissociation，SID/span)是通过使复合物离子撞击一个具有化学惰性、刚性的表面，经过单次高能撞击后，产生相比于CID和HCD技术电荷更均匀分布的蛋白亚基(如图1)，从而提供化学计量比和互作网络等信息。此外，相比于CID常常导致小分子配体丢失，SID可以产生保留小分子配体的复合物亚基。/pp style="text-align: justify "　　 /pp style="text-align: center "img width="600" height="253" title="SID.webp.jpg" style="width: 600px height: 253px " alt="SID.webp.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/671db102-c3a5-4bc3-ad7d-5e07248fc1a3.jpg" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "　　图1. SID示意图/pp style="text-align: justify "　　目前，SID技术在蛋白复合物方面的工作主要是在飞行时间质谱(span style="font-family: times new roman "TOF MS/span)上完成，但随着蛋白复合物的分子量越来越大，结构解析深度越来越深入，对质谱仪器的分辨率也提出了更高的要求。每一种类型的质量分析器(span style="font-family: times new roman "TOF、FTICR或者Orbitrap/span)都有它们的优劣势，而仪器的选择主要依赖于待解决的问题本质。为此，Vicki H. Wysocki课题组与赛默飞公司Alexander A. Makarov博士合作，strong首次将SID解离源装配到Exactive Plus Extended Mass Range(EMR)Orbitrap仪器上/strong(如图2)。这套SID即可用来传输离子又可用来进行SID。值得一提的是，SID装置并未影响离子进入HCD池和一级质谱分析。/pp style="text-align: center "img title="EMR-orbitrap.jpg" alt="EMR-orbitrap.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/97acf2a9-f158-474e-bef1-ca2f3c2deea8.jpg"//pp style="text-align: center "img width="600" height="498" title="2.webp.jpg" style="width: 600px height: 498px " alt="2.webp.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/7c134afb-82fa-472e-8848-062123d511f0.jpg" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: justify "　　图2. a)SID装置3D设计图，b)SID模式下离子轨迹图，c)SID改造后EMR Orbitrap仪器图。/pp style="text-align: justify "　　随后，作者strong利用该仪器对Streptavidin和L-GlutamateDehydrogenase蛋白复合物进行了质谱分析/strong。其中，前者是具有D2对称性的同源四聚体，后者是具有D3对称性的同源六聚体。图3为Streptavidin的一级谱及其SID谱图。先前的文献表明，通过CID主要产生的是streptavidin复合物的去折叠单聚体和三聚体，但这一结果显然不能支持streptavidin是由同源二聚体组成的结构。而11+的母体streptavidin复合物经过SID会解离成两个二聚体，分别为5+和6+，证明SID更能反映他们真实的拓扑结构(图3a-c)。值得一提的是，之前对于谱图中出现的3+单聚体和6+同源二聚体，由于TOF MS分辨率不高所以要依靠IMS才能进行分辨3，但现在EMR Orbitrap在高分辨率模式(R=140,000 at m/z 200)下就可直接对它们二者进行分辨(图3d)，甚至盐加和离子或者N末端Met修饰与否都可以在高分辨谱图中完全获得(图3e)。/pp style="text-align: center "img width="600" height="466" title="3.webp.jpg" style="width: 600px height: 466px " alt="3.webp.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/335862ab-316e-4d66-8193-777c95b0aa48.jpg" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: justify "　　图3. a)Streptavidin四聚体拓扑结构(PDB ID：1SWB)，b)Streptavidin四聚体一级质谱图，c)11+价态Streptavidin四聚体的SID谱图(span style="font-family: times new roman "45 V，495 eV/span)，d)高分辨率模式下3+价态Streptavidin单聚体和6+价态的二聚体，e)3+价态单聚体和6+价态二聚体的N末端蛋氨酸修饰和Na离子加和谱图。/pp style="text-align: justify "　　此外，作者还考察了span style="font-family: times new roman "L-Glutamate Dehydrogenase/span同源六聚体的拓扑结构。HCD结果表明，该六聚体很难在气相中发生解离，需要较高HCD能量和高电荷态，常常导致先失去一个去折叠单体，无法真实反映亚基组成。而通过SID可以获得比较稳定的三聚体信号，反映出span style="font-family: times new roman "L-GlutamateDehydrogenase/span同源六聚体的拓扑结构主要为三聚体-三聚体界面，在低能量下主要断裂较弱的三聚体界面(图4a)，当能量逐渐升高单体会从三聚体亚基中解离出来(图4b)。/pp style="text-align: center "img width="600" height="461" title="4.webp.jpg" style="width: 600px height: 461px " alt="4.webp.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/f1e97f6c-ca94-485b-825b-e918eeceb873.jpg" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: justify "　　图4. 28+价态L-Glutamate Dehydrogenase同源六聚体在a)175 eV和b)235 eV能量下的SID谱图。/pp style="text-align: justify "　　综上所述，相比于SID-TOF MS仪器，具有更高质谱分辨率的SID–EMR Orbitrap仪器后续将为大蛋白复合物提供更丰富的四级结构信息。此外，Vicki H. Wysocki课题组先前还报道了将SID装载到FTICR-MS仪器，在SID谱图中可对霍乱毒素(Cholera toxin B，CTB)多种亚基进行同位素分辨(R=210,000 at m/z 5803.7)，例如8+四聚体、6+三聚体、4+二聚体和2+单聚体4，感兴趣的学者们可进一步了解。得益于Orbitrap和FTICR的超高质量分辨率，相信SID源将在蛋白-蛋白、蛋白-金属离子、蛋白-小分子配体复合物体系中发挥越来越重要的作用。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "参考文献：/pp style="text-align: justify "　　span style="font-family: times new roman "[1] VanAernum, Z. Gilbert, J. Belov, M. Makarov, A. A. Horning, S. Wysocki, V. Anal. Chem., 2019, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b05605./span/pp style="text-align: justify "span style="font-family: times new roman "　　[2] Zhou, M. Wysocki, V. H. Acc. Chem. Res., 2014, 47, 1010-1018./span/pp style="text-align: justify "span style="font-family: times new roman "　　[3] Quintyn,Royston S. Yan, J. Wysocki, Vicki H. Chem. Biol., 2015, 22, 583-592./span/pp style="text-align: justify "span style="font-family: times new roman "　　[4] Yan, J. Zhou, M. Gilbert, J. D. Wolff, J. J. Somogyi, Á . Pedder, R. E. Quintyn, R.S. Morrison, L. J. Easterling, M. L. Pa?a-Toli?, L. Wysocki, V. H. Anal. Chem., 2017, 89,895-901./span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong文献链接：/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "a style="color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " href="https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/acs.analchem.8b05605" target="_blank"span style="color: rgb(0, 32, 96) "https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/acs.analchem.8b05605/span/a/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "（文献原文可联系仪器信息网编辑部提供，联系电话：010-5165-4077-8223）/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "文中提及的赛默飞span style="font-family: times new roman "ExactivePlus(EMR)Orbitrap/span相关信息可点击链接： /pp style="text-align: justify text-indent: 2em "a style="color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " href="https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100244/C152611.htm" target="_blank"span style="color: rgb(0, 32, 96) "https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100244/C152611.htm/span/a/p

帕金森疾病（Parkinson’s disease, PD）是第二常见的神经退行性疾病，患者所表现出的运动功能障碍主要由黑质（substantia nigra, SN）中多巴胺能神经元丧失引起。尽管PD致病因素多样，但多项证据表明线粒体功能缺陷在其中的重要性，例如编码维持线粒体质量控制蛋白的PARK7、PARK6和PARK2基因突变能引起早发型PD【1】。多巴胺能神经元对线粒体功能障碍的易感性可部分归因于其高代谢需求，从而引起线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的持续刺激，然而这种巨大能量的提供是以线粒体氧化损伤增加为代价的。尸检研究表明，PD患者SN中mtDNA完整性的丧失与功能性线粒体复合物I（MCI）的丧失存在相关性。然而，这种MCI获得性损伤究竟是PD疾病进程中的一种副产品还是疾病的驱动因素还不得而知。2021年11月3日，来自美国西北大学Feinberg医学院的D. James Surmeier团队在Nature杂志上发表了一篇题为 Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism 的文章，这项研究通过选择性破坏小鼠多巴胺能神经元中MCI功能，发现MCI功能障碍足以导致进行性的帕金森病相关运动缺陷，且不同类型的运动功能损伤（精细动作和粗大运动）与不同部位（纹状体和黑质）多巴胺释放的相关性，挑战了长期以来存在的关于该疾病运动症状的观点。为了证明MCI功能障碍是否作为PD的驱动因素，该团队从小鼠多巴胺能神经元中特异性地敲除编码MCI催化核心亚基的Ndufs2基因。cNdufs2-/-小鼠在出生后20天（P20）仍表现出正常的粗大运动行为。但在随后10天中，SN多巴胺能神经元中的线粒体成为ATP的净消费者而非生产者，且线粒体嵴结构发生了明显改变。利用RiboTag方法分离多巴胺能神经元中的mRNA并进行测序发现，cNdufs2-/-小鼠中存在一种类似Warburg效应的代谢重编程，即编码促进糖酵解蛋白的基因上调，而与OXPHOS以及编码糖酵解抑制剂的基因下调。除了触发代谢重编程外，该团队还发现Ndufs2的缺失会导致与轴突生长和运输、突触传导、多巴胺（DA）合成和储存等相关的基因表达发生显着变化。对纹状体组织的液相色谱和质谱分析进一步验证cNdufs2-/-小鼠纹状体DA合成明显下降，此外，有助于驱动起搏的环核苷酸门控阳离子通道电流也明显减少。到P60，与多巴胺能信号相关的轴突蛋白的丢失由背侧纹状体扩大到腹侧纹状体，且cNdufs2-/-小鼠SN多巴胺能神经元胞体树突区域中的酪氨酸羟化酶表达降低至对照组一半左右，且DA释放量下降约75%。与在整个基底神经节中DA迅速耗尽的传统PD模型相比，cNdufs2-/-小鼠的病理分期能够评估DA释放的区域缺陷如何与行为相关联。随着背侧纹状体DA释放在P30左右下降到接近检测阈值，cNdufs2-/-小鼠失去了执行联想学习任务的能力，有趣的是，该任务可以通过P30时的左旋多巴治疗恢复，而P60的治疗则不能恢复。在通过小鼠从前爪去除粘合剂所花费的时间来评估精细运动技能的实验中，cNdufs2-/-小鼠完成任务时间明显延长，同时也表现出较差的旷场探索行为表现。此外，P60的cNdufs2-/-小鼠仅表现出轻微的步态障碍，到了P100才会表现出后肢张开、爪子位置异常和步幅改变等特征。而在P120-150期间，大约有40%的SN多巴胺能神经元丢失。需要注意的是，cNdufs2-/-小鼠在后期才出现粗大运动行为缺陷，这与SN DA而非背侧纹状体 DA释放变化平行。尽管有明确的临床证据表明纹状体DA耗竭对于PD患者的运动迟缓和僵硬是必要的【2】，但其充分性从未得到充分测试，因为传统的PD模型往往会导致整个基底神经节DA的快速耗竭。在此处通过对cNdufs2-/-小鼠的观察表明，背侧纹状体DA释放的丧失足以产生运动学习和精细运动缺陷，但并未达到类似于临床PD的运动症状水平。该团队通过分别向小鼠背侧纹状体或SN中立体定位注射携带AADC（可将左旋多巴转化为DA）的AAV，以及随后对小鼠旷场步态的分析，证明黑质多巴胺释放丧失对于粗大运动缺陷而言是必要因素。总的来说，这项研究不仅证明多巴胺能神经元中MCI功能丧失足以引发进行性的、轴突先行的功能丧失和左旋多巴反应性帕金森病，还证明背侧纹状体的DA耗竭对于联想运动学习和精细动作而言是必要的，但黑质的DA释放缺陷才会引起类似于临床PD患者表现出的粗大运动损伤特征。针对这项研究，来自美国格莱斯顿研究所的Zak Doric和Ken Nakamura在同期杂志上发表观点文章 Principles of Parkinson’s disease disputed by model 。他们指出González-Rodríguez等构建的基于线粒体功能障碍的帕金森疾病小鼠模型代表了目前可用的散发性PD最佳模型之一，它不仅可以研究复合物 I 缺陷在疾病中的作用，还可以提供一个模型来评估治疗策略的潜力。此外，该模型一个显著特征是多巴胺神经元在几个月中进行性退化，且轴突和胞体退化存在延迟，这种延迟便于详细研究两个不同部位多巴胺损伤所带来的影响。另一个相当大的进步是该模型证实纹状体多巴胺释放减少对于运动缺陷来说是必要而不充分的，也就是说，黑质多巴胺在维持粗大运动方面起着至关重要的作用。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04059-0https://doi.org/10.1038/d41586-021-02955-z

近期，中科院合肥物质科学研究院智能所仿生功能材料与传感器件研究中心刘锦淮研究员、黄行九研究员领导的研究团队在持久性有机污染物检测电学纳米器件研究方面取得一系列新成果。　　持久性有机污染物(POPs)指人类合成的能持久存在于环境中、通过生物食物链(网)累积、并对人类健康产生危害的化学物质，它具有毒性高、化学稳定性强等特点。传统检测方法复杂，检测仪器体积大、成本高，因而利用纳米材料独特的物理化学效应，研制具有现场实时检测功能的纳米传感器件，简化检测程序，降低成本，具有重要的学术价值和社会效益。　　基于纳米传感器件灵敏度与晶粒尺寸的相关效应，智能所研究团队成功研制出了纳米颗粒组装的多层多孔纳米结构二氧化锡(SnO2)空心球、SnO2/多壁碳纳米管纳米复合物和珊瑚状SnO2等纳米结构材料。基于上述独特结构纳米材料的传感器对艾氏剂、滴滴涕等POPs具有高的灵敏度和短的检测时间。　　这作为一种新的POPs检测方法，引起国内外同行的广泛关注，英国物理学会在其网站对智能所研究团队的工作作了特别报道。　　为了进一步提高传感器对POPs的选择性，研究人员还将β-环糊精修饰到多壁碳纳米管上制作成电导式传感器，对多氯联苯具有非常好的选择性，相关成果已被英国《材料化学杂志》(Journal of Materials Chemistry)作为底封面文章发表。此外，研究人员利用多孔阳极氧化铝膜的强大负载能力，制作电容传感器对多氯联苯进行检测，发现其具有较高的灵敏度和较强的抗干扰能力。　　相关的研究工作得到了国家重大科学研究计划(纳米研究计划)、国家自然科学基金和中科院“百人计划”等项目的大力支持。

1. 文章信息标题：CdTe Quantum Dot/Bi2WO6 Nanosheet Photocatalysts with a Giant Built-In Electric Field for Enhanced Removal of Persistent Organic Pollutants期刊：ACS Applied Nano Materials 20222. 文章链接ScienceDirect专用链接：https://doi.org/10.1021/acsanm.2c00155或https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsanm.2c001553. 期刊信息期刊名：ACS Applied Nano Materials2021年影响因子：5.097分区信息：中科院2区；JCR分区（Q2）涉及研究方向：工程技术：材料4. 作者信息：杨朋启（首要作者），吴正岩（首要通讯作者）；张嘉（第二通讯）5. 光源型号：北京中教金源CEL HXF300（300 W氙灯，可见光范围）和CEL-NP2000-2A（光密度测量仪）文章简介：近年来，由于各种有机污染物的大量使用导致水体环境污染加剧。针对此类污染，课题组设计并开发了一种高效的碲化镉量子点/钨酸铋纳米片复合半导体材料作为光催化剂用于治理有机污染物。由于低维半导体材料内部存在强的激子效应，严重抑制了电子-空穴的分离和转移。作者通过在材料内部构建内置电场作为内在驱动力，促进激子的解离和光生电子-空穴的转移，从而提高对苯酚、罗丹明B、四环素的降解效率，并且在短时间内基本可以达到完全降解的目的。同时，该催化剂又展现出良好的循环利用率，多次催化后仍可保持较高的光催化效率。因此，该催化剂在水体污染物治理方面展现出一定的应用前景。 我们一致认为本文的创新之处有以下几点：1、首次在2维钨酸铋（200）晶面和碲化镉量子点（111）晶面构建了内置电场。2、实验和DFT理论计算双向证明了内置电场的构建调节了激子效应，促进了激子的解离。3、在水体环境中各种可持续存在的有机物治理方面展现优异的性能。

纳米材料著名供应商-德国PlasmaChem公司最近推出了一系列新产品：1. ZnCdSeS 复合量子点，低镉，疏水复合量子点是最新一代低镉、高发光半导体纳米晶，稳定性及与复合物的相容性有了较大的提高。表面用疏水性有机分子修饰。很容易溶解于己烷、庚烷.、甲苯、氯仿、四氢呋喃和吡啶等溶剂中。直径约6 nm。干粉包装 2. Zn-Cu-In-S/ZnS 量子点, 无镉, 疏水无毒发光量子点 Zn-Cd-In-S / ZnS (核/壳) ，表面经过疏水有机配体修饰。很容易溶解于己烷、庚烷.、甲苯、氯仿、四氢呋喃和吡啶等溶剂中。不溶于水、乙醇和醚。发射峰宽度（FWHM）约100 nm。大斯托克跃迁（约120 nm）,典型量子产量40-70%。颗粒直径约4-5 nm。干粉包装。 3. ZnO 量子点, 干粉, 亲水性无毒ZnO 纳米晶体掺入镁，很容易分散于水中。表面用 -OH and -COOH 修饰。发光峰宽最大激发 320-370 nm. 颗粒大小: 2-3 nm 4. 石墨烯-纳米片，干粉厚度: 1-4 nm颗粒大小: 最大2 &mu m比表面积: 700-800 m² /g纯度: 91 at.%. 其他元素: O 7 at.% N 2 at.% 5. 氮化硼, 六方体BN 纳米粉颗粒分布范围: 100-1000 nm平均颗粒大小: 500± 100 nm比表面积: 23± 3 m2/g纯度: 98,5% 氮含量 55%控制杂质 %: O 1 C 0,1 B2O3 0,1 欢迎联络：北京安唯安实验设备有限公司Beijing AnWeiAn Lab Equipment Co.,Ltd地址:中国北京市海淀区昆明湖南路9号云航大厦4029室邮编:100195电话:+86 10 88132032传真:+86 10 82386759E-mail: info(at)al-tt.com网址: www.al-tt.com 德国PlasmaChem纳米材料中国独家代理商-----碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、纳米石墨、纳米金属、纳米陶瓷、纳米线、量子点、纳米配体、自组装聚甘氨酸。。。。 全部电子版PlasmaChem纳米材料目录：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH102845/

pimg style="WIDTH: 600px HEIGHT: 75px" title="sj0213xuan01_副本.jpg" border="0" hspace="0" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201511/insimg/8c21f2e9-490e-4a10-b5be-359d731bbccf.jpg" width="600" height="75"//ppstrongspan style="COLOR: rgb(0,0,0)"“复合/纳米材料的形貌及粒度表征”网络主题研讨会/span/strong/ppbr/strongspan style="COLOR: rgb(0,0,0)"会议时间：2015年12月9日 14:00-17:00/span/strong/ppbr/报告日程：/ppbr/span style="COLOR: rgb(112,48,160)"strong报告一：纳米材料的形貌和粒度分析方法及应用/strong/span/ppbr/报告人：朱永法/ppbr/清华大学化学系教授、博导，分析化学研究所副所长,国家电子能谱中心副主任。从事半导体薄膜材料的表面物理化学、纳米材料的合成与性能、环境催化以及光催化的研究工作。/ppbr/报告概要：/ppbr/主要讲述了纳米材料最常用的三种形貌分析方法的原理和应用特点以及粒度分析的方法和在纳米材料研究方面的应用实例。目前最常用的形貌分析方法是扫描电子显微镜、透射电子显微镜和原子力显微镜。扫描电镜视场广，样品制备简单，不会产生信息失真，可以观察形貌以及实现颗粒大小的分布统计。透射电镜可以观察纳米材料的形貌和颗粒大小，但视野范围小，样品制备过程容易产生大颗粒的丢失现象，但可以区分聚集态和一次粒子的信息。原子力显微镜可以观察薄膜的颗粒大小，也可以观察分散态的纳米材料的形貌及大小。此外，还可以测量颗粒的厚度以及薄膜的粗糙度分布。激光粒度仪是测量颗粒大小常用的方法，但无法观察纳米材料的形貌，是一种统计颗粒直径分布，容易失真。此外，很多纳米材料分散在溶液中，可能是水合方式存在，获得的是水合颗粒大小的分布，并不是真实的材料颗粒大小，但可以获得粒度分布的信息。此外，通过XRD和拉曼光谱还可以获得纳米材料晶粒大小的数据。/ppbr/span style="COLOR: rgb(112,48,160)"strong报告二：基于PeakForce Tapping模式的纳米材料表征/strong/span/ppbr/报告人： 孙昊/ppbr/布鲁克中国北方区客户服务主管/ppbr/报告提纲：/ppbr/PeakForce Tapping是由Bruker公司发明的一种新的基本成像模式。与传统的Contact、Tapping模式相比，PeakForce Tapping具有探针-样品作用力小、能够自动优化反馈回路、能够进行定量力学成像等优点。基于PeakForce Tapping模式，Bruker公司发展了一系列扩展成像技术，如智能成像（ScanAsyst），它可以轻易实现绝大部分常见样品的扫描参数自动优化，使刚入门的客户也能非常容易地得到专家级的图像；定量纳米力学成像（PeakForce QNM）可以在扫描形貌的同时实时定量地分析出样品的模量与粘滞力，为纳米力学测量带来了革新；峰值力表面电势测量（PFKPFM）与峰值力导电性测量（PFTUNA）使得在软样品表面同时的电学和力学测量成为可能。在这个Webinar中，我们将介绍基于PeakForce Tapping的一系列新的成像技术在纳米表征中的应用。/ppbr/span style="COLOR: rgb(112,48,160)"strong报告三：纳米材料的粒度表征/strong/span/ppbr/报告人：方瑛/ppbr/HORIBA 应用工程师/ppbr/报告概要：/ppbr/颗粒的尺寸会影响纳米材料的各种性能，而溶液的电位则会影响纳米乳液的稳定性。纳米颗粒分析仪可以表征纳米颗粒的粒径和电位，报告会介绍粒径和Zeta电位的测试原理，重点会介绍颗粒分析在纳米材料中的应用。/ppbr/span style="COLOR: rgb(112,48,160)"strong报告四：尺度表征用纳米标准样品/strong/span/ppbr/报告人：刘忍肖/ppbr/博士，高级工程师，国家纳米科学中心/中科院纳米标准与检测重点实验室，主要工作领域为纳米技术标准化，承担了十余项纳米技术标准制修订、纳米标准物质/标准样品的研制工作；从事与纳米技术相关的标准化科研工作，参与两项国家重大科学研究计划项目和一项质检公益性行业科研专项，承担国家自然科学基金和北京市自然科学基金项目。/ppbr/报告提纲：/ppbr/纳米标准样品概况；尺度表征用纳米标准样品；示例：粒度、台阶高度纳米标准样品。/ppbr/报名条件：仪器信息网个人用户，自助报名当天参会。br/br/span style="COLOR: rgb(255,0,0)"strong报名方式：扫描下方二维码或点击链接。/strong/spanbr/br/img title="12-9纳米材料研讨会.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201511/insimg/3c15c368-57fd-486a-a4ab-b1df6999103e.jpg"/br/br/仪器信息网“复合/纳米材料的形貌及粒度表征”网络主题研讨会/ppbr/a title="“纳米材料的形貌及粒度表征应用技术”网络主题研讨会" href="http://www.instrument.com.cn/webinar/Meeting/subjectInsidePage/1749" target="_blank"http://www.instrument.com.cn/webinar/Meeting/subjectInsidePage/1749/a/p

什么是磁珠?磁珠是利用一定的组织包裹四氧化三铁核而形成的可以被磁铁吸附的同时有通过表面被包物吸附（结合）目标物质的小珠子。之所以它神奇，是因为它的用途很多！具体有哪些呢？01 细胞分离在磁性纳米颗粒表面接上具有生物活性的吸附剂或其它配基如抗体、外源凝结素等，利用它们与目标细胞的特异性结合，借助外磁场的作用，可以很方便、快速的对细胞进行分离分类。与常用的细胞分离方法相比，具有简单、快捷、高效和安全等特点。下图是磁性纳米颗粒分离细胞原理的示意图。02 免疫分析免疫分析在现代生物分析技术中是一种重要的方法，它对蛋白质、抗原、抗体及细胞的定量分析发挥着巨大作用。高分子磁性纳米颗粒用于免疫分析，其原理是在高分子磁性纳米颗粒表面接枝定向吸附于细菌的抗体，并利用它与原液混合、沉降，在磁场作用下分离、提纯，得到吸附于高分子磁性纳米颗粒上的活细菌。高分子磁性纳米颗粒可偶联抗体分离带特定抗原的免疫细胞，利用高分子磁性纳米颗粒结合的抗原或抗体进行免疫分析，具有特异性高、分离快、重现性好等特点。这一方法已应用于一些免疫学功能检测中，例如人体器官移植前的人的主要组织相容性复合物分型，可将与不同抗原对应的抗体偶联于高分子磁性纳米颗粒上，分离相应的细胞，然后作微量细胞毒试验，以进行分型及交叉配型。此外，将高分子磁性纳米颗粒与针对不同细胞亚型标志抗原的抗体偶联，富集细胞后观察计数，即可得知外周血中各型细胞的比例。03 酶的固定化酶具有-COOH、-OH、-NH2等活性官能团，可通过物理吸附、交联、共价偶合、包埋等方式和磁性纳米颗粒结合，具体实施法有吸附交联法、共价结合、共价键偶合法等。磁性生物高分子微球固定化酶能提高酶的生物兼容性和免疫活性、亲疏水性和稳定性易于将酶与底物或产物分离、操作简单易行可利用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，提高固定化酶的催化效率。04 磁控检测在通常的介入治疗过程中，会发生异位栓塞及梗死等现象，并引起严重的并发症，这是临床上急需解决的棘手问题，而使用磁性纳米颗粒载体的介入治疗，在磁控血管内进行栓塞则具有磁控导向、靶位栓塞等优点，为解决以上难题提供了途径。05 靶向药物纳米颗粒的粒径比较小可以通过毛细血管，因而可用磁性纳米材料作为定向载体，在外加的磁性导向系统下，将药物输送到特定的病变部位释放，增强疗效、减少药物对人体正常组织的副作用、具有良好的生物兼容性，即磁靶向给药系统技术。06 基因治疗目前常用病毒载体和脂质体载体，病毒载体存在制备困难，装载外源大小有限制，能诱导宿主免疫反应及潜在的致瘤性等缺点。目前广泛应用的脂质体，具有病毒载体的优点，而没有病毒载体的缺点。但是脂质体的颗粒过大影响了转染效率磁性纳米粒子的出现克服了它们的缺点。磁性四氧化三铁生物纳米颗粒的制作简单直径可达10nm以下，具有非常大的表面能，且具有多个结合位点，因而携带能力优于其他载体，且转染效率也高于目前使用的载体。因此磁性生物纳米颗粒可成为较好的基因载体而应用于基因治疗。本文参考文章名称：功能化高分子磁性纳米颗粒的制备与表征 作者：毕如意

近日，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所研究员张珽团队在《纳微快报》（Nano-Micro Letters）上发表最新研究成果。该研究开发了一种新策略，通过将电纺纤维网络嵌入水凝胶中，从而实现同时具有超薄结构和优异力学性能的复合水凝胶薄膜（ 5 μm）的构建。纤维复合水凝胶提供了广泛的可调模量（从~ 5 kPa 到几十MPa），这与大多数生物组织和器官的模量相匹配。超薄的结构和超柔软特性使电纺纤维复合水凝胶能够无缝附着在各种粗糙表面上，是构建贴附型生物电子器件的理想材料。 纤维复合水凝胶薄膜基于静电纺丝、旋涂和冻融联合技术构建（图1）。通过调控静电纺丝时间、旋涂时间和冻融次数，实现对纤维复合水凝胶薄膜理化性质的调控（厚度5微米到毫米；模量几千帕到几十兆帕）。例如，增加纺丝时间可显著提高纤维复合水凝胶薄膜的力学性能；提高旋涂速率，有利于降低纤维复合水凝胶薄膜的厚度；增加冻融次数，可提高水凝胶自身的模量。纤维复合水凝胶具有优异的力学强度，一片厚度仅为7微米水凝胶薄膜可轻松托起20g重量的物体。此外，包埋的纤维网络可有效抑制应力集中导致的裂纹扩增，赋予纤维复合水凝胶薄膜优异的抗撕裂性能（图2）。图1 纤维复合水凝胶设计和制备      图2 纤维复合水凝胶薄膜力学性能     常规的水凝胶材料具有容易失水的缺点，长期暴露于空气中时，由于体系水分的蒸发从而使水凝胶体系失效。该研究通过在纤维复合水凝胶体系中掺入甘油作为保水剂，使复合水凝胶体系具有优异的抗失水性能。暴露于空气中七天后，仍具备优异的柔性。此外，为了改善纤维复合水凝胶的导电性，甘油/NaCl体系使纤维复合水凝胶在空气中维持长期的高导电性能（图3）。      图3 纤维复合水凝胶薄膜抗失水性能 得益于纤维复合水凝胶薄膜超软和超薄的特性，其可实现对各种不同粗糙表面的无缝贴附，其广泛可调的力学性能几乎可实现对所有生物软组织（如脑、肝脏、心脏、肺和皮肤）模量的完美匹配，可伴随组织产生形变而不损伤组织，是构建柔性生物电子器件的理想材料（图4）。 图4 纤维复合水凝胶薄膜的柔性和贴附性能      基于甘油/NaCl体系的纤维复合水凝胶构建的贴附型生物电极具有比商业凝胶电极更加优异的信噪比和长期使用性能。商用凝胶电极长期（48h）暴露于空气中会由于失水从而丧失性能，甘油/NaCl体系的纤维复合水凝胶电极在7天后仍旧保持良好信噪比，可实现对人体肌电信号的采集。甘油/NaCl体系的纤维复合水凝胶电极用于检测人体肌电信号，可实现对不同运动姿势和不同运动强度肌肉电信号的监测（图5）。     图5 纤维复合水凝胶电极用于人体肌电信号监测 研究人员通过将电纺纤维网络包埋于水凝胶，开发了一种制备超软、超薄、力学增强复合水凝胶的新策略。该工作为超薄柔性生物电子提供了新颖的设计和构建思路。