黏弹表征

沃特世将通过新型UPLC和UPLC-MS分析工作流程为蛋白糖基分析带来革命性转变 新型RapiFluor-MS标记试剂和样品制备方案将极大提升对蛋白N-糖进行分析和表征的速度、灵敏度以及简便性 华盛顿特区，2015年1月27日 – 沃特世（Waters?）公司（纽约证券交易所代码：WAT）今日隆重发布用于糖蛋白表征分析的开创性新技术。此技术将在WCBP 2015大会上介绍给公众，其内容包括新型GlycoWorks?RapiFluor-MS N-糖分析试剂盒、Waters?ACQUITY UPLC?、ACQUITY? UPLC FLR检测器和ACQUITY QDa?检测器，它们将帮助科学家们准确分析游离N-糖，使分析速度、灵敏度和简便性提升到更高水平，为科学家们提供前所未有的详细结构信息。 此项新型技术系列能够实现快速糖基释放和标记，可将工作流程中的样品制备时间从一天缩短至一小时以内；使表征和研发分析中的质谱检测灵敏度提升至当前方法的100至1000倍；还可为常规实验室提供简便可靠的方案支持，即使没有MS专家，也能顺利完成分析。“我们今天推出的新型技术为蛋白糖基分析带来了开创性的分析方法，它的出现意味着科学家们将能够对游离N-糖进行前所未有的监测和表征分析，”沃特世消耗品业务部门副总裁Mike Yelle说道，“这些全新的工作流程承担了过去专业且复杂的操作，实现了流程一体化，使科学家们和实验室在成功的道路上更近一步。” 大部分的生物治疗性蛋白质都是糖蛋白，且这些蛋白质上的特异性多聚糖群体是关键的品质属性，可对其功能、稳定性和治疗安全性概况产生影响。提交至监管机构的新药申报材料中必须包含其所含糖基侧链的详细结构信息，以及能够证明这些糖蛋白能够在生产过程中保持糖型谱图一致的信息。 支持糖蛋白工艺开发、监测和批量放行 对于从事生物治疗药物工艺开发、监测或批量放行研究的科学家们而言，全新的RapiFluor-MS标记技术与沃特世ACQUITY UPLC H-Class系统和QDa检测器的完美结合将开创游离N-糖谱图监测的新时代。沃特世所提供的试剂和方案在速度和灵敏度方面都具有非常突出的优势，将为用户带来更加简便的常规MS分析，ACQUITY QDa检测器可生成前所未有的详细信息，分析人员通过这些质量数数据即可轻松确认糖型。科学家们无需再依靠质谱专家和高分辨率的LC-MS仪器，即可对糖型分析进行方法开发、转换和执行过程中频频出现的问题作出确切的解答。此套工作流程可帮助生物制药组织更轻松地诊断问题、加快决策制定，更快速地将实验室中的分子变成药物推向临床领域。 对使用荧光检测技术的分析人员而言，将此款新型试剂盒与ACQUITY UPLC和ACQUITY UPLC FLR检测器联用时，样品制备时间可从一天缩短至一小时以内，同时荧光灵敏度也将得到有效提高。 支持蛋白糖基表征分析 蛋白糖基表征包括对连接到糖蛋白的所有多聚糖（无论其浓度有多低）进行鉴别，以及对这些多聚糖的分子结构进行确证。要高效地完成这项工作，需要UPLC-MS-MS仪器能够应对分析中的各项难题。 沃特世UNIFI?蛋白糖基分析应用解决方案于2013年推出，是更广泛的沃特世UNIFI生物制药平台解决方案的一部分，它配有高分辨率的UPLC/QTof-MS系统，可对生物制药研发实验室中以及受高度监管的后期开发和QC组织中的蛋白糖基侧链进行定性和监测。 现在，凭借RapiFluor-MS标记提供的高灵敏度，研究人员将获得更大的光谱和质谱响应值，这将有力促进低含量峰的准确质量数确认，提高MS/MS多聚糖碎裂性能，实现确定性更高的糖型指认。 此外，我们还推出了RapiFluor-MS葡聚糖校准曲线标准品和多聚糖性能测试标准品（基于混合IgG），用以支持系统性能的基准测试和执行基于葡聚糖单元数(GU)的蛋白游离糖基分析研究。沃特世公司率先将基于GU的葡聚糖校准曲线标准品保留时间归一化方法实现了商业化，此方法最初由来自爱尔兰国家生物工艺研究培训所(NIBRT)的Pauline Rudd教授提出。这种基于GU的方法使多聚糖的分析更加稳定，可以更轻松地在仪器之间和实验室之间实现UPLC-MS检测分析的转换。沃特世正在与Rudd教授及其在NIBRT的团队合作，开发全新的GU数据库，期望能够促进GU和GU+准确质量数多聚糖分配，这项工作将作为联合海报的主题于本年度的WCBP会议上展示。 更多信息： 有关GlycoWorksRapiFluor-MS N-多聚糖试剂盒的更多信息，请访问www.waters.com/glycans。 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司通过提供实用、可持续的创新，使全球范围内的医疗服务、环境管理、食品安全、水质监测、消费品和高附加值化学品领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。 2014年沃特世拥有19.9亿美元的收入，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 ### Waters、RapiFluor-MS、ACQUITY、ACQUITY UPLC、UNIFI、QDa和UPLC是沃特世公司的商标。

市场调研机构Research and Markets发布报告称：全球蛋白质表征和鉴定的市场容量在2014年达到了15.69亿美元，预计年复合年增长率为10.63%，到2019年将达到26.0028亿美元。该市场容量的计算包含了色谱、电泳、质谱仪器，及相关的耗材和服务。　　蛋白质鉴定仪器和耗材在生命科学、临床诊断、药物发现和开发等多个领域都有应用，它们广泛的用于生物标记物的鉴定和生物药品的表征。其中药物发现和开发是2014年蛋白质鉴定仪器和耗材最大的应用市场之一。　　蛋白质表征和鉴定仪器的终端用户主要集中于学术研究所、生物技术和制药公司、科技开发服务企业。　　蛋白质表征和鉴定仪器、耗材的重要供应商有：安捷伦、伯乐、布鲁克、丹纳赫、GE医疗、珀金埃尔默、岛津、西格玛奥德里奇、赛默飞、沃特世等。

蛋白表征生物大分子药蛋白质是由不同氨基酸连接形成的多聚体，并且通过正确折叠为一个特定构型，发挥蛋白药物的生物学功能。氨基酸序列的特定位置可以与化学基团共价结合，发生蛋白质翻译后修饰，这些翻译后修饰会导致蛋白的结构发生改变，从而影响蛋白药物的生物学活性，所以需要对蛋白的分子量、肽段覆盖率、翻译后修饰等进行检测。精确分子量分析：分子量的检测是鉴定蛋白的第一步，使用高分辨率质谱分析可得到蛋白质的多电荷信号，通过对信号进行去卷积分析，可获得精确分子量数值，并初步判断蛋白的修饰状态。对于抗体药物还可打开轻重链或者去除糖基，分别分析糖基化和去糖基化轻链和重链的分子量。我们推荐THERMO高分辨质谱来进行：Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL 是离子阱和轨道阱高分辨组合质谱仪，通过强大的功能、稳定性以及低运行成本成为蛋白质组学和代谢组学研究的最佳选择，完全超过并替代 Q-TOF系统。通过高分辨、精确质量数测量和多级碎片解析，完成复杂体系成份鉴定和表征。LTQ-Orbitrap XL采用全新HCD八极碰撞反应池，实现信息更丰富的MS/MS应用，包括蛋白质差异定量分析iTRAQ、PTM分析、de novo 序列分析以及代谢组学研究。Thermo Scientific&trade Q Exactive&trade 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物。 本台式 LC-MS/MS 系统将四极杆母离子选择性与高分辨率和准确质量数（HRAM）Orbitrap 检测相结合，提供出色性能和多功能性。 Q Exactive 质谱仪特别适用于非目标或目标化合物筛查，也能够实现广泛的定性和定量应用，可广泛用于药物发现、蛋白质组学、环境和食品安全、临床研究和法医毒理学。2.肽段覆盖率及肽段分析：肽段覆盖率是指检测到的肽段氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例。蛋白质肽段覆盖率的检测，对于蛋白质类药物的一级氨基酸序列的确证，保证蛋白质类药物的高级结构形成及维持蛋白质类药物性质均具有很重要的意义。3.二硫键分析：二硫键是蛋白质通过各种链间和链内的半胱氨酸连接在一起的化学键，对蛋白质分子保持正确的高级结构，维持必要的生物活性至关重要。所以在蛋白质类药物的结构分析中，二硫键一直是分析的重点。4.N-糖糖型分析：N糖（聚糖与天冬酰胺的氮链相连）是生物药物中，尤其是单抗药物中最广为人知的糖基化形式，其中N-聚糖结构会影响药代动力学、药效学和免疫原性，因此需要对糖型进行分析。另外，抗体结构分析还可以用到毛细管电泳系统，我们推荐BECKMAN PA800 PLUScIEF法测定单抗药物等电点 使用CE(毛细管电泳仪)对样品与已知等电点多肽作为参照物进行cIEF等点聚焦，依据样品与参照肽段的相对迁移时间计算样品的等电点。 cIEF 法测定单抗样品电荷异质体纯度 使用CE(毛细管电泳仪)对样品进行cIEF等点聚焦，而后对主峰纯度进行积分，得出样品电荷异质体纯度。 CE-SDS 法测定单克隆抗体纯度 将样品还原后，使用SDS毛细管电泳电泳与紫外检测器分析，检验轻链或重链的纯度及杂质含量。

近日，连化物所生物分子结构表征新方法研究组（1822组）王方军研究员、刘哲益副研究员团队与西南交通大学封顺教授团队合作，利用我所自主搭建的高能紫外激光解离—串联质谱仪器，揭示了质子化氨基酸侧链的正电荷在电喷雾离子化过程中影响蛋白质结构的分子机制，为质谱精确表征蛋白质高级结构提供了参考。非变性质谱（nMS）是研究蛋白质及其复合物组成和高级结构的前沿质谱技术。在nMS分析中采用生物兼容溶液和非变性电喷雾离子化将蛋白质从液相转移至气相并保持高级结构和相互作用。然而带正电荷的质子化氨基酸侧链在失去水分子的溶剂化稳定作用后，会与空间接近的蛋白骨架羰基形成氢键，通过分子内溶剂化稳定侧链正电荷。虽然有报道通过离子迁移—质谱检测到了分子内溶剂化引起的蛋白质碰撞截面积变化，但是对其发生的具体位点和引起结构变化的区域仍然缺乏有效分析手段进行精确表征。在本工作中，研究团队利用我所自主搭建的高能紫外激光解离—串联质谱仪器和蛋白质光解离质谱数据处理软件系统，通过蛋白质紫外光解离碎片离子的价态分布和位点解离碎片产率分析，探测到肌红蛋白带电残基侧链分子内溶剂化的具体位点，以及对蛋白质结构影响的区域位置。团队系统表征了不同价态（质子化数目）下的蛋白质结构差异，发现高电荷价态下蛋白质气相结构易受分子内溶剂化效应的影响而偏离溶液态结构，低电荷蛋白质离子的气相结构更加接近溶液状态。研究团队进一步证明，冠醚18C6与蛋白质带电侧链的络合主要发生在溶液中，随后在电喷雾离子化过程中起到稳定蛋白质结构的作用。紫外激光解离质谱分析揭示冠醚主要结合在蛋白质离子的高电荷密度区域，通过阻断带电侧链的分子内溶剂化使蛋白质气相结构更加接近溶液状态。相关研究结果展示了高能紫外激光解离质谱在同时获取蛋白质序列和动态结构信息中的显著优势，为nMS表征中蛋白质溶液结构的保持和高效表征提供了重要的理论和技术参考。近年来，我所王方军和肖春雷研究员通过交叉学科联合创新攻关，在大连相干光源搭建了高能紫外激光解离—串联质谱实验线站，兼容50-150nm极紫外自由电子激光和193nm准分子激光解离模式，已在多肽（Anal. Chim. Acta，2021）、蛋白质（Cell Chem. Biol.，2022）、金属团簇（J. Phys. Chem. Lett.，2020；Sci. China Chem，2022）等大分子体系的解离和结构表征中取得了系列研究成果。相关研究成果以“Ultraviolet Photodissociation Reveals the Molecular Mechanism of Crown Ether Microsolvation Effect on the Gas-Phase Native-like Protein Structure”为题，于近日发表在《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society）上。该工作的共同第一作者是我所1822组联合培养硕士研究生周伶强和刘哲益。

p style="text-indent: 2em "RedShift™ BioAnalytics公司推出了一款新型蛋白质表征平台——AQS3® PRO，这一平台结合了强大的、高度集成的自动化生物分析软件，为生物医疗行业带来了高灵敏度的光谱分析。/pp style="text-indent: 2em "用户通过这一平台可以观察浓度范围在0.1至200 mg/mL的蛋白质二级结构变化，并能进行集成性、可量化、稳定的结构检测和相似性检测，为用药的安全性和有效性提供重要支撑。它能够提供多种属性的测量，减少甚至消除了使用不同工具进行各种单一属性测量的需要。此外，AQS3pro还具有先进的自动化多样本分析功能，大大简化了生物医疗产业的分析工作流程。/pp style="text-indent: 2em "RedShift™ BioAnalytics公司的首席技术官Eugene Ma表示：“ AQS3prois是生物物理表征领域的一项重大进展——将红外光谱应用在生物医疗领域的诊断分析上。这一平台是我们内部一流研发团队与大量行业专家、学术专家倾力合作的结晶。其检测的准确性、重复性和重现性已在数百个样本中得到验证，这些样本包含有数千种尺寸量度的蛋白质。有力的数据支撑和合作伙伴的热情增强了我们对AQS3Pro的信心，我们相信这一成果具有相当大的产业化价值。”/pp style="text-indent: 2em "AQS3Pro新系统使用了RedShift™ BioAnalytics公司的微流控调制光谱学（MMS）专利技术，这一技术将针对微流体的中红外激光光谱分析与先进的信号处理相结合，对蛋白质的二级结构进行测量。它能够在0.01至200mg/mL的浓度范围内对蛋白质直接进行无需标记的测量，在生物医药研发和制造过程经常遇到的各种条件下，无需样品稀释，就可以进行样品表征。其检测是高度自动化的，其多样品检测功能、便捷化操作设置和最先进的生物分析软件进一步提升了检测流程的效率。创新而灵活的分析套件也使得光谱数据的常规分析高度自动化，其先进的检测分析工具能够方便地获得样品的结构性变化，并对这些变化的影响进行深入分析。/pp style="text-indent: 2em "“我与RedShift™ BioAnalytics一直在AQS3PRO的验证性测试中合作。”美国特拉华大学的Christopher Roberts教授说， “这一平台将MMS和红外光谱应用在蛋白质溶液的分析中，让我们能够对多种样本、多种浓度范围蛋白质的二次结构性变化，进行同时的原位量化测量。无论是对从事蛋白质基础性研究的科学家，还是负责生物产品开发的工程师，AQS3PRO都将带来极大的助益。”/p

2021年，《高分子学报》邀请了国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写从基本原理出发的高分子现代表征方法综述并上线了虚拟专辑。仪器信息网在获《高分子学报》副主编胡文兵老师授权后，也将上线同名专题并转载专题文章，帮助广大研究生和年轻学者了解、学习并提升高分子表征技术。在此，向胡文兵老师和组织及参与撰写的各位专家学者表示感谢。更多专题内容详见：高分子表征技术专题高分子表征技术专题前言孔子曰：“工欲善其事，必先利其器”。我们要做好高分子的科学研究工作，掌握基本的表征方法必不可少。每一位学者在自己的学术成长历程中，都或多或少地有幸获得过学术界前辈在实验表征方法方面的宝贵指导！随着科学技术的高速发展，传统的高分子实验表征方法及其应用也取得了长足的进步。目前，中国的高分子学术论文数已经位居世界领先地位，但国内关于高分子现代表征方法方面的系统知识介绍较为缺乏。为此，《高分子学报》主编张希教授委托副主编王笃金研究员和胡文兵教授，组织系列从基本原理出发的高分子现代表征方法综述，邀请国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写。每篇综述涵盖基本原理、实验技巧和典型应用三个方面，旨在给广大研究生和年轻学者提供做好高分子表征工作所必须掌握的基础知识训练。我们的邀请获得了本领域专家学者的热情反馈和大力支持，借此机会特表感谢！从2021年第3期开始，以上文章将陆续在《高分子学报》发表，并在网站上发布虚拟专辑，以方便大家浏览阅读.期待这一系列的现代表征方法综述能成为高分子科学知识大厦的奠基石，支撑年轻高分子学者的茁壮成长！也期待未来有更多的学术界同行一起加入到这一工作中来.高分子表征技术的发展推动了我国高分子学科的持续进步，为提升我国高分子研究的国际地位作出了贡献.借此虚拟专辑出版之际，让我们表达对高分子物理和表征学界的老一辈科学家的崇高敬意！基于原子力显微镜的单分子力谱技术在高分子表征中的应用ApplicationofAtomicForceMicroscopy(AFM)-basedSingle-moleculeForceSpectroscopy(SMFS)inPolymerCharacterization作者：张薇，侯矍，李楠，张文科作者机构：吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室,长春,130012作者简介：张文科，男，1973年生.分别于1997、2002年在吉林大学化学系(学院)获得学士、博士学位，导师为张希教授；2001~2002年于德国慕尼黑大学(LMU)博士联合培养，导师为HermannE.Gaub教授；2003~2007年于英国诺丁汉大学从事博士后研究.2007年6月至今，吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室教授.2011年入选教育部“新世纪优秀人才支持计划”；2015年获得国家杰出青年基金资助.以原子力显微镜及磁镊等技术，从单个分子水平开展超分子作用力及大分子组装结构与组装过程研究，主要研究方向包括：单分子力谱与超分子组装、高分子结晶及力致熔融、核酸-蛋白相互作用、聚合物力化学等.摘要基于原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,AFM)的单分子力谱技术以其操作简便、适用面广等优势，成为了单分子领域应用最为广泛的技术之一.本文阐述了该技术的基础原理与实验技巧，包括仪器构造、工作原理、探针与基底的选择、样品固定、实验操作、单分子信号的获得以及数据处理.介绍了基于AFM的单分子力谱技术在合成高分子及生物大分子表征中的典型应用及前沿进展.AFM单分子力谱技术将有助于建立合成高分子的链结构、链组成与单链弹性以及链间相互作用与其宏观力学性能间的关联，帮助理解生物大分子的结构、相互作用与其生物功能之间的联系.AbstractAtomicforcemicroscopy(AFM)-basedsingle-moleculeforcespectroscopy(SMFS)hasbeenusedwidelyintheinvestigationofmolecularforcesbecauseofitsfriendlyuserinterface(e.g.,easytooperateandcanworkinliquid,airandhighvacuumphase)andworldwidecommercialization.ThisreviewisaimedtointroducetheprincipleandprotocolofAFM-basedSMFSincludingthesetup,theworkingprinciple,typicalcurves,thechoiceofAFMtipandsubstrate,immobilizationofsamples,manipulationofthedevice,empiricalcriteriaforsingle-moleculestretchinganddataanalysis.RecentprogressesontheapplicationofAFM-basedSMFSinthecharacterizationofsyntheticpolymersandbiopolymerswerereviewed.Forsyntheticpolymers,theeffectsofprimarychemicalcompositions,sidegroups,tacticityandsolventsonthesinglechainelasticitieswerediscussed.TheapplicationsofAFM-SMFSindisclosingthestructureofunknownmolecule,polymer-interfaceinteractionsandpolymerinteractionsinpolymerassemblies(e.g.,polymersinglecrystal)wereintroduced.Inaddition,thenatureofmechanochemicalreactionsandcharacterizationofsupramolecularpolymerswererealizedviathistechnic.Forbiopolymers,theeffectsofbase-pairnumber,theforce-loadingmode(unzippingorshearing)onthestabilityofshortdouble-strandedDNA(dsDNA)werereviewed.Accordingtothisknowledge,thesingle-moleculecut-and-pastebasedDNAassemblywasthendiscussed.ThetypicalforcefingerprintsoflongdsDNA,proteinsandpolysaccharidesaswellastheforce-fingerprint-basedinvestigationofmolecularinteractionswereillustrated.Finally,theapplicationofAFM-SMFSinrevealingtheintermolecularinteractionsandthemechanismofvirusdisassemblyaswellastheantivirusmechanismoftanninintobaccomosaicviruswerereviewed.Therefore,AFM-basedSMFSisessentialforrevealingtherelationshipbetweentheconformation/compositionofpolymerchainsandmicro/macro-mechanicalpropertiesofpolymermaterialsaswellascorrelatingthemolecularstructure/interactionofbiopolymerswiththeirbiofunctions.关键词AFM单分子力谱  合成高分子  生物大分子KeywordsAtomicforcemicroscopy-basedsingle-moleculeforcespectroscopy  Syntheticpolymers  Biopolymers 合成高分子材料自诞生以来，迅速地以其优良的物理、化学及力学性能等在军事、航空航天、医疗及其他民用领域得到了广泛应用.其力学性能是最基本、最重要的性质之一，同时受到高分子的单链弹性及链间相互作用的影响[1,2].因此，建立高分子链一级结构、单链弹性及链间相互作用与材料宏观力学性能间的联系,对高分子材料的理性设计至关重要.然而，传统的材料学研究方法，如宏观拉伸实验、X射线晶体衍射、固体核磁及拉曼等技术无论从样品制备到检测均涉及大量分子，体现平均效应，表征宏观力学性能，无法获得单个链或键的性质及行为的相关信息.此外，传统研究方法也无法连续、动态及精确地体现出单个事件的不同步骤(例如高分子在不良溶剂中的塌缩行为)，导致很多重要信息无法获取.因此，可在纳米尺度精确操纵与测量的单分子技术，例如基于AFM的单分子力谱，被广泛应用于单个分子的结构、功能及其动态行为的研究中[1~5].利用该技术，人们获得了溶剂、取代基以及立构规整度等因素对高分子单链弹性的影响，验证并改进了一些经典高分子理论模型[1,6~9].该技术还可以研究高分子的构象变化及其在界面的吸附行为，揭示外力诱导下高分子链中化学键类型的变化规律(力化学)[1,10~12].同时，该技术还被用于凝聚态(晶体、层层组装薄膜等)中高分子间相互作用的相关研究[13,14].生物大分子(核酸、蛋白质及多糖等)结构与功能的研究对于认识复杂生命过程的本质，了解疾病的发生发展机制以及开发新型药物与生物医用材料至关重要.因此，AFM单分子力谱技术也被广泛用来研究生物大分子，例如DNA的解链及动态结构变化、蛋白质的折叠与解折叠、生物大分子间的相互作用(病毒的遗传物质与蛋白质外壳的相互作用)等[9,15~20].相关研究深化了人们对这些生物分子所参与的生命过程的认识，并为其功能调控奠定了坚实基础.本文将重点评述AFM单分子力谱技术的基础原理、实验技巧以及该技术在合成高分子及天然高分子领域的典型应用及前沿进展.1单分子力谱的基础原理1.1几种典型的单分子力谱技术迄今为止，诞生了许多单分子操纵技术，例如生物膜力学探测技术、玻璃纤维技术、光学镊子(光镊)、磁性珠技术(磁镊)以及AFM单分子力谱技术[9,21~25].后3种技术的应用较为广泛.光镊利用聚焦激光束产生辐射压力形成的光学陷阱来捕获修饰有样品分子的小球，通过移动激光光束控制小球的移动，实现对样品分子的三维操纵，其时间分辨力能够达到10-4s，被广泛应用于蛋白质折叠及解折叠等研究.但光镊系统构造复杂，对环境要求极高，有效样品捕获率低以及激光束容易对样品造成光和热损伤等不足亟待解决.磁镊技术将样品固定在基底与超顺磁性小球之间，利用外加磁场控制磁球，操纵样品分子，例如旋转等[22].因此，磁镊被广泛用于DNA缠绕及解缠绕等研究中.该技术可以检测低至10-3pN的力值，也被应用于一些极微小力的测量.该技术还能同时对多个磁球进行操纵，实现高通量测试.由于需要通过成像观测磁珠，因而相机的拍摄速度决定了磁镊的时间分辨率，通常在10-2s以上.在众多的单分子力谱技术中，AFM单分子力谱技术的应用最广，理论发展更为成熟[1~5,9,26,27].该技术将样品分子固定在AFM探针与基底之间，通过控制AFM探针的位移来操纵样品分子.该技术具有较高的时间和空间分辨率，较宽的力学测量范围，可以在真空、水相以及有机相等多种环境下工作，因此被广泛地应用于合成与天然高分子等众多体系中的分子内及分子间相互作用的研究.综上所述，光镊及磁镊的力学精度稍高，适用于由弱相互作用及熵弹性所控制的力学性质的研究；AFM单分子力谱更适合较强相互作用或者由焓控制的弹性性质的研究.为了更全面地认识聚合物的结构与力学性质，可以将上述3种单分子力谱技术联合使用.1.2AFM单分子力谱1.2.1仪器构造基于AFM的单分子力谱是AFM的工作模式之一.因此，其基本构造与AFM相同，主要由位置控制系统(压电陶瓷管)、力学传感系统(AFM探针的微悬臂及其顶端针尖)以及光学检测系统(激光二极管、棱镜、反射镜与四象限光电检测器)三部分组成(图1)[9,21,28,29].对压电陶瓷管两端施加电压，可以控制其驱动样品台或AFM探针进行亚纳米精度的位移.z方向的移动用于调整探针与样品间的距离；x，y方向的移动用以调整探针在样品表面的探测位置及范围.光学检测组件中的激光器将激光照射在微悬臂靠近针尖的一端，再反射到四象限光电检测器上.当AFM探针受到样品分子的牵拉发生弯曲时，其反射的激光的位置也会随之变化.据此，可以计算出微悬臂的偏转量，结合微悬臂的弹性系数，可以获得待测样品分子的相关力学信息[3~5].Fig.1TheschematicdiagramofAFM-SMFS.1.2.2工作原理实验前，样品分子的一端通过物理吸附、特异性相互作用或化学偶联等方法被固定在基底.随后，驱动压电陶瓷管使AFM探针逼近待测样品(图2(a)).如果基底对探针没有长程的吸引或排斥作用，微悬臂将处于松弛状态.探针与基底接触后，受力向微悬臂上表面方向弯曲，引起二极管的2个象限间的差分信号(pha-b)的变化(图2(a)与2(b)，状态2→3).在此过程中，样品分子会通过化学、物理或特异性作用吸附在探针上，在探针与基底之间形成桥联结构.随后，探针远离基底并恢复松弛状态(图2(a)，4)，pha-b也恢复初始数值.探针继续远离基底，桥联于探针与基底间的样品分子受到拉伸，导致微悬臂向针尖方向偏转(图2(a)，5)，引起pha-b的增加(图2(b)，5).最后，桥联结构中稳定性最薄弱的部分发生断裂，微悬臂迅速恢复为不受力的松弛状态(图2(a)，6)，表现为pha-b的突然回落(图2(b)，6)[1,9,21,29].每个完整的逼近-回缩过程都会产生pha-b对应压电陶瓷管位移的原始曲线(图2(b))[29].Fig.2(a)SchematicillustrationofthebasicworkingprincipleofAFM-SMFS (b)Originalvolt-piezodisplacementcurves (c)Typicalforce-extensioncurves.Fig.3ElectronmicroscopyimagesofacommercialSi3N4AFMprobe.Fig.4Molecularimmobilizationbasedon(I)physicalabsorption,(‍Ⅱ)specificbinding,(‍Ⅲ)gold-thiolchemistry,(‍Ⅳ)silanizationandenzymaticbiosynthesis.Fig.5Immobilizationofthiol-labeledDNAbasedonsilanizationandbifunctionalPEG.Fig.6Typicalcurvesobtainedinconstantvelocity(a)andforce-clampmode(b),respectively.原始曲线经过校正才能正成为最终的力-拉伸长度曲线(图2(c))[1,2,4,9,21,29].将具有弹性的微悬臂看成弹簧，根据胡克定律F=kcΔx(kc为微悬臂弹性系数，Δx为微悬臂偏转量)可以计算出微悬臂受到的作用力，即样品分子内或分子间的作用力.kc通过对微悬臂在远离基底时热振动所获得的能量谱的积分即可获得；Δx利用图2(b)中斜线部分(状态2→3)的斜率(s)，即Δx=s-1pha-b就可以计算出.样品分子的拉伸长度通过从原始数据横坐标记录的压电陶瓷管的位移中扣除Δx获得.至此，pha-b对应压电陶瓷管位移的原始曲线被成功地转化为样品分子的力-拉伸长度曲线.1.2.3力曲线及其含义AFM针尖逼近和远离样品表面的一个循环中可以获得2条力曲线，称为逼近力曲线与回缩力曲线(图2(c))[1,2,4,9,21].逼近力曲线上B区域的形状可以给出样品模量等信息.例如：当AFM探针接触较软的样品时，受到的排斥力随位移缓慢增加；而接触硬度较大的样品时，受到的排斥力快速增加，B区域的力信号与水平基线之间形成近90°的直角.对于回缩力曲线，C-D区域可以给出单分子弹性性质、链结构信息以及分子内、分子间相互作用强度等定量信息.2AFM单分子力谱实验技巧2.1探针与基底的选择AFM探针直接影响力学探测的稳定性、精确度及测量范围[1,2,4,9,21,29].其材质通常是硅或氮化硅，由针尖、微悬臂及承载微悬臂的基片组成(图3).针尖通常是四面体形状，最尖端的曲率半径(tipradius)为几个到几十纳米，高度(tipheight)通长为3~28µm.微悬臂有矩形和三角形2种，长度为7~500µm，厚度为0.5~7µm.其材质及几何尺寸均对共振频率和弹性系数有重要影响，需要根据实验体系来选择探针.对于弱相互作用体系(例如双链DNA的解拉链)[30]，应选择相对柔软，即弹性系数小的探针；而强相互作用体系(例如：共价键强度的测量)[31]，则需选择相对坚硬，即弹性系数较大的探针.值得注意的是，刚性较大的探针在应力松弛时其内部储存的能量释放速度更快，更适于研究多重键的连续打开与形成的动态过程，例如聚酰胺(PA66)单晶中聚合物链在受力熔融过程中的黏滑运动(stick-slip)[32].此外，一些公司也生产了许多功能化的AFM探针.例如：满足基于巯基-金的化学分子偶联的镀金AFM探针；为了增加激光束在微悬臂上表面的反射率，只在上表面蒸镀金属涂层(铝或金等)的探针等.然而，只存在于微悬臂上表面的镀层，往往导致其上下表面的膨胀系数产生差异，引起热漂移[33].为了减小该热漂移，有些探针只在其微悬臂的尖端进行有限的金属蒸镀(例如MLCT-BioDC型号探针).如需增加时间分辨率，可以选用超短探针[34].但超短探针的弹性系数通常较大.科研人员曾利用离子束刻蚀的方法将微悬臂做成镂空结构，同时保证了时间分辨率和弹性系数[35].然而，使用较小尺寸微悬臂时，激光容易“漏射”到样品表面，发生反射，与微悬臂表面的反射光产生干涉，导致力曲线出现大幅度波动.为了减少这种干涉效应，通常可以采取以下几种策略：(1)减小汇聚到微悬臂表面的激光光点的大小，从而减小漏光；(2)选用横向尺寸较大的微悬臂，增大反射面积；(3)选择透明基片(例如玻璃片)固定样品，降低基片的反射率；(4)适当增加样品平面相对于微悬臂平面的角度，降低反射光的相干性.AFM探针需要被牢固地固定在夹具上，以减少系统漂移.为了提高微悬臂检测的灵敏度，将激光光斑尽可能地照射在微悬臂的最前端.仪器调试完毕，让整个系统平衡10~30min，使微悬臂上下表面材质差异所引起的界面张力达到平衡，减小系统漂移.如在同一个样品上进行力谱探测的时间较长，且实验前期及后期微悬臂反射到光电检测器中的激光强度(sum值)有较大变化，可以在实验开始及结束时分别校正微悬臂的光学灵敏度及弹性系数.如数值差异较大，则实验前期与后期所得数据分别用初期及实验结束时的校正参数进行转换分析，防止由悬臂弯曲等因素导致激光点位置偏移，进而影响测试结果.AFM单分子力谱实验中常用基底(样品固定用)主要有石英、玻璃、硅片、云母及镀金片等[1,4,9,21,29].硅片较为平整，容易通过物理或化学修饰固定样品，最为常用.玻璃和石英片的平整度不如硅片，但其较好的透光性可以同时进行光学成像和单分子力谱实验.同时，透明基片有助于减小由较大的激光光斑或较小的微悬臂所产生的干涉现象.对于细胞类样品，也可直接在接种了细胞的聚苯乙烯培养皿上进行单分子力谱实验，以弥补玻璃基底细胞黏附率低的不足.含有巯基的样品分子可以选择表面有金镀层的基底.但金镀层反射率较强，当微悬臂较小时，漏到金片表面的激光较多，容易产生干涉现象.除了前述4种消除干涉的策略，还可以通过差减拉伸力曲线与松弛力曲线的方法来扣除干涉条纹[36].总之，要根据体系选择合适的基底.2.2样品固定与偶联成功进行单分子力谱实验的关键环节是样品分子在AFM针尖与基底之间的有效偶联，形成桥联结构，即样品分子的固定.根据相互作用本质的不同，样品固定方式可以分为物理吸附，特异性相互作用以及化学偶联(图4)[1,20].物理吸附主要利用样品分子与基底或针尖间的物理相互作用，例如范德华力、氢键、静电相互作用以及疏水作用力等，吸附样品分子(图4，Ⅰ)[9,21,26,27].通常将待测样品配成稀溶液，滴加到固体基片表面，吸附一定时间后，润洗掉游离及吸附不牢固的分子即可.为了增加单分子探测的几率并减小多分子信号的干扰，可以降低样品溶液浓度、减少吸附时间，以降低样品分子的吸附密度[2,28].对于吸附能力强且分子在溶液中易发生聚集的样品体系，需要配制极稀溶液来实现单分子拉伸探测[41].基于物理吸附的样品，制备虽然操作简便、快速，但由于探针在目标分子上的接触位置无法控制，导致拉伸长度及断裂力值随机分布.其次，物理吸附的作用力通常较弱且不可控，不适用于强作用力体系的研究.但在有些样品体系中，例如：拉伸多糖分子时，物理吸附也可以达到较高的断裂力(如1nN左右)[1,37~41].该现象主要源于样品分子在基底及AFM探针表面的多点物理吸附[1,37,41].此外，当探针以较大的下压力(例如2nN)接触样品分子时，在力诱导下样品分子有可能与AFM探针发生力化学反应，形成共价键，从而增大断裂力[1,37,42].特异性相互作用也经常用于固定样品分子(图4，Ⅱ).该方法专一性强、结合强度确定.其中生物素-链霉亲和素(biotin-streptavidin)系统(亲和常数高达1015mol/L)是最常用的分子对[9,21,26,27,43].此外，谷胱甘肽-谷胱甘肽S转移酶[44]以及镍离子(Ni2+)-氮川三乙酸(NTA)-组氨酸标签(His-tag)[45]的配位作用等也可以用于目标分子的固定.特异性分子对可以通过简单的化学反应被修饰在样品分子的末端或AFM探针、基底的表面，也可以通过基因工程方法被构建在蛋白质类样品的末端.上述分子对的相互作用强度通常在100pN左右，断裂力值高于该数值的体系不能采用特异性相互作用固定样品分子.样品分子还可以通过化学修饰直接固定在AFM探针或基底上(图4，Ⅲ与Ⅳ).化学修饰通过形成共价键固定样品分子.其修饰过程比物理吸附复杂，但形成的共价键较为牢固，断裂力可达纳牛顿(nN)级别，适用的力值测量范围较大.基于金-硫(Au-S)相互作用的化学偶联是常用的化学修饰方法之一(图4，Ⅲ)[21,26,27].该体系需要向待测样品中引入巯基.蛋白质类样品可以通过基因工程方法引入侧链含有巯基的半胱氨酸；核酸或高分子样品，可以通过化学方法在样品合成时直接引入巯基.随后，选用镀金的探针或基底，即可通过Au-S相互作用固定样品.研究表明金表面的氧化还原状态、溶剂的种类(水或乙醇)、反应环境的pH值以及反应时间等均影响目标分子在金表面偶联的稳定性[46].硅烷化是另一种常用的化学偶联方法(图4，Ⅳ)[9,21,26,27].该方法首先利用食人鱼(Piranha)洗液(V(98%H2SO4)∶V(30%H2O2)=7∶3)或者紫外臭氧等方法处理AFM探针或基底，使其表面羟基化.随后利用末端修饰有活性基团(例如氨基、羧基、巯基、环氧基等)的硅烷偶联剂与上述羟基反应形成硅氧键.最后，使探针或基底引入的活性基团与样品分子中相应的官能团反应形成共价键，从而固定样品分子.含有3个可水解基团的硅烷化试剂(例如三甲氧基或三乙氧基硅烷)与羟基反应效率较高.但在少量水存在时，该试剂可以发生分子间缩合，生成低聚硅氧烷，不仅对力谱实验产生干扰，还会增加样品分子的修饰密度，产生多分子信号.为了避免上述现象，可以选用只含有一个可水解基团的硅烷化试剂[46].末端含有氨基的硅烷化试剂在单分子力谱实验中的应用较为广泛.该氨基可以与含有琥珀酰亚胺羟基酯(NHS)的双功能偶联剂进一步反应固定目标分子(图5)[47]，也可以在EDC(DCC)/NHS的催化下与羧基反应形成酰胺键来实现偶联.近年来，研究人员将硅烷化反应与基于酶催化反应的化学偶联结合，固定蛋白质类样品(图4，Ⅳ)[48].该方法利用氨基硅烷化试剂修饰探针或基底，再利用氨基巯基交联剂引入末端含有巯基的桥联蛋白(例如半胱氨酸).桥联蛋白的另一端含有甘氨酸-亮氨酸(GL)，利用可快速催化GL与天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸(NGL)间连接反应的OaAEP1酶，就可将末端含有NGL的蛋白样品固定在基底或探针上.半胱氨酸、GL以及NGL均可以通过基因工程方法引入桥联蛋白及目的蛋白末端.通过共价键固定的样品体系，可以将双官能团偶联剂与惰性(单官能团)分子偶联剂(例如另一个末端是甲基的硅烷化试剂或者硫醇分子)共同修饰到基片表面(图5)[1,49].惰性偶联剂不含与样品分子反应的活性基团，无法连接样品分子，因此可以稀释样品分子，增加单分子信号[3].研究相互作用力的体系，例如受体与配体相互作用，柔性的PEG连接分子通常被引入样品分子与探针或基底之间(图4，Ⅱ)[9,21,27].连接分子主要有以下几种作用：(1)减小样品分子在探针或基底的非特异性吸附；(2)使样品分子构象自由、取向灵活，在相互作用的过程中结合得更加充分；(3)将断裂信号平移到更长的断裂长度，减小非特异性相互作用对目标力信号的干扰.图5给出了基于硅烷偶联剂和带有双官能团PEG的单股DNA共价固定方法.样品分子与AFM针尖的偶联方式决定了实验过程中一些实验参数的设置.依靠物理吸附的体系，探针接触样品表面时需要施加较大的下压力(例如1nN)和较长的停留时间，以增大样品分子在针尖表面吸附的概率及稳定性.利用特异性相互作用或化学反应的偶联，探针接触基底时则需采用尽可能小的下压力和较短的停留时间，避免破坏针尖表面修饰的有限数量的功能基团.此外，对于化学修饰的AFM探针，其表面的功能基团可能随拉伸次数的增加而变化，影响实验效率，因此需要适时更换探针.此外，如果力谱实验中多分子信号频繁出现，可以采取如下策略补救：(1)降低探针作用在样品上的下压力及停留时间，减小样品分子与探针间的作用力；(2)探针远离基底时，首先使探针在z方向小范围移动，使较短的分子率先被拉伸，随后逐渐增加探针的移动范围，使较短的分子先从探针上脱落，在探针与基底间保留单个、较长的分子；(3)采用“飞鱼”模式来获取单分子信号[1]，即控制探针在基底上方一定距离内程序性地靠近-远离基底，而不直接接触，当探针接触到一端固定在基底而另一端自由运动的样品分子并成功偶联后，再对该分子进行拉伸.2.3恒速与恒力模式恒速模式是AFM单分子力谱常用的测量模式(图6(a))[9,21,26,27,29].该模式下，压电陶瓷管控制AFM探针以恒定的速率对样品分子进行拉伸操纵，可以直接探测分子内或分子间作用力的强度、分子链长度等信息.获得的典型力学信号通常有单峰、锯齿峰或平台等.如果样品分子与探针及固体基片间的桥联结构足够稳定，还可以对同一个样品分子进行往复拉伸-松弛操纵，获得分子内或分子间的相互作用以及相应结构的动态破坏与形成过程[50].对于非平衡体系，还可以获得不同拉伸速率下，体系内力的强度随力加载速率变化的相关信息，获得体系解离速率常数及能量转换路径的信息[51].在恒速模式的基础上还发展了ForceMapping方法，即在样品表面选定范围内的不同位点进行恒速拉伸[9,21,27].该方法可以探测样品表面不同区域的黏附力情况，也可以研究细胞膜表面蛋白质的分布情况等.AFM单分子力谱另一种常用模式是恒力模式，也称力钳(force-clamp)模式(图6(b))[52~54].该模式通过力反馈系统精确控制压电陶瓷管的位移，使施加在样品分子上的作用力保持恒定，记录分子链长度随时间的变化过程，被广泛应用于蛋白质解折叠等领域[34].以多聚串联蛋白质解折叠实验为例[34]，先将蛋白质快速拉伸到接近其解折叠力的力值附近，保持外力恒定，一段等待时间后，一个折叠结构在外力作用下打开，释放出一定的长度.此时，探针施加在蛋白质上的力快速下降，仪器反馈系统快速响应，压电陶瓷管再次拉伸蛋白分子到设定力值，维持恒力模式.该过程表现在长度-时间曲线上是长度的突然增加，代表蛋白解折叠所释放的长度.拉伸长度在下一个解折叠事件前保持恒定.随后，其余折叠结构依次打开，最终得到台阶状的长度-时间曲线(图6(b)).从上述曲线中可以获得解折叠路径(包括中间态)及折叠结构寿命的信息(相邻台阶出现的时间间隔).恒力模式还可以研究蛋白质解折叠的逆过程，即折叠过程.将施加在解折叠蛋白分子上的外力突然减小到较低的力值(如十几个皮牛)并保持恒定，就可以原位跟踪蛋白质的动态折叠过程.值得指出的是，为了准确跟踪检测蛋白解折叠等动态结构变化信息，真实描述相关过程，仪器的力学反馈系统需要足够快.2.4单分子信号的指认AFM单分子力谱实验的核心目标是获得单个分子的拉伸信号.因此，指认单分子信号、规避或消除体系中的多分子信号至关重要.单分子信号的指认是一个有挑战性的任务，人们总结了一些半经验性的标准用于单分子信号的指认[1].首先，可以统计体系的信号率，如果信号率较高(10%)，则预示体系内可能存在着一定比例的多分子拉伸[1].随后，可以观察单条力曲线上力信号的个数、形状及力值.通常，单分子拉伸只对应力-拉伸长度曲线上一个单独的峰.如果力曲线上出现多个连续、大小不一的峰或平台，则可能对应着多分子拉伸[49].其次，可以对数据归一化处理[1].同一实验体系中，相同结构与性质的分子受到的拉伸力与被拉伸的长度成正比.据此可以对不同拉伸长度的曲线进行归一化处理(拉伸长度除以完全伸展长度).如果归一化曲线能完好的重合，则证明该批数据均来自单个分子的拉伸操纵.此外，往复拉伸实验中，如果分子链内部不存在高级结构及强相互作用，即使经过多次的拉伸、松弛操纵，单分子的拉伸及松弛力曲线依然可以重合.除了上述方式，还可以利用一些模型拟合力曲线，比较拟合参数(如库恩长度，相关长度或者链段弹性系数等)来甄别单分子数据[1].如果拟合参数相差较大，则证明存在多分子拉伸信号.常用的模型主要有蠕虫链模型(WLC)与自由连接链模型(FJC)[1,2].WLC模型主要用于描述刚性及半刚性高分子.FJC模型中高分子弹性的变化主要来自熵的贡献，主要用于柔性高分子以及刚性高分子低力值区域的单分子力谱数据的拟合.例如：研究人员将相互作用的MUC1多肽与scFv抗体通过PEG连接分子分别修饰在探针与基底上，进行单分子操纵.利用FJC模型拟合数据后，可以准确地区分出1~6个分子对被拉伸时分别对应的力曲线[3,55].此外，已知聚合物的力学指纹谱也可以被用来指认单分子拉伸信号[46].PEG、羧甲基化淀粉以及多聚蛋白质的力学指纹谱是被经常采用的单分子拉伸指示剂.为此，可以将待测分子与已知指纹图谱的分子进行串联(图7)[49].需要注意的是待测体系的力学稳定性要大于内标分子产生力学指纹谱所需的力值.Fig.7Basicstrategytoisolate/identifysinglechain/moleculepairstretching.2.5力谱数据的分析处理单分子力谱数据可以给出的信息包括长度及力值的定量信息.为了更精确地描述这些定量信息，通常需要对大量力学信号进行统计分析[1].常用的统计方法是将所得数据以柱状图形式呈现，进行高斯拟合，得出最可几值.此外，还可以利用自由连接链模型及蠕虫链模型对数据拟合，获得库恩长度、相关长度或者链段弹性系数等信息[1].近年来，这些经典模型不断被修正，应用范围逐渐被拓展[56].例如：FJC模型中了增加参数Ksegment，表征高分子链中每一个链段的弹性，被修正为可伸长的FJC模型(eFJC).该模型中，每一个链段类似弹簧，受力过程中伸长，可以更加精确地描述高分子受力时的弹性行为.为了更好地描述高分子主链的固有弹性，即本征弹性，由量子力学(QM)计算得到的非线性单链焓弹性模量被整合到WLC、FJC及FRC模型中，得到了QM-WLC、QM-FJC与QM-FRC模型[57].在特定情况下，如水环境或真空条件，侧基和环境的非共价相互作用会对高分子链弹性产生影响.为了得到上述情况下高分子主链的弹性，基于两态(two-states)系统的非共价作用动力学被引入，创建了TSQM-WLC、TSQM-FJC及TSQM-FRC模型.上述修正模型能够更加精确地定量高分子链的结构及性质[57].一些非平衡态体系，例如受体配体的解离、力诱导下的转变等，力加载速率会影响力-拉伸长度曲线的形状.因此，可以在较大力加载速率范围内，观察上述非平衡体系的力强度变化，获得动态力学谱[1].之后采用诸如Bell-Evans模型等对其进行拟合，分别可以得到沿着受力方向的结合状态与过渡状态间的距离(xβ)以及体系没有外力作用下的解离常数(Koff).3AFM单分子力谱的典型应用3.1合成高分子体系3.1.1聚合物单链弹性聚合物主链结构对其单分子弹性性质具有重要影响.研究人员利用AFM单分子力谱详细地研究了导电高分子聚苯胺(PANI)在氧化、还原及掺杂状态下的单链弹性性质(图8)[58].实验结果显示这些聚苯胺的力曲线呈现出类似变化规律：力值随着拉伸长度的增加呈单调上升.利用FJC模型拟合上述力曲线，结果表明聚苯胺分子氧化态时刚性最大，掺杂状态时最为柔软.这是不同状态的聚苯胺分子中芳香胺与醌二亚胺的含量不同所导致的.Fig.8Normalizedforce-extensioncurvesofPANIindoped(red),oxidized(blue),andreduced(black)states,respectively(ReprintedwithpermissionfromRef.‍[58] Copyright(2009)AmericanChemicalSociety).除了主链的氧化还原态外，聚合物主链的立构规整性对其弹性也有重要影响(图9)[1,9].在甲苯溶液中拉伸反式-及顺式-聚异戊二烯时，前者在低力值区体现出较大刚性，而后者则表现出明显的熵弹性.FJC模型的拟合也验证了顺式聚异戊二烯较高的熵弹性.这是由于反式聚异戊二烯以伸展的构型存在，而顺式聚异戊二烯则是扭曲构型.相同外力作用下，顺式聚异戊二烯构象数变化较大，熵弹性较大.该研究表明即使反式聚异戊二烯处于溶液中这种高弹态，其熵弹性仍然不如顺式聚异戊二烯强.Fig.9Normalizedforce-extensioncurvesofcis-andtrans-poly(isoprene)intoluene(ReprintedwithpermissionfromRef.[1] Copyright(2003)ElsevierLtd.).AFM单分子力谱还被用于探究高分子侧链结构对其弹性行为的影响[1,2,9,59].聚丙烯酰胺(PAAM)与聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)主链结构一样，前者重复单元侧链只含有2个氢原子，而后者则含有异丙基与氢原子.这种分子结构的差异导致2种高分子的水合能力不同.水溶液中，PAAM在低力值区域表现出明显的熵弹性.PNIPAM由于侧链异丙基体积较大，更加伸展，熵弹性没有PAAM显著，但在高力值区域表现出明显的焓弹性，如图10所示[1,59].Fig.10Normalizedforce-extensioncurvesofPNIPAMandPAAMinwater(ReprintedwithpermissionfromRef.[1] Copyright(2003)ElsevierLtd.).人们又在单分子水平研究了侧链树枝代数对主链重复单元为苯乙烯与马来酸酐的聚合物GnMA-g-BA(n=1,2,3)弹性的影响[60].在四氢呋喃中拉伸时，G2MA-g-BA分子的刚性大于G1MA-g-BA，表明侧链树枝代数的增加使高分子体积变大，导致其刚性增强.然而，侧链树枝代数增加的同时也导致主链周围空间效应的增大，从而减小酰胺侧基与溶剂间的氢键相互作用.因此，在三氯甲烷中实验时，G2MA-g-BA的刚性反而弱于G1MA-g-BA.故考察聚合物侧基对单链弹性的影响时需要注意考虑溶剂化效应.除了聚合物链本身的组成结构会影响其弹性性质外，聚合物所处的环境(如溶剂)也会影响高分子弹性.例如：高分子在良溶剂中通常以无规线团形式存在，而在不良溶剂中则塌缩成小球[6,61,62].研究人员利用AFM单分子力谱研究了聚苯乙烯(PS)链段在不同溶剂中的弹性行为.在环戊烷中拉伸PS分子时，由于环戊烷破坏了间隔苯环之间的π-π堆积，PS本征弹性能够得以体现[63].然而，在不良溶剂中拉伸形成塌缩小球的PS时，则得到了带有平台与单峰的力曲线(图11(a)与11(b)).平台对应着塌缩结构在外力诱导下逐渐被打开的过程，单峰则对应着伸展后的PS分子在外力拉伸下的弹性行为.利用WLC模型模拟上述单峰信号.假设塌缩小球内部的高分子链段是松弛的，则拟合曲线的上部面积代表从塌缩结构变成伸展状态的过程中高分子与溶剂的界面能的增加，即PS的疏水塌缩过程由界面能支配(图11(c))[61].随后，PS纳米粒子的疏水水合自由能与自身尺度间的关联也被深入探究[64].当PS纳米粒子的尺寸1nm时，水分子在其表面重排，体系发生焓变，水合自由能则与其表面积呈线性关系.Fig.11(a)IllustrationofAFM-SMFSstudyoftheglobule-to-coiltransitionofPSinwater (b)Theforce-extensioncurve(red)ofPSwithentropicelasticstretchingportionfitbytheWLCmodel(blue) (c)Thermodynamicrelationshipsbetweenpolymersandfreemonomersinvariousconformationalstates(ReprintedwithpermissionfromRef.[61] Copyright(2012)AmericanChemicalSociety).通过AFM单分子力谱获得的样品弹性性质还可以用于推测其结构，因此研究人员尝试利用该技术探索未知分子.例如：无定形红磷的分子结构无法通过传统的研究方法获得，其结构一直未知.因此，研究人员将红磷吸附在玻璃基底上，利用AFM探针在乙醇中拉伸红磷分子[65].如图12所示，实验获得的力曲线与拉伸链状高分子类似，表明红磷为线性高分子，并且其平均表观链长约为106nm.利用QM-WLC模型进行理论计算后发现，实验获得的红磷拉伸的力曲线与一种“之字形”梯状的拟合曲线高度重合.因此，无定形红磷可能为“之字形”梯状的线形高分子.Fig.12Theforce-extensioncurveofa-redP(solidblackcurve)andtheQM-WLCfittingcurves(dottedlines)ofitspossiblestructures(inset),respectively(ReproducedwithpermissionfromRef.[65] Copyright(2019)ofWiley-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim).3.1.2高分子-界面相互作用高分子在界面的吸附形态对于很多领域(例如界面黏附调控以及层层组装膜构筑等)非常重要，但通常难于表征.AFM单分子力谱被成功用于研究高分子在界面处的吸附形态及解吸附力[1,9].研究表明，高分子在界面处的吸附形态影响着力曲线的形态(图13(a)).例如：通过共价键被修饰在硅基底上的聚二甲基硅氧烷(PDMS)分子，解吸附时产生了带有单峰的力曲线.这表明该分子是以大的“环状”结构(bigloop)或“尾部”结构(tailstructure)吸附在基底.聚四乙烯基吡啶(PVP)在甲醇溶液中通过氢键吸附在氨基修饰的基底上，解吸附时得到了带有锯齿形力信号的力曲线.这意味着PVP分子是以不规则的小的“环状”结构(loopstructure)吸附在基底上，吸附位点较多，力曲线上每一个锯齿峰均对应着环状结构依次从基底上解吸附的过程.然而，当聚乙烯甲酰胺(PVAm)分子通过静电作用力吸附在基底，其解吸附的过程则获得了带有长平台的力曲线.这表明PVAm是以“平躺”形态(train-likestructure)吸附在基底.上述结果表明AFM单分子力谱是研究高分子界面吸附的有效方法.Fig.13(a)Force-extensioncurvepatterns(toprow)andthecorrespondingadsorptionconformations(bottomrow)(ReproducedfromRef.[1]withpermissionofElsevierLtd.) (b)SchematicdrawingofthebreakageofAu-AubondsmeasuredbyAFM-basedSMFS (c)Thestrengthofthiol-goldcontactsonoxidizedandreducedAusurface(ReprintedwithpermissionfromRef.[46] Copyright(2014)NaturePublishingGroup).AFM单分子力谱还被用于研究末端含有巯基的聚合物与金表面的相互作用(图13(b))[46].首先，巯基通过PEG连接分子被固定在AFM探针上，然后接近金基底.Au-S键形成后，再控制探针远离基底.在还原金表面实验获得的断裂力的最可几值约为0.6nN.为了验证该力值是来源于Au-S键的断裂还是Au原子被从基底拉出所导致的Au-Au键断裂，研究人员将上述实验中得到的修饰有金原子的AFM探针继续在修饰有巯基的基底上进行实验，结果得到了类似的断裂力值.这证明，施加外力时，Au-S结合位点处的Au-Au键发生断裂，Au原子被拉出.结合XPS与拉曼光谱技术，人们发现巯基与金相互作用过程中首先形成配位键，而后转变为共价键.同时，氧化金表面及较长的反应时间能增强巯基与金形成的结合位点的力学稳定性(图13(c))[46].为了研究金与其他硫族元素相互作用的规律，研究人员分别合成了含有不同硫族元素的嵌段聚合物(PEG-PUX-PEG(X=S,Se,Te))，研究了该聚合物链在金表面的吸附形态及强度[10].结果显示该种嵌段聚合物以规律的小的“环状”结构(loopstructure)吸附在基底上，且结合位点较多，因此实验得到带有规则锯齿形力信号的力曲线.4nm的锯齿间距与聚合物链中相邻硫族元素间的链段长度相一致.对断裂力值的分析表明Au-Te键的强度最强，Au-Se键次之，Au-S键最弱[10].这证明相对原子质量大的硫族元素与金形成的键强度较大.此外，人们还利用AFM单分子力谱研究了聚多巴胺与氧化钛基底的相互作用[66]，以及高分子在固液界面的摩擦行为的本质[67].3.1.3高分子组装体中分子间相互作用半结晶性高分子广泛存在，其在高分子材料中占据非常大的比例.高分子结晶相的结构对材料的力学及光电性质等诸多性质具有重要影响.从单分子水平研究高分子链结构对结晶过程、晶体结构以及材料力学性质等的影响规律，对于进一步揭示结晶机制、建立链结构与材料性能之间的联系、设计发展高性能高分子材料具有重要意义.然而相关研究充满挑战，通过将原子力显微镜(AFM)成像与单分子力谱技术有机结合，并辅以合适的样品制备及偶联方法，研究人员成功地将单条高分子链从聚氧乙烯(PEO)晶体中提拉出来，定量测量了晶体中高分子链间作用力的大小(图14(a)与14(b))[13].Fig.14(a)SchematicillustrationofAFM-basedSMFSstudyonaPEOsinglecrystal (b)TypicalforcecurvesrecordedintheAFM-basedSMFSexperimentonagold-nanoparticle-labeledPEOsinglecrystal(ReprintedwithpermissionfromRef.[13] Copyright(2011)AmericanChemicalSociety) (c)SchematicillustrationofthehydrogenbondchangeinPA66singlecrystalwhenslippingonerepeatunitalongthepullingdirection (d)TheforcecurvesofPA66obtainedduringtheunfoldingofafoldedstructure(ReprintedwithpermissionfromRef.[32] Copyright(2018)AmericanChemicalSociety).在此基础上，研究人员进一步克服样品制备等难题，将其发展成一种普适性的研究方法，成功地将该方法应用到聚乙烯(PE)、尼龙66(PA66)、尼龙6(PA6)、聚乳酸(PLLA)和聚己内酯(PCL)等众多高分子晶体体系当中，结合聚合物单分子力谱和受控分子动力学模拟，系统考察了晶体中聚合物链构象(螺旋、平面锯齿和非平面锯齿)链组成及外界环境等对纳米力学性质的影响规律：(1)发现晶体中高分子链运动模式的纳米力学特征，螺旋链在受力拉伸时采取螺旋运动模式，力值变化较平稳、波动较小，而锯齿链会发生黏滑运动(stick-slip)导致力值出现锯齿状波动[68,69]；同时首次通过单分子实验观测到PA66及PA6晶体中高分子链在受力形变过程中多重氢键的动态断裂与重新形成的粘滑运动过程[32](图14(c)与14(d))；发现高分子链在晶体中滑动过程中进行高速旋转直至氢键重新形成；结果还显示，stick-slip运动既受主链结构及链折叠模式的影响，也受力加载装置的弹性系数、无定形区域的链长度等因素的影响；例如：弹性系数较大的探针在松弛过程中储能释放速度较快，链上的残余应力较小，因此在链段滑移后有利于氢键再次形成，表现为力曲线上锯齿峰的数量较多(图14(c)).基于上述具有指纹特征的力谱，研究人员成功地发展了高分子晶体中链折叠模式的定量化研究方法，该方法无需对样品进行标记，具有很好的普适性，研究结果显示溶液相制备的高分子晶体中近邻规整折叠模式所占比例很高(≥91%)，表明分子内相互作用对结晶过程起到了关键作用[70].除了晶体，层层组装膜中聚电解质分子间的相互作用及其结合/解离的动力学性质也受到了关注.为此，聚阴离子电解质形成的薄膜被固定在基底表面，聚阳离子电解质PM2VP249被修饰在AFM探针上，进行单分子力谱实验(图15)[14].结果显示，电荷相反的电解质有2种结合模式：一种是在膜的表面发生表面沉积(图15，I)，另一种是进入到膜的内部进行内部包埋(图15，Ⅱ).内部包埋模式受到盐离子浓度的影响较大.Fig.15Schematicdescriptionofthestrengthmeasurementofionicbondsandthetypicalforcecurvesrecordedduringthedisruptionofazipperofionicbonds(I:oneatatime Ⅱ:simultaneousdisruptionofcooperativecomplexeswithmultiplebonds)(ReprintedwithpermissionfromRef.[14] Copyright(2012)AmericanChemicalSociety).3.1.4力诱导化学反应近年来，力响应功能基团(亦即力色团)，即受到外界刺激时能够发生特定键断裂的功能基团，受到人们的关注[71~78].这些力色团可以赋予材料更高的韧性、自修复性等，并可用于材料体系内部应力损伤的探测.定量研究高分子中的化学键在外力作用下的断裂及转变，对于揭示力化学反应的本质、开发新型力色团继而实现高分子材料的增强增韧以及内部应力大小的可视化呈现具有重要意义[11,31].人们利用AFM单分子力谱揭示了一系列含有力响应基团的高分子在外力诱导下的化学反应的本质与特点[72,79~92].例如带有多个重复四元环功能基团的肉桂酸类高分子被共价桥联在AFM探针与基底之间进行拉伸操纵(图16)[11]，获得了带有锯齿峰平台的力曲线.每个小锯齿的峰间距约为2.4nm，与打开一个和四元环相连的冠醚分子所增加的2.46nm的长度极其相似(图16).因此，力曲线上每一个小锯齿峰都代表着一个四元环开环以及与之相连的冠醚分子链的应力释放过程.锯齿峰的高度则对应着四元环开环反应所需要的力值.实验中获得了力值约为1nN(粉色区域)与2nN(蓝色区域)的2种锯齿峰，分别对应顺式及反式四元环开环所需外力的大小(图16).该结果表明，即使是同样的力色团，其在主链上的不同连接方式也可以导致其力学性质的不同，为材料力学性质的调控提供了新思路[11].Fig.16Arepresentativeforce-extensioncurveofcopolymerP2(ReprintedwithpermissionfromRef.[11] Copyright(2017)NaturePublishingGroup).马来酰亚胺-巯基的化学反应常常被用于蛋白质的偶联或修饰中.然而，由于反米歇尔加成反应及巯基交换的原因，马来酰亚胺-巯基交联产物的稳定性很差.但如果上述交联产物能够水解开环，其稳定性将被大幅度提高.因此人们在单分子水平探索了机械力对马来酰亚胺-巯基键稳定性的影响[31].结果表明，在水溶液中断裂马来酰亚胺巯基键(S―C键)需要大约1nN的作用力，而在乙腈中只需要0.4nN.这是由于外力作用下，马来酸硫醚在水溶液中发生水解开环与反米歇尔加成反应，而在乙腈中只发生后一种反应.不受力的情况下，马来酸硫醚的水解开环反应速率很慢，半衰期约为100h.而在外力诱导下，其水溶液中的开环反应速率被提高至1s左右.因此，通过外力诱导引起开环反应而提高了马来酰亚胺-巯基键的稳定性.该项研究提供了一种通过施加外力来稳定马来酰亚胺-巯基键的方法.3.2超分子聚合物3.2.1超分子聚合物的表征超分子聚合物的非共价连接和动态性在赋予其独特性质的同时，也使其分子量等表征变得十分困难.AFM单分子力谱被成功用于具有一定稳定性的长链超分子聚合物的表征[93,94].例如：研究人员曾利用2-脲基-4-嘧啶酮基团(UPy)修饰AFM探针与基底，然后向体系中加入UPy-UPy溶液，依靠超分子组装在探针与基底之间形成超分子聚合物的桥联结构.根据拉伸曲线上的断裂长度以及单个Upy的长度，可以计算出超分子聚合物的聚合度信息(断裂长度/Upy单元长度)(图17(a))[95].除了用于这种基于多重氢键的超分子聚合物体系外，AFM单分子力谱技术还被成功用于客体增强的超分子聚合物体系的研究.该实验中科研人员利用溴化吡啶衍生物DADV分子间的电荷转移相互作用，再结合葫芦脲CB对该复合物的主体增强相互作用，使CB加载DADA，形成超分子聚合物(图17(b))[96].在对该超分子聚合物的拉伸操纵过程中得到了带有一个单峰或者平台状力信号的力曲线(图17(c)).平台力信号对应着超分子聚合物从基片表面的解吸附过程.统计结果显示，该超分子聚合物的最可几分子长度为60nm.此外，人们还合成了首尾均含有蒽的单体，利用π-π相互作用形成超分子聚合物.单分子操纵实验显示，链段长度为23.9nm.以上结果表明AFM单分子力谱技术是表征超分子聚合物的有效手段.当然，如果超分子聚合物的力学稳定性过低，将导致该聚合物链被完全拉伸之前就已经发生断裂，则无法给出聚合物的信息.Fig.17(a)Arepresentativeforce-extensioncurveofUPybasedsupramolecularpolymers(ReprintedwithpermissionfromRef.[95] Copyright(2005)Wiley-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim) (b)Illustrationofthesupramolecularpolymerformationbasedonmultiplehost-stabilizedcharge-transferinteractions (c)Force-extensioncurvescorrespondingtothedesorptionofsupramolecularpolymerchainsfromthesubstrateinthesolutionofDADV-2CB[8]andthehistogramofthelengthofplateausontheforcecurves(ReprintedwithpermissionfromRef.‍[96] Copyright(2010)Wiley-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim).3.2.2动态力学性质研究近年来，超分子聚合物的动态力学性质成为了研究的热点，因为该性质与材料的刺激响应性以及自修复等性质直接相关.AFM单分子力谱已被成功用于研究聚[2]索烃中索烃大环的受力运动规律(图18(a))[97].实验获得了带有锯齿峰的力曲线，对应着氢键锁定基元的连续打开过程.对同一条聚合物链进行往复拉伸过程中，拉伸与松弛曲线上都可以获得锯齿状的力信号，这证明索烃分子间的氢键作用在受力解离之后仍可以恢复至原来的结合状态，体现出超分子相互作用的可逆性.通过对不同拉伸/松弛速率下的断裂(或成键)作用力进行统计分析，绘制出了该索烃体系解离及形成的能量路径.该聚合物交联后制备的功能化水凝胶的宏观力学性质，体现出了与单分子力学性质的直接关联(图18(a)).Fig.18(a)SchematicdescriptionoftheAFM-basedSMFSexperimentonpoly[2]catenaneandthepropertiesofcorrespondinghydrogels(ReproducedwithpermissionfromRef.[97] Copyright(2019)ChineseChemicalSociety) (b)Nanomechanicalpropertiesofasupramolecularhelix.Highdynamicflexibilityobtainedduringstretching(top)andlowstaticflexibilityasobtainedbythermalshape-fluctuationanalysis(bottom)(ReprintedwithpermissionfromRef.[100] Copyright(2020)Wiley-VCHVerlagGmbH&Co.KGaA,Weinheim).轮烷分子独特的超分子互锁结构使其成为了分子开关和分子马达等相关研究的模型分子.AFM单分子力谱被成功用于研究开启该分子马达所需要的外力大小以及动态解离与结合过程[98].实验过程中，轮烷分子的“轴”被固定在基底上，轮状分子则通过PEO桥联在AFM探针上.结果显示，轮烷分子主要依靠氢键来维持其结构稳定.在运动过程中，能量在轮状分子内氢键与PEO链和AFM微悬臂构成的串联体系的弹性势能间转换.研究人员又设计合成了通过机械互锁结构间相互作用形成类似蛋白质折叠结构的寡聚轮烷分子[98].在拉伸操纵寡聚轮烷分子的过程中，人们发现寡聚轮烷分子具有类似蛋白质的折叠性能，并且其折叠速率可以与蛋白质折叠速度相媲美.类似体系还包括基于多重氢键的UPy二聚体的力学蛋白模拟体系[99].此外AFM单分子力谱方法还被成功地用于由纯的超分子相互作用(π-π及疏水效应)所形成的超分子螺旋的纳米力学性质研究，研究发现该螺旋具有很低的静态柔性及很高的动态柔性(图18(b))[100].3.3生物大分子的纳米力学性质及动态结构研究3.3.1脱氧核糖核酸(DNA)DNA是生物体内重要的遗传物质，携带有转录RNA及合成蛋白质的重要信息.双链DNA独特的双螺旋结构对遗传信息的稳定存在及准确传递至关重要.在一些生理活动中，例如复制或转录等，双螺旋DNA经常受到外力作用发生一定程度的形变.因此，充分了解DNA的力学性质有助于深入理解一些重要的生理过程.近年来，随着DNA纳米技术的不断发展，各种基于DNA的纳米组装体被成功构筑，研究DNA互补链之间的结合强度对于功能组装体的构建及组装体的结构与性能调控具有重要意义[101].人们首先利用AFM单分子力谱研究了短双链DNA(10、20以及30个碱基对)的力学性质(图19(a))[30].结果显示，其断裂力值随着碱基数与力加载速率的增加而增加(图19(b)).此外，其断裂力值也受断裂方式的影响，即剪切断裂模式(2条链的5′端同时受力)所需的力值大于解拉链模式(2条链同一侧的5′端与3′端同时受力)[30].因此，短链核酸受力模式(剪切与解拉链)影响着其表观作用强度.Fig.19(a)Atypicalforce-piezodisplacementcurveofadsDNA (b)TheunbindingforcedependenceonthestretchingvelocityofdsDNA(10,20and30bp)(ReprintedwithpermissionfromRef.[30] Copyright(1999)NationalAcademyofSciences,U.S.A.).基于上述规律，研究人员将短双链DNA用作力学传感器[102].不同碱基对数量的短双链DNA被分别固定在PDMS模板和玻璃基底上，通过一段65碱基的带有荧光基团的单链DNA桥联.当模板与玻璃基底分离时，带有荧光基团的单链DNA会保留在碱基对数量较多的双链DNA一侧.该设计可以在碱基对数目相同的DNA中精确地区分出少至一个碱基对的错配.基于短双链DNA的力学稳定性，研究人员进一步将AFM单分子力谱与荧光显微镜结合，在单分子水平对短链DNA进行纳米组装[103].待搬运DNA的一端首先与存储区域基片表面固定的单股DNA形成双链结构，另一端则与针尖上固定的单链DNA互补形成桥联结构，针尖垂直运动过程中待搬运DNA以解拉链方式从基片表面断裂并留在针尖表面，从而被针尖从存储区域搬走.当该探针转移至目标样品区域时，被搬运DNA能够与该处基底固定的单股DNA形成一段新的双链DNA.此时，被搬运DNA与基片表面单链DNA形成的互补结构的长度大于其与针尖上的DNA形成的互补链的长度.当探针远离该区域时，串联结构中的两段双链DNA均处于剪切受力模式.由于被搬运DNA与目标区域基底固定的DNA形成的双链片段更长，稳定性更强，因此被搬运DNA与探针表面DNA解链，留在目标区域.利用上述原理，核酸分子可被连续搬运组装几百次，再结合荧光分子、量子点、蛋白质，可以实现多种物质在基片表面的图案化组装.通过将长链dsDNA桥联于AFM针尖及固体基片之间进行拉伸操纵，研究人员获得了具有指纹特征的长链dsDNA单分子力谱[9,104].在拉伸初期，DNA由无规卷曲变为伸展状态，对应力曲线的低力值区域.随着外力增加，DNA达到完全伸展长度后被进一步拉伸时，其构象由天然B-DNA变为过度拉伸的OS-DNA，导致力曲线出现高度约为65pN(F1)的长平台(B-OS转变，图20(a)).上述平台力值没有拉伸速率依赖性，具有指纹图谱特性.往复拉伸实验中，施加的外力等于或低于65pN时，松弛曲线可以与拉伸曲线重合.因此，B-OS转变是一个可逆过程.B-OS转变后继续拉伸，DNA将熔融解链，对应着力曲线高力值处的短平台(F2，图20(a)).该短平台力值受拉伸速率影响，属于非平衡过程.Fig.20(a)Atypicalforce-extensioncurveobtainedduringthestretchingofadsDNA(ReprintedwithpermissionfromRef.‍[9] Copyright(2012)EditorialOfficeofChemicalJournalofChineseUniversities) (b)AprobablemodeloftelomericDNAtopologyafterforce-inducedmelting.DifferentconditionsintherenaturationprocesseventuallyinducetelomericdsDNAtoformdifferenttopologies(ReprintedwithpermissionfromRef.[16] Copyright(2020)OxfordUniversityPress).长双链DNA的力学指纹谱可被用于探究长双链端粒序列在外力诱导下解链，及动态形成G-四链体(G4,由G链形成)及i-motif的过程(C4,由与G链互补的C链形成)[16].首先，研究人员开发了EM-PCR方法，合成了具有串联重复序列的长双链端粒DNA.随后，通过两段双链DNA把手序列以及金/巯基、生物素/链霉亲和素相互作用，将端粒DNA桥联于AFM探针与金基底之间.双链端粒DNA受力解链后，G-四链体和C-四链体的形成与双链DNA的复性相互竞争.单价K+、酸性条件、稳定i-motif结构或G-四链体结构的配体(如SWCNT和TMPyP4)均能够将平衡向抑制双链复性、促进高级结构形成的方向移动.只有当G-四链体和C-四链体同时形成时，双链结构的复性才会被完全抑制(图20(b)).DNA指纹图谱还能揭示小分子结合试剂对其力学稳定性的影响[9].例如：DNA小沟结合试剂纺锤菌素可以增加DNA的结构稳定性，表现为B-OS转变平台力值的增高，而另一种小沟结合剂偏端霉素A则导致平台力值降低.DNA大沟结合试剂α-helical肽及310-helical肽则使B-OS转变平台与DNA熔融解链所对应的平台融为一体.同时，高浓度的嵌入剂，例如溴化乙锭、道诺霉素、YO和普罗黄素等，使DNA链伸展，双螺旋结构消失，双链的力学稳定性增加，阻止外力诱导下的熔融解链，表现为B-OS转变平台的消失.共价交联剂顺式-二氨基二氯化铂通过交联DNA链中鸟嘌呤也能阻止外力诱导的熔融解链.上述结果表明，利用DNA指纹谱来探索DNA与小分子物质相互作用的研究，从单分子水平提供了小分子药物在体内的作用机理，为药物的筛选及研发提供了理论依据.长双链DNA的力学指纹谱还可用作DNA与DNA结合试剂(如DNA结合蛋白)相互作用的“指示剂”(图21).例如：上述DNA的B-OS转变过程，一直争议不断.一种观点认为，该过程中DNA的空间结构被破坏，双螺旋结构转变为梯形结构，但保持双链.另一种观点则认为，DNA发生了熔融解链.人们通过长双链DNA的指纹图谱及其与单链DNA结合蛋白(SSB)的相互作用验证上述2种观点[105].拉伸操纵DNA的过程中，SSB蛋白被加入(图21(a)).结果显示，该条件下的往复拉伸/松弛力曲线不能重合，出现了明显的滞后现象(图21(b)).表明B-OS转变过程中，部分双链DNA出现了熔融解链，并与SSB蛋白结合；松弛过程中，SSB蛋白阻碍单链DNA复性，表现为松弛曲线的滞后现象.根据滞后程度可以判断单股DNA结合试剂与其结合的程度及强度.Fig.21(a)SchematicillustrationofB-OStransitionofdsDNAandSSB-ssDNAinteraction (b)Typicalforce-extensioncurvesobtainedduringtherepeatedlymanipulatingofadsDNAinthepresenceofSSBproteins(ReprintedwithpermissionfromRef.‍[105] Copyright(2010)AmericanChemicalSociety) (c)SchematicillustrationoftheeffectofDnaDproteinondsDNA (d)Typicalforce-extensioncurvesobtainedbystretchingthesamedsDNAinthepresenceofDnaDprotein(ReprintedwithpermissionfromRef.[21] Copyright(2008)ElsevierLtd.).类似的方法还被用于探索双链DNA结合蛋白(例如DnaD蛋白)与双链DNA的相互作用[21].较高浓度的DnaD蛋白可以使双链DNA环化，形成圆盘样结构(图21(c)).因此，在该蛋白存在下拉伸双链DNA，力曲线上首先出现锯齿样力信号，对应圆盘结构被破坏的过程(图21(d)).此后，该蛋白会促进双链DNA解螺旋，导致其完全伸展长度变长，表现为力曲线上对应B-OS转变平台的变短及右移(图21(d)).3.3.2多糖(船式-椅式转变)多聚糖是重要的能源物质，其糖环结构、连接方式及分子内氢键使其具有独特的单分子力学性质[1,9,29,106].多聚糖中连接吡喃糖环的键的取向与糖环长轴的相对关系决定了力曲线的形态.二者相互取向垂直时，会在力曲线上产生“肩式”平台，对应糖环船式-椅式结构的转变.这种糖环构象转变对应的“肩式”平台高度恒定，具有指纹图谱特征，可以用于共价键等强相互作用体系研究的单分子信号指示剂.例如：人们曾用羧甲基化淀粉作间隔基团，以其构象转变的指纹图谱作“指示剂”，测量了单个Au―S(Au―Au)键、Si―C键、组氨酸与Ni2+及NTA之间的络合作用的强度等等[40,107].有些多糖分子在溶液中能形成螺旋结构，被拉伸操纵时会获得带有长平台的力信号[2,108].以淀粉分子为例，拉伸操纵的初期，淀粉链由无规卷曲变为伸展状态，对应力曲线上力值接近基线的部分；随后，淀粉链内氢键断裂，空间结构解螺旋，出现长平台样力信号；外力逐渐增大，淀粉链内糖环的构象由椅式转变为船式，高力值区域出现“肩式”平台(图22)[2,108].Fig.22Force-extensioncurvesobtainedduringthestretchingofasingleamylosechaininbutanol(ReprintedwithpermissionfromRef.[108] Copyright(2006)AmericanChemicalSociety).3.3.3蛋白质蛋白质的空间结构对其性质与功能有重要影响.单分子力谱是研究蛋白质折叠结构及动态解折叠与折叠过程的有效手段[9,29,109,110].相关研究始于对机械力极其敏感的肌联蛋白作为研究对象[110,111].多聚肌联蛋白被固定在探针与基底之间，在探针远离基底的过程中，类似免疫球蛋白的结构域在外力作用下依次解折叠，产生了锯齿形力信号.锯齿峰间的距离约为25~28nm，这与解折叠结构域的完全伸展长度(31nm)非常近似.因此，锯齿峰对应着肌联蛋白中免疫球蛋白样结构域的解折叠过程.此后，在拉伸具有确定数目的免疫球蛋白样串联结构域(Ig4或Ig8)时，得到了最多含有4或8个连续锯齿峰的力信号，再次验证锯齿峰对应着结构域的解折叠.此外，拉伸后松弛，蛋白质可以再次折叠.这也证明，外力诱导下，一些蛋白质的折叠及解折叠过程是可逆的.同时，蛋白质的解折叠指纹谱可以作为“指示剂”，探究自身的错误折叠及其他蛋白质的折叠与解折叠过程[109,112,113].蛋白质的力学指纹谱还能用于研究蛋白质与蛋白质或其他物质的相互作用，直接探索参与相互作用的结构域等.例如：人们将重组蛋白(NuG2)8固定在探针与基底之间，在拉伸过程中，加入相互作用的hFc蛋白[114].结果显示(NuG2)8解折叠力曲线上锯齿峰的力值显著增加.这证明hFc的结合增加了(NuG2)8结构的稳定性.利用AFM单分子力谱获得了蛋白质的微观力学性质后，人员尝试利用这些信息预测宏观材料的力学性能并指导新型材料的设计[17].例如：GB1蛋白在解折叠后能够快速地重新折叠，节肢弹性蛋白(resilin，R)能表现出显著的熵弹性.因此，研究人员预测上述2种蛋白组成的融合蛋白将展现良好的韧性与弹性.通过将GB1蛋白与节肢弹性蛋白进行交联，得到了水凝胶样的宏观材料.低应变条件下，该材料在节肢弹性蛋白的贡献下展现出很好的形变恢复能力；而在较高应变情况下，GB1的存在使该材料具有能量耗散性能，显著提高了材料的力学性能.该研究有效建立了生物大分子微观力学性能与材料宏观力学性能之间的联系.3.3.4真实生物体系-天然病毒从单个分子水平探测活体细胞中生物大分子间的相互作用对于理解这些大分子参与的生命过程的机制，继而实现对相关过程的调控具有重要意义，然而相关研究充满挑战.病毒是介于生物大分子与活体细胞的一个中间状态，其结构相对简单.研究人员选取烟草花叶病毒为模型体系，利用AFM单分子力谱探测了该病毒中RNA与蛋白质外壳的相互作用及解组装过程(图23)[115].首先利用金-巯基相互作用将病毒颗粒“垂直”地固定在金基底.当探针与病毒颗粒接触时，病毒RNA通过物理作用吸附在探针上.当AFM探针远离基底时，RNA在探针的牵引下从蛋白质外壳上解组装(图23(a)与图23(b)).上述过程获得了带有锯齿的平台状力信号，平台的力值大小依赖于RNA的拉伸速率，对应着RNA与蛋白质外壳间相互作用的强度.此外，力曲线上相邻2个锯齿峰间的距离与病毒RNA中“AAG”序列(与蛋白质外壳作用最强的序列)间的距离相似，表明“锯齿”状力信号对应不同序列的RNA从蛋白质外壳上的解组装(图23(c)).在此基础上，通过系统研究溶液pH值、钙离子浓度等对RNA解组装过程的影响规律，揭示了该病毒从外界进入植物细胞后边解组装边复制的分子机理[51].Fig.23(a)TMVStructure (b)SchematicillustrationoftheRNAmanipulationonTMV (c)Comparisonofthedistancebetweenadjacentsawtooth-likepeaksinstretchingcurvesandtheoreticaldistancebetweenadjacentAAGsintheTMVRNAsequence(ReprintedwithpermissionfromRef.[115] Copyright(2010)AmericanChemicalSociety) (d)Force-extensioncurvesobtainedduringthepullingofRNAoutofTMVintheabsence(blue)andpresence(red)oftannin(ReprintedwithpermissionfromRef.‍[116] Copyright(2019)TheRoyalSocietyofChemistry).随后，研究人员探究了单宁酸及其衍生物对烟草花叶病毒RNA与其蛋白质外壳相互作用的影响，揭示抗病毒药物的作用机理[116].结果显示，加入单宁酸后将RNA从TMV病毒上解组装所需外力显著增大(图23(d))，即单宁酸能显著增加病毒RNA(尤其是AAG序列)与蛋白质外壳的相互作用，阻碍病毒在生物体内的解组装.这是由于单宁酸上的棓酰基与蛋白质、核酸的活性基团之间形成了较多非共价键，例如疏水相互作用和氢键等.同时，当RNA被拉伸出病毒颗粒后，单宁酸迅速占据蛋白外壳内的RNA结合位点，导致RNA无法有序地重新组装.该项工作从单分子水平深化了人们对单宁酸的抗病毒机制的认识，有助于指导设计新型的抗病毒药物.4结语及展望随着AFM技术及相关仪器的不断进步，以及相关实验经验的积累，AFM单分子力谱的适用对象已经从简单的孤立大分子体系拓展到复杂、真实体系[13,115,116].同时，为了降低流体力学阻力，在接近材料真实使用环境中研究高分子链的行为，AFM单分子力谱的探测微环境从液相被拓展到空气相[117].通过优化环境湿度、探针的弹性系数及疏水性来克服黏附力影响，研究人员成功地在空气相中探索了PEO单晶的力致熔融机制.为减小环境介质对大分子本征性质的干扰，AFM单分子力谱的工作微环境又被拓展到真空，并精确测量了PS分子中π-π作用[57,63].为了观察一些快速的动力学过程及捕捉存在时间极短的中间态，AFM探针被进一步优化，具有了更快的响应速度.微悬臂的探测速率与其共振频率相关，通过减小微悬臂的尺寸(尤其是长度)可以增加其弹性系数，进而增加共振频率，由于流体力学阻力也随之减小，该探针的探测速率最终被提高至3870µm/s[34].利用该微型探针，人们获得了肌肉纤维中肌联蛋白(Titin)在高速拉伸时的解折叠信息，结合分子动力学模拟(通常在更高的拉伸速率下进行)，有助于深入理解其折叠与解折叠机制.此外，研究人员还利用聚焦离子束改变微悬臂的形状与尺寸，通过降低其流体力学阻力与硬度来提高力精度与力稳定性[35].加工后，微悬臂的共振频率几乎没有变化，但流体力学系数及弹性系数显著降低，噪音被控制在sub-pN范围.AFM技术与其他光谱技术结合，在获得力学及长度信息的同时还能获得化学组成信息，将有助于更好地建立材料结构与性能之间的联系.例如：基于AFM探针的针尖增强拉曼光谱(TERS)，可以同时获得材料的表面形貌及表面物种的光谱信息[118]；AFM与红外光谱联用的纳米红外系统，能够将样品的形貌、性能和化学结构等信息很好地统一(图24)[119].同样，AFM单分子力谱技术与其他光谱技术的原位结合将使得人们对于单分子的力学、光学及电学等的原位研究成为可能，将为功能材料的开发奠定重要基础.Fig.24(a)SchematicdiagramofAFM-IR (b)TheAFMprobeoscillationinresponsetoIRabsorptionofthesample (c)ThemeasurementoftheAFMprobeoscillationasafunctionofwavenumber(ReprintedwithpermissionfromRef.[119] Copyright(2017)AmericanChemicalSociety).参考文献1ZhangWK,ZhangX.ProgPolymSci,2003,28(8):1271-1295.doi:10.1016/s0079-6700(03)00046-72ZhangX,LiuCJ,WangZQ.Polymer,2008,49(16):3353-3361.doi:10.1016/j.polymer.2008.04.0563NoyA.CurrOpinChemBiol,2011,15(5):710-718.doi:10.1016/j.cbpa.2011.07.0204JanshoffA,NeitzertM,OberdörferY,FuchsH.AngewChemIntEd,2000,39(18):3212-3237.doi:3.0.co 2-x%22\t%22http://www.gfzxb.org/thesisDetails%22\l%2210.11777/_blank"10.1002/1521-3773(20000915)39:183.0.co 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蛋白药物具有分子量相对较大，结构复杂多样性和可变性等特点，其产品质量容易受到生产过程中各种理化条件影响，如发酵或细胞培养条件改变，分离纯化工艺不同，产品质量都会有差别，因此对蛋白药物结构的表征和质量的控制必须贯穿于蛋白药物研发的整个过程中，以确保对蛋白药物产品质量属性进行全程、实时的监控。但在蛋白药物产品结构表征和质量监控中，样品前处理（如氨基酸序列分析，糖基化分析）和数据挖掘都是非常耗时的工作，如何提高蛋白质药物生产过程中质量监控效率至关重要。本次研讨会由 Bruker 和 Ludger 联合主办，为大家介绍 Bruker 特色的质谱表征方案和Ludger功能性糖链塑形（GlyShape）的质量设计理念，并通过 IgG1, EPO 和 FSH 等生物药物结构表征应用实例和临床案例分析，来诠释如何利用低成本和高效率的方法加强蛋白药物的质量监控，提高蛋白药物有安全性和有效性。竭诚欢迎您的莅临。会议日期：2017年9月15日 13：00 - 16：15会议地点：上海张江高科技园区蔡伦路720弄1号楼一楼多功能厅会议咨询：于小姐 13370119923 yiting.yu@bruker.com会议报名：邮件报名，请于2017年 9月13日前将参会信息 姓名+电话+工作单位+职位+参会人数发送至： yiting.yu@bruker.com 一．报告简介 报告 1：《布鲁克创新质谱技术助您提高蛋白药物质谱表征效率》 -- 让细节和速度能同时兼顾不再成为蛋白药物质谱表征的难题 质谱仪在蛋白质药物结构表征中的应用越来广泛，但质谱分析中耗时的样品前处理和数据挖掘大大制约了质谱仪在蛋白质药物生产中的应用，Bruker特色的质谱表征方案则致力于让质谱表征方法细节和速度同时兼顾，大幅提高蛋白药物质谱表征效率。报告 2：《功能性糖链塑形（GlyShape）的临床应用及案例分析》--加速提高生物药研发的安全性和有效性，帮助生物药公司节省研发和生产成本 Ludger专业的糖组学和糖基化分析技术，将通过IgG1, EPO 和FSH 等生物药物的临床案例分析来诠释如何用更低的成本和更快的速度提高生物药物的安全性和有效性。糖基化对蛋白的生物活性至关重要，因此，需要对多批次抗体的糖基化形式都进行表征，检测其糖基化形式的变化范围，之后证明该单抗药物的糖型结构在参照糖型的变化范围内。 基于QBD的质量控制理念与临床实践相结合，Ludger首先提出了功能性糖链塑形（GlyShape）的质量设计理念。二．讲师简介Daryl Fernandes 博士， 英国 Ludger 生物科技公司创始人和总裁。1980年获得了牛津大学糖生物学研究所生物寡糖结构分析专业的博士学位。在医学和生物技术领域利用和开发糖基化分析技术已经拥有超过三十年的经验。于1999年建立了自己的生物科技公司—Ludger。刘先明，布鲁克质谱生物制药应用与市场专员。毕业于苏州大学生物物理专业，拥有多年蛋白药物质谱表征分析经验，目前主要负责基于 ESI-Q-TOF 和 MALDI-TOF/TOF 技术平台在生物制药领域中的应用技术支持和技术推广。 三． 公司介绍Ludger 生物技术公司 Ludger 是一家专门从事糖组学和糖基化分析技术的生物科技公司，以支持生物制药的实现和药物的转变。公司成立于 1999 年，由 CEO 达里尔费尔南德斯博士创立，实验室和办公室座落在英国牛津附近的卡拉姆科技中心。Ludger 已通过 ISO9001 认证，目前拥有28位研究人员，分别从事以下科学和商业活动：合同定制研究，糖基化分析服务、研究和开发，糖技术耗材和试剂的生产等，其中也包含纯化的多糖标准品。布鲁克（北京）科技有限公司 布鲁克公司作为全球领先的分析仪器公司之一。自成立五十多年以来，我们始终坚持一个理念：针对当今的分析需求，开发最先进的技术和最全面的解决方案。今天，遍布几大洲九十多个地点的五千多名员工正在为这个信念努力工作。刀工作。作为质谱技术的领导者，布鲁克公司质谱部门为您提供各种类型的先进质谱系统，产品包括：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱质谱仪（MALDI-TOF和MALDI TOF/TOF)、电喷雾-离子阱质谱仪（ESI-Ion Trap）、电喷雾-飞行时间质谱仪（ESI-TOF）、电喷雾-四极杆-飞行时间串级质谱仪（ESI-Q-q-TOF）、超高分辨飞行时间质谱仪（UHR-TOF）、傅里叶变换回旋共振质谱仪(Q-q-FTMS)、气相-三重四极杆质谱仪（GC-MS/MS） 、液相-三重四极杆质谱仪（LC-MS/MS）。与此同时，我们还开发了农残筛查、毒物检测等一系列解决方案和软件产品，以最大化的满足科研、工业生产及检测等领域快速增长的需要。我们服务的客户群分布广泛，包括制药，生物科技，蛋白质组学和分子诊断等领域里的公司、学术研究单位和政府机构。公司总部设在美国，生产基地在德国，服务与销售中心遍布全球，以提供给用户最快捷和全面的服务。 Ludger 生物技术公司布鲁克（北京）科技有限公司2017年9月7日

颗粒表征行业过去十数年间从各类表征技术的发展、各工业领域内更广泛的应用、各项技术的标准化程度的提高与普及、新款仪器的问世，到许多商家公司的变更，是本行业半个世纪前随着激光与微电子行业的问世而跨入现代化进程以来变化最明显的。颗粒表征技术的发展回顾现代颗粒表征技术的初始化发端于延伸传统的筛分、光学显微镜、与沉降法粒度测量的下限。那些用于表征10微米以上颗粒的技术，特别是应用于固体颗粒的颗粒表征仪器商业化可以说是早已完成了。近十几年来主要是一些技术细节的进一步改进与应用的进一步推广，例如在3D打印、能量储存（锂离子电池）、药物等很多行业。这方面的最大变化是各类技术的国际标准化、国内标准化与行业标准化的建立与普及，以及各类有证（标准）的国家级与行业参考颗粒物质（RM），包括单分散粒径RM、多分散粒径RM、计数RM、表面积RM、Zeta电位RM等的可利用性。迄今为止国际标准化组织仅颗粒表征技术委员会（ISO TC 24）就已有61个国际标准、1个技术规范、3个技术报告。中国国家标准化管理委员会的颗粒表征与分检及筛网标准化委员会专委会（TC 168）也已有60个国家标准。这些技术在过去十数年内的持续改进发展与一些新技术的问世，主要来自于纳米科学技术发展的推动与将测量粒径下限进一步下推与测量样品浓度上推的需求。表征技术与仪器本身的发展也受益于其他行业的新技术，例如3D打印、光刻与微机电系统已被用于生产颗粒表征仪器的过程；不断发展的各类光源、光导纤维、CCD、CMOS、光电探测器阵列都已成为现代化颗粒表征仪器的一部分。某些测量技术例如传统的库尔特原理（电阻法），进一步扩展了测量的动态范围与测量下限、数值化的脉冲记录可使同一测量除了计数与颗粒体积测定以外，也可用以测定颗粒形状或追踪样品的动态变化。基于同样原理的可调谐电阻脉冲传感法使用在可伸展薄膜上的小孔测量纳米级颗粒，已成功地用于病毒研究，包括新冠病毒研究；利用纳米碳管、3D打印以及小至10纳米的电极，整个电阻法测量可在微芯片上完成。英国科学家在2006年发明的、基于追踪激光照射下悬浮液内纳米颗粒运动的颗粒示踪法是近十年来发展最迅速的基于数量测定的纳米颗粒粒径测定新技术。这个可以包含计数、电泳迁移率测定与荧光分析的新技术可与动态光散射互补，如果能够进一步增宽测量粒径与浓度的动态范围，则一定可以有更广泛的应用前景。传统的动态光散射已突破稀溶液和90度散射角测量的局限，利用光学纤维进行后向散射、多角散射测量，以及多角度整体分析已逐渐成为通例。随着计算机能力的进一步扩展与数据传输速度的提高，动态范围高达1012与采样速度快达10纳秒的芯片相关器或软件相关器取代了传统相关器。越来越多的相关函数反演算法使这一已沉寂了很多年的领域又活跃了起来。打破测量必须在静止液体中进行的限制，在分馏设备的出口处测量在流动液体中单分散分馏成分的动态光散射也取得了可喜的进展。中国科学家在2012年发明的，以CCD或CMOS作为探测器，同时测量动态光散射时间与空间相关性的超快速图像动态光散射方法，利用系综平均取代扩散平均，弥补了传统动态光散射费时、信噪比低的缺点，可以在瞬间（快达1微秒的两幅帧）测出颗粒的平均粒径，已成功地在数秒钟内实时测量了金颗粒的成长。这一测量速度还将随着帧传输速率的增加进一步提高。另一个可注意到的变化是电泳光散射测量zeta电位技术的进一步发展，例如直流与交流电场混用以排除测量中电渗的影响、使用透明电极以测量极高浓度样品中颗粒的zeta电位、用大规模并行相位分析光散射测量蛋白质的电泳、用对称测量增加分辨率等。Zeta电位测量的应用与数据解释也为更多的用户理解与接受。随着越来越多行业对颗粒形状表征的需求，动态图像法，特别是取样方法与图像分析算法与软件也是活跃的热点。颗粒表征仪器企业的并购整合这十几年来最引人注目的可能是颗粒表征仪器行业内商家的整合。据不完全统计，从2000年至今，至少有13家公司的所有权发生了变化，有的是集团内整合，有的是国际兼并，有的是国内并购。随着现代化颗粒表征技术第一代研发人员由于年龄原因的退出、公司所有权变化后的人事变动、以及很多成熟技术的黑盒子化，提供用户支持的第一线应用人员甚至总部的应用支持人员对科学技术知识掌握的深度与广度打了很多折扣，有些人对自己公司的产品知其然而不知其所以然，市场上的竞争也经常脱离应有的科学技术基础。中国颗粒表征领域的发展可喜的是中国颗粒表征领域的发展，无论是对技术的推进（激光粒度法中的很多新型光学设计、图像动态光散射、各类矩阵反演算法等）、应用的普及化（全球最大的激光粒度仪与质控气体吸附表面分析仪的用户群体）、标准化程度（全球数一数二的与颗粒有关的国家标准与颗粒标准物质的类型与数量）、商业化的活跃程度（具有最多业内商家的国家）都随着中国国力的增强与现代化的发展而走在前沿。中国颗粒表征企业也开始进行国际并购，销售渠道越来越宽。颗粒表征技术未来展望展望下一个十年，颗粒表征技术在现有的基础上会在各级标准化的促进下得到更广泛的应用，云数据计算与共享会逐渐推广，表征技术不再限于单参数测量而是在单一测量、或同时测量中得到多个参数，或同一参数在不同条件下测量后对数据进行整体分析。更多的注意力会放在气溶胶、气泡动态测量与在线测量；各类数据挖掘法会用于动态图像法中的图形辨识以用来测量更小与更浓的样品；激光粒度仪将不再局限于球形模型而开始对实际样品尝试非球形模型。作者简介许人良，国际标委会颗粒表征专家。1980年代前往美国就学，受教于20世纪物理化学大师彼得德拜的关门弟子、光散射巨擘朱鹏年和国际荧光物理化学权威魏尼克的门下，获博士及MBA学位。曾在多家跨国企业内任研发与管理等职位，包括美国贝克曼库尔特仪器公司颗粒部全球技术总监，英国马尔文仪器公司亚太区技术总监，美国麦克仪器公司中国区总经理，资深首席科学家。也曾任中国数所大学的兼职教授。 国际标准化组织资深专家与召集人，执笔与主持过多个颗粒表征国际标准 美国标准测试材料学会与化学学会的获奖者 中国颗粒学会高级理事，颗粒测试专业委员会常务理事 中国3个全国专业标准化技术委员会的委员 与中国颗粒学会共同主持设立了《麦克仪器-中国颗粒学报最佳论文奖》浸淫颗粒表征近半个世纪，除去70多篇专业学术论文、SCI援引4700以上、数个美国专利之外，著有400页业内经典英文专著《Particle Characterization： Light Scattering Methods》，以及即将由化学工业出版社出版的《颗粒表征的光学技术及其应用》。

大家好，本周为大家分享一篇李惠琳课题组最近发表在Mass Spectrometry Reviews上的综述，Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes1。结构生物学的快速发展极大地促进了蛋白结构表征工具的开发。其中，基于质谱的分析方法凭借其快速、灵敏、高通量的优势从中脱颖而出。相比于原子水平的高分辨结构表征工具如X-射线晶体学、核磁共振（NMR）、冷冻电镜（Cryo-EM）等，基于质谱的分析方法能够有效地补充蛋白动力学结构变化的信息，并且不受蛋白纯度、分子量大小的限制。而相较于低分辨的蛋白表征工具如圆二色光谱、动态光散射等，基于质谱的分析方法能够提供更高的肽段或残基水平分辨率，获取额外的序列、翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）、局部空间结构等信息。常见的结构质谱包括：氢氘交换质谱（hydrogen‐deuterium exchange MS, HDX-MS）、交联质谱（cross‐linking MS, CX-MS）、表面标记质谱（covalent labeling MS, CL-MS）等。已有相当多的文献对这些方法进行了详细的介绍2,3，在此不再赘述。而此篇综述将重点介绍非变性至上而下质谱（native top‐down MS, nTDMS）在蛋白及其复合物结构表征中的应用。在过去的十年，非变性质谱（native MS, nMS）特别是nTDMS发展迅速。nMS作为一个桥梁将蛋白质组学与结构生物学相连，其保留非共价相互作用的特性使其广泛用于蛋白复合物四级结构表征，如推断亚基组成、化学计量比、亚基排布等。然而，对于一些深层次的结构信息，如氨基酸序列、PTMs、配体结合位点、亚基结合界面等，仅靠单一的nMS是无法获取的。与之对应的，变性条件下的自上而下质谱（TDMS）能够在完整蛋白水平下直接获得序列以及PTMs信息，虽然有助于PTM的准确定位以及蛋白、蛋白异质体（Proteoform）的鉴别，但却丢失了涉及非共价相互作用的高级结构信息。受限于质谱仪器的发展，在早期，nMS与TDMS通常在两个独立的实验中进行，随着质量分析器以及多种活化/碎裂方式的开发，nMS与TDMS的能够有效的结合，充分发挥各自的优势，在实现多层次结构信息获取的同时，也在不断挑战更加复杂的生物体系，如核糖体、膜蛋白、内源蛋白混合物等。实验设计nTDMS已成为表征蛋白质和复合物的初级到高级结构的重要工具。随着蛋白质样品的大小和复杂性的增加，用于nTDMS的仪器不仅需要符合某些特定标准，还需要不断提高其性能以满足这些增加的需求。nTDMS分析中几个关键的步骤包括：样品前处理、ESI离子化、二级碎裂、质量检测以及数据处理。样品前处理为了维持蛋白的自然状态，通常需要在生理环境中进行nMS分析。然而，缓冲液中的非挥发性盐会产生大量盐簇并与蛋白离子形成非特异性加合物，从而抑制离子信号、降低检测的准确度和灵敏度。因此，样品前处理过程中最重要的环节就是除盐。然而适当的离子强度有助于维持蛋白的三维结构，所以通常的步骤是对蛋白进行缓冲液置换，将蛋白置换至醋酸铵或碳酸氢铵等挥发性盐溶液中。目前已开发了多种在线或离线的除盐方法，详细内容的可在综述原文中查看，此处不再赘述。除了使用非挥发性缓冲盐，减小ESI喷针孔径大小也可以提高系统耐盐能力。碎裂/活化方式二级碎裂方式是实现nMS到nTDMS的关键。常见的活化方式按照原理可分为三类：基于碰撞（CID, SID）、基于电子（ECD, ETD, EID等）以及基于光子（UVPD, IRMPD）的活化/碎裂方式。值得注意的是，CID与IRMPD都属于慢加热的活化方式，能量累积的非常慢，以至于在发生碎裂之前已经进行了能量重排，一些较弱的或者不稳定的键会优先发生断裂，最终导致非共价相互作用在活化的过程中被破坏。而SID、ExD与UVPD则属于快加热的活化方式，碎裂发生在能量重排之前，非共价相互作用得以在这一过程保留下来，碎片化程度受到非共价相互作用的限制，因此可被用于表征蛋白的空间结构。此外，将多种活化方式的结合或与离子淌度技术串联也是获取多层次结构信息的关键。质量检测与变性条件下的质谱分析相比，蛋白复合物在天然环境下通过电喷雾电离产生的电荷数相对较少，因此需要具有较大m/z 范围的质量分析仪（高达m/z = 20,000 Da甚至更高）。最初，nMS分析高度依赖基于飞行时间（time of fight, TOF）质量分析器，因为TOF具有理论上无限的m/z范围。近年来，高分辨质量分析器如轨道阱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）为生物大分子的nTDMS分析带来了新的活力。在综述中，我们简要介绍了每种质量分析器的最新进展，并重点强调了FTICR和Orbitrap在nTDMS分析中的发展和应用。数据处理除了基本的硬件设施，配套的数据处理软件也十分重要。nTDMS数据处理流程通常包括以下4个步骤：同位素峰选取、去卷积、数据库搜索、验证和可视化。正文中，我们对每个步骤进行了简要描述，并重点介绍用于数据库搜索和异质体鉴别的软件。多层次结构信息的获取得益于多种活化/碎裂方式的开发，nTDMS分析可同时获得多层次的结构信息（图1）。主要有以下两种策略：第一种策略，完整蛋白复物（MS1）首先被CID或SID碎裂至亚基（MS2），亚基可进一步碎裂肽段（MS3），在MS1及MS2中可获蛋白复合物结合计量比、拓扑结构、蛋白异质性等信息，在MS3阶段则可获取蛋白序列、PTMs定位以及异质性来源等信息。第二种策略则是完整蛋白复合物（MS1）直接被UVPD或ExD碎裂成肽段（MS2），受益于UVPD以及ExD独特的碎裂方式，发生碎裂的区域主要位于蛋白复合物的表面可及区，而未发生碎裂的区域可能位于蛋白复合物的核心区域或参与亚基相互作用界面。不同的碎裂情况反映不同的空间结构，带有配体的肽段碎片可以用于配体结合位点的定位。综述中，我们详细阐述了如何利用nTDMS获得蛋白复合物的多层次结构信息以及如何将碎片信息与结构信息相关联。图1. nTDMS可提供的多维度结构信息复杂生物体系中的应用蛋白质的空间结构决定了其生物功能，而蛋白质-蛋白质/配体相互作用是大多数生物进程的基础。通过突变、翻译后修饰、或者与金属、小分子配体、蛋白质、DNA、RNA等分子发生共价或非共价的相互作用，蛋白质功能在活细胞中不断受到调节。随着MS仪器、方法的不断开发和数据处理软件的逐渐成熟，nTDMS已被广泛应用于各种生物系统，从小蛋白质、蛋白质-配体复合物到大分子组装体，如膜蛋白、蛋白酶体、核糖体、病毒衣壳，甚至是内源性蛋白混合物。它们中的许多都是极具挑战性的体系，即便是采用NMR、X-射线晶体学或Cryo-EM等生物物理方法分析也是非常困难的。因此，来自nTDMS的见解对于理解这些蛋白质和复合物至关重要。在这里，我们总结nTDMS在所有生物体系中的应用实例，旨在全面了解nTDMS在解决生物学问题方面的潜力。小蛋白的结构表征和区分最初，nTDMS主要用于50 kDa以下单体蛋白的结构表征，大部分的研究都是围绕蛋白质气相结构与溶液相结构对比展开的。根据nTDMS的碎裂情况，推断蛋白的气相空间结构，并与NRM获得的溶液结构进行对比。此外，如果在二级碎裂前增加离子预活化有助于蛋白分子的展开，以便研究蛋白气相展开路径以及获取蛋白质内部空间结构信息。得益于碎片离子对蛋白空间结构的高度敏感性，nTDMS还被用于区分不同蛋白亚型、蛋白突变体的结构差异。蛋白-小分子配体相互作用随后，nTDMS应用到了蛋白-配体复合物中，不同的配体类型适合不同的活化/碎裂方式，除了金属离子、RNA/DNA等以静电作用为主的蛋白配体能够在CID活化时存活，大部分复合物的碎裂都需要选择ECD或UVPD等方式。nTDMS可用于蛋白-配体结合计量比、亲和力、结合位点、作用机制、结构动力学/变构效应的研究。它是一种强大的结构表征工具，其在抑制剂筛选、酶催化监控、RNA-蛋白质互作机制的应用实例在正文中已有详细的介绍。蛋白-蛋白相互作用随着仪器设备的快速发展，nTDMS已应用到更大的体系如蛋白-蛋白复合物，通过组合不同的活化/碎片化技术，在一次实验中可以获得多层次的结构信息。nTDMS可以帮助区分不同的蛋白异质体，并在完整复合物、亚基、肽段三个水平上确定异质性的来源。蛋白的异质性与其生物学功能密切相关，通过调整蛋白的异质性可以实现蛋白功能的转变，具体的应用案例已在正文详细介绍。除此之外，nTDMS还可以用作蛋白-蛋白复合物结合界面、气相展开以及深层次结构探索。治疗性抗体和抗原-抗体复合物在过去的几十年中，治疗性抗体已成为最受欢迎的候选药物之一，它们的高特异性和低副作用促进了治疗性抗体的快速增长。在综述中，我们还详细地介绍了nTDMS在治疗性抗体和抗原-抗体复合物体系中的应用。nTDMS可用于抗体可变区的测序、具有不同药物计量比（DARs）的抗体耦联药物的结构表征、以及抗体-抗原复合物中互补决定区及抗原表位区的鉴别。膜蛋白无论是对于传统的结构表征工具如：X-射线晶体学、NMR还是nTDMS，膜蛋白的结构表征一直以来面临着诸多困难。膜蛋白具有低丰度以及低溶解性等特点，最常见的方法是利用与nMS兼容的膜模拟物如：去污剂胶束、纳米微盘等去溶解膜蛋白，在nTDMS分析时再将膜蛋白从胶束中释放出来，释放出的蛋白可在nTDMS中进一步碎裂获取结构信息。具体的实验流程和应用实例可在综述正文中查看。大分子组装体正文中，还介绍nTDMS在极具挑战性的大分子组装体如：核糖体、蛋白酶体、病毒衣壳中的应用实例，这些生物体系普遍存在的问题是分子量非常大（接近MDa），且具有较高的异质性。对这些大分子机器进行nTDMS分析要求仪器具有较高的质量范围以及分辨率。大分子机器的结构表征充分说明nTDMS方法无论在深度还是广度上都有极大的提升。Native top-down MS蛋白质组学值得注意的是，当质谱前端结合非变性分离技术，如native GELFrEE，尺寸排阻色谱，毛细管区带电泳，离子交换色谱等，nTDMS还可以在靶向模式或发现模式下用于复杂蛋白质组的高通量分析，如内源性蛋白混合物。nTDMS分析最大的优势在于它能区分不同的蛋白异质体，并对每种蛋白异质体进行结构表征，这是其他在肽段水平进行分析的结构质谱法如：HDX-MS, CL-MS所无法实现的。总结与展望总之，在这篇综述中我们重点介绍了nTDMS的最新进展和在不同生物体系中的应用，强调通过nMS与TDMS结合可以获得额外的多层次结构信息。新技术的出现以及仪器的进步使nTDMS能够应用于结构生物学中日益复杂的生物样本体系，包括蛋白质配体、多聚蛋白复合物、大分子组装体和内源性复合物。尽管这样，nTDMS分析仍面临着的挑战，包括但不限于前端的样品分离、离子化、去溶剂化、高质荷比分子传输、异质性样本的分析以及软件的开发。未来nTDMS将与其他的一些结构表征方法相结合以获取更加全面的结构信息。正文中对未来发展趋势进行了讨论并提到了其他一些令人兴奋的创新技术如：基于MALDI离子源的质谱成像技术用于蛋白原位分析、电荷检测质谱（CDMS）用于异质性样本分析，多重技术的结合将为蛋白质复合物的nTDMS研究开辟新的道路。我们希望这篇综述能让读者更好地理解nTDMS提供的独特结构信息，并推动该方法的广泛应用。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. 参考文献1.Liu RJ, Xia SJ, Li HL. Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. Mass Spec Rev. 2022 e21793. https://doi.org/10.1002/mas.217932.Britt HM, Cragnolini T, Thalassinos K. Integration of mass spectrometry data for structural biology. Chem Rev. 2022 122(8):7952-7986. 3.Liu XR, Zhang MM, Gross ML. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: fundamentals and applications. Chem Rev. 2020 120(10):4355-4454.

项目编号：OITC-G220290791项目名称：ZYCGR22011901仪器平台（第二批）科研设备采购项目预算金额：310.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：280.0000000 万元（人民币）采购需求：包号货物名称数量是否允许采购进口产品预算金额（万元）最高限价（万元）1全自动蛋白质表征分析系统1套是1801652毛细管电泳仪1台是130115合同履行期限：详见项目需求。本项目( 不接受 )联合体投标。

仪器信息网讯 在IPB 2014召开期间，&ldquo 2013年颗粒测试与表征技术培训班&rdquo 在上海国际展览中心举办，吸引了100多位颗粒测试与表征技术工作者参加培训。2013年颗粒测试与表征技术培训班现场　　本期培训班由中国颗粒学会主办，并得到了丹东百特仪器有限公司、广州博勒飞粘度计质构仪技术服务有限公司与纽伦堡会展服务(上海)有限公司的大力支持。北京粉体技术协会理事长胡荣泽教授致辞丹东百特仪器有限公司总经理董青云　　董青云携丹东百特软件部经理范继来及上海办事处主任侯东瑞分别介绍了激光粒度分析方法新版国际标准ISO 13320-2009、激光粒度分析原理与方法以及百特最新的粒度分析技术。　　新标准ISO 13320:2009 (E)将原标准ISO 13320-1:1999、13320-:1999合二为一，并增加了一些新内容与心新术语，附录E对获得更高测量精度给出了建议。而等同于采用ISO 13320:2009 (E)的中国国标预计明年正式发布。　　董青云表示：&ldquo 激光粒度分析是目前应用最广泛的一种方法，具有宽、快、简、广等特点，但它又不是万能的方法，会受到环境、样品、仪器、人等的影响。要获得准确的粒度分析结果，就要研究样品、研究仪器、研究标准，找到更适合自己的方法。&rdquo 广州博勒飞粘度计质构仪技术服务有限公司总经理丁晓炯　　丁晓炯主要向与会者介绍了粉体流动性的评价方法、PFT粉体流动测试仪在粉体流动性测量、数据解析中的实际应用，并在现场亲自操作PFT粉体流动测试仪进行测样演示。　　粉体的流动性研究是目前很多材料行业的难点，而现有常见的一些方法不能满足实际需求。美国Brookefield公司根据ASTM D6128推出的PFT粉体流动测试仪，拥有流动函数测试、时间固结流动函数测试、壁面摩擦测试、松装密度测试等功能，特别适合测量5mm粒径以下的粉体，能够为工业处理设备中的粉体流动行为提供了快捷而容易的分析结果。

TA仪器与陕西科技大学联合举办&ldquo 材料热分析和粘弹性表征及其应用技术交流会&rdquo 近年来随着材料研究的不断发展，在化工、医药、食品、能源、新材料等工程技术领域对于材料的研究不断深入，作为材料研究的重要工具，流变仪，动态热机械分析仪、热重分析仪、差示扫描量热仪等仪器越来越广泛的应用其中，这些仪器对于材料的粘弹性能、热物性能的研究提供了的重要技术手段。此次会议主要是加强这些领域的技术交流，针对各领域研究人员及工程技术人员，达到深入的了解材料在热分析和粘弹性等方面的基础理论和表征方法的目的，包括这些测试的最新应用。提高技术人员在自己的研究领域内，确定材料在热物性和粘弹性方面的测试目的和评价手段，更好的针对自己的研究领域和实验所需参数选择和组织更好的研究工作。会议主要内容：一、材料热分析表征及其应用1、材料热分析（热重、差热）的特性及其表征方法2、材料热分析测试的结果分析及其实验方法改进3、材料热分析测试的应用二、材料粘弹性能表征及其应用1、材料的粘弹特性及其物理指标2、材料粘弹特性的仪器测试方法3、材料粘弹特性的应用--------------------------------------------------------------------------------------演讲嘉宾:（以下排名按照演讲顺序，不分先后）刘保健副教授陕西科技大学化学与化工学院 主要研究方向 高分子物理，聚合物结构与表征的实验研究，不同结晶度聚乳酸膜降解性的研究等王宇副教授西安交通大学理学院材料物理系 物质非平衡合成与调控教育部重点实验室，目前从事的研究领域主要包括: 智能材料、形状记忆与磁控形状记忆合金、固态相变与玻璃化转变、磁热与磁致伸缩效应。曾在日本国立物质材料研究机构、美国Los Alamos国家实验室进行研究工作。杨胜鹰 先生毕业于北京化工大学高分子材料系，国家高级工程师，在加入美国TA仪器之前，他在石化行业材料研发行业任职多年，拥有非丰富的研发和技术支持经验。李润明 博士TA仪器流变技术支持,上海交通大学材料学博士。主要研究方向是聚合物流变学，在材料表征分析和测试领域具有丰富的经验。马倩 博士TA仪器热分析技术支持，美国Tufts大学凝聚态物理博士，师从美国著名热分析科学家Peggy Cebe。有着多年高分子热分析表征以及X射线散射理论和实验研究经历。会议时间 2013年4月18日会议地点：陕西科技大学逸夫楼会议室会议日程安排08:50 - 09:00 会议嘉宾致辞09:00 - 09:40 材料动态粘弹性理论及实验表征 李润明 博士09:40 - 10:30 流变在材料粘弹性的表征方法及其应用 李润明 博士10:30 - 10:40 茶歇10:40 - 11:00 流变仪技术应用专题 刘保健 先生11:00 - 11:40 DMA在材料粘弹性的表征方法及其应用 李润明 博士11:40 - 12:00 DMA在记忆合金方面的测试和应用 王宇 先生12:00 - 14:30 午餐14:30 - 15:20 差热法对于材料的表征方法及其应用 杨胜鹰 先生15:20 - 16:10 热重法对于材料的表征方法及其应用 马倩 博士16:10 - 16:20 茶歇16:20 - 16:50 TA热物性测试仪器及其应用 马倩 博士16:50 - 17:30 参观陕西科技大学化学与化工学院重点实验室仪器展示现场问答附件：材料热分析和粘弹性表征及其应用技术交流会详情请垂询: TA仪器市场部王小姐电话: 021-34182128 传真: 021-64951999Email: vwang@tainstruments.com

沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日在北京成功举办了以“质谱技术在蛋白表征及高级结构中应用”为主题的技术研讨会，吸引了60余位来自国家蛋白质组中心、中国食品药品检定研究院、中国科学院、清华大学、北京大学、军事医学科学院、中国农业科学院等知名高校、科研院所、分析测试平台及生物制药企业等相关领域的研究人员参加了会议。 研讨会的主旨为 “提升国内蛋白表征领域对蛋白高级结构研究的认知”，涵盖三大议题：蛋白药物深度结构表征所需要的质谱技术与生物信息学软件、氢氘交换（HDX）技术及IMS在结构生物学特别是表位学研究、蛋白质相互作用研究领域的最新进展及SONAR技术在蛋白质鉴定和非标记定量蛋白质组学研究中的进展。 会上国际知名学者、日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士指出，氢氘交换质谱（HDX MS）逐渐成为蛋白质高级结构研究不可或缺的技术，并介绍了氢氘交换质谱技术及其在表位学和蛋白相互作用研究上的具体应用 。同时对其最近发表在Nature Communication上的题为《Haem-dependent dimerization of PGRMC1/sigma-2 receptor facilitates cancer proliferation and chemoresistance》论文的研究成果进行了汇报，获得了与会科研学者的一致高度评价。 日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士做大会报告 沃特世（Waters）总部制药业务部高级市场拓展经理Asish Chakraborty博士对生物制药行业普遍关注的宿主蛋白残余测定进行了报告演讲，并介绍了使用通用型UPLC/MS分析对生物治疗性蛋白质中的HCP进行全面鉴定和定量。此分析方法采用在线二维液相色谱法分离多肽，然后利用高分辨率、高质量准确度的质谱仪进行蛋白质鉴定和定量。另外，Chakraborty博士对当前氢氘交换质谱方案的新进展也作了更新介绍。 沃特世公司总部Asish Chakraborty博士做大会报告 来自沃特世亚太区的高级科学家陈熙博士作了题为“非变性质谱技术及IMS行波离子淌度质谱技术在蛋白质高级结构研究上的应用进展”的精彩报告，介绍了行波离子淌度高分辨质谱技术在生物药分析上的最新应用进展，成熟的行波离子淌度分离技术为常规高分辨质谱增加了更多一个维度的分离能力，在蛋白质药物常规结构表征如二硫键错配、氢-氘交换质谱技术进行蛋白质药物高级结构和动态变化研究以及HCP(宿主细胞蛋白)残留的鉴定和定量上发挥着重要作用。 沃特世亚太区高级科学家陈熙博士做大会报告 沃特世中国应用科学家殷薛飞博士作了 “最新DIA质谱技术-SONAR在非标记定量蛋白质组学研究中的应用”的报告。殷博士介绍的 SONAR数据采集模式于今年9月发布，科学家们只需执行一次进样即可完成更准确的定性和定量分析，对复杂样品中脂质、代谢物和蛋白质的定量和鉴定，可免去采用MS/MS方法分析时通常需要额外进行方法开发的麻烦。 大会还邀请了来自美国Genentech的蛋白质化学部科学家甘雨田博士分享了她运用蛋白质组学思路进行生物药物研究开发的思路与实践，甘博士还介绍了她今年8月发表于Nature Biotechnology上的ISDetect快速自动蛋白末端质谱检测法，引起与会人员的强烈兴趣。 会议最后 ，沃特世中国生物制药高级经理宋兰坤女士作了“LC/MS平台化方案助力生物药研究开发”的报告，并对会议进行了总结。宋经理说：“质谱技术是蛋白质研究中不可取代的工具，其在蛋白质常规表征及高级结构研究中均有很好的应用方案及研究文献, 为揭示生命科学的奥秘发挥着越来越重要的作用。作为全球生物制药领域解决方案顶尖供应商，沃特世公司为生物药物产业界及蛋白质研究相关科学领域提供先进的仪器和技术。希望本次会议的议题可以激发与启迪科研工作者的思路，为生物药物产业的从业人员搭建一个学术讨论与经验分享的平台。 会议同期展出的蛋白科学研究先进生物技术墙报

蛋白质作为生命基本构成单元，几乎承担着所有生命活动。深入研究蛋白质的功能和结构，全面分析蛋白质间的相互作用和调控机制，不仅能更好地了解生命的奥秘，还为疾病的预防和治疗提供新思路和新方法。为帮助广大实验室用户及时了解蛋白质分析及表征技术最新进展及前沿应用，仪器信息网将于11月09日举办“蛋白分析及表征技术进展”主题网络研讨会，聚焦蛋白质的结构表征、相互作用和动态变化等前沿研究，涵盖质谱、X射线晶体衍射、核磁共振、原子力显微镜和冷冻电镜等技术分享，欢迎大家踊跃报名！报名链接：https://insevent.instrument.com.cn/t/fbs （点击报名）『会议日程』蛋白分析及表征技术进展(2023年11月09日)报告时间报告方向专家单位09:30-10:00结构蛋白组学质谱仪器与方法徐伟北京理工大学 教授10:00-10:30分析型超速离心机在生物大分子药物分析中的前沿应用李文奇清华大学蛋白质研究技术中心 蛋白质制备与鉴定平台主管/高级工程师10:30-11:00分析实验中移液产品的正确选择和使用庄昕晔普兰德（上海）贸易有限公司 产品专员11:00-11:30大分子晶体学在蛋白分析中的应用范仕龙清华大学蛋白质研究技术中心 X射线晶体学平台主管/高级工程师11:30-12:00基于等温滴定微量热技术的蛋白互作分析研究吴萌中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 高级工程师12:00-13:30午休时间13:30-14:00高速原子力显微镜的生物大分子研究焦放中国科学院物理研究所 特聘研究员14:00-14:30生物型原子力显微镜在蛋白质形貌和结构表征中的应用樊友杰布鲁克（北京）科技有限公司 高级应用/服务工程师14:30-15:00蛋白质表观分子量的核磁共振检测方法李红卫北京大学北京核磁共振中心 高级工程师15:00-15:30冷冻电镜制样技术经验交流郭振玺北京大学冷冻电镜平台 副主任/高级工程师15:30-16:00利用肌红蛋白铰链区域紧密的氢键网络来构建稳定的结构域交换二聚体的研究谢成北京大学张文彬教授课题组 博士后『精彩报告预览』徐伟 教授北京理工大学《结构蛋白组学质谱仪器与方法》【报告摘要】：针对生理条件下微量生物分子三维结构及功能研究这个科学问题，首先发展了具有高稳定性、高重复性的液相离子迁移电泳技术与仪器，该方法利用Laminar flow取代了传统的电渗流，通过引入Taylor扩散实现了样品分子的分离、半径和分子有效带电量的同时测量。为了获取生物大分子较全面的立体结构，课题组进一步将离子迁移电泳与非变性质谱技术相结合，通过气相非变性质谱实验获得了分子的溶液可及表面积、通过液相迁移电泳实验获取了分子体积，再结合流体力学Stokes Flow方程，最终获取了蛋白及蛋白复合体的三维几何尺寸信息，该方法可应用于蛋白-小分子复合体结构研究和蛋白质内部几何结构解析。基于液相离子迁移原理，课题组进而开发了液相离子阱装置，在液相条件下实现了离子的富集、选择性传输与顺序弹射分析。通过该装置，不仅可以实现复杂样品的分离，也可以将质谱仪器的检测灵敏度提升100倍以上。报名占位李文奇 蛋白质制备与鉴定平台主管/高级工程师清华大学蛋白质研究技术中心《分析型超速离心机在生物大分子药物分析中的前沿应用》【报告摘要】：生物大分子药物包括抗体药、细胞治疗药、疫苗、重组蛋白类药物等；生物大分子药物具有分子量大，结构复杂的特点，随着生产工艺的不断优化和分析技术的进步，生物大分子药物的质量控制将日趋规范和严格，国家药品监督管理部门也在不断提升该类产品的质量控制要求。有效的质量控制分析方法是确保产品安全性和有效性的基础，报告介绍了生物大分子药物市场规模以及临床现状，结合生物大分子药物的研发流程和基本性质，针对性的对其成药性评价，制备和工艺开发提出相对应的质量控制分析方法，尤其是分析型超速离心机在生物大分子药物分析中的主要应用和发展前景，通过分析超速离心技术在国内外进而对于不同类型的生物大分子药物制定分析策略。报名占位庄昕晔 产品专员普兰德（上海）贸易有限公司《分析实验中移液产品的正确选择和使用》【报告摘要】：移液操作是实验工作的基本技能之一，同时也是最容易被忽视的技能。 液体移液仪器、体积量具在实验室移液操作中扮演着重要的角色。这决定了几乎所有化学与生物学分析测试的精度和结果的可靠性、重复性，正确的选择、使用移液产品是生化实验的必要基础。本次报告将介绍BRAND瓶口分液器、移液器、连续分液器、容量瓶、移液管等移液产品的原理和操作。报名占位范仕龙 晶体学平台主管/高级工程师清华大学蛋白质研究技术中心《大分子晶体学在蛋白分析中的应用》【报告摘要】： 大分子晶体学是一种通过生物大分子（如蛋白质和核酸）形成晶体，以获得其高分辨率三维结构的技术。在蛋白性质研究中，大分子晶体学发挥着重要的作用。 通过大分子晶体学，可以确定蛋白质的三维结构，这对于理解蛋白质的功能和作用机制非常重要；通过大分子晶体学，可以解析蛋白质与其他分子（如酶底物、配体等）的结合位点，以及相互作用的方式。这有助于揭示蛋白质的功能机理，例如酶的催化机制、信号传递等。从而指导药物设计和研发。通过解析药物与靶蛋白的结合模式，可以优化药物的结构和性能，提高药物的特异性和效力；最后大分子晶体学可以提供结构信息，帮助药物研发人员进行结构优化工作。通过研究晶体结构和结合位点的特性，可以设计和改进蛋白质受体和配体的结构，使其具有更好的稳定性、活性和选择性。 总之，大分子晶体学在蛋白性质研究中发挥着至关重要的作用，可以帮助揭示蛋白质的结构、功能机理和多样性，指导大分子和小分子药物设计和优化。报名占位吴萌 高级工程师中国科学院分子细胞科学卓越创新中心《基于等温滴定微量热技术的蛋白互作分析研究》【报告摘要】：蛋白质与其他分子的相互作用是蛋白组学研究中的重要内容，用于研究蛋白-蛋白相互作用的技术和方法有很多种。等温滴定微量热技术是最早发展起来可用于蛋白间相互作用研究的定量检测技术，具有可在溶液中无需任何标记、样品无损地进行检测的特点。本报告结合工作实际对等温滴定微量热技术（ITC）的原理、操作及应用着重进行介绍。报名占位焦放 特聘研究员中国科学院物理研究所《高速原子力显微镜的生物大分子研究》【报告摘要】：待定。报名占位樊友杰 高级应用/服务工程师布鲁克（北京）科技有限公司《生物型原子力显微镜在蛋白质形貌和结构表征中的应用》【报告摘要】：蛋白质在细胞中发挥着各种各样的功能，涵盖了细胞生命活动的各个方面，如发挥催化作用的酶和参与生物体内的新陈代谢的胰岛素，还有可以进行物质运输的分子马达蛋白。细胞免疫反应、细胞分化、细胞凋亡等过程中也都有大量蛋白质的参与。 研究蛋白质的形貌和结构以及蛋白质与其他分子之间的相互作用，有助于理解蛋白质的作用，了解蛋白质是如何行使其生物功能，这无论是对于生物学还是医学和药学，都是非常重要的。通过对蛋白力学结构的分析，可以进行功能注释和指导设计特异性的蛋白的合成。 本报告我们将向大学介绍Bruker生物型原子力显微镜在蛋白质领域的相关应用，包括蛋白质形貌的表征和原位动态过程的观察，还有单分子力谱在蛋白结构解析中的应用。 Bruker生物型原子力显微镜的全针尖扫描模式的设计能从结构上很好地与现在的主流倒置显微镜进行无缝的耦合联用，能够让我们从多变量角度对蛋白质进行解析。报名占位李红卫 高级工程师北京大学北京核磁共振中心《蛋白质表观分子量的核磁共振检测方法》【报告摘要】：蛋白质表观分子量更加真实的反映了其在接近生理条件下的存在状态。本报告介绍一种可以极大降低环境因素的影响、提高测试结果的可重复性的蛋白质表观分子量的测定方法，方法在蛋白质研究以及蛋白质类产品的研发与生产过程中具有较高的实用价值。通过该方法，发明人旨在探索一条从方法创新到实验室应用再到企业应用的途径。报名占位郭振玺 副主任/高级工程师北京大学冷冻电镜平台《冷冻电镜制样技术经验交流》【报告摘要】：冷冻电镜样品制备是冷冻电镜技术发展的瓶颈之一，制约着解析生物大分子复合物三维结构的效率。本报告将结合报告人所在冷冻电镜平台自主开展的支撑科研工作者快速制备冷冻样品的几种方法，与大家进行交流。报名占位谢成 博士后北京大学化学与分子工程学院张文彬教授课题《利用肌红蛋白铰链区域紧密的氢键网络来构建稳定的结构域交换二聚体的研究》【报告摘要】：我们探究了氢键对肌红蛋白（Mb）结构域交换二聚体的形成和稳定性的影响。当Mb二聚体铰链区氢键网络附近的 Leu137 突变为亲水性氨基酸（Glu 或 Asp）后，二聚体的稳定性增强。铰链区氢键网络更紧密的突变体中，氢键数量更多，α螺旋刚性更强，二聚体结构更加稳定。本研究证明了氢键对于设计稳定结构域交换蛋白质二聚体的重要性和实用性。报名占位扫码加入高内涵成像技术交流群（发送备注姓名+单位+职位）扫码直达报名页面温馨提示:1) 报名后，直播前一天助教会统一审核，审核通过后，会发送参会链接给报名手机号。填写不完整或填写内容敷衍将不予审核。2) 通过审核后，会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。会议内容及报告赞助:仪器信息网 赵先生：13331136682，zhaoyw@instrument.com.cn

2020年伊始，新冠疫情爆发，全球经济被按下了“暂停键”。疫情期间，科学仪器企业伸出援手共同抗疫的同时，也在苦练内功、研发新品，迎接“春天”的到来。纵观2020年中国颗粒测试市场，新产品层出不穷，创历年新高，仪器信息网特此盘点了20余款颗粒测试与表征仪器新品，以飨读者。（特别声明：受限于时间与资源，新品盘点范围仅限本网收录的不完全统计，如有遗漏，欢迎补充完善）2020年，颗粒测试与表征仪器新品种类繁多，涉及纳米粒度仪及Zeta电位分析仪、图像粒度粒形分析仪、颗粒计数器、筛分仪、比表面及孔径分析仪、多组分竞争吸附仪、化学吸附仪等。纳米粒度仪及Zeta电位分析仪（1）马尔文帕纳科2020年8月，马尔文帕纳科发布Zetasizer Advance 系列新品，包括Zetasizer Ultra、Zetasizer Pro、Zetasizer Lab三种型号，且每种型号又分为Blue Label和Red Label 两个版本，均可进行颗粒粒度、Zeta电位和分子量分析。2021年1月15日，马尔文帕纳科超级品牌日将线上直播发布 Zetasizer Advance，具有多种创新设计的新品即将揭开神秘面纱，点击下方图片查看详情。（2）HORIBAViewSizer 3000ViewSizer™ 3000 实现了纳米颗粒追踪分析技术的突破性提升，包括特有的照射和检测方法，使得各种尺寸纳米颗粒的可视化、粒径和数量浓度测量成为可能。仪器创新点：1）仪器配备三种波长激光光源，激光功率可调，实现宽分布样品粒径的精确测量；2）特有的样品池设计可实现样品体系的快速混合，且清洗方便；3）荧光模块可实现样品中各组分粒径分布及颗粒数量与比例的测量；4）运用重力沉降原理扩展仪器的粒径测量上限。（3）德国飞驰 A22 NeXTAnalysette 22 NeXT于2020年6月正式上市，用户可根据需求自行选择测量范围：Analysette 22 NeXT 微米型测量范围为0.5–1500μm，能满足大多数常规样品的测量需求；Analysette 22 NeXT纳米型测量范围拓展至0.01-3800μm，测量精度极高，附加的检测器能够灵敏地分辨极小的颗粒。该新品操作和清洗非常简单，分析时间短，具备可靠的测量结果和重复性，还可以记录额外的测量数据如湿法分散过程中体系的温度及PH值。（4）东曹 LENS3东曹生命科学新推出的LenS3多角度光散射检测器为测量合成聚合物、多糖、蛋白质和生物大分子分子量(MW)和回转半径(Rg)提供了革新的解决方案。仪器创新点： 1）采用了创新的光路设计，可以在10°、90°和170°三个固定角度进行光散射测量；2）可以测量小至2nm样品的散射光的角不对称性，远低于目前的检测极限。（5）美国PSS PSS Nicomp 380 N3000 PlusNicomp 380 N3000系列纳米激光粒度仪是在原有的经典型号380DLS基础上升级配套而来，相对于上一代产品，配件选用材料进行升级，配套软件版泵升级，检测速度升级，检测精度升级。其配套粒度分析软件复合采用了高斯（Gaussian）单峰算法和拥有专利技术的 Nicomp多峰算法，对于多组分、粒径分布不均匀分散体系的分析具有独特优势。（6）美国MAS CHDF4000型CHDF4000高分辨率纳米粒度仪采用毛细管流体分离技术(CHDF)，用于测量粒径在5nm-2μm 范围内胶体的真实粒度分布（PSD），还可以用来分析多组分的复杂粒度体系，并不需要作出任何假设。另外，该粒度仪样品用量很少，小于1ml即可。 Zeta-APSZeta-ASP为一款高浓度胶体和乳液的特性参数检测仪，可以测试粒径、Zeta电位、滴定、电导等。此仪器对于高达60%（体积）浓度的样品，无需进行稀释或样品前处理，即可直接测量，甚至对于浆糊凝胶、水泥以及其它仪器很难测量的材料都可直接进行测量。 ZetaFinder ZF400型ZetaFinder ZF400 高浓度Zeta电位分析仪采用专门的电动声波振荡技术，可完成非凡的电动测量结果，从而避免了传统的微电泳技术的许多限制和局限。该仪器可同时测量Zeta电位、PH、电导、温度等指标，样品在测量时甚至可以进行滴定操作，并且可以在任何pH值下分析固体、不透明或半透明样品。（7）丹东百特 BT-90+BT-90+纳米粒度仪是丹东百特在BT-90纳米粒度仪基础上，全新开发的测量纳米颗粒粒度及其分布的纳米粒度测试系统，可实现亚纳米至微米范围的准确检测。BT-90+具有极佳的功能扩展能力，除了可以检测颗粒的粒径之外，还具备检测体系的粘度、颗粒之间的相互作用力、温敏材料的温度变化趋势等能力。（8）广州贝拓DLS 90DLS90纳米粒度仪具有极速测量和标准测量两种模式，极速测量模式下，最快可以10s给出测量结果。该仪器采用光子计数级的高精度光电倍增管和集成的光子相关器，配备精确的温控系统，采样时间最短可达100ns，可测量粒径范围低至1nm图像粒度粒形分析仪（1）FlowCam FlowCam 5000CFlowCam 5000C是Fluid Imaging Technologies公司于2020年3月发布的新品，该仪器可通过40+种形态参数表达所测颗粒的尺寸和形状，获得高质量颗粒图像和基于图像直测获得的定量数据，每分钟可分析成千上万个颗粒，是一款高效率、高性价比的颗粒检测仪器。（2）梅特勒-托利多 EasyViewer 400梅特勒-托利多全新发布的EasyViewer 400是一款探头式工具，功能更加强大、分辨率更高、探头尺寸更长，为测量高浓度体系、更小颗粒、透明液滴和颗粒、中试放大提供高效解决方案。该工具无需取样、稀释或备样，测量快速，简单易用，可一键生成报告，具有高分辨率（980nm）、更窄景深、背光光源三大亮点。无论是实验室研发还是中试放大，均可实时在线捕捉高分辨率晶体、颗粒和液滴尺寸、形貌的演变过程，对于科研人员理解机理、优化过程、快速决策扮演着重要的角色，广泛应用于制药、化工等多种领域。颗粒计数器（1）美国PSS FMS AccuSizer 780 OL-NDFMS AccuSizer 780 OL-ND 在线颗粒计数器使用基于光阻法的单颗粒光学传感技术（SPOS）原理，对检测样本不仅仅可以给出粒度分布（PSD），更可以获得颗粒数量（COUNT）。该仪器全自动化工作，无需人工进样，完美解决了自动取样和自动检测两大难题。（2）德国TOPAS LAP 323LAP-323气溶胶粒径谱仪利用双波长光散射技术测试颗粒物粒径和数量分布，采用两个不同波长的激光二极管对颗粒进行测试，分辨率更高，结果数据更准确。此外，该设备还具有集成度高、智能化流量控制、设计紧凑、使用便捷等特点。筛分仪格瑞德曼 AJ200空气筛分仪AJ200适用于颗粒样品的粒度分离、团聚样品的分散，该产品具有特殊喷嘴设计，转速可调，适用于更加广泛的应用条件。创新点：1）气流喷嘴可以转动，保证样品充分流动；2）真空度可手动或自动调节气流压力，确保不同颗粒粉末准确结果 ；3）德国吸尘器，超低静音，功率大效率高。比表面及孔径检测类仪器（1）麦克仪器 ASAP 2425ASAP 2425多站式全自动比表面与孔隙分析具有六个独立分析站，不同于市面上大多数仪器，可同时分析样品，也可独立分析，可在一小时内完成六个BET比表面分析；拥有12个独立的样品脱气站，即一个样品的制备不会影响另一个样品的脱气和分析。用户可选配低比表面积型号（氪气分析）和微孔型号，其中，低比表面积型号可精确测量低表面积材料( 1 m2/g)；微孔型号则包括1mmHg 传感器，增强了微孔表征性能。（2）精微高博 TB系列TB系列比表面积及孔径同步分析仪在使用过程中，多个样品共用同一杜瓦瓶、同一气源进行测试分析，可保证分析测试的准确性和重复性，真正实现多站间无差异化分析。独有的Vtech技术融合了Vspace冷自由空间控制技术、Vlevel液氮面控制技术、Vstable稳定测试技术、Vctrl防抽飞控制技术，使得TB系列产品的测试效率更高，测试结果更重复、更稳定，更能满足大孔材料的测试需求。（3）贝士德 BSD-MAB该吸附穿透曲线分析仪自带的热导检测器可测定不同实验条件的双组份的吸附穿透曲线，如不同吸附剂，不同温度，不同压力，不同床层厚度，不同气体浓度，不同穿透流量等；连接色谱或质谱可完成三组分及三组分以上的多组分竞争性吸附、选择性吸附以及置换吸附等测试；可实现吸附剂对ppm级别浓度的TVOC、SO2及NH3等污染气体的吸附测试，尤其适用于吸附剂对室内、车内等环境中微量污染气体吸附性能的评价及吸附相关参数的测定。（4）理化联科 iPore400iPore 400型能同时测定6个样品，并对另外六个样品进行独立地脱气处理，可代替氪吸附完成超低比表面样品的测定，为医药行业尤其是进入药典的药品、电池材料以及3D打印常用金属粉末等超低比表面样品的测试，提供全新解决方案，同时还可以对膜的孔径进行测定。 iPore600iPore 600型能在测定3个微孔样品的同时，独立地对另外六个样品进行脱气，具有两套独立的真空系统，适合高校及研究单位对超微孔材料和微介孔材料的比表面及孔径进行精确分析，可广泛应用于电池材料、金属粉末、固体药物制剂（原料药API及其辅料）等超低比表面样品的质量控制和研发。 iChem 700iChem 700全自动程序升温化学吸附仪可用于对催化剂材料进行TPD、TPR、TPO、TPRx、脉冲化学吸附、催化剂处理、脉冲校准和动态BET比表面分析等，以对催化剂材料的酸碱度、酸碱分布、活性金属分散度、金属与载体的相互作用等进行分析，此外，可配置在线色谱仪，连续对TPRx产物进行定性和定量监测以及对脱附气体的浓度进行检测。

5月29日-6月1日， 由云南大学和赛默飞世尔科技（中国）有限公司共同主办的“2019年全国表面分析方法及新能源与新材料表征研讨会“在云南昆明圆满召开。来自国内外的120多名专家学者齐聚昆明，对XPS、Raman、电镜等在表面分析技术等交叉领域的最新研究进展及应用进行了交流和讨论。随着我国材料科学、化学化工、半导体及薄膜、能源、微电子、信息产业、生物医药及环境领域等高新技术的迅猛发展，表面分析技术在过去的几十年中有了长足进步，在科学研究领域的作用日益增长。“2019年全国表面分析方法及新能源与新材料表征研讨会”正是在这一背景下召开的一个多学科交叉的学术交流会议。大会伊始，来自云南大学的吕正红院士为研讨会做了开幕致辞。吕院士首先向参加本次研讨会的与会者表示欢迎和感谢，然后介绍了云南三所高校的历史发展，之后就XPS和UPS在OLED科研领域的应用作了详细的介绍。云南大学吕正红院士会议现场气氛热烈，互动频繁。台上，各位专家分享自己的工作内容及成果。台下，每一位与会者都听得津津有味，并做了认真记录。提问环节，台上台下就表面分析的研究进行了交流和探讨。据赛默飞表面分析及常量元素分析中国区商务经理范春明先生介绍，赛默飞从2014年起坚持每年举行全国表面分析技术研讨会，为仪器分析方法研究人员与科研人员搭建良好的交流平台。仪器分析方法研究人员在此开拓了眼界，为未来的科研工作埋下伏笔。科研人员借此可以了解更多关于表征方法的新进展，为未来在科研工作中获得更好的研究成果打下基础。本次会议聚焦的是新能源与新材料表征，明年将会聚焦其他热门领域。此次会议的举办也是赛默飞作为一家大型企业承担社会责任、促进相关技术交流的体现。会议合影

2021年，《高分子学报》邀请到国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写从基本原理出发的高分子现代表征方法综述并上线了虚拟专辑。仪器信息网在获《高分子学报》副主编胡文兵老师授权后，也将上线同名专题并转载专题文章，帮助广大研究生和年轻学者了解、学习并提升高分子表征技术。在此，向胡文兵老师和组织及参与撰写的各位专家学者表示感谢。高分子表征技术专题前言孔子曰：“工欲善其事，必先利其器”。 我们要做好高分子的科学研究工作，掌握基本的表征方法必不可少。每一位学者在自己的学术成长历程中，都或多或少地有幸获得过学术界前辈在实验表征方法方面的宝贵指导！随着科学技术的高速发展，传统的高分子实验表征方法及其应用也取得了长足的进步。目前，中国的高分子学术论文数已经位居世界领先地位，但国内关于高分子现代表征方法方面的系统知识介绍较为缺乏。为此，《高分子学报》主编张希教授委托副主编王笃金研究员和胡文兵教授，组织系列从基本原理出发的高分子现代表征方法综述，邀请国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写。每篇综述涵盖基本原理、实验技巧和典型应用三个方面，旨在给广大研究生和年轻学者提供做好高分子表征工作所必须掌握的基础知识训练。我们的邀请获得了本领域专家学者的热情反馈和大力支持，借此机会特表感谢！从2021年第3期开始，以上文章将陆续在《高分子学报》发表，并在网站上发布虚拟专辑，以方便大家浏览阅读. 期待这一系列的现代表征方法综述能成为高分子科学知识大厦的奠基石，支撑年轻高分子学者的茁壮成长！也期待未来有更多的学术界同行一起加入到这一工作中来.高分子表征技术的发展推动了我国高分子学科的持续进步，为提升我国高分子研究的国际地位作出了贡献. 借此虚拟专辑出版之际，让我们表达对高分子物理和表征学界的老一辈科学家的崇高敬意！ 原文链接：http://www.gfzxb.org/article/doi/10.11777/j.issn1000-3304.2020.20238《高分子学报》高分子表征技术专题链接：http://www.gfzxb.org/article/doi/10.11777/j.issn1000-3304荧光关联光谱在高分子单链研究中的应用周超 1,2 ,杨京法 1,2 ,赵江 1,2 1.中国科学院化学研究所机构　北京 1001902.中国科学院大学机构　北京 100049作者简介: 赵江，男，1967年生. 分别于1989年、1992年在吉林大学物理系获得学士、硕士学位，1995年于中国科学院物理研究所获得博士学位，之后分别于北京大学化学与分子工程学院、日本产业综合研究所、美国伊利诺伊大学从事博士后研究，2004年起于中国科学院化学研究所任研究员，入选中国科学院“百人计划”，2009年获得国家杰出青年科学基金资助，2013年当选美国物理学会Fellow. 以单分子荧光显微与光谱方法开展关于高分子物理基础性研究，研究方向包括：多电荷大分子、聚合物表界面、高分子动力学、相变与玻璃化转变等 通讯作者: 赵江, E-mail: jzhao@iccas.ac.cn摘要: 荧光关联光谱(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)是一项用于研究体系动力学性质的统计光谱技术，随着它被引入材料与化学研究领域，近年来取得了大量全新的研究成果. 该技术在高分子科学研究中也逐渐发挥出越来越大的作用，特别是在聚合物结构和动力学方面，这表明它在高分子领域的巨大潜力. 本文将从FCS的基本原理、实验技巧以及在一些具有挑战性体系中的应用等方面展开，着重介绍它在高分子溶液，如聚电解质溶液、高分子混致不溶现象，以及不同的表界面体系中取得的新成果，展示FCS区别于其他传统技术的特点和优势.关键词: 荧光关联光谱 / 高分子 / 聚电解质 / 表界面 / 混致不溶 目录1. 荧光关联光谱的基本原理2. 荧光关联光谱的实验技巧2.1 实验样品的标记和纯化2.2 激发体积的校准3. 荧光关联光谱在高分子单链研究中的应用3.1 FCS在聚电解质体系中的应用3.2 FCS在高分子混致不溶现象中的应用3.3 FCS在表界面体系中的应用3.4 FCS在有外场作用的体系中的应用4. 荧光关联光谱技术的发展和应用5. 结论参考文献高分子物理研究的目标之一是探究聚合物在不同尺度上的结构与动力学，及其对于高分子体系性质的决定性. 其中，聚合物构象是最为基础的研究内容. 高分子构象是指由于主链上单键内旋转而产生的分子链在空间的不同形态. 对于中性聚合物体系，由于分子链的结构自相似性，利用标度理论可以成功描述其在良溶剂、θ溶剂以及不良溶剂中分子链的尺寸. 散射技术是研究高分子链构象最成功的方法，如：光散射、X射线散射以及中子散射. 就动态光散射而言，它通过检测高分子溶液散射光强随时间涨落而得到其关联函数，从而获得单分子链的扩散速率信息，并获得分子链的流体力学半径信息[1,2]. 结合静态散射实验所获得的回转半径，可以确定聚合物在溶液中的形态[3,4]. 虽然光散射方法在具有短程相互作用的中性聚合物体系表征中非常成功，但是该项技术在一些条件或情形下却遇到了很大的困难，如：多电荷体系、多组分复合体系、表界面体系等. 在多电荷体系中，多重长程静电相互作用使得动态光散射信号中出现令人费解的“快慢模式”[5~7]. 用光散射法来考察高分子的混致不溶现象时，混合溶液中强烈的组分涨落导致强烈的光散射背景信号，严重影响了光散射对信息的提取[8]. 因此，采用新的技术和研究方法开展高分子表征无疑是重要的.荧光关联光谱(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)是表征高分子的有效新方法之一. 它与动态光散射同属于光子相关光谱技术，通过分析光信号的涨落而得到分子链动力学信息. 然而，FCS具有很高的探测灵敏度，通过获取荧光涨落信号而得到单个分子的动力学信息. 荧光关联光谱技术是由Madge、Elson和Webb[9~11]在20世纪70年代发展起来的，20世纪90年代，随着Rigler等[12]将共聚焦技术引入，FCS得到快速发展. 采用共聚焦显微技术，FCS的激发-探测空间体积缩小至~10−15 L，激发-探测空间内的分子数目大大地降低，实验的信噪比也随之提高. 与此同时，具有很高灵敏度的单光子检测器的采用使得FCS实现了单分子水平的测量. 随着计算机技术的进步，数据采集卡能够实时地进行数据的采集和相关性计算，使得FCS技术得到了重要的突破，在科学研究中的应用也越来越广泛.近年来，FCS在高分子物理研究中逐渐表现出重要作用，相比于传统的散射技术，它有着独特的优势. 第一，FCS具有极高的灵敏度，可以在极稀薄条件下(~10−9 molL−1)进行测量，同时具有达到光学衍射极限空间分辨率(~200 nm)与出色的时间分辨率(10−6 s). 第二，FCS的信噪比与聚合物的分子量无关. 在实验中，聚合物链通过化学键合的方式实现一比一的荧光标记，因此，分子量不同的样品对于信号的贡献相同. 但是，对于光散射技术而言，散射光强与聚合物分子量具有依赖性，因而信噪比也随之改变，分子量偏小样品的实验难度较大. 第三，对样品的荧光标记同样带来了可选择性与识别性，实现了同一体系中不同组分的区分式研究. 例如，通过对不同组分使用不同的荧光分子进行标记，采用多色FCS对各组分间的运动及其关联进行分析；也可选择性地对多组分体系中的特定组分进行标记，实现复杂体系中特定组分的研究.伴随着FCS技术的发展以及与其他研究手段的联用，其应用越来越广泛，从最初的生物领域[13~15]到胶体[16,17]、聚合物[18,19]，从溶液[20~23]到熔体[24~26]、凝胶[27~29]、表界面体系[30~32]等，都取得了许多原创性的成果. 值得指出的是，FCS在测量平动和转动扩散系数、反应速率常数、平衡结合常数、细胞内粒子浓度等方面有着突出的优势[33~35].1. 荧光关联光谱的基本原理当一个体系处于热力学平衡态时，分子的热运动会导致体系浓度、密度等发生局部涨落. 通过相关分析方法，计算这些局部涨落的关联函数，就可以从信号中提取出体系的热力学信息. 动态光散射技术正是运用了此方法，通过测量溶液的散射光强随时间涨落而获得其关联函数，从而获得样品的动力学信息. 荧光关联光谱测量共聚焦空间内样品荧光强度随时间的涨落，通过计算其关联函数而得到对涨落有贡献的热力学性质信息.在激发空间内在任一时刻荧光强度F(t)，激发空间内荧光信号在t时刻的强度涨落δF(t)为：其中，⟨F(t)⟩=1/T∫0TF(t)dt，为从0到T 时间内的平均荧光强度.上述涨落的归一化自关联函数为G(τ)：自关联函数包含了导致共聚焦空间内荧光信号强度涨落的所有信息，如：平动及转动扩散导致的荧光信号涨落、探针的光物理和化学变化(如：三重态)等导致的涨落等. 对于单光子激发体系，激发空间内的光强分布满足三维高斯分布，对在溶液中进行三维扩散的荧光分子而言，其浓度的涨落满足扩散方程，因而其关联函数的表达式为：其中，Veff=π1.5w02z0为激发空间的体积，特征时间τD=w02/4D为荧光分子通过激发空间所需的平均时间. G(0)=1/Veff⟨c⟩=1/N为激发空间内荧光分子平均数目的倒数，当样品的浓度越低时，G(0)值越大.从G(τ)的表达式可知，FCS的自关联函数有4个变量w0、z0、⟨c⟩、D，其中w0、z0属于仪器的参数，即共聚焦空间的横向半径与纵向半高度，而⟨c⟩、D分别是荧光分子的平均浓度和扩散系数. 因此，在准确标定仪器参数w0w0、z0z0的条件下，通过数值拟合将得到未知样品的浓度和扩散系数. 扩散分子的流体力学半径可以根据Stokes-Einstein方程得到：其中，kB为玻尔兹曼常数，T为温度，η为介质黏度.FCS仪器结构如图1所示，激光器的输出光经过准直扩束后由二向色镜反射进入物镜，并经物镜聚焦在样品中激发荧光. 产生的荧光由同一物镜收集，再次通过二向色镜以及滤镜将杂散的激光以及背景光过滤压制，最终由透镜聚焦并由针孔进行空间滤波进入到检测收集系统.图 1Figure 1. Schematic illustration of instrument structure of fluorescence correlation spectroscopy.由于单光子检测器可能出现接收一个光子产生多个电子的情况，为了消除这个过程带来的误差，可以将荧光信号分成等强度的两部分，然后对2个通道内的信号作交叉关联：2. 荧光关联光谱的实验技巧由于一般的聚合物不发光，因此FCS实验所采用的样品需要进行荧光标记. 另外，在实验操作方面，最需要注意对于激发体积的严格校准，以确保实验测量的准确性.2.1 实验样品的标记和纯化样品标记方法主要有以下2种：第一，在样品需要标记的位点预留反应的基团，如：氨基、羧基、叠氮基团等，再根据不同的基团及FCS实验的要求选择合适的活性荧光分子进行化学键合. 为了获得较高的标记效率，在标记过程中加入的荧光分子的量远大于聚合物，所以反应结束后有大量游离的自由荧光分子存在，需要通过体积排除色谱和超滤等方法进行分离提纯，直至滤液中不再检测到荧光信号.第二，在样品合成过程中加入适当比例的共聚合荧光单体进行共聚，例如，通过RAFT聚合制备聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)时，可以加入适当比例的荧光单体来合成具有一定分子量范围、分子量分布较窄和荧光标记的样品[36]. 反应完成后同样也需要超滤、透析等方式进行分离提纯.2.2 激发体积的校准FCS实验之前，需要对仪器进行校正得到仪器激发体积的参数. 采用已知浓度和扩散系数的荧光分子样品来进行校正，例如Rhodamine 6G (Rh6G)分子，它在纯水中的扩散系数为414 μm2s−1 (25 °C)，实验中一般将其配置成5×10−9 molL−1 (5 nmolL−1)的水溶液进行FCS测量，然后通过对测得的关联函数进行拟合即可得到激发空间的尺寸.另外，温度对于扩散系数的影响很大，不同温度下进行实验时，同样需要对扩散系数进行校正，校正的公式如下：如图2所示，以波长为488 nm的激光作为激发光，对FCS测量得到的Rhodamine 6G的自相关曲线进行拟合得到激发空间的尺寸为w0=0.224 μm，z0=1.608 μm.图 2Figure 2. A typical autocorrelation function curve and the fitting result of free Rhodamine 6G molecules in water.需要说明的是，FCS的测量会受到样品体系折射率不匹配的影响. 如图3所示，当样品溶液与物镜的折射率不匹配时，会导致表观的激发体积出现显著变化：第一，表观的w0值随折射率不匹配的增加而减小，这是折射率不匹配产生的像差导致；第二，随着物镜焦点位置从界面处愈加深入到样品溶液中时，折射率不匹配导致的表观w0值的变化愈明显[36].图 3Figure 3. (a) Representative normalized autocorrelation function curves of fluorescent nanoparticles diffusing in aqueous solution of glycerol at a small focal depth (25 μm) (b) Values of the apparent lateral radius of the excitation-detection volume of FCS as a function of the refractive index of the solution. The distance of the focal point in the sample medium away from the coverslip surface is displayed. (Reprinted with permission from Ref.[36] Copyright (2012) American Chemical Society).依据FCS的原理，w20=4DτDw02=4DτD，因此，即使微小w0变化也将显著影响探针分子拟合得到的扩散系数值. 因此，选择合适的溶液体系和物镜使得折射率尽可能匹配，对于FCS的测试准确性至关重要. 在折射率不匹配问题无法避免时，如图3(b)中，可以使用一个较低的焦点位置(25 μm)能有效地避免激发体积的畸变[36].此外，如图4所示，以厚度为0.16 mm的盖玻片为例，当实验使用物镜的校正环与样品池底部的盖玻片厚度不匹配时，激发体积的尺寸也会出现较大的偏差，所以在实验前还需注意物镜校正环与盖玻片厚度是否匹配[37].图 4Figure 4. Values of the apparent lateral radius of the excitation-detection volume of FCS as a function of the value of correcting collar (Reprinted with permission from Ref.[37] Copyright (2018) University of Chinese Academy of Sciences).因此，在FCS实验中，应该尽量选择合适的物镜类型以匹配样品的折射率，并调整镜头校正环数值与盖玻片厚度一致，如果折射率不匹配的情况不能避免，那就选择较低的、固定的焦点深度值以保证实验结果可靠可信.除了上述两点之外，在实验过程中还需要注意激光光强的选择，过强的入射光容易导致荧光探针发生光漂白而带来实验误差，因此应该降低进入物镜的激光光强进行实验.3. 荧光关联光谱在高分子单链研究中的应用FCS以其独特的优势在一些传统研究手段难以涉足的高分子体系中展现出独特的优势，例如：考察水溶液中聚电解质的单链动力学[38~44]、混致不溶现象中高分子链构象的变化[36]、表界面体系中高分子的扩散动力学[30~32,45~48]等等.3.1 FCS在聚电解质体系中的应用聚电解质是主链或者侧链上带有可离子化基团的聚合物，在极性溶剂中，聚电解质主链由于解离而带电，同时存在大量带有相反电荷的抗衡离子[49,50]. 正是聚电解质链间、链段间以及链与抗衡离子间多重长程静电相互作用，在赋予聚电解质丰富性质的同时，也给聚电解质的研究带来了很大的困难[51~53]. 例如，当采用动态光散射技术研究带电聚合物体系时，在低离子强度的聚电解质溶液中，存在“快与慢”的2种松弛模式. 为了探究聚电解质中的这种多级松弛模式的起源，研究人员进行了大量的实验并提出了多种可能的解释，但至今仍未有一个确切的回答[5,6,54~56].如果采用传统散射技术来研究低离子强度条件下带电聚合物体系的扩散运动，实验中遇到不少困难，而FCS实验中样品极稀浓度和极高选择性的优势就体现出来，依靠FCS技术，研究人员可以在极稀薄条件下进行实验研究，在聚电解质溶液体系获得全新的信息.Wang等[38]利用FCS在实验上第一次观察到了在无扰溶液中疏水聚电解质的一级构象转变. 如图5(a)所示，弱聚电解质聚(2-乙烯基吡啶) (P2VP)分子的构象随带电分数的变化而呈现出一级转变特征，即：随pH的升高由伸展的线团构象至坍缩的链球. 除了通过pH值改变聚电解质的带电分数，聚电解质的构象转变也可以由改变外加盐的浓度导致，即：抗衡离子吸附与静电屏蔽作用. 如图5(b)所示，P2VP的单分子链流体力学半径随着静电屏蔽长度的增加而连续增加.图 5Figure 5. (a) Diffusion coefficient of P2VP as a function of pH value of the solution. Inset: The hydrodynamic radius of P2VP as a function of pH value (b) The hydrodynamic radius of P2VP as a function of Debye length of the system (Reprinted with permission from Ref.[38] Copyright (2007) American Institute of Physics).Xu等[39]利用FCS技术在单分子水平上研究了强聚电解质的构象. 实验发现，在无外加盐的情况下，强聚电解质聚苯乙烯磺酸钠(NaPSS)和季胺化聚(4-乙烯基吡啶)(QP4VP)的流体力学半径和聚合度之间分别存在着0.7和0.9的标度关系，说明在低离子强度时，聚电解质链的构象比中性聚合物在良溶剂中溶胀的无规线团构象更加伸展. 如图6所示，采用棒状构象的分子模型得到了理想的拟合结果(其中QP4VP在高分子量部分出现偏离是高分子量聚电解质吸附更多的抗衡离子所导致的). 拟合结果显示分子链的直径分别为2.2和2.3 nm，这比理论假设的裸露水合聚电解链的直径0.8 nm要大很多，这也说明了聚电解质链的周围有抗衡离子云的存在.图 6Figure 6. Values of hydrodynamic radius of NaPSS and QP4VP plotted as a function of degree of polymerization. The solid lines denote the numerical fitting based on the theoretical model of diffusion of a rod-like molecule, and the dashed line denotes the fitting results using the diameter of a hydrated chain, i.e., d=0.8 nm. (Reprinted with permission from Ref.[39] Copyright (2016) American Institute of Physics).Xu等[40]进一步研究了在不同外加盐浓度情况下聚电解质链的构象. 如图7所示，聚电解质分子链构象具有分子量依赖性：在低盐浓度时，短链分子的聚电解质采取棒状构象，而长链分子采取无规线团构象；随着外加盐浓度的增加，所有的NaPSS和QP4VP均采取无规线团构象.图 7Figure 7. Diffusion coefficient of NaPSS (a) and QP4VP (b) as a function of degree of polymerization under salt concentrations of 10−4, 0.1, and 1.0 molL−1, respectively The solid lines represent the results of fitting using the relation of Rh∼N−v. (Reprinted with permission from Ref.[40] Copyright (2018) American Institute of Physics).Ren等[41]通过FCS技术研究了i-motif DNA的解折叠过程. 如图8所示，在不同盐浓度的条件下，随着pH值的升高，i-motif DNA均发生了从有序的四联体结构到无规线团的构象转变，并且这一转变对盐浓度有着依赖性：盐浓度越高，解折叠的起始pH值就越低. 这种盐浓度依赖性的主要原因是外加盐的引入导致更多的抗衡离子吸附在DNA链上而降低了链的电荷密度，降低了链周围的局部质子浓度，而后者是控制折叠形成的关键因素.图 8Figure 8. The values of hydrodynamic radius of a single i-motif DNA strand as a function of pH value in the solution Three conditions were chosen: solution without any salt addition (salt-free), and 50 mmolL−1 and 100 mmolL−1 NaCl solutions (physiological environment) The start and end points of the conformation transition are denoted by the arrows. (Reprinted with permission from Ref.[41] Copyright (2018) The Royal Society of Chemistry).如果将光子计数直方图(PCH)技术与FCS相结合，可以对聚电解质主链的电势、有效带电量、抗衡离子分布等方面进行深入研究. 例如，Luo等[42]将pH敏感的荧光探针标记于NaPSS链的不同位点，采用PCH技术测量分子链局部的pH值，发现聚电解质链附近的局部氢离子浓度比本体溶液中高2~3个数量级，而末端效应使得分子链中间的静电势高于末端的静电势. 同时，他们还发现氢离子浓度在径向呈现出e指数衰减的趋势，这证明了聚电解质链周围存在抗衡离子云的说法[43].Jia等[44]研究了抗衡离子分布与聚合物浓度的依赖关系，通过FCS测量NaPSS溶液中作为抗衡离子探针的带负电荧光分子的扩散系数，确定自由探针和吸附于主链的探针2个组分，发现与主链结合的抗衡离子组分随着聚合物浓度的增加而增加. Xu等[40]采用PCH测量NaPSS单分子链电位，发现其随着聚合度的增大而单调上升，且在聚合度大的区间达到饱和. 这说明主链的静电势与分子量不是线性关系，其有效带电分数以及有效电荷密度随着分子量的增加而减小. 上述实验结果说明聚电解质抗衡离子与主链的相互作用是吸附与脱附的动态平衡，而不是经典的Manning抗衡离子凝聚[57~60].3.2 FCS在高分子混致不溶现象中的应用高分子的混致不溶现象(cononsolvency)是一类回归型过程：2种高分子的良溶剂按一定比例混合后反而成为了不良溶剂[61,62]. 一个典型的例子是：常温下聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)在水与一定比例的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、DMSO等良溶剂的混合液中不再溶解，溶液的相分离温度显著改变，溶液黏度下降，PNIPAM凝胶溶胀率下降. 研究人员对这一现象的起源进行了大量的实验探究，至今未能达成共识[8,63~66].了解高分子链的构象对于理解混致不溶现象至关重要. 前人采用光散射方法研究了水和甲醇混合溶剂中PNIPAM链从线团到塌缩球再到线团的构象转变[64]. 需要特别说明的是，为了在极稀溶液中获得足够高的散射强度与信噪比，研究中采用了分子量高达107 gmol−1的样品. 当采用FCS技术研究该过程时，由于其超高的灵敏度以及与样品分子量无关的信噪比，可在混合溶剂环境下高分子单链的研究中提供独特的信息[67]. Wang等[36]利用FCS研究了PNIPAM在水-乙醇混合溶剂中的混致不溶过程. 如图9所示，PNIPAM具有非对称的回归型构象变化特征：随着乙醇浓度的增大，在一个很窄的乙醇浓度范围内PNIPAM链剧烈塌缩，然后在很宽的乙醇浓度范围内逐渐地再度伸展，说明这一构象转变不是先前文献中所认为的一级构象转变过程. 这表明乙醇分子比水分子更强烈地与PNIPAM链发生作用，这是由乙醇较强的疏水水合效应所致，暗示了Tanaka提出的模型中水合/失水的协同能力强于醇分子吸附/脱附的协同能力[65,66].图 9Figure 9. Normalized autocorrelation function curves of diffusing single chains of PNIPAM with five degrees of polymerizations in pure ethanol (a) and at xEtOHxEtOH of 0.25 (b) The solid line with each data set denotes the results of the numerical fitting using three-dimensional diffusion model Rh6G in (a) denotes the results of free fluorescent Rhodamine 6G, and its drastic difference from those of polymers indicates the successful labeling and sample purification (c) The values of hydrodynamic radius of PNIPAM single chains as a function of xEtOHxEtOH (Reprinted with permission from Ref.[36] Copyright (2012) American Chemical Society).如图10所示，不同乙醇浓度下得到PNIPAM单链的尺寸的标度率(Rh∼NυRh∼Nυ)表明，标度指数νν随着xEtOHxEtOH变化：随着乙醇的浓度的增加，ν从~0.57到0.5再到~1/3变化，说明在上述3个区域，PNIPAM高分子链分别采取了溶胀、无规线团、坍缩链球的构象，即：由纯水中的溶胀线团经无规线团构象而急剧转变为塌缩链球构象，进而又再度逐渐伸展，经过无规线团构象变化至溶胀线团构象. 从标度指数的变化也可以发现回归型链构象变化的高度非对称性，进一步印证了Tanaka提出的协同吸附-优先吸附模型[65,66].图 10Figure 10. Typical double-logarithmic plot of hydrodynamic radius of single PNIPAM chains as a function of degree of polymerization under different solvent compositions: (a)xEtOH=xEtOH=1.0, (b)xEtOH=xEtOH=0.28, (c)xEtOH=xEtOH=0.25 Solid lines are the least-squares linear fitting (d) The vv values as a function of xEtOHxEtOH The three dotted lines denote the theoretical values of the static scaling index for a random coil (0.588), an undisturbed coil (0.5), and a compact globule (1/3). (Reprinted with permission from Ref.[36] Copyright (2012) American Chemical Society).3.3 FCS在表界面体系中的应用受限高分子链，尤其是处于界面的高分子链结构及动力学性质，直接关系到表界面的机械性能、摩擦性能、流变性能等，这些性质与高分子材料在表界面上的应用息息相关，如涂料、润滑剂、胶黏剂等[68~71]. 但是对于高分子链在表界面处的动力学研究存在着不少技术难题，主要原因是表界面动力学带来的浓度涨落被局限于二维或准二维空间，探测难度极大，使得传统的散射方法难以应用. 近年来，得益于单分子技术的迅猛发展，空间和时间分辨能力分别有了显著的优化，极大提高了人们直接“观察”分子或粒子行为的能力，这为我们从分子水平认识聚合物在界面上的动力学性质打下了基础.荧光关联光谱因其极高的灵敏度与显微测量能力被成功地应用于表界面体系的研究中. 对于处于二维自由扩散的分子而言，其自关联函数为：其中，w0是二维FCS观察区域(即激发空间在界面等二维平面投影)的半径，⟨ρ⟩=⟨N⟩/A，即单位面积内荧光探针的平均数量，A是激发空间在界面等二维平面上投影的面积.Sukhishvili等[30]利用FCS研究了荧光染料标记的不同分子量的聚乙二醇(PEO)在固-液界面上的扩散. 从分子链界面扩散运动行为出发，分析出在极稀浓度的条件下聚合物分子在固-液界面上呈现出了紧密吸附的pancake构象，发现了界面扩散系数与分子量的-3/2的独特标度率. Zhao等[31,32]则利用FCS研究了PEO在固-液界面上扩散速率与界面吸附浓度的非线性关联性，即：随着聚合物浓度的增加，其扩散系数先增加并在某一浓度值达到极值，进而骤然大幅下降. 这是由于极低浓度分子链紧密吸附的pancake构象会随着吸附浓度的增加变成loop-tail-train构象，即：吸附使得分子链构象变得相对松散，其扩散速率由与基底接触的train部分占主导. 随着吸附浓度的增加，较为自由的loop-tail部分则增加了其运动能力，因此扩散系数增加；更高浓度时扩散系数出现骤降是因为体系中出现了jamming效应，即分子链间的作用增强，阻碍了分子链的扩散运动.Ye等[45]利用FCS研究了不同拓扑结构的聚合物链在石英-二氯甲烷界面上的扩散，如图11所示，线形聚苯乙烯(PS)扩散的标度率为D∼M−1.5，重现了reptation模型；而环形PS的标度率则为D∼M−1，展现为Rouse模型. 两者的差异是由于环形分子没有末端，无法像线形分子一样完成蛇行运动，而是由一系列链段受到热激发进行跳跃，跨过局部能垒的运动组成.图 11Figure 11. Double-logarithmic plots of center-of-mass diffusion coefficient against molecular weight for surface diffusion of cyclic (c-PS) and linear (l-PS) polystyrene chains on fused silica-DCM interface The solid lines with slopes of 1 and 3/2 are drawn as guides to the eye The dashed lines through the points representing the best fit of the data give power law slopes of 1.46 for linear chains and 1.00 for cyclic chains. (Reprinted with permission from Ref.[45] Copyright (2016) The Royal Society of Chemistry)Yang等[46]利用FCS研究了不同盐溶液作为液相时，NaPSS在疏水单层分子膜界面上的扩散行为. 如图12所示，吸附在疏水表面的聚电解质分子链的扩散受到液相中不同阴离子的影响，主要原因在于不同的阴离子效应改变了界面疏水相互作用强度，从而改变了界面与分子链之间摩擦力，造成扩散系数的显著改变.图 12Figure 12. Typical data of the lateral diffusion coefficient of a NaPSS single chain at the interface of a hydrophobic surface and an aqueous solution as a function of the salt concentration in the aqueous solution (Reprinted with permission from Ref.[46] Copyright (2011) American Chemical Society)Yang等[47]利用FCS技术研究了聚苯乙烯与聚异戊二烯(PI)的嵌段共聚物在二甲基甲酰胺(DMF)与PI聚合物构成的液体界面上的扩散运动. 如图13所示，在本体聚合物分子量跨越了2个数量级的变化，界面上PS-b-PI的扩散系数仅有轻微的下降. 这表明，在PI/DMF的体系中，存在很低黏度的界面层，该界面层的黏度与构成界面的本体聚合物的分子量不存在明显依赖性.图 13Figure 13. Interfacial diffusion coefficient of single PS-b-PI chain as a function of the molecular weight of bulk PI The dashed line is for the guide of eye Inset: illustration of the sample geometry (Reprinted with permission from Ref.[47] Copyright (2008) American Chemical Society).Li等[48]利用FCS探究了PEO分子在烷烃-水界面上的扩散行为. 研究发现，PEO在该界面上聚合物的横向扩散为正常扩散，与二维布朗运动模型相吻合. 如图14所示，液-液界面上的PEO的界面扩散系数与其聚合度之间存在D∼N−0.5的标度关系，这一新的标度关系表明其界面扩散运动遵循着新的运动机理.图 14Figure 14. The logarithm of interfacial diffusion coefficient of PEO as a function of the logarithm of molecular weight (Reprinted with permission from Ref.[48] Copyright (2020) The Royal Society of Chemistry).从单分子层面上研究界面扩散，有助于发现分子最真实和原始的扩散行为规律，这在传统的系综平均实验中往往会被忽略或者被多种因素耦合而产生的运动行为掩盖，这是上述FCS实验结果最大的优势之处. 此外，值得注意的是，在研究固-液界面上聚合物扩散机理时，不同研究团队利用FCS和单粒子追踪(single particle tracking, SPT)技术，得到了不同的结果及界面扩散机理，也因此导致了FCS和SPT 2种技术在界面分子动力学研究上存在多年的学术争论[30,31,72,73]. 我们基于这个问题也展开了实验对比，发现FCS和SPT都能够提供准确且可靠的实验结果，在条件满足时两者能够得到相互吻合相互匹配的实验结果，相关数据结果将在未来进行发表.3.4 FCS在有外场作用的体系中的应用对于聚合物而言，在其合成、分离、加工等过程中有可能会经历电场、流动场、剪切场等作用，尤其在生命体中更是常见. 因此，对于外场作用下的聚合物性质的研究也是极为重要的.当我们将荧光关联光谱应用于外场作用下的体系中时，除了分子热运动导致平动扩散引起的荧光信号涨落，还不得不考虑外场导致荧光分子定向运动通过激发体积带来的信号涨落. 带有定向运动的FCS，如果其运动的方向垂直于激光光束的方向，经过修正的模型拟合关联函数可以获得扩散系数与定向运动速率：其中，vf=w0/τf即为定向运动速率.Dong等[74]将FCS和毛细管电泳结合起来测定了量子点在极稀溶液中的表面电势. 利用FCS的自关联函数拟合得到荧光粒子的定向运动速度和扩散系数，在电泳实验中定向运动的特征时间τf和自扩散系特征时间τD之间满足：其中，Q为带电量，E为外加电场强度. 通过测定不同电场强度下定向运动和扩散的特征时间，通过线性拟合得到荧光粒子的表面电势. Wang等[75]利用FCS研究了P2VP在交变电场下的单链构象转变. 结果表明电场强度对于分子链构象的影响存在滞后转变. 这种滞后现象可以归因于单个疏水性聚电解质链的不对称双稳态能态，由于抗衡离子的解离、迁移和凝聚，其coil和globule构象之间的势垒可以通过交变电场诱导的偶极子降低到kBT以下.4. 荧光关联光谱技术的发展和应用随着FCS技术的发展，出现了双色荧光关联光谱(DC-FCCS)[76,77]、双焦点荧光关联光谱[78,79]、FCS与荧光共振能量转移(FRET)联用[80,81]、可连续改变共焦体积荧光关联光谱[82]等新技术. 这些新技术相较于传统的FCS，可以获取样品更多的热力学信息. 图15是DC-FCCS的简单示意图，采用2种波长的激光分别激发2种对应的荧光分子，然后选择性光学器件对不同波长的荧光进行分离，最后由2个APD检测器分别检测2种荧光信号，再对信号进行关联性分析. DC-FCCS的基本原理就不在此赘述，除了对2种荧光分子的荧光强度涨落进行各自的自关联分析之外，我们还可以对这2种荧光信号做交叉关联分析得到两者相互运动乃至相互作用的信息. 需要说明的是，选择的这2种荧光分子在光谱上必须分离得很好，否则会出现很大的串扰影响实验结果.图 15Figure 15. Schematic illustration of dual color fluorescence cross-correlation spectroscopyChen等[83]利用DC-FCCS和光散射相结合的方法深入研究了聚电解质溶液中单链运动之间的关联性，发现了聚电解质分子链间的运动耦合. 将DC-FCCS实验得到自关联函数的自由扩散部分转化为均方位移数据(MSD)，发现其在长短2个时间尺度上分别存在具有不同扩散系数的正常扩散运动，表明链间的静电排斥相互作用带来的“笼子效应”导致了单个分子链的自扩散运动中同样存在一快一慢2种时间尺度上的扩散模式：短时间尺度上为“笼子”内的快扩散行为，长时间尺度上为跨越不同“笼子”的慢扩散行为(如图16所示). 这2种松弛模式均存在强烈的离子强度依赖性，随着外加盐浓度的增加，削弱了链间的排斥作用而弱化了“笼子效应”，导致了长短时间尺度上的动力学非均匀性减弱，甚至消失. 实验结果还表明，聚合物浓度的增加限制了聚电解质链的运动，从而削弱了链间运动的关联性(如图16(b)所示). 将其与光散射中“慢模式”对应的扩散系数对比发现，“慢模式”对应的扩散系数数值处于分子链自扩散长短时间尺度的扩散系数之间，这说明光散射观察到的“快慢模式”与长程静电相互作用引起“笼子效应”有着密切的联系，同时也说明聚电解质的多级松弛过程比我们预想的更加复杂.图 16Figure 16. (a) Values of the diffusion coefficient of the short-time diffusion (Dshort-timeDshort-time) and the long-time diffusion (Dlong-timeDlong-time) of NaPSS with three different molecular weights under different salt concentrations (b) Diffusion coefficient of single NaPSS chain with three different molecular weights at short- and long-time lag as a function of concentration Diffusion coefficients measured by DLS (the slow mode, DDLS,slowDDLS,slow) are displayed for comparison. (Reprinted with permission from Ref.[83] Copyright (2019) American Chemical Society).5. 结论荧光关联光谱技术作为一种高灵敏度的显微统计光谱方法，能够有效地在多种复杂条件下开展高分子动力学的研究，包括：极稀薄溶液、表界面等等. 这项技术出色的空间分辨能力以及由于荧光标记带来的分子识别性，赋予了更加丰富的应用能力与前景. 随着这项技术的不断发展和应用范围的进一步拓展，相信未来它会和传统的散射技术一样被越来越多的人了解和使用，在多个领域都能取得丰富且具创造性的成果.致　谢　感谢研究生及合作者的辛勤劳动与贡献.参考文献[1]Wu C, Zhou S. Phys Rev Lett, 1996, 77(14): 3053−3055 doi: 10.1103/PhysRevLett.77.3053[2]Gao J, Wu C. Macromolecules, 1997, 30(22): 6873−6876 doi: 10.1021/ma9703517[3]Liu X B, Luo S K, Ye J, Wu C. 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3月29日，复旦大学化学西楼1楼多功能厅济济一堂，美国麦克仪器举办了题为&ldquo 粉体与纳米颗粒表面表征的最新进展&rdquo 的技术讲座，会议聚集了来自华东理工大学、上海师范大学、复旦大学、东华大学、上海电力大学、上海交通大学等知名高校以及一些国际国内知名企业参与。此次讲座热度远超我们预期，讲座刚刚开始，会议室就已经爆满，但仍有很多人慕名前来，其中还有孕妇不怕旅途颠簸仍坚持来参加我们的讲座，会议室已经到了站都站不下的地步。面对大家如此强烈的需求，为了不让大家失望，我们和学校联系另开辟了一间会议室，两个会议室讲座同期进行。爆满的会议室 讲座开始，麦克默瑞提克（上海）仪器有限公司总经理许人良博士首先对我们公司做了简单的介绍，接下来，应用部经理钟华博士做了颗粒粉体表征技术的讲座，主要介绍了物理吸附和化学吸附的一些应用知识，对应用过程中一些常见问题以及数据处理的技巧做出讲解，在座人员认真聆听并积极提出自己的疑问，钟华博士耐心解答，逐一解释，受到广大用户的好评。 麦克默瑞提克（上海）仪器有限公司总经理许人良博士就粉体与纳米颗粒表征进行了别开生面的讲解，从基础理论到具体表征方法，从广泛的应用领域到具体某个应用，许人良博士做了深入浅出的诠释。会议期间，广大参会者踊跃提问，许人良博士一一做出解答，并针对常见的问题，给出合理的指导与解释，受到广大参会者的高度评价。会议结束后，仍有部分用户在会议室和许人良博士热烈讨论问题，许人良博士渊博的知识让与会者印象深刻。大家纷纷表示此次会议受益匪浅，讲座中讲到的一些应用技巧可立即应用到实际工作中去。并表达了希望能多举办此类活动的愿望。许人良博士在讲座现场 美国麦克仪器成立于1962年，是材料特性实验室分析仪器和服务的领导者。1962年，美国麦克仪器研制出世界上第一台自动表面积分析仪，1965年，研制出世界上第一台压汞仪，1966年，研制出世界上第一台沉降式粒度分析仪。1982年，研制出世界上第一台全自动物理吸附仪，同年开发出第一台全自动化学吸附仪，1986年，研制出世界第一台六站吸附仪，1991年，研制出第一代带内置控制器的吸附分析仪，......2012年，研制出世界上第一台高精度同时三站微孔物理吸附仪。美国麦克仪器迈着坚实的脚步，引领行业的发展；通过自身研发，创造出一个又一个的奇迹。 美国麦克仪器产品在1979年进入中国市场，成为中美建交后最早进入中国市场的分析仪器。在为中国用户服务30多年后，于2011年3月在上海成立了麦克默瑞提克（上海）仪器有限公司，专业为中国市场提供美国麦克仪器公司的产品。公司总部设在上海，并在北京、广州、西安分别设有办公室。

2023年，市场监管总局（国家标准委）积极实施《国家标准化发展纲要》、《质量强国建设纲要》加大标准供给力度，以高标准引领高质量发展。市场监管总局数据显示，前三季度新批准发布国家标准1971项，同比增长超过110%。其中，工业领域发布国家标准1660项，占比84.2%。仪器信息网关注到，2023年，我国颗粒学领域标准建设工作成果斐然。多项颗粒表征技术及分析仪器相关国家标准发布或实施，涉及静态光散射法、静态图像法、电泳光散射法、离心沉降法、单颗粒电感耦合等离子质谱法、纳米颗粒跟踪分析法等，由全国纳米技术标准化技术委员会、全国颗粒表征与分检及筛网标准化技术委员会归口管理。本文特将上述标准加以整理，供相关从业者查阅参考。2023年度发布/实施的颗粒表征国家标准标准号标准名称发布日期实施日期GB/T 43196-2023纳米技术 扫描电子显微术测量纳米颗粒粒度及形状分布2023-09-072024-04-01GB/T 42732-2023纳米技术 水相中无机纳米颗粒的尺寸分布和浓度测量 单颗粒电感耦合等离子体质谱法2023-08-062024-03-01GB/T 42469-2023纳米技术 抗菌银纳米颗粒 特性及测量方法通则2023-03-172023-10-01GB/T 42311-2023纳米技术 吸入毒性研究中呼吸暴露舱内纳米颗粒的表征2023-03-172023-10-01GB/T 42348-2023粒度分析 颗粒跟踪分析法(PTA)2023-03-172023-10-01GB/T 42342.2-2023粒度分布 液相离心沉降法 第2部分：光电离心法2023-03-172023-10-01GB/Z 42353-2023Zeta电位测定操作指南2023-03-172023-10-01GB/T 41949-2022颗粒 激光粒度分析仪 技术要求2022-12-302023-07-01GB/T 42208-2022纳米技术 多相体系中纳米颗粒粒径测量 透射电镜图像法2022-12-302023-07-01GB/T 41948-2022 颗粒表征 样品准备2022-12-302023-04-01一、《纳米技术 扫描电子显微术测量纳米颗粒粒度及形状分布》本标准牵头单位为中国计量科学研究院，主要参加单位包括国家纳米科学中心、北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京理化分析测试中心）、山东省计量科学研究院、卡尔蔡司（上海）管理有限公司、北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司、中国检验检疫科学研究院、北京粉体技术协会等。纳米颗粒因尺度效应而具有传统大颗粒所不具备的独特性能，被广泛应用于生物医药、化工、日用品、润滑产品、新能源等领域。而纳米颗粒的粒度形状分布，直接关系到相应产品的性能质量及安全性，需要进行准确的测量表征。扫描电子显微镜（SEM）作为最直观、准确的显微测量仪器之一，在纳米颗粒测量表征中不可或缺。本标准从很大程度上完善和补充国内现有标准的不足，给出较为完整的颗粒粒径测量的分析评价方法，对于采用不同扫描电子显微镜（SEM）得到的颗粒测量结果一致性评判，具有重要的参考价值。标准解读详见：【标准解读】扫描电子显微术测量纳米颗粒粒度及形状分布 二、《纳米技术 水相中无机纳米颗粒的尺寸分布和浓度测量 单颗粒电感耦合等离子体质谱法》本标准由国家纳米科学中心、珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司、赛默飞世尔科技(中国)有限公司、岛津企业管理(中国)有限公司、清华大学、中国计量科学研究院、杭州谱育科技发展有限公司，安捷伦科技（中国）有限公司制定。单颗粒电感耦合等离子质谱法（spICP-MS）是一种在非常低的浓度中检测单个纳米颗粒的方法。与传统表征金属纳米颗粒技术相比，使用单台ICP-MS，不需联用设备就可以同时完成纳米颗粒的成分、浓度、粒径、粒度分布和颗粒团聚的检测，这是透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）等纳米粒径表征技术无法完成的，并且此方法可将样品中溶解的纳米颗粒离子与固体纳米颗粒区分开来。本标准是国内首项使用单颗粒电感耦合等离子体质谱方法表征纳米颗粒的国家标准，支撑spICP-MS作为一种普适性方法的推广与应用。标准解读详见：《单颗粒电感耦合等离子质谱法检测纳米颗粒》国家标准解读 三、《Zeta电位测定操作指南》 本标准由山东理工大学 、上海市计量测试技术研究院 、中机生产力促进中心有限公司 、河南中科智能制造产业研发中心有限公司制定。Zeta 电位通常用于研究液体介质中颗粒分散体系的等电点(IEP)和表面吸附，并作为比较不同样品静电分散稳定性的指标。Zeta电位不是可直接测量的量，而是使用适当理论确定的量。此外，Zeta电位不是悬浮颗粒的固有属性，而是取决于颗粒和介质属性，以及它们在界面上的相互作用。介质的化学成分和离子浓度的任何变化都会影响这种界面平衡，从而影响Zeta电位。因此，样品制备和测量过程都会影响测定结果。为了避免zeta电位测量操作问题使测量结果出现误差，需要一个统一的zeta电位测量操作指导原则。本标准发布实施，提供了使用光学电泳迁移法或电声法测定Zeta电位的样品制备和测量过程的操作指南。标准解读详见：ISO颗粒表征专家许人良解读《Zeta电位测定操作指南》国家标准 四、《纳米技术 多相体系中纳米颗粒粒径测量 透射电镜图像法》本标准牵头单位为国家纳米科学中心，主要参加单位包括国标（北京）检验认证有限公司、北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心）、深圳市德方纳米科技股份有限公司、中国计量大学、北京粉体技术协会等。透射电子显微镜（TEM）具有原子水平的分辨能力，它不仅可以在观察样品微观形态，还可以对所观察区域的内部结构进行表征，成为纳米技术研究与发展不可或缺的工具。特别是TEM配合图像分析技术对多相体系中纳米颗粒粒度进行分析具有一定的优势。本标准从很大程度上完善和补充国内现有标准的不足，给出较为完整的多相体系中纳米颗粒粒径分析评价方法，不仅对于多相体系中纳米颗粒的粒径这种需要探讨体系内部的颗粒测量给出了方案，而且对于不同TEM的颗粒测量结果一致性评判具有重要的参考价值。标准解读详见：【标准解读】透射电镜图像法测量多相体系中纳米颗粒粒径 五、《粒度分析 颗粒跟踪分析法(PTA)》本标准由中国计量科学研究院 、深圳国技仪器有限公司 、太原理工大学 、上海思百吉仪器系统有限公司 、中机生产力促进中心有限公司 、湖州中能粉体材料股份有限公司 、山东理工大学 、仪思奇(北京)科技发展有限公司 、珠海真理光学仪器有限公司 、大昌洋行（上海）有限公司等单位制定。PTA基于激光照射、散射光成像、颗粒识别及定位、单一颗粒跟踪等技术手段，对悬浮液中的颗粒扩散运动进行测量。近年来，学术界在脂质体及其他药物载体、纳米毒理学、病毒、外泌体、蛋白聚集、喷墨墨水、颜料颗粒、化妆品、食品、燃料添加剂及微气泡等工作中开始使用PTA技术进行表征。ASTM已发布了一个标准指南(E2834-12)，指导纳米颗粒跟踪分析法NTA测量粒径分布。本标准旨在扩展规范的范围并推进PTA操作的系统化。本标准概述了颗粒跟踪分析法的理论、基本原理及优缺点，同时对仪器配置、测量程序、系统确认和分析报告等进行了描述，数据含义阐述及解释是其中重要内容之一。六、《粒度分布 液相离心沉降法 第2部分：光电离心法》本标准由罗姆（江苏）仪器有限公司 、中机生产力促进中心有限公司 、安徽鼎恒实业集团有限公司 、中国计量大学 、长兴旭日粉体科技股份有限公司制定。尽管过去20年发展了多种颗粒表征新技术，但由于技术的进步(例如多波长特征)以及沉降技术是基于重力或离心场中定向运动（迁移）进行颗粒表征最本初的方法，沉降法在某种程度上重新焕发活力。作为一种分级技术，沉降分析有助于区分具有接近沉降速度的不同颗粒及其相应的等效斯托克斯直径。可以非常精细地分辨粒度分布，这与光谱集成技术相比是一个优势。此外，如果颗粒的扩散通量按沉降通量的顺序排，一些离心技术有助于对颗粒系统进行多维表征，即同时确定多个分布量(例如颗粒大小和密度或形状因子)。GB/T42342《粒度分布液相离心沉降法》是通过离心沉降法加速颗粒在液体中迁移来确定颗粒材料的沉降速度、沉降系数和粒度分布的方法。第1部分给出了离心沉降法的基本原理和指南，第2部分给出了用液相离心沉降法测定颗粒粒度分布的方法。七、《纳米技术 抗菌银纳米颗粒 特性及测量方法通则》本标准由国家纳米科学中心 、中国食品药品检定研究院 、中国医学科学院基础医学研究所制定。银纳米颗粒具有抗菌性能，成为在消费品中应用最广泛的纳米材料之一。银纳米颗粒越来越多地应用于消费品中，以控制产品表面或内部的微生物生长。尽管市面上有很多含银纳米颗粒的抗菌产品，但大多数产品在销售时并未提供纳米颗粒理化性质和抗菌特性的信息。目前，大多数生产商依据实践经验提供特性指标。在参考了纳米技术领域抗菌银纳米颗粒粉体和胶体的其他标准的基础上，本标准提供了银纳米颗粒特性指标及推荐测量方法的指南。本标准中推荐的主要测量方法可用于工业界具体参数确定。本标准总结选取了目前常用的测量方法，因此需要适时更新。八、《纳米技术 吸入毒性研究中呼吸暴露舱内纳米颗粒的表征》 本标准由国家纳米科学中心 、广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院制定。纳米颗粒吸入毒理学的一个关注点是确保从业人员和消费者的健康。为了进行纳米颗粒的呼吸毒理学研究，有必要对呼吸舱内纳米尺寸颗粒的浓度、尺寸和分布特征进行监测。监测细颗粒或粗颗粒的传统方法，如称重法，不足以用于纳米颗粒,因为纳米特性参数（如颗粒表面积、颗粒数目等）可能是关键的决定因素，需进行监测。本标准提供了一系列的呼吸暴露舱内纳米颗粒监测方法，既包括差分迁移分析系统(DMAS)，用于测量颗粒数量、尺寸、分布、表面积和估算质量浓度；也包括应用透射电子显微镜(TEM)或者扫描电子显微镜(SEM)进行形貌表征；还包括应用X射线能量色散谱(TEM-EDXA)进行化学成分分析。九、《颗粒 激光粒度分析仪 技术要求》本标准由中国计量科学研究院 、珠海真理光学仪器有限公司 、合肥鸿蒙标准技术研究院有限公司 、丹东百特仪器有限公司 、中国计量大学 、济南微纳颗粒仪器股份有限公司 、成都精新粉体测试设备有限公司 、堀场（中国）贸易有限公司 、上海思百吉仪器系统有限公司（马尔文帕纳科） 、大昌洋行（上海）有限公司（MicrotracMRB） 、上海理工大学 、珠海欧美克仪器有限公司等单位制定。激光粒度分析仪是用于测量颗粒大小及其分布的仪器。与其他粒度测量仪器相比，激光粒度分析仪具有粒度测量范围宽、测量速度快、测量重复性好和操作方便等优点。激光粒度分析仪在制造和使用中，制造单位和用户最关心的就是其性能指标。本标准对仪器的重复性、准确性、分辨力和Dso检测下限等提出具体要求，以规范仪器厂家的生产与宣传行为，便于不同实验室之间对粒度结果进行比较，利于用户选择适合自己需要的激光粒度分析仪。十、《颗粒表征 样品准备》本标准由深圳市德方纳米科技股份有限公司 、合肥鸿蒙标准技术研究院有限公司 、山东理工大学 、济南微纳颗粒仪器股份有限公司 、中国科学院过程工程研究所 、华南理工大学 、澳谱特科技（上海）有限公司 等单位制定。颗粒材料在国民经济的众多领域都起着重要的作用。在颗粒材料的研发、制备、生产与应用中，都离不开对颗粒特性的表征。除了需要对各类表征技术及分析仪器进行标准化外，对颗粒表征样品准备过程（包括取样、制样和样品转移等）的标准化也至关重要。适宜和规范的样品准备是得出正确颗粒表征特性的必要条件。本标准用于确立颗粒表征所用样品的准备程序，以指导颗粒测试人员得到正确的待测样品。

2021年，《高分子学报》邀请了国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写从基本原理出发的高分子现代表征方法综述并上线了虚拟专辑。仪器信息网在获《高分子学报》副主编胡文兵老师授权后，也将上线同名专题并转载专题文章，帮助广大研究生和年轻学者了解、学习并提升高分子表征技术。在此，向胡文兵老师和组织及参与撰写的各位专家学者表示感谢。更多专题内容详见：高分子表征技术专题 高分子表征技术专题前言孔子曰：“工欲善其事，必先利其器”。 我们要做好高分子的科学研究工作，掌握基本的表征方法必不可少。每一位学者在自己的学术成长历程中，都或多或少地有幸获得过学术界前辈在实验表征方法方面的宝贵指导！随着科学技术的高速发展，传统的高分子实验表征方法及其应用也取得了长足的进步。目前，中国的高分子学术论文数已经位居世界领先地位，但国内关于高分子现代表征方法方面的系统知识介绍较为缺乏。为此，《高分子学报》主编张希教授委托副主编王笃金研究员和胡文兵教授，组织系列从基本原理出发的高分子现代表征方法综述，邀请国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写。每篇综述涵盖基本原理、实验技巧和典型应用三个方面，旨在给广大研究生和年轻学者提供做好高分子表征工作所必须掌握的基础知识训练。我们的邀请获得了本领域专家学者的热情反馈和大力支持，借此机会特表感谢！从2021年第3期开始，以上文章将陆续在《高分子学报》发表，并在网站上发布虚拟专辑，以方便大家浏览阅读. 期待这一系列的现代表征方法综述能成为高分子科学知识大厦的奠基石，支撑年轻高分子学者的茁壮成长！也期待未来有更多的学术界同行一起加入到这一工作中来.高分子表征技术的发展推动了我国高分子学科的持续进步，为提升我国高分子研究的国际地位作出了贡献. 借此虚拟专辑出版之际，让我们表达对高分子物理和表征学界的老一辈科学家的崇高敬意！二维相关红外光谱分析技术在高分子表征中的应用Applications of Two-dimensional Correlation Infrared Spectroscopy in the Characterization of Polymers本文作者：侯磊，武培怡 作者机构：东华大学化学化工与生物工程学院,上海,201620作者简介：武培怡，男，1968年生. 1985年，南京大学化学系获学士学位，1998年，德国ESSEN大学获博士学位. 1998~2000年在日本触媒研究中心从事研究工作，2000~2017年任复旦大学高分子科学系教授，2017年起任东华大学化学化工与生物工程学院教授. 2001年入选上海市科委启明星计划、上海市教委曙光计划，2003年入选上海市科委白玉兰科技人才计划，2004年入选上海市科委启明星跟踪计划，获得国家杰出青年基金资助、上海市引进海外高层次留学人员专项资金资助，2005年度入选教育部首届新世纪人才计划，2007年入选上海市优秀学科带头人计划，2016年入选英国皇家化学会会士，2017年获陶氏化学“Dow Innovation Challenge Award”. 主要研究方向包括二维相关光谱在聚合物体系中的应用、智能仿生材料、聚合物功能膜等.摘要二维相关光谱作为一种先进的光谱分析方法，具有提高谱图分辨率、解析动态过程等优势，近来在高分子表征中引起了越来越多的关注. 高分子体系涉及了丰富的相互作用和复杂的结构，分子光谱是常用的表征手段，而借助二维相关光谱分析技术，能够有效识别精细结构、判别动态变化机制，从而显著丰富和完善分析结果. 本文重点围绕二维相关红外光谱，简述了发展历史和基本原理，随后结合实际过程，介绍了相关实验和分析技巧，最后列举了其在高分子表征中的典型应用，展示了二维相关红外光谱分析的特点，具体涉及温度响应高分子的响应机制、可拉伸离子导体中复杂相互作用、小分子在聚合物基质中的扩散、天然高分子的结构表征等研究. 希望通过本文的介绍，能够帮助读者更好地理解二维相关光谱，进一步拓展其在高分子领域中的应用.AbstractTwo-dimensional correlation spectroscopy (2Dcos) is an advanced analysis method, which holds great advantages in improving spectral resolutions and interpreting dynamic processes, and has attracted great attention in the field of polymers. Molecular spectroscopy is frequently applied in the characterization of polymers, which involves abundant molecular interactions and complex structures. Under the help of 2Dcos analysis, fine structures as well as dynamic mechanisms within the polymer systems can be effectively identified, thus significantly enriching and improving the analysis results. In this paper, we will mainly focus on the two-dimensional correlation infrared spectroscopy (2DIR). Firstly, the history and basic principles of 2Dcos are briefly introduced. Then, some relevant experimental and analytical techniques are presented based on the actual process. Finally, typical applications of 2DIR in the polymer characterization are demonstrated and the features thereinto are also shown. Particularly, the response mechanisms of temperature-responsive polymers, complex molecular interactions in stretchable ionic conductors, diffusion processes of small molecules in polymer matrix and structures of natural polymers are investigated. It is hoped that this paper will help readers better understand 2Dcos and further expand its applications in the field of polymers.关键词分子光谱   二维相关光谱   高分子   分子相互作用 KeywordsMolecular spectroscopy   Two-dimensional correlation spectroscopy   Polymer   Molecular interactions  高分子材料体系涉及丰富的相互作用和多级结构，这是决定材料最终性能的关键. 分子光谱(红外、拉曼光谱)作为表征高分子材料的常用手段，一方面可以检测不同化学结构/组分所对应的官能团，依据特征吸收峰强度和位置，实现对高分子化学结构的鉴别，另一方面，可以基于不同官能团特征吸收峰的强度和位置变化，判别基团所处的物理或化学环境，实现对体系中复杂相互作用的解析. 随着高分子材料的发展，体系趋向多样化、多功能化，而传统的一维分子光谱存在谱峰重叠严重、分辨能力有限等问题，一定程度限制了分子光谱在复杂高分子体系的应用拓展.二维相关光谱(Two-dimensional correlation spectroscopy，2Dcos)作为一种先进的光谱分析手段，尤其适合于从分子水平探讨各类外扰作用下复杂高分子体系涉及的结构和相互作用变化. 相较于传统的一维光谱，二维相关光谱的优势在于：(1)对于包含许多重叠峰的复杂谱图，起到图谱简化的作用；(2)通过将原始谱图在第二维度上延伸，能够明显提高原始一维谱图的分辨率；(3)谱峰的相关性可帮助判断体系中的相互作用以及峰归属；(4)可用于确定外界刺激下不同过程的发生次序. 本文首先将结合二维相关光谱的发展历史，介绍其基本原理. 其次，围绕动态谱图获取和二维相关分析，介绍二维相关光谱的一些实验和分析技巧. 最后，结合具体体系，重点阐述二维相关光谱在高分子表征中的应用.1 基本原理1.1 发展历史二维相关光谱分析方法的基本概念最早起源于核磁共振(NMR)领域. 二维核磁共振(2DNMR)谱通过多脉冲技术激发核自旋，采集原子核自旋弛豫过程的衰减信号，最后经双重傅里叶变换得到[1]. 通过将核磁信号扩展到第二维度，可以显著提高谱图的分辨率，并且有效简化包含许多重叠峰的复杂光谱. 与此同时，通过选择相关的光谱信号，可以鉴别和研究分子内/间的相互作用. 尽管二维光谱技术在核磁领域取得了快速发展，却在很长一段时间内未能深入到其他光谱分支，如红外、拉曼、紫外-可见吸收、荧光光谱等. 阻碍二维光谱技术发展的一个根本原因在于多重射频脉冲的二维核磁技术可以成功地在精密而昂贵的核磁仪器上实施，却不能在普通的红外、拉曼和紫外-可见吸收等光谱仪器上实现. 因为这类光谱的时间标尺(time scale)远小于核磁共振[2]. 一般来说，核磁时间标尺数量级在毫秒到微秒之间，而红外吸收光谱观察分子振动的时间标尺在皮秒数量级，因此产生二维红外光谱必须采用特殊的新途径.二维相关光谱概念上的突破是由特拉华大学(University of Delaware)的化学家Noda[3,4]提出的. 他把核磁实验中的多重射频励磁看作是一种对体系的外扰(外部扰动). 施加于体系的外扰可以多种多样，如热、磁、机械、电场、化学甚至声波等. 每种外扰对体系的影响是独特而有选择性的，并由特定的宏观刺激和分子相互作用的机理所决定. 因此，包含在动态光谱中的信息类型是由外扰的方式和电磁波的种类所决定的. 外扰的波形没有任何限制，从简单的正弦波、脉冲、到随机的噪音或静态的物理量(如时间、温度、压力等)的变化均可应用于外扰. 由此，Noda设计出一种完全不同的二维光谱实验技术，他用外扰来激发被检测体系的分子，由于被激发分子的弛豫过程慢于振动光谱的时间标尺，因而可使用时间或温度等外扰分辨振动光谱(红外、拉曼)技术来跟踪研究被检测体系受外界扰动而产生的动态变化，结合数学中的相关分析技术，将原有的光谱信号扩展到第二维度，从而得到二维相关光谱(如图1所示). 二维相关光谱实际研究的就是动态光谱的变化[5,6]. 此后，随着二维相关光谱技术的发展，逐渐在荧光光谱、X射线衍射谱、凝胶渗透色谱等也得到了应用. 总体而言，二维相关光谱分析在红外光谱中的应用最为成功，这主要是由于红外光谱的信噪比相对较高，具有高灵敏度、高选择性和非破坏性等特点，能够在分子结构和链段运动等方面提供丰富信息. 另一方面，红外光谱的谱峰重叠严重，解析起来存在一定困难，二维相关光谱的引入可以很好地解决这一问题. Fig. 1 Acquisition procedure of generalized 2D correlation spectra. In the 2D synchronous and asynchronous spectra, red colors represent positive intensities while green colors represent negative ones.1.2 计算原理二维相关光谱考虑外扰变量下(如时间、温度、压力、浓度、电场、磁场等)光谱强度y(v, p)的变化情况，其中v为光谱变量，可以为任何光谱量化的参数，如红外波数、拉曼位移、紫外波长、X射线散射角等，p为外扰变量，可以是任意合理的物理或化学变量，如时间、温度、压力、电场强度、浓度、pH、离子强度等. 对于体系在一定外扰区间(1~N)下引起的动态光谱y˜(v, p)定义为[2,5]：y¯(v)为体系的参考光谱，通常选为平均谱. 参考光谱的定义为实际过程中，可以选择某一个参考点p = Pref处的光谱作为参考光谱. 参考点可以是实验的初始状态或结束状态，也可以直接简单地设为0，这种情况下，动态光谱即为我们观察到的光谱强度.二维相关强度X(v1, v2)表示在外扰变量区间内，对光谱变量v1和v2光谱强度变化y˜(v, p)的函数进行比较. 由于相关函数是计算2个互不依赖的光谱变量v1和v2处强度的变化，因此可以将X(v1, v2)转变为复数形式[2]：这里，组成复数的相互垂直的实部和虚部分别称作同步和异步二维相关强度. 同步二维相关强度Ф(v1, v2)表示随着p值的变化，v1和v2处光谱强度的相似性变化，而异步二维相关强度Ѱ(v1, v2)则表示光谱强度的相异性变化.二维相关光谱的快速计算方式在于对动态光谱进行Hilbert-Noda变换，将其从外扰域转换到频率域上，最终得到二维相关光谱[2,5].二维相关同步谱：二维相关异步谱：其中Mjk代表Hilbert-Noda转变矩阵的第j行第k列的元素，表示为：1.3 解谱规则二维相关光谱图包含同步谱和异步谱2类，图1展示了典型的同步和异步谱图.1.3.1 二维相关光谱同步谱图二维相关光谱同步谱图表现了给定2波数v1和v2处光谱强度的同步或者一致变化. 同步谱图沿对角线(对应于光谱坐标v1 = v2)方向对称，其中相关峰可以出现在对角线上，也可以出现在对角线外. 落在对角线上的相关峰称作自动峰，自动峰强度对应于外扰过程中光谱变化的自相关函数. 在同步谱中，自动峰的强度始终为正，代表了对应波数下光谱强度动态波动的整体程度. 所以，在动态谱图中表现出更大程度强度变化的区域对应的自动峰越强，而那些基本保持不变的峰自动峰强度小甚至没有自动峰. 交叉峰处于同步谱图的非对角线区域，表现了不同波数光谱信号的同步变化. 这样一种同步的变化，反过来，预示着2波数间可能存在一定的相关性. 尽管自动峰的强度始终为正，但交叉峰的强度可正可负. 如果2波数的交叉峰为正，说明这2个波数对应的光谱强度在外扰下同时增加或者同时降低；如果两波数的交叉峰为负，说明这2个波数对应的光谱强度一个增加另一个降低.1.3.2 二维相关光谱异步谱图异步谱图呈现了2个给定波数v1和v2处光谱强度的异步或者相继变化，它关于对角线反对称. 异步谱图中只有交叉峰，而无自动峰. 异步交叉峰只有在2个给定波数的光谱强度发生异相(如延迟或加快)变化时才出现. 这一特点尤其可以帮助区分光谱中的来源不同的重叠峰. 于是，外扰过程中，混合物中的不同组分、材料中的不同相或者化学基团经历不同的变化对光谱强度的贡献能够得以辨别. 即使是2个谱带靠的很近，只要它们的瞬间特征或者时间依赖光谱强度变化模式存在本质不同，它们之间便会出现异步交叉峰. 所以异步交叉峰的出现意味着这些谱带有着不同的来源或者是不同分子环境下的官能团. 异步谱图的交叉峰可正可负，而异步谱图中交叉峰的符号可以用来辅助判断谱带在外扰过程中的变化次序.1.3.3 二维相关光谱读谱规则利用同步和异步谱图的交叉峰，可以获得外扰条件下光谱强度发生变化的先后次序关系. 为方便表述，将同步谱图中(v1, v2)处的峰强度记为Φ(v1, v2)，将异步谱图中(v1, v2)处的峰强度记为Ψ(v1, v2). 根据Noda规则[5]：(1)当Φ(v1, v2) 0时，如果Ψ(v1, v2) 0，则v1谱带处的强度变化发生先于v2谱带处的强度变化(表示为v1→v2)，而如果Ψ(v1, v2) 0，则v2→v1；(2)当Φ(v1, v2) 0时，如果Ψ(v1, v2) 0，则v2→v1，而如果Ψ(v1, v2) 0，则v1→v2. 简单说来，如果(v1, v2)在同步和异步谱图的交叉峰符号一致(都为正或者都为负)，则v1→v2；如果(v1, v2)在同步和异步谱图的交叉峰符号不一致(一个为正而另一个为负)，则v2→v1.2 实验技巧二维相关光谱作为一种有效的光谱分析手段，是针对一系列动态光谱的数学分析，具体可分为2个过程：动态谱图获取和二维相关分析. 本节将结合实际操作过程，介绍二维相关红外光谱的一些实验和分析技巧.2.1 动态谱图获取2.1.1 样品制备对于固体聚合物样品，溴化钾压片法制备的样品可直接用于透射红外光谱测试；另外，还可使用溶液铸膜(solution casting)法在红外窗片上直接制备得到适合透射红外光谱测试的薄膜. 对于溶液样品，主要应考虑样品的密封问题，避免测试过程中溶剂的挥发. 此外，水溶液或者水凝胶样品，为避免H2O分子的红外吸收对高分子链上C―H和C＝O基团吸收峰的影响，可以用D2O作溶剂.2.1.2 测试条件测试模式方面，为得到高信噪比的红外光谱图，一般使用透射模式进行数据采集. 特殊的样品也可选用其他附件，例如对样品表面进行研究时可选用ATR附件. 测试条件方面，为兼顾扫描时间和信噪比，可设置红外谱图分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次.2.1.3 测试环境二维相关光谱的特点在于只对光谱的变化敏感，能够显著放大一系列动态光谱的变化情况. 不论样品浓度、厚度如何，如果其处于静态，不发生变化，则对应的二维相关光谱无任何信号. 因此，为了使二维相关光谱的信号只来源于样品本身的结构变化，需要保证测试过程中环境的相对稳定，排除测试环境变化引起的水或二氧化碳吸收峰变化的干扰. 通常，可以借助干燥空气或者氮气吹扫，待测试环境稳定后进行背景采集，随后开展一系列动态光谱的采集.2.2 二维相关光谱分析将采集的一系列动态光谱在特定的软件上进行数学处理，即可得到二维相关光谱同步和异步谱图. 目前，能够快速获得二维相关光谱的软件种类很多[7]，大都是免费获取或者是商业化的软件，包括2D Shige、TDCOS、Mat2DCorr、2DCS、Midas 2010、R corr2D、Python Scikit Spectra、Python NumPy等. 关于二维相关光谱的谱图分析，重点在两部分：精细结构的分辨和动态过程的解析. 二维相关光谱异步谱可以区分光谱中来源不同的重叠峰，将异步谱中谱峰对应的波数进行基团归属，即可分辨体系的精细结构. 此外，通过结合同步谱和异步谱交叉峰的符号，可以获得外扰条件下光谱强度发生变化的先后次序关系. 为了方便解析复杂体系谱峰响应的先后次序，根据Noda规则，本课题组提出了一种简便的判断方式[8]. 如表1、2所示，分别读出了图1异步谱中所有谱峰对应的波数及其在同步和异步谱中交叉峰的符号(强度正负)，之后将其对应一一相乘，结果如表3所示. 该表中每一个正值都代表它所对应的横轴的波数先于或快于纵轴的波数响应，而每一个负值代表它所对应的横轴的波数后于或慢于纵轴的波数响应. 基于此，可以直观地得出对应动态过程的谱峰响应次序(“→”表示先于或快于)：1647→1628→1622→1615 cm-1.Table 1 Signs of cross-peaks in synchronous spectrum (corresponding to Fig. 1).Table 2 Signs of cross-peaks in synchronous spectrum (corresponding to Fig. 1).Table 3 The final results of multiplication on the signs of each cross-peak in synchronous and asynchronous spectra.3 典型应用基于二维相关光谱在判断精细结构和解析动态过程的优势，本节将结合本课题组的研究工作，介绍二维相关光谱在高分子表征中的应用，主要涉及温度响应高分子的响应机制、可拉伸离子导体中复杂相互作用、小分子在聚合物基质中的扩散机理等.3.1 温度响应高分子的响应机制温度响应高分子能够在外界温度发生变化时改变自身的物理或化学性质，形成对环境的感应并产生反馈，在智能传感、药物缓释、可控驱动、过滤分离、智能窗户等领域得到了广泛关注和应用[9~11]. 温度响应高分子的响应过程往往源于分子结构或链构象的变化，分子光谱(红外、拉曼光谱)对分子基团及相应的相互作用十分敏感，非常适合于研究其中的响应机理. 传统的一维分子光谱存在谱峰重叠严重、分辨能力低以及难以捕捉动态过程等不足，借助二维相关光谱分析，可以对温度响应高分子的精细结构和动态响应机制进行深入解析，探讨其中的构效关系.聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)在水溶液中呈现LCST (lower critical solution temperature)型转变，即升温过程发生相分离，相转变温度约为32 ℃[12]. PNIPAM分子链同时存在亲水的酰胺基团和疏水的碳链骨架、异丙基侧基，利用变温红外光谱对PNIPAM水溶液升温过程进行跟踪，观察到vas(CH3)和vs(CH2)吸收峰波数的降低以及Amide I区域1625和1649 cm-1处吸收峰的相互转化，表明聚合物链C―H基团的脱水和分子间/内氢键C＝O… H―N的形成. 基于二维相关光谱分析，获取了PNIPAM水溶液相分离的微观动力学机理：温度升高首先发生侧基CH3的两步脱水，随后是主链的塌缩和聚集，最后为酰胺氢键的形成，并最终导致了相分离[13].PNIPAM的LCST型转变对溶剂组成也十分敏感. 尽管水和甲醇都是PNIPAM的良溶剂，但在两者以一定比例混合的状态下对PNIPAM则为不良溶剂. 例如：当甲醇和水的体积比为0.35:0.65时，PNIPAM在该混合溶剂中的LCST约为-7.5 ℃，这种现象称为“共不溶”现象. 利用红外光谱和二维相关光谱分析研究PNIPAM在水/甲醇混合溶剂中温度响应行为[14]，传统一维红外光谱分析表明，相比于纯水溶液，PNIPAM链在水/甲醇混合溶剂中处于塌缩的状态，并且PNIPAM和甲醇的相互作用明显被削弱了，这主要归因于混合溶剂中水-甲醇团簇的形成导致了PNIPAM链水合位点的减少. 进一步的二维相关红外光谱分析证实了水-甲醇团簇对PNIPAM链水合过程的抑制作用.除此之外，本课题组还探讨了其他LCST型聚合物的转变机理[15~19]、共聚(无规共聚、嵌段共聚)结构对温敏聚合物相变行为的影响[20~22]、温度响应水/微凝胶的体积转变过程[23~25]等，相关工作已进行过系统总结[26,27]，这里不再赘述.水凝胶结构与生物组织十分相近，在仿生皮肤等领域获得了广泛关注. 将两性离子单体与丙烯酸(acrylate acid, AA)共聚，通过调节盐浓度，制备得到具有优异可塑性、可拉伸性、自愈合性的超分子聚电解质水凝胶[28]. 同时，聚电解质的离子传输性质赋予了水凝胶对温度、应变、应力的多重感知功能. 基于对干态和湿态凝胶的红外光谱解析，获取了该水凝胶涉及的丰富的分子间/内相互作用，包括聚丙烯酸(PAA)链段羧基之间的氢键相互作用、两性离子链段中磺酸根与季铵盐的静电相互作用、PAA链段羧酸根和两性离子链段季铵盐的静电相互作用等，而这些丰富的分子间/内相互作用是该超分子水凝胶力学性能的决定性因素. 在此基础上，用甲基丙烯酸(methyacrylate acid, MAA)取代丙烯酸，即在PAA链段引入疏水的α-甲基，通过调节MAA和两性离子单体的比例，实现了超分子水凝胶在LCST和UCST (upper critical solution temperature)行为之间的转变[29]，如图2所示. 具体地，当两性离子单体与MAA质量比大于1时，聚合物在水溶液中表现出UCST行为；当两性离子单体与MAA质量比等于1时，聚合物在宽的温度范围(10~80 ℃)内均不溶于水；两性离子单体与MAA质量比小于1时，聚合物在水溶液中表现出LCST行为. 同时，LCST和UCST可以通过两性离子和MAA单体的共聚比例方便地进行调节. 二维相关红外光谱从分子水平有效揭示了这一体系独特相行为的产生原因. 结果表明，羰基氢键结构的转化是LCST型水凝胶相行为的驱动力，而磺酸根涉及相互作用(水合作用、静电作用等)的变化是UCST型水凝胶相行为的驱动力.Fig. 2 (a) The chemical structure of the polyzwitterion Turbidity curves and typical photos for the (b) UCST- and (c) LCST-type hydrogels Temperature-dependent FTIR spectra (d, e) and 2D correlation spectra (f, g) of typical UCST- and LCST-type hydrogels (Reprinted with permission from Ref.[29] Copyright (2018) American Chemical Society).在天然的阳离子多糖(季铵化壳聚糖)中原位聚合亲水的阴离子单体(AA)，构筑了具有温度、pH、机械力、电学等刺激响应行为的双网络聚电解质水凝胶. 该水凝胶同时集成了生物相容、离子传输、黏附、可拉伸、自愈合等多种功能，可作为仿生离子皮肤用于监测压力、温度、pH、电信号等刺激引起的生理信号变化[30]. 值得注意的是，该离子皮肤具有温度可调的黏附性，即升温黏附强度提升，降温黏附强度下降，例如水凝胶在猪皮上37 ℃下的黏附强度是20 ℃下的5.5倍，且具有良好的循环稳定性，这主要源于聚电解质水凝胶的UCST型转变. 季铵化壳聚糖由疏水主链和亲水的季铵盐基团组成，具有两亲性结构，通过改变聚合过程中AA组分的比例，可以实现对双网络聚电解质水凝胶相变行为的调控. 利用温度分辨红外光谱及二维相关分析对水凝胶的温度响应机理进行研究，结果表明体系的UCST型转变源于焓变驱动的季铵化壳聚糖与PAA链段间离子相互作用的解离和氢键作用的增强. 关于水凝胶的黏附性，涉及了丰富的分子相互作用，如PAA与基体间的氢键、季铵化壳聚糖与基体间的疏水相互作用、离子相互作用等. 二维相关红外光谱分析表明，升温相变过程中离子对解离，释放了大量解离的羧基，促使了PAA链段中羧基二聚体之间强氢键以及与季铵化壳聚糖链段羟基之间氢键的形成，提高了水凝胶的强度. 同时，水凝胶中羧基二聚体的形成有利于氨基的质子化，从而改善了组织黏附性.聚甲基丙烯酸(PMAA)在合适的水环境中也可表现出LCST型相转变[31]. 通过在PMAA水溶液中引入AlCl3等无机盐，调节盐浓度，实现了体系相转变温度的广泛可调，并构筑了具有多级结构、可实现紫外-可见-红外宽谱带光管理的新型水玻璃. 该水玻璃不仅可以可逆地切换可见光区域的透射率，阻挡紫外和红外光，还具有缺口不敏感性、自我修复断裂和划痕的功能. 借助二维相关红外光谱可对该水玻璃的动态响应机制进行解析，经分析，PMAA链段上不同化学基团在升温过程的响应次序为：α-甲基→亚甲基→羧基，表明疏水的α-甲基的脱水合是该体系相转变过程的驱动力，导致了聚合物主链的塌缩以及羧基之间氢键结构的解离. 此外，温度分辨小角X射线散射(SAXS)、微小角中子散射(VSANS)光谱证实了聚合物链塌缩引起的散射强度增加，从而产生可见光透过率的变化.一些聚电解质复合物在水溶液中也表现出热致相转变行为[32]. 通过调节典型聚电解质复合物——聚苯乙烯磺酸盐/聚二烯丙基二甲基铵在溴化钾水溶液中的浓度，同时观察到了LCST和UCST型相转变现象：低浓度下，聚电解质复合物呈现UCST型固液相转变；高浓度下，聚电解质复合物则表现为LCST型液液相分离. 基于温度分辨拉曼光谱和二维相关光谱分析，深入研究了体系中的水合效应和阴-阳离子相互作用. 研究发现，在水溶液中，聚电解质复合物的阴-阳离子相互作用呈现2种状态：直接接触型离子对(contact ion pairs, CIPs)和溶剂分离型离子对(solvent-separated ion pairs, SIPs). 聚合物浓度较低时，疏水的聚电解质链段使得阴-阳离子直接结合，CIPs占主导，而温度的升高导致了CIPs的解离，从而引起体系的UCST型转变；聚合物浓度较高时，CIPs比例低，升温导致了阴-阳离子的结合，从而引起体系的LCST型转变. 二维相关拉曼光谱分析则给出了相转变过程中的基团衍化次序，进一步揭示了聚电解质复合物两种截然不同的相转变机理：UCST型体系升温呈现出阴-阳离子相互作用逐渐减弱的解离过程，即“CIPs→SIPs→自由离子”，而LCST型体系升温呈现出阴-阳离子相互作用逐渐增强的缔合过程，即“自由离子→SIPs→CIPs”(图3). Fig. 3 2D correlation synchronous and asynchronous Raman spectra of polyelectrolyte complexes with (a) UCST- and (b) LCST-type transitions (c) Schematic illustration of the phase transition mechanisms (Reprinted with permission from Ref.[32] Copyright (2020) American Chemical Society).将温度响应聚合物引入分离膜，能够赋予膜材料温度响应功能，实现可控的物质分离[33]. 利用温敏性聚N-乙烯基己内酰胺(PVCL)和非温敏性聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)协同稳定金属有机框架(MOF)纳米片，并进一步抽滤得到层层堆叠的温度响应纳米片复合膜. 其中PVCL提供温敏性，PVP提供支撑作用，PVCL和PVP的协同作用使得在升降温循环过程中，层间纳米孔道体积既可以同步增大和缩小，而层间距维持稳定. 所得MOF纳米片复合膜水通量及对染料截留能力具有温度敏感性. 温度升高，PVCL链塌缩使得层间纳米孔道体积增大，因而水通量增大，且升降温循环过程稳定性良好. 将尺寸相近的3种染料分子(亮绿、中性红、结晶紫)混合液进行过滤测试发现，随温度升高，尺寸较小的亮绿和中性红分子截留率下降明显高于结晶紫. 值得注意的是，对不同温度下滤液的紫外-可见光谱进行二维相关光谱分析，可以得到不同染料随温度升高的流出顺序：亮绿→中性红→结晶紫，证实了复合膜中纳米孔道尺寸随温度升高而逐渐增大. 利用二维相关红外光谱进一步对纳米片复合膜的温度响应机制进行了解析，结果显示，PVCL链段在升温过程的脱水和塌缩作为复合膜温敏行为的驱动力，降低了MOF纳米片的界面润湿性，最终导致纳米孔道的变化，而PVP链段在这一过程中并未发生明显变化，主要起到层间支撑作用(图4).Fig. 4 (a) Temperature-dependent FTIR spectra of the composite membrane (30-60 ℃). The arrows indicate the spectral variation trends at different wavenumbers (b) 2D correlation synchronous (left) and asynchronous (right) spectra of the composite membrane (c) Schematic illustration of the "smart" membrane separation performance (Reprinted with permission from Ref.[33] Copyright (2020) Springer Nature).3.2 可拉伸离子导体中复杂相互作用的揭示生命系统的生理活动与离子传导密切相关，譬如皮肤和神经纤维须通过离子传导电信号实现环境感知和运动反馈. 可拉伸离子导体是模拟弹性生物组织离子传输的重要材料，在仿生皮肤、人工肌肉、可拉伸储能、软机器人等领域取得了广泛应用.在进行可拉伸离子导体的构筑时，往往需要兼顾力学和离子传导等性能，其中涉及了丰富的分子相互作用. 本课题组围绕可拉伸离子导体，在对体系分子内/分子间相互作用机理的研究基础上，提出了一系列调控力学、电学和光学性质的分子设计. 例如：利用纳米级无定形矿物粒子和天然多糖的离子作用，调节物理交联PAA的黏弹性，所构筑的仿生皮肤可以快速自修复，且具有更高的应力响应灵敏度[34]；基于AA和两性离子共聚物，选择结构匹配的离子液体，通过带电荷基团之间的离子协同效应构筑了导电纳米通道，氢键作用实现了导电通道和动态交联网络之间的协同效应，所制备的本征可拉伸导体材料透明性好、可拉伸性能突出(10000%)[35]；基于聚阴离子和聚阳离子间的弱氢键相互作用构筑了一种聚离子弹性体，所得聚离子弹性体高度透明，具有接近生物组织的力学性能和感知功能，并且可以实现同步的致动和反馈效果[36]；利用含氟聚离子液体与离子液体之间的离子-偶极和离子-离子相互作用，设计了一种可水下通信的光学伪装离子凝胶，该离子凝胶透明、力学性能可调、可3D打印，且具有水下自愈合、水下黏附、导离子等功能[37]. 二维相关红外光谱的优势在于从动态过程中识别体系的精细结构和复杂相互作用，因而是研究离子凝胶/弹性体中分子相互作用机制的有效手段.通过合理调控分子间/内相互作用，设计制备了一种基于天然小分子α-硫辛酸(α-thioctic acid, TA)的可涂覆离子凝胶油墨(图5)[38]. 在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯([EMI][ES])存在的条件下，TA室温即可进行浓度诱导的自发开环聚合，得到稳定、透明、高拉伸且自愈合的离子凝胶弹性体. 该弹性体易溶于乙醇，因而能够方便地涂覆到任意表面，赋予涂覆体稳定的离子导电能力和应变感知功能. 利用红外光谱等手段探讨了离子凝胶中离子液体对聚硫辛酸(polyTA)的稳定机制：相比于纯的polyTA体系，离子凝胶的COOH伸缩振动区域在1734 cm-1出现了明显的肩峰，而离子液体的S＝O伸缩振动峰在离子凝胶中呈现了明显的红移，表明polyTA的羧基与硫酸乙酯阴离子形成了COOH… [ES]氢键. 分子动力学模拟结果表明了COOH… [ES]氢键的热力学稳定性，同时该氢键能够有效降低polyTA的势能. 因此，离子液体主要通过阴离子ES与polyTA基间形成强氢键而稳定polyTA. 二维相关红外光谱则揭示了离子凝胶升温过程不同化学基团的响应次序：COOH… [ES]氢键→羧酸二聚体→自由羧基，说明COOH… [ES]氢键对温度变化最敏感，进一步证实了COOH… [ES]氢键对于稳定polyTA离子凝胶的重要作用. Fig. 5 (a) Schematic illustration of the COOH[ES] H-bonding in the ionogel (b) ATR-FTIR spectral comparison among ionogel, [EMI][ES] and neat polyTA (c) Temperature-variable FTIR spectra of the ionogel in the C＝O stretching region from 25 °C to 151 °C Perturbation-correlation moving window (d) and 2D correlation synchronous and asynchronous spectra (e) generated from (c). (Reprinted with permission from Ref.[38] Copyright (2021) Wiley).受指纹结构启发，构筑了一种具有共形和可重复编辑褶皱结构的本征可拉伸离子导电芯鞘纤维[39]，其中，纤维芯层为离子凝胶弹性体，鞘层为氟橡胶，芯鞘界面借助共价交联网络和离子-偶极相互作用实现协同拓扑互锁和物理黏附. 经过表面褶皱结构的优化，该离子纤维拉伸应变感知灵敏度(gauge factor)可提升至10以上，超过了绝大多数可拉伸离子导体应变传感器. 利用红外光谱对离子凝胶芯层的分子相互作用进行研究，发现其中涉及了离子液体阳离子咪唑环上C―H与聚合物侧基乙氧基间的氢键、聚合物链段C＝O间的偶极-偶极相互作用、离子液体阴-阳离子间的弱静电相互作用等，而这些都对离子凝胶的高拉伸行为做出了重要贡献. 基于对芯层和鞘层力学性能的研究，发现表面褶皱形成的主要原因在于，高模量的氟橡胶鞘层弹性回复率显著低于离子凝胶芯层，在应变回复过程中造成了芯层和鞘层的界面失稳. 随着预应变的增加，弹性回复率差异变大，从而导致更加密集的褶皱结构. 此外，形成的表面褶皱可通过加热至60 ℃完全消除，从而赋予纤维可重复编辑褶皱的能力. 二维相关红外光谱揭示了离子凝胶芯层高温下残余应变的消除主要源于聚合物链段C＝O间偶极-偶极相互作用的减弱和构象重排，而氟橡胶鞘层由C―F间偶极-偶极相互作用锚定的链构象也可以通过加热消除.通过在强氢键交联的PAA网络中引入熵驱动的弱交联两性离子超分子网络，产生竞争机制，设计制备了一系列透明、抗冻、保湿、黏附、高拉伸、高回弹、自愈合、应变硬化、导质子、可重复加工等综合性能优异的离子皮肤(图6)[40]. 不同于传统水凝胶和离子凝胶，该离子弹性体不含大量溶剂，仅含有少量达到吸湿平衡的水分子，这使得分子间的羧酸二聚体氢键足以交联PAA分子链而形成强交联网络，而弱交联的两性离子超分子网络则提供柔性. 通过红外光谱、核磁共振谱和力学松弛等实验探讨了这一二元网络体系中的分子相互作用. 其中，具有较低pKa值的两性离子的存在使得PAA轻度去质子化，游离的质子是主要载流子. 去质子化的PAA与两性离子的阳离子端也可以发生离子缔合. 利用变温红外光谱并结合二维相关光谱分析，验证了体系中的3种主要分子相互作用，并根据它们对于温度的响应顺序判别了其结合强度，即PAA链段羧酸二聚体氢键 PAA-甜菜碱离子相互作用 甜菜碱-甜菜碱离子相互作用，这一光谱表征结果为该离子皮肤强弱协同竞争网络的分子设计提供了重要依据. Fig. 6 (a) Temperature-variable FTIR spectra of PAA/betaine ionic elastomer upon heating (b) 2D correlation synchronous and asynchronous spectra generated from (a) FTIR (c) and 1H-NMR (d) spectra of PAA, betaine, and PAA/betaine (e) Schematic illustration of PAA/betaine elastomer and the order of interaction strength among the three main interacting pairs (Reprinted with permission from Ref.[40] Copyright (2021) Springer Nature).3.3 小分子在聚合物基质中的扩散聚合物生产和加工的许多工序都涉及小分子物质在聚合物基体的扩散，研究这类扩散行为具有重要的理论和实践意义. ATR-FTIR光谱可对小分子在聚合物基质中的扩散过程进行实时、原位、快速、多组分检测，能够同时获取扩散系数和分子层面相互作用等信息. 扩散装置示意图如图7所示，聚合物基体处于ATR晶体和扩散物质之间，当扩散物质从聚合物基体的上表面扩散至下表面时即可被检测到. 随着时间的增加，与扩散物质相关的特征吸收峰强逐渐增大直至扩散平衡(扩散谱图，图7(b)). 以扩散时间为横坐标、扩散物质特征吸收峰强度/面积为纵坐标作图，即可得到扩散曲线(图7(c)). 结合二维相关光谱分析，可以提供动态扩散过程结构与相互作用的变化信息，有助于解析扩散机制[41~45].Fig. 7 (a) Schematic illustration of the diffusion experiments by ATR-FTIR spectroscopy (b) typical diffusion spectra (c) a typical diffusion curve.基于朗伯比尔定律和菲克扩散模型，Fieldson等[46]建立了基于ATR-FTIR光谱测试计算扩散系数的公式：其中这里，At为扩散时间t时，特征红外吸收峰的强度或面积；A∞为扩散达到平衡时，特征红外吸收峰的强度或面积；L为聚合物薄膜基体的厚度；D为扩散剂的扩散系数；γ为光波在聚合物基体中渗透深度的倒数，可表示为：其中，θ (θ = 45o)为红外光的入射角；n1和n2分别为聚合物和ATR晶体的折光指数；λ为红外光的波长. 基于以上扩散方程对ATR-FTIR光谱测试得到的扩散曲线进行拟合，即可得到相关扩散系数. 此外，根据曲线拟合情况可以判断该扩散过程的扩散模型.利用时间分辨ATR-FTIR光谱并结合二维相关光谱分析技术对水分子在乙基纤维素(EC)基薄膜中的扩散行为进行系统研究[47]. 分析表明，水分子在EC中的扩散行为符合菲克扩散模型，通过对扩散曲线的拟合计算得到了相关的扩散系数. 此外，探讨了EC中增塑剂(柠檬酸三乙酯)含量对水分子扩散行为的影响，结果表明，增塑剂的添加不影响水分子的扩散模型，主要起到加速水分子扩散的作用，这主要源于增塑剂的加入改善了EC链的活动性而提高了EC基体的自由体积(free volume). 利用二维相关光谱对水分子羟基伸缩振动区域扩散谱图进行解析，观察到在整个扩散过程中，主要存在着4种类型的水分子，即本体水(强氢键作用)、团簇水(中等强度氢键作用)、相对自由的水分子(弱氢键作用)以及自由的水分子(极弱氢键作用). 依据Noda规则，判别出不同状态水分子扩散的先后顺序：团簇水→本体水→相对自由的水分子或自由的水分子，表明扩散首先来自体积较小、相对弱氢键结合的团簇水，其次才是大量的本体水，而随着扩散过程的进行，部分水分子与聚合物基体相互作用而脱离团簇水或本体水，产生了(相对)自由的水分子.EC被广泛用作药物包衣材料以实现药物缓释的功能，利用ATR-FTIR光谱对药物分子在EC基薄膜中的扩散行为进行实时监测可以有效模拟这一药物缓释过程(图8)，从而为EC基药物包衣材料的配方优化提供理论指导[48]. 扩散谱图直观呈现了体系中各组分的变化情况，包括水分子(1637 cm-1)和药物分子(1569 cm-1)特征吸收峰强度的上升，增塑剂(1737 cm-1)特征吸收峰强度的下降等，表明水分子和药物分子在EC基薄膜中的扩散以及薄膜中增塑剂的部分溶解. 定量分析结果表明，扩散主要包含3个阶段：(A)水分子扩散；(B) EC膜吸水饱和，水扩散停止并溶解EC基体中的致孔剂；(C) 随着致孔剂的溶解，EC薄膜中形成孔道，使得药物分子和水分子共同扩散，同时增塑剂溶解. 二维相关红外光谱分析结果进一步证实了C阶段的各组分变化顺序：水分子扩散→药物分子扩散→增塑剂溶解，并且显示药物分子始终处于水合状态. 此外，通过改变药物分子的水溶性、致孔剂的种类以探讨膜配方对扩散行为的影响，结果表明随着致孔剂水溶性的增加和/或药物分子水溶性的降低，B阶段将缩短甚至消除. Fig. 8 (a) Time-resolved ATR-FTIR spectra collected during the water and drug diffusion (b) 2D correlation synchronous and asynchronous spectra during the diffusion of Stage C (c) Schematic illustration of water and drug diffusion across the EC-based film (Reprinted with permission from Ref.[48] Copyright (2015) Elsevier).氢氧化物/尿素是溶解纤维素的重要组合，其中尿素可稳定纤维素的疏水部分，有利于形成包合物从而促进纤维素的溶解. 在分子层面上，尿素溶液对纤维素的作用机理尚不明确. 采用ATR-FTIR光谱并结合二维相关光谱衍生的外扰相关移动窗口(perturbation-correlation moving window，PCMW)技术研究了不同浓度尿素水溶液(0，20 wt%、40 wt%和50 wt%)在黏胶纤维膜中的扩散行为，在分子水平揭示了尿素溶液的动态扩散行为以及与黏胶纤维的相互作用机制[49]. 从扩散谱图的变化规律以及对应的扩散曲线看，尿素溶液的扩散过程可大致分为2个步骤，水分子首先通过黏胶纤维膜，随后带动尿素分子一起通过. PCMW谱图显示，尿素浓度越高，尿素分子扩散滞后现象越明显. 根据菲克扩散模型，尿素分子在黏胶纤维膜的扩散系数随尿素浓度的增加而减小. 在红外光谱中，特征谱峰出现位移表明相应官能团相互作用的变化. 基于扩散过程Amide Ⅲ(尿素)和CH2-O(6)H伸缩振动(纤维素)的峰位移变化趋势，尿素水溶液在黏胶纤维中的扩散过程可以概括为：首先水分子破坏黏胶纤维膜无定形区的氢键网络，与羟基形成新的纤维素-水氢键，随后尿素分子在水分子的“桥连”作用下形成纤维素-水-尿素氢键，从而间接作用于纤维素. 低浓度下，水分子相对含量较大，可以快速打开扩散通道带动尿素分子通过黏胶纤维膜. 而高浓度下，尿素分子发生聚集且固定了大量水分子，从而在宏观上延缓了尿素溶液的扩散.热转移印花是纺织品印花方法之一，本质上是分散染料向聚酯纤维动态扩散的过程. 借助ATR-FTIR光谱对分散红9 (DR 9)在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜中的扩散过程进行了原位跟踪，模拟了热转移印花过程，并结合二维相关光谱探讨了分散染料-分散染料、分散染料-PET相互作用机制，在分子水平上阐释了其扩散机理(图9)[50]. DR 9在PET薄膜中的扩散过程符合菲克扩散模型. 温度越高，扩散速度越快，这主要归因于：(1) 温度升高导致了PET基体自由体积的增加和分子链热运动的增强；(2) DR 9在高温下分子运动的增强. 此外，将不同温度下的扩散系数按照Arrhenius公式进行线性拟合，可以计算得到DR 9在PET中扩散活化能为15.33 kJ/mol. 通过对扩散过程中不同阶段的红外谱图进行对比，观察到了体系中存在丰富的分子间/内相互作用，包括PET和DR 9的C＝O基团间偶极-偶极相互作用、芳香基团间π-π相互作用以及DR 9分子内氢键等. 二维相关红外光谱分析进一步细化了扩散体系中不同化学基团的分子间/内相互作用及其在扩散过程中的变化情况. 高温下，随着DR 9分子热运动增强，DR 9分子之间的相互作用减弱. 借助DR 9和PET中C＝O基团之间的偶极-偶极相互作用，DR 9扩散进入PET基体. 在扩散过程中，DR 9中形成了较强的分子内氢键，从而提高了DR 9的平面性，促进了扩散过程. 随着越来越多的DR 9分子扩散到PET基体中，DR 9和PET的芳香基团之间的π-π相互作用成为主导，DR 9的分子内氢键减弱. Fig. 9 (a) Time-resolved ATR-FTIR spectra and (b) 2D correlation synchronous and asynchronous spectra of DR 9 diffusion in PET at 140 ℃ (c) Schematic diagram of DR 9 diffusion into PET (Reprinted with permission from Ref.[50] Copyright (2020) American Chemical Society).采用时间分辨ATR-FTIR光谱对不同温度下碳酸丙烯酯(PC)-双三氟甲磺酰亚胺锂(LiTFSI)在聚偏氟乙烯-六氟丙烯共聚物(P(VDF-HFP))中的扩散行为进行了原位监测，同时获得了凝胶聚合物电解质中各扩散组分的扩散系数和分子层面相互作用信息[51]. 基于PC中C＝O伸缩振动区域的二阶导数分析，推断出PC在凝胶电解质主要存在四种状态，即与P(VDF-HFP)发生偶极-偶极相互作、PC分子间发生偶极-偶极相互作用、与锂离子发生强离子-偶极相互作用、与锂离子发生弱离子-偶极相互作用. 同时，LiTFSI参与的分子相互作用也得以识别，包括锂离子与PC中C＝O之间的离子-偶极相互作用，锂离子与P(VDF-HFP)中C―F之间的离子-偶极相互作用、TFSI-的溶剂化作用等. 扩散过程中，首先是PC分子以溶剂团簇的形式扩散进入P(VDF-HFP)，PC分子中的C＝O与P(VDF-HFP)中的C―F发生偶极-偶极相互作用，一定程度减弱了P(VDF-HFP)聚合物链间的偶极-偶极相互作用，从而有利于锂盐的扩散. 随后，借助锂离子与C＝O的离子-偶极相互作用，锂离子随着PC分子扩散进入P(VDF-HFP)，TFSI-在扩散过程中也一直处于溶剂化状态. 这里，PC分子既充当了增塑剂的角色，同时也是离子(包括阴离子和阳离子)扩散的载体. 本工作在分子水平上揭示了PC-LiTFSI在P(VDF-HFP)的传导机制，对高性能凝胶聚合物电解质的结构设计和性能优化具有一定的指导意义.3.4 天然高分子的结构表征海藻酸钠(SA)作为一类天然多糖，生产成本低、无毒且具有良好的生物相容性、可降解性，在食品工业、制药、纺织印染等领域得到了广泛应用. 随着实验室和工业对SA的日趋重视，理解SA内部的氢键结构也变得越发重要. 利用红外光谱对SA升温过程特征基团的变化进行原位监测，结合二维相关光谱等分析手段从分子水平研究了SA体系的相互作用机制，探讨了温度扰动下SA分子间/内、SA与水分子间氢键结构的演变历程[52]. 研究发现，加热过程可分为30~60 ℃和60~170 ℃ 2个阶段：第一阶段为弱氢键结合的水分子脱除，第二阶段为强氢键结合的水分子脱除. 二维相关红外光谱结果表明：30~60 ℃区间内，随脱水过程发生，SA与水分子的氢键逐步断裂，SA中C―OH和COO-基团逐渐参与形成分子间/内氢键(O3H3⋯O5和O2H2⋯O＝C―O-)，因此水分子的存在一定程度破坏了SA中原有的氢键结构；60~170 ℃区间内，强结合水脱除，SA与水分子的氢键进一步断裂，同时SA分子间/内氢键相互作用逐步减弱，出现了部分相对自由的C―OH和COO-基团(图10). 由于相对自由的COO-比C―OH更早出现，可以推测C―OH形成的分子间/内氢键相互作用比COO-更强.Fig. 10 2D synchronous and asynchronous spectra of the SA film during heating between (a) 30-60 °C and (b) 60-170 °C (c) Schematic illustration of the heat-induced hydrogen bonding transformation in the SA film[52] (Reprinted with permission from Ref.[52] Copyright (2019) Elsevier).多元羧酸与纤维素的羟基反应，能使纤维素大分子间形成立体的交联网络结构，从而赋予棉纤维织物抗皱性能. 1,2,3,4-丁烷四羧酸(BTCA)作为一类典型的用于棉纤维织物抗皱整理的多元羧酸，其与纤维素的酯化过程受到了广泛关注，但其中关于分子水平相互作用机制及动态反应机理仍不清晰. 利用FTIR光谱对加热过程中纤维素与BTCA在催化剂次亚磷酸钠(SHP)作用下的酯化反应过程进行原位跟踪，并借助二维相关光谱分析技术探讨了该反应的分子机理，重点关注了分子层面相互作用机制以及反应全过程中的化学基团转变历程[53]. 分析表明，室温下，体系中的O―H和C＝O等极性基团有强氢键相互作用. SHP存在时，碱金属离子(Na+)与羧基反应并将其转化为相应的羧酸盐，从而一定程度削弱了BTCA间的氢键相互作用. 在30~100 ℃的加热过程中，体系中的氢键部分断裂，导致一些O―H和C＝O处于相对自由的状态. 这里，SHP的存在和加热过程都会导致体系中氢键相互作用的减弱，从而使相应的化学基团更自由，有利于酸酐生成和酯化反应. 当加热至100 ℃以上后，羧酸盐和自由羧酸开始脱水形成环酐. 一旦形成环酐，就会与纤维素大分子链上的O―H反应生成酯. 通过逐步成酐和酯化反应过程，BTCA实现了对纤维素的交联. 该结果对多元羧酸的抗皱整理工艺优化及寻找更有效的多元羧酸类抗皱整理剂和催化剂具有一定的指导作用.4 总结与展望本文主要介绍了二维相关光谱的基本原理、实验和分析技巧等，并结合具体的体系(如温度响应高分子、可拉伸离子导体、小分子在聚合物中的扩散过程、天然高分子等)，简述了二维相关光谱在高分子表征中的应用. 这里，二维相关光谱不仅能够有效鉴别高分子体系涉及的丰富相互作用，还能提供外扰作用下动态过程发生的分子机制. 相关研究结果一方面有助于启发新型功能高分子材料的结构设计，另一方面也可以为实际工艺过程的配方优化和参数调整提供指导.二维相关光谱作为一种先进的光谱分析手段，在高分子材料体系的表征中得到了越来越多的关注. 随着高分子材料涉及的体系越来越复杂、功能越来越强大，这为二维相关光谱的应用提供了更多的机遇，但同时也带来了更多的挑战. 在后续的研究工作中，二维相关光谱分析可以重点关注以下几方面：(1) 光谱手段的多样性. 目前关于二维相关光谱在高分子体系中的应用主要是基于中红外光谱，关注的是分子层面相互作用信息. 一方面，中红外光谱也有一定的局限性，例如低浓度溶液体系信号弱、水的吸收峰干扰严重等. 对于中红外光谱难以表征的体系，可以尝试其他分子光谱手段，如拉曼光谱、近红外光谱等，开展二维相关光谱分析. 另一方面，其他光谱手段，包括荧光光谱、圆二色谱、紫外-可见吸收光谱、X射线衍射谱等，都可以进行二维相关光谱分析，以获取多层面丰富的结构信息. 目前，这些光谱在处理二维相关分析时，大部分因信噪比低而导致噪音被显著放大，使得结构解析变得困难，如何有效解决这一问题是丰富二维相关分析光谱手段的关键.(2) 外扰变量的丰富性. 时间、温度便于控制，是目前获取动态光谱最常用的外扰变量. 然而，影响高分子结构和性能的因素是多种多样的，例如湿度变化能够引起高分子力学性质的改变、紫外光照射可以引起高分子的老化等，尤其是刺激响应高分子，可以对温度、压力、电场、磁场、pH、浓度等丰富的外扰产生响应，引起物理或化学性质的变化. 最近，Li等[54]利用二维相关红外光谱研究了乙醇诱导聚丙烯酰胺/Pluronic 127水凝胶相分离的机理，获取了氢键解离和无定形-结晶转变等信息. 因此，利用二维相关光谱探讨不同刺激下高分子结构的演变机制，将进一步拓宽二维相关光谱的应用范围. 需要注意的是，对于测试过程无法原位施加的外扰变量，应尽量避免其他因素改变而引起的光谱变化，否则将影响二维相关光谱分析结果的真实性和可靠性.(3) 多种分析手段的关联. 一方面，通过二维相关光谱交叉谱的计算和解析，可以将不同分析手段所得结果进行关联，这能够帮助理解高分子不同层面结构的内在联系. 另一方，二维相关光谱分析结果涉及丰富的相互作用和结构变化，经过与其他分析表征手段的结果进行比对和相互验证，可有效加深人们对二维相关光谱分析结果的理解. 参考文献1Ernst R R, Bodenhausen G, Wokaun A. 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Nano Res, 2020, 13(11): 2973-2978. doi:10.1007/s12274-020-2959-6 34Lei Z, Wang Q, Sun S, Zhu W, Wu P. Adv Mater, 2017, 29(22): 1700321. doi:10.1002/adma.201700321 35Lei Z, Wu P. Nat Commun, 2019, 10(1): 3429. doi:10.1038/s41467-019-11364-w 36Lei Z, Wu P. Mater Horiz, 2019, 6(3): 538-545. doi:10.1039/c8mh01157e 37Yu Z, Wu P. Adv Mater, 2021, 33(24): 2008479. doi:10.1002/adma.202008479 38Wang Y, Sun S, Wu P. Adv Funct Mater, 2021, 31(24): 2101494. doi:10.1002/adfm.202101494 39He C, Sun S, Wu P. Mater Horiz, 2021, 8(7): 2088-2096. doi:10.1039/d1mh00736j 40Zhang W, Wu B, Sun S, Wu P. Nat Commun, 2021, 12(1): 4082. doi:10.1038/s41467-021-24382-4 41Shen Yi(沈怡), Peng Yun(彭云), Wu Peiyi(武培怡), Yang Yuliang(杨玉良). Progress in Chemstry(化学进展), 2005, (3): 499-513. doi:10.3321/j.issn:1005-281X.2005.03.016 42Liu M, Wu P, Ding Y, Chen G, Li S. Macromolecules, 2002, 35(14): 5500-5507. doi:10.1021/ma011819f 43Tang B, Wu P, Siesler H W. J Phys Chem B, 2008, 112(10): 2880-2887. doi:10.1021/jp075729+ 44Wang M, Wu P, Sengupta S S, Chadhary B I, Cogen J M, Li B. Ind Eng Chem Res, 2011, 50(10): 6447-6454. doi:10.1021/ie102221a 45Lai H, Wang Z, Wu P, Chaudhary B I, Sengupta S S, Cogen J M, Li B. Ind Eng Chem Res, 2012, 51(27): 9365-9375. doi:10.1021/ie300007m 46Fieldson G T, Barbari T A. Polymer, 1993, 34(6): 1146-1153. doi:10.1016/0032-3861(93)90765-3 47Hou L, Feng K, Wu P, Gao H. Cellulose, 2014, 21(6): 4009-4017. doi:10.1007/s10570-014-0458-1 48Feng K, Hou L, Schoener C A, Wu P, Gao H. Eur J Pharm Biopharm, 2015, 93: 46-51. doi:10.1016/j.ejpb.2015.03.011 49Dong Y, Hou L, Wu P. Cellulose, 2020, 27(5): 2403-2415. doi:10.1007/s10570-020-02997-y 50Yan L, Hou L, Sun S, Wu P. Ind Eng Chem Res, 2020, 59(16): 7398-7404. doi:10.1021/acs.iecr.9b07110 51Li H, Hou L, Wu P. Chinese J Polym Sci, 2021, 39(8): 975-983. doi:10.1007/s10118-021-2571-6 52Hou L, Wu P. Carbohydr Polym, 2019, 205: 420-426. doi:10.1016/j.carbpol.2018.10.091 53Hou L, Wu P. Cellulose, 2019, 26(4): 2759-2769. doi:10.1007/s10570-019-02255-w 54Li Y, Wang D, Wen J, Liu J, Zhang D, Li J, Chu H. Adv Funct Mater, 2021, 31(22): 2011259. doi:10.1002/adfm.202011259 《高分子学报》高分子表征技术专题链接：http://www.gfzxb.org/article/doi/10.11777/j.issn1000-3304原文链接：http://www.gfzxb.org/thesisDetails#10.11777/j.issn1000-3304.2021.21362DOI：10.11777/j.issn1000-3304.2021.21362

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Microfluidic Platform for Time-Resolved Characterization of Protein Higher-Order Structures and Dynamics Using Top-Down Mass Spectrometry [1]，文章的通讯作者是北京大学生物医学前沿创新中心的王冠博教授和中国科学院深圳先进技术研究院的门涌帆副研究员。　　蛋白质的高阶结构和动力学特性对理解蛋白质的生物学功能和揭示其潜在机制至关重要。自顶向下质谱法(Top-down MS)在完整蛋白水平和肽段碎片水平都能获得结构信息。非变性Top-down MS可以分析蛋白质复合体的结构以及完成亚基鉴定和修饰分析。自顶向下氢/氘交换质谱(Top-down HDX MS)为构象或结合界面分析提供了高空间分辨率，并实现了构象特异性表征。微流控芯片可以为这些质谱工作流程的前端反应提供优越的平台。然而，目前大多数质谱微芯片装置是为Bottom-up或Top-down蛋白质组学设计的。本文中，作者提出了一种用于蛋白质高阶结构和动态Top-down MS分析的芯片设计策略。它适用于时间分辨的非变性质谱和HDX质谱，该设计旨在有效电离完整的蛋白质复合物，灵活控制多种反应物流动，并在较大的流速范围内精确控制反应时间在亚微升/分钟。本文通过对单克隆抗体、抗体-抗原复合物和共存蛋白构象等体系的分析来验证该装置的性能。　　TDK-MS(Top-down and kinetic MS)芯片的结构如图1A所示，该方法可以有效电离完整的蛋白质，包括单克隆抗体(mAb)和抗体-抗原复合物(图1 B, C)。　　图1. 完整蛋白质和蛋白质复合体在非变性条件下的高效电离　　虽然分析蛋白质组合化学计量学和监测构象变化需要保持蛋白质高阶结构和非共价相互作用的完整性，然而为了推导结构信息或在串联MS中展开蛋白质以提高碎裂效率，往往需要不同程度的变性来产生亚复合体，因此变性剂的浓度和变性的时间对变性程度至关重要。本文中，作者采用交错人字微结构(Herringbone microstructure, HM)(图2A, B)，并对其性能进行了评估(图2C−E)。如此高的混合效率为进一步微型化芯片混合模块提供了可能。在监测Mb的变性时，作者使用TDK-MS芯片和商用混合三通管平行混合holo-Mb溶液(5 μM)与乙腈(ACN)，并比较它们在混合比例变化时的响应(图2F)。TDK-MS芯片在非变性和变性条件之间切换的快速响应通过NIST mAb的变性得到了证明，在向NIST mAb溶液中添加甲酸后，响应时间小于5分钟(图2G)。　　图2. 高效混合和快速响应的流体控制　　微芯片的灵活通道设计允许引入独立控制的溶液。例如，尽管酸和有机溶剂都能诱导变性，但这两种变性剂同时存在时，对变性途径的影响是不同的。Mb和Hb是血红素蛋白，其中血红素基团分别非共价连接在1条多肽链和4条非共价组装链上，因此这是研究共存复合体解离动力学和亚基构象变化的理想模型。将5 μM holo蛋白溶液与ACN和FA按一定的混合比例依次混合，可以通过解离产物的出现和蛋白质离子电荷态分布的变化来表征复杂的解离和蛋白质的展开。在固定ACN浓度下，随着FA浓度从0.01增加到0.3% (v/v)，依次观察到的主要现象是血红素丢失、apo-Mb展开以及折叠的holo-Mb转化为展开的apo-Mb(图3A)。相比之下，在FA浓度恒定的情况下，当ACN从1增加到50%时，Mb主要表现为血红素损失，只有中等程度的apo-Mb展开，这可能是由于展开的部分迅速聚集(图3B)。　　图3. (A)增加FA浓度，固定ACN浓度和(B)增加ACN浓度，固定FA浓度时获得的Mb和Hb的质谱图。　　在HDX MS检测中，TDK-MS芯片提供了快速和有效的氘代及淬灭，精确控制HDX反应时间，并在2H-标记形式下高效电离完整蛋白质(图4)。　　图4. 2H标记完整的(A)Mb、(B)Hb α亚基和(C)Hb β亚基在不同反应时间下的HDX质谱图　　由于过大的流速不利于电离效率，并且有可能会增加堵塞或流动中断的风险，因此流速应保持在最佳范围内，这又限制了混合通道中HDX时间的可调节范围，从而影响了HDX动力学分析的灵活性。为了解决这一问题，作者设计了一个具有多个不同长度反应通道的混合模块，在不更换芯片的情况下，除了改变流速外，还可以通过通道切换在更大范围内调整反应时间。在原型芯片中，5个不同长度的通道可以在对蛋白质电离和流动稳定性都最优的流速下，产生从几秒到几分钟不等有效的HDX时间(图5)。　　图5. Top-Down HDX MS 分析　　本文中作者开发的策略将有利于生物大分子结构的精细分析，并有助于质谱微芯片的方法开发。

复合材料是指由两种或两种以上不同物质以不同方式组合而成的材料，它可以发挥各种材料的优点，克服单一材料的缺陷，扩大材料的应用范围。由于复合材料具有重量轻、强度高、加工成型方便、弹性优良、耐化学腐蚀和耐候性好等特点，已广泛应用于航空航天、汽车、电子电气、建筑、健身器材等领域，在近几年更是得到了快速发展。为进一步促进全国各地高校、科研院所、企业等相关从业人员进行技术交流，仪器信息网将于2022年7月8日举办“复合材料性能表征与评价”网络会议，邀请领域内杰出专家和业内人士围绕复合材料物理性能的表征与评价带来精彩报告。会议日程2022年7月8日“复合材料性能表征与评价”网络会议报告时间报告题目报告嘉宾09:30--10:00聚合物基复合材料压缩性能试验方法陈新文 中国航发北京航空材料研究院 高级工程师10:00--10:30复合材料拉伸试验应变测量方法比较王斌 力试（上海）科学仪器有限公司 总经理10:30--11:00柔性压阻适变复合材料的研究黄培 重庆大学 副教授11:00--11:30易用、稳定、多元————引伸计的发展及未来趋势岳洋 天氏欧森测试设备（上海）有限公司 高级工程师11:30--12:00考虑局部效应的复合材料层合板界面参数表征与界面裂纹扩展研究白瑞祥 大连理工大学 教授/博导报告嘉宾及报告内容陈新文，中国航发北京航空材料研究院检测研究中心高级工程师，非金属及复合材料力学性能专业团队负责人，从事复合材料层合板、夹层结构、陶瓷基复合材料、有机玻璃、橡胶、胶黏剂等航空材料的力学性能表征和测试技术研究工作20多年。曾负责多项重点型号任务，为航空各型飞机非金属及复合材料结构研制、强度设计、定寿等提供了试验技术和力学性能数据支持。曾获奖和立功多次，发表文章近20篇，参与书籍《航空材料的力学行为》、《航空材料力学检测》、《先进复合材料技术导论》等的编写，制定企业标准15项，国家级标准6项。报告题目：《聚合物基复合材料压缩性能试验方法》报告摘要：压缩性能试验是聚合物基复合材料所有材料级力学试验中技术难度最大、标准方法数量最多的一种试验。本报告系统介绍了影响复合材料压缩试验结果的关键因素、现有试验方法的优缺点，经过标准技术内容的比较分析，给出工程上选择压缩试验标准的指南，最后对聚合物基复合材料压缩试验标准发展方向提出了建议。王斌，力试（上海）科学仪器有限公司 总经理&企业法人， 企业创始人。二十余年试验机行业从业经验，对试验机和试验技术有深入的研究与独特见解，在市场开发，试验技术发展方向，客户需求方面有深入的了解和经验。拥有多项发明专利。职业履历：美特斯（MTS）工业系统（中国）有限公司 技术总监；上海新三思计量仪器制造有限公司 总经理；力试（上海）科学仪器有限公司 总经理。报告题目：《复合材料拉伸试验应变测量方法比较》报告摘要：从测试标准对应变测量的要求出发，对粘贴应变片、夹持引伸计、全自动引伸计和视频引伸计及DIC等各种应变测量方法的精度、成本、操作难易程度等进行了比较，对各种方法测量得到的弹性模量的离散性进行了分析。黄培，重庆大学航空航天学院副教授，主要从事纳米材料、复合材料和传感器等方面的研究。主持国家自然基金项目2项，横向合作项目2项，发表SCI论文40余篇，其中以第一或通讯作者在Journal of Materials Chemistry A、ACS Applied Materials & Interfaces、Carbon、ChemSusChem、Nanoscale等期刊发表论文20篇。报告题目：《柔性压阻适变复合材料的研究》报告摘要：柔性压阻复合材料在医疗、环境保护、工业等领域有非常广泛的需求，然而目前柔性压阻复合材料的有效应力测试范围较窄，难以满足对人体运动的监测。考虑到压阻复合材料的有效应力测量范围主要受其力学性能决定， 因此我们制备了一系列机械性能适变的压阻复合材料，并研究了其有效应力测试范围的变化规律。岳洋，Tinius Olsen(天氏欧森)高级工程师，英国伯明翰大学和华中科技大学双工学学士，美国德州大学工学硕士。2016年加入Tinius Olsen,拥有美国A2L2校准资质，能够为客户提供完善的应用技术解决方案、产品校准，以及产品和软件相关的培训。报告题目：《易用、稳定、多元————引伸计的发展及未来趋势》报告摘要：经过130多年的发展，引伸计在材料试验中持续发挥着重要作用。从机械式引伸计到光学引伸计，从单方向、单视野到多方向、多视野的测试，设备的易用性和多功能性已经显著提高。选择合适的技术取决于许多因素，包括成本、准确性和易用性，以及材料和所进行试验的具体性质。白瑞祥，大连理工大学工程力学系教授，博士生导师，工业装备结构分析国家重点实验室固定人员。中国复合材料学会第六届、第七届理事，入选辽宁省百千万人才工程。主要研究方向包括先进材料的细观力学分析和设计，含损伤工程结构物的损伤和承载能力，复合材料结构动力学与故障诊断，复合材料工程结构分析与数值仿真，含损伤工程结构物修复和强化机理。承担和参与国家973课题、国家变革性技术课题、国家自然科学基金重点项目及面上项目多项，近年来负责国家大飞机和探月等航空航天工程中复合材料结构的失效行为检测和数值仿真课题二十余项。发表学术论文190余篇，SCI 检索论文50余篇。报告题目：《考虑局部效应的复合材料层合板界面参数表征与界面裂纹扩展研究》报告摘要：连续碳纤维增强树脂基复合材料是飞机结构设计中常用的材料，界面是其力学性能的薄弱环节。在外荷载作用下，界面应力较大的部位容易引起层间分层或胶层脱粘，导致裂纹扩展和结构早期失效。本研究对纤维/树脂界面、考虑邻近铺层纤维方向和裂纹尖端的桥联行为等局部效应的层合板界面破坏行为进行了探讨。运用修正梁理论（MBT）数据减缩方案对不同铺层界面的I型断裂韧性进行了表征，基于扩展断裂过程出现的“跳跃”现象对R曲线散点进行了过滤，应用Foote模型和最小二乘法对R曲线进行拟合，得到一套考虑不同铺层界面的断裂参数。采用基于有限元法的三线性牵引-分离准则的内聚区模型（CZM）预测了不同铺层界面的I型断裂行为，表征了有效的层间界面参数。基于双线性CZM模型表征了II型分层界面的牵引-分离关系，在ABAQUS中重现了不同铺层界面的II型分层断裂过程。建立了含圆形嵌入分层层合板轴压下分层扩展有限元模型，利用3D-DIC技术测量并重构了加载过程中试件表面位移场的变化规律，验证了模型和算法的有效性。参会方式（手机电脑均可听会）1、官网报名（点击此处链接或扫描下方二维码，免费报名听会）；2、报名成功，通过审核后您将收到通知；3、会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。扫一扫，免费报名听会

2021年，《高分子学报》邀请了国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写从基本原理出发的高分子现代表征方法综述并上线了虚拟专辑。仪器信息网在获《高分子学报》副主编胡文兵老师授权后，也将上线同名专题并转载专题文章，帮助广大研究生和年轻学者了解、学习并提升高分子表征技术。在此，向胡文兵老师和组织及参与撰写的各位专家学者表示感谢。更多专题内容详见：高分子表征技术专题高分子表征技术专题前言孔子曰：“工欲善其事，必先利其器”。 我们要做好高分子的科学研究工作，掌握基本的表征方法必不可少。每一位学者在自己的学术成长历程中，都或多或少地有幸获得过学术界前辈在实验表征方法方面的宝贵指导！随着科学技术的高速发展，传统的高分子实验表征方法及其应用也取得了长足的进步。目前，中国的高分子学术论文数已经位居世界领先地位，但国内关于高分子现代表征方法方面的系统知识介绍较为缺乏。为此，《高分子学报》主编张希教授委托副主编王笃金研究员和胡文兵教授，组织系列从基本原理出发的高分子现代表征方法综述，邀请国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写。每篇综述涵盖基本原理、实验技巧和典型应用三个方面，旨在给广大研究生和年轻学者提供做好高分子表征工作所必须掌握的基础知识训练。我们的邀请获得了本领域专家学者的热情反馈和大力支持，借此机会特表感谢！从2021年第3期开始，以上文章将陆续在《高分子学报》发表，并在网站上发布虚拟专辑，以方便大家浏览阅读. 期待这一系列的现代表征方法综述能成为高分子科学知识大厦的奠基石，支撑年轻高分子学者的茁壮成长！也期待未来有更多的学术界同行一起加入到这一工作中来.高分子表征技术的发展推动了我国高分子学科的持续进步，为提升我国高分子研究的国际地位作出了贡献. 借此虚拟专辑出版之际，让我们表达对高分子物理和表征学界的老一辈科学家的崇高敬意！光散射技术在高分子表征研究中的应用Laser Light Scattering and Its Applications in Polymer Characterization作者:郑萃，刘芷君，梁德海 作者机构：中国石化北京化工研究院,北京,100013 北京大学化学与分子工程学院,北京,100871作者简介：梁德海，男，1971年生. 1994年获南开大学环境科学系理学学士，同年进入南开大学化学系攻读硕士. 2001年在美国纽约州立大学石溪分校获得理学博士学位，并留任博士后. 2006年加入北京大学化学与分子工程学院高分子科学与工程系，任副教授；2012年任教授. 2011年得到教育部新世纪优秀人才计划的支持，2015获得Elsevier第九届冯新德高分子奖最佳文章奖. 研究方向为高分子溶液物理，主要项目包括：基于生物大分子的非平衡态原始细胞模型的构筑及动态行为研究；多肽诱导脂质体膜内吞及外吐机理研究；大分子拥挤及限制作用的定量化研究.摘要光散射技术是高分子领域中重要的表征手段之一. 静态光散射和动态光散射的结合能够获得丰富的关于高分子的信息，如重均分子量、回转半径、第二维里系数、流体力学半径、尺寸分布、分子链构象等. 除合成高分子外，光散射技术同样适用于研究生物大分子、微生物、胶体、纳米粒子、病毒、囊泡等在溶液或悬浮液中的行为. 本综述重点介绍稀溶液中静态光散射和动态光散射的历史、基本理论和实验技巧. 对于浓溶液适用的交叉相关技术和扩散波谱技术以及固体光散射也做简要介绍. 为了帮助初学者更好地理解并掌握光散射技术，综述的最后介绍了4个应用实例：动、静态光散射相结合跟踪研究线团到密实球的转变过程，光散射确定超支化分子的标度关系，时间可分辨的光散射来剖析聚合诱导胶束化的机理，以及去偏振动态光散射研究纳米粒子在生物介质中的聚集行为.AbstractLaser light scattering (LLS), which includes static light scattering (SLS) and dynamic light scattering (DLS), has been widely applied in characterization of polymer samples in dilute solutions. SLS measures the angular dependence of the excess scattered intensity, from which the weight average molecular weight, radius of gyration, and second viral coefficient are obtained. DLS measures the intensity-intensity time correlation functions, from which the hydrodynamic radius and size distribution are obtained. The combination of SLS and DLS enables information on chain conformation. Beside synthetic polymers, LLS is also suitable for the solutions and suspensions of biopolymers, microbial, colloids, nanoparticles, virus, and vesicles. The history, theory, and experimental techniques of SLS and DLS specific for dilute solutions are summarized. In recent years, the cross-correlation techniques, diffusing wave spectroscopy, and other related techniques have been developed to expand LLS to study samples in semi-dilute and even concentrated solutions. These techniques, as well as solid light scattering, are also briefly introduced in this review. In the last, we provide four typical examples of light scattering experiments: the coil-to-globule transition as studied by the combination of SLS and DLS, the scaling of hyperbranched polymers as determined by LLS, the polymerization-induced micellization process as monitored by time-resolved LLS, and the aggregation of nanoparticles in biological media as investigated by depolarized DLS.关键词光散射  高分子表征  分子量  回转半径  相关函数KeywordsLaser light scattering  Polymer characterization  Molecular weight  Radius of gyration  Correlation function 1光散射技术的发展简史人们对光散射的认识最早可以追溯到1869年著名的丁达尔(Tyndall)凝胶散射实验. 1871年，瑞利对空气中的光散射现象进行了理论研究[1]，推导出了球形粒子的散射公式，解释了晴空蓝和夕阳红的成因[2]. 之后，德拜(Debye)和甘(Gans)分别把瑞利的散射理论拓展到了非球形粒子[3] 和大尺寸的粒子[4]，完善了气体中粒子的光散射理论.在液体等凝聚相(condensed phase)中，散射强度的实测值通常比瑞利理论的预测值小一个数量级以上，这是由散射波的相消干涉造成的. 针对这种现象，斯莫鲁霍夫斯基(Smoluchowski)和爱因斯坦(Einstein)[5]从密度涨落的角度出发，提出了光散射的涨落理论(fluctuation theory of light scattering)，极大地拓展了光散射的应用范围. 1940年前后，德拜和齐姆(Zimm)将涨落理论与溶液中的高分子表征相结合，实现了光散射对高分子的分子量、分子尺寸、分子形状和分子间相互作用的测量[6].静态光散射(static light scattering, SLS)也称为弹性光散射，是指不考虑散射波长(或能量)变化的光散射. 1914年，布里渊(Brillouin)预测固体中热声波的散射光频率会出现双峰分布，后被实验所证实，从而开启了人们对准弹性光散射，即动态光散射(dynamic light scattering, DLS)的研究. 由于对光源单色性的苛求，动态光散射技术直到1960年前后激光光源趋于成熟之后，才得到了较好的发展. 1964年，佩科拉(Pecora)[7]利用高分子溶液中散射光的频率变化，计算出了高分子的扩散系数，并得到了高分子的流体力学半径、链柔顺性等信息.当溶液中粒子的浓度增加到一定程度时，就会发生多重散射，即散射光再次或多次与粒子发生作用. 这种浓度下溶液的光散射理论较为复杂. 近年来，科学家们针对这类体系设计了许多特殊的方法或仪器，如折射率匹配法(1991年)[8]，微样品池法(1998年)[9,10]、光纤准弹性散射法(fiber optical quasi elastic light scattering, FOQELS，1991年)[11,12]、时间交叉相关法(1981年)[13]、3D交叉相关法(1999年)[14]、互相关法(1997年)[15]等. 2006年，得益于电荷耦合器件(charge coupled device，CCD)以及计算机的发展，基于光斑(speckles)的互相关法得到了实质性发展[16]，得以对亚浓溶液或浓溶液进行较为深入的研究. 当溶液体系达到浑浊状态时，极其严重的多重散射使得光在体系中的行进可以按扩散过程来处理，扩散波谱(diffusing wave spectroscopy, DWS)理论应运而生[17]，基于该理论的技术可适用于多种不同的浑浊体系.固体介质中也存在光散射现象，但在原理和应用等方面与溶液中的光散射都有很大差别. 固体中很容易产生严重的多重散射，且固体表界面的强烈散射常会对内部的散射造成严重干扰，这些都使得固体的光散射结果难以解读. 早在1922年，布里渊[18]就用光散射对固体振动进行了研究，但这不是严格意义的弹性光散射. 1960年斯坦因(Stein)[19]优化了垂直偏振光散射方法，极大地简化了散射结果，使得固体光散射在测定聚合物的链取向和晶体结构的研究中得到广泛应用[20,21].2光散射原理2.1气体光散射光的本质是电磁波，含有周期变化的电场E. 原子或分子在电场作用下会发生极化，强度与极化率α相关. 原子在周期性变化的电场中会被周期性地极化，从而转变为一个次级光源，向周围发射同频率的电磁波，即散射光(图1).Fig. 1Scattered light generated by a scatterer as it is induced to be an oscillating dipole in the incident beam. θ is the scattering angle, and the inset shows the angular dependence of the scattered light from small particles, such as atoms or molecules. The polarization of incident beam is not considered.单原子产生的散射光强Is由原子的极化率α和入射光波长λ决定. 另外，在空间某点测定的散射光强还与观测点到散射点的距离r有关. 1871年，瑞利推导出如下的散射公式：其中I0为入射光强度. 单个原子、分子和粒子在空气中的散射光强都可以用公式(1)描述. 对于多粒子体系，可表示为体积V中存在N个散射粒子，如果粒子尺寸小(半径小于入射光波长的1/20)，且数目较少，粒子之间的散射光不发生干涉，散射光强可表示为：公式(2)表明，散射光强度与波长的4次方成反比，波长短的蓝色光的散射明显强于波长更长的红色光，因此天空在阳光的照耀下显示为蓝色.2.2溶液光散射光散射技术在溶液体系中具有非常广泛的应用. 在稀溶液中，利用静态光散射技术能够测定散射粒子的绝对分子量M、回转半径Rg、第二维里(Virial)系数A2等信息；利用动态光散射技术能够测定散射粒子的流体力学半径Rh及其分布等信息. 光散射技术在亚浓溶液或浓溶液中也发挥了重要作用，但该类体系中的多重散射使得散射理论变得十分复杂. 本文重点介绍稀溶液中的光散射理论，对非稀溶液体系的散射理论只做简要介绍.2.2.1稀溶液中的静态光散射在稀溶液中，根据Clausius-Mossoti公式，可将难以测量的极化率α转化容易测量的折光指数n：其中n0是纯溶剂的折光指数，M为粒子的绝对分子量，NA为阿伏伽德罗(Avogadro)常数，c (=MN/VNA)为质量浓度. 值得一提的是dn/dc， 即溶液折光指数n对溶液质量浓度c的导数，称为折光指数增量，可以用专有仪器测定，或是从相关手册[22]中查到. 当dn/dc = 0时，预示体系中测不到反映溶质结构信息的光散射信号.对于dn/dc ≠0的单组分体系，将公式(3)代入(2)中，可得到瑞利散射公式：其中H称为光学常数，R为瑞利比.忽略由溶剂自身密度涨落引起的散射. 根据涨落理论，散射光强I仅与光学常数H、质量浓度c和渗透压π相关，并遵循如下的关系式：根据van’t Hoff关系式：其中，M为溶液中粒子的绝对分子质量，A2为第二维里系数，用来定量描述溶剂-溶质之间的相互作用. 将公式(6)代入(5)中，可以得到：式(7)中只有2个未知数M和A2. 理论上只要测量2个不同浓度溶液的散射光强I，就可以计算得到粒子的绝对分子量M和第二维里系数A2. 但是，由于每一台光散射仪的探测器面积和探测器到样品的距离都可能不同，激光束的粗细和样品池的大小也可能存在差异，因此对于同一个样品，每台光散射仪得到的信号都可能是不同的. 仪器测得的光强，必须要转化为绝对散射光强，才可以进行下一步的计算. 在实际操作中，常用瑞利比R代替I，并考虑以下这些影响因素：第一步，偏振校正. 取决于样品的性质，散射光的偏振方向会发生变化，且会影响散射光强的大小. 偏振的校正较复杂[23]. 目前绝大多数光散射仪均使用了VV偏振散射设计，即入射光与观测的散射光都是垂直(vertical)偏振的，相应的散射光强标记为Rvv.第二步，散射体积校正. 常见的散射仪器一般用小孔和狭缝来限制检测器接收的散射光. 激光束中被小孔或狭缝截留的光路在空间中所占的体积称为散射体积(图2). 对于同一个体系，散射体积越大，测得的散射光越强. 在激光光束和小孔或狭缝固定的情况下，散射体积与散射角θ (入射光矢量与散射光矢量的夹角)存在sinθ的定量关系. 因此在静态光散射实验中，在θ角测定的散射光强需要进行sinθ的校正.Fig. 2Geometry of a typical laser light scattering setup (top view).第三步，净剩光强校正. 公式(7)中的光强是散射粒子自身的光强，在溶液中又称净剩光强，即溶液的散射光强Isolution减去溶剂的散射光强Isolvent.在实验中，以瑞利比Rvv已知的标准溶剂为参照，在同一台散射仪器上进行样品的测量是最常用的做法. 例如温度为T时，样品在θ角的瑞利比RTθ 通过以下公式得到：其中ITθ、RTθ、nT为样品在温度T下的净剩光强、瑞利比和折光指数，I25θ,standard、R25θ,standard和n25standard分别为标准溶剂在25 oC的散射光强、瑞利比和折光指数，也可以选用其他温度的配套数值. 当样品溶液和标准试剂的折光指数不同时，也需要进行校正. 狭缝和小孔所对应的指数分别为1和2. 甲苯是目前最常用的标准试剂，25 °C和632.8 nm波长下的瑞利比为8.70×10-6 cm-1. 甲苯与苯在不同波长和温度下的瑞利比可以从参考文献中查阅[24,25].将散射光强用瑞利比表示后，公式(7)可改写为：公式(9)适用于描述小粒子(尺寸小于波长的1/20)在溶液中的散射行为. 通常测量多个浓度下的Rvv值，将Hc/Rvv对c作图，从拟合直线的截距和斜率中分别求得M和A2值.当高分子的尺寸较大时，同一高分子内部不同重复单元的散射光会发生干涉现象，从而导致散射光强出现了散射角度的依赖性(图3). 从光强角度依赖性数据可以反推粒子的尺寸和形状. 具体做法是在公式(9)的基础上，引入与散射角度相关的形状因子(form factor)P，其中包含了粒子的尺寸和结构信息.Fig. 3Interference pattern of light scattered from two segments in a large particle or polymer chain. The inset shows the angular dependence of the scattered light.在光散射中，习惯上使用散射矢量q表示散射角. 散射矢量q定义为散射光波矢量与入射光波矢量的差. q与散射角度θ之间的数值关系为[24]：由式(10)可知，散射矢量q的单位为长度的倒数. 在波长和溶液体系固定的前提下，q是由散射角θ决定的变量，此时形状因子可相应地记为P(q). 经P(q)修正后的散射光强公式为[23]：对于小粒子而言，P(q) = 1，与散射角度无关.用回转半径Rg来描述高分子的尺寸，当qRg 1时：将公式(12)代入公式(11)中，并做近似处理，可得到：公式(13)是经典的静态光散射方程. 通过配置若干不同浓度的样品，测定每个样品的散射光强随角度的变化，利用公式(13)就可以得到样品的分子量M，回转半径Rg以及第二维里系数A2. 需要强调的是，对于具有一定多分散度的高分子样品，静态光散射测定的是绝对“重均”分子量和“z均”回转半径. 因此对于关联分子量和回转半径的研究，如确定二者的标度关系，必须采用分布尽可能窄的样品，测得的光散射数据才有分析处理的意义.对于浓度较高或分子量较大的样品，公式(13)有时并不能给出令人满意的结果. 在这种情况下，可以尝试利用改进的公式来进行数据处理：其中k为和第二维里系数相关的常数. 根据公式(14)绘制的图称为Berry Plot，同样可以得到重均分子量和回转半径.当qRg 1时，不同形状粒子的P(q)存在较大差别[23,26].回转半径为Rg的无规高分子线团：半径为R的均匀实心球：半径为R的空心薄球壳：半径为R的薄圆盘：其中J1为一阶贝塞尔函数.长度为L的细圆柱：其中Si(x)为sinus积分函数：通过测定待研究体系的形状因子P(q)，并与标准体系进行对比，就能够判断粒子的构象并确定其特征尺寸参数. 当体系浓度足够小，2A2c一项相对于1/MP(q)可以忽略时，公式(11)可转化为：即：在公式(22)中，M/Hc是与散射角θ或散射矢量q无关的量. 因此，测定各个散射角度下的Rvv，用零角度的数值归一化，再对q作图就得到了P(q)曲线. 为了提高用P(q)确定体系构象的准确性，尽量选用窄分布的样品，并在测定时覆盖尽可能宽的散射角度.利用静态光散射来测定共聚物比均聚物要复杂很多. 由公式(4)可知，决定体系散射性能及强度的内在因素是dn/dc. 共聚物等体系包含有2种或2种以上的组分. 当这些组分的(dn/dc)不同时，散射方程将急剧地复杂化. 以AB两嵌段共聚物为例，体系总的(dn/dc)AB = wA(dn/dc)A + wB(dn/dc)B，wA和wB分别为A和B嵌段的质量分数. 按照均聚物的测定方式，利用公式(13)能够得到共聚物的表观分子量Mapp[27]:其中：由公式(23)和(24)可以得到如下结论：(1) Mapp由两嵌段的(dn/dc)决定. 当所选溶剂的(dn/dc)AB接近0时，Mapp趋于无穷大.(2) 公式中有3个独立的未知数Mw,A，Mw,B和wA，因此需要在3种不同折光指数的溶剂中测定样品的Mapp，然后解方程得到两嵌段共聚物的真实分子量Mw [27]. 对大多数嵌段共聚物体系，找到3种可单分散溶解共聚物的溶剂并不容易. 吴奇等人在1994年报道了只用2种溶剂就可利用静态光散射测定共聚物分子量的方法[28]，但数据处理稍显繁琐.(3) 当在选用的溶剂中A嵌段的(dn/dc)A= 0时，直接测定的是B嵌段的分子量，反之亦然. 利用这种掩盖法，只需要2种溶剂就能精确测定A嵌段、B嵌段以及共聚物总的分子量.公式(23)还可以改写为：[28]其中P和Q是与嵌段共聚物组分非均匀分布相关的常数.由上式可知，当A和B两嵌段的dn/dc相等或接近时，所测定的表观分子量与真实值一致. 同理，也只有在这种情况下，才能够利用公式(13)来测定共聚物的回转半径Rg. 如果A和B两嵌段的dn/dc相差较大，特别是当(dn/dc)AB接近0时，Hc/Rvv在小角度会出现负斜率，导致外推得到的Rg为负值.利用静态光散射还可以测定粒子的分形维数. 一般来讲，若物体的维数是d，则其质量M和尺寸R应满足如下的标度关系：例如：三维的实心物体，质量M 与 R3成正比，而二维的实心物体，M与R2成正比. 维数d在一定程度上反应了粒子的结构和形状. 而高分子线团、空心粒子或具有不规则形状的物体，其维数通常不是整数. 静态光散射是测定粒子分形维数的有效工具. 对于尺寸为R的粒子，当满足qR 1 (一般大于3)时，绝对散射光强Rvv和散射矢量q之间的标度将满足[23]：Rvv和q的双对数图是一条直线，直线斜率的相反数就是该粒子的分形维数d. 该方法的准确度与q有效的数据范围有关，一般需要跨越数量级. 因此，不是所有体系都适用这种方法. 表1列出了常见拓扑结构的分形维数.2.2.2稀溶液中的动态光散射散射体积一般是固定的，其中往往包含有多个散射粒子. 由于布朗运动，散射体积内粒子的数目和位置都在发生变化，这导致在固定检测位置测定的散射光强会随时间发生涨落. 图4所示是2个高分子相对位置发生改变引起的光强涨落. 看似无规的涨落信号中埋藏了粒子扩散的信息. 挖掘扩散信息的途径是从随时间变化的I ~ t曲线得到光强-光强的时间相关函数.Fig. 4Time dependence of the interference pattern. The inset shows the change of scattered intensity with time at fixed scattering angle.首先介绍相关函数的概念. 在I-t 曲线中，t和t + τ时刻分别对应着光强It和It+τ，τ称为延迟时间. 当τ→0时，总有It = It+τ，而当τ→∞时，It和It+τ则是围绕平均光强It的2个随机值，无任何相关性. 用符号表示对其中的物理量作统计平均. It⋅It+τ是以τ为变量的光强-光强时间相关函数，即It和It+τ乘积的统计平均随延迟时间τ的变化. 当τ=0时，It⋅It+τ有最大值I2t；当τ趋近于∞时，It⋅It+τ有最小值It2：令：g2(τ)称为归一化的光强-光强时间相关函数[29].将动态光散射中的g2(τ)对τ作图，得到如图5中所示的曲线. 如果体系中只包含一种散射体A，则g2(τ)随τ呈现单一的快速衰减，衰减最快处对应的时间τA反映了体系的特征性质.Fig. 5Intensity-intensity correlation function.在现代的光散射仪中，光强的测定和g2(τ)的计算都是由硬件直接完成. 测定光强常用的仪器是雪崩光电二极管探测器(avalanche photodiode detector, APD)；从光强到g2(τ)是由相关器来完成的[24].从g2(τ)到粒子扩散的信息，还需要经过以下步骤：第一步，求解电场-电场时间相关函数g1(τ). g2(τ)是光强的相关函数，需要将其转换为电场的相关函数g1(τ)，才能和扩散过程直接相关联. 在光的波动理论中，光强是电场的平方. 而g2(τ)和g1(τ)的关系比简单的平方关系要复杂，称为西格特关系式(Siegert relation)[30]：其中β是和测量光路相关的系数. 当检测器前的狭缝或小孔合适，只测到单光斑(speckle)时，β=1.第二步，求解粒子自扩散系数Ds. 这个求解的过程是动态光散射理论的核心. 这里只简单介绍基于van Hove自相关函数Gs(r, τ) 的推导过程. 假定某个粒子在时间t的位置为0, Gs(r, τ)就是在时间t+τ时在位置r处发现该粒子的概率. 由于g1(τ)是随散射矢量q而变化的，可写成g1(q, τ). g1(q, τ)和Gs(r, τ)符合傅里叶变换(Fourier trans-formation)的关系：对于单分散、各向同性粒子的扩散运动(布朗运动或无规行走)，Gs(r, τ)仅依赖于距离r = | r |，且符合高斯方程：从Gs(r, τ)的半峰宽可以解出散射粒子的均方位移ΔR(τ)2. 在布朗运动中，ΔR(τ)2与粒子的自扩散系数D0的关系为：求解方程(31)可得：其中Γ=q2D0，称为线宽. 据公式(34)，将ln(g1(τ))对τ作图，从直线的斜率直接得到D0.第三步，求解流体力学半径Rh. 利用Stokes-Einstein方程：其中k为玻尔兹曼(Boltzmann)常数(1.38×10-23 J/K)，T为绝对温度，η为溶剂黏度，可从扩散系数直接得到流体力学半径. 对于有一定分散度的样品而言，DLS测定的流体力学半径和扩散系数都是z均值.由于粒子各向异性等因素的影响，在不同散射角度测定的扩散系数存在差异，因此在固定角度测定的是表观扩散系数Ds,app. 另外，光散射直接测定的是粒子的互扩散系数(mutual diffusion coefficient)，只有在零浓度时才与自扩散系数一致[23,31,32]. 因此，利用动态光散射求算扩散系数的公式包含了散射角度和浓度的依赖性：其中k1和k2是2个常数. k1和样品的分散度以及拓扑形状有关，k2和样品与溶剂的相互作用有关. 公式(36)与静态光散射公式(13)在形式上是类似的. 在实验中，同样需要对不同浓度的样品在不同的散射角进行测量，然后按照公式(36)，通过角度和浓度的外推，得到粒子扩散系数D0.以上介绍的是单分散粒子的动态光散射理论. 当样品呈多分散时，扩散系数D0或线宽Γ会出现相应的分布，一般用G(Γ)表示. 由公式(34)可得：g1(τ)是由G(Γ)经拉普拉斯变换得到的，而实际过程中是通过测定g1(τ)来反推样品的分布G(Γ)，因此是反拉普拉斯变换. 针对动态光散射实验开发的反拉普拉斯变换的方法有许多，如累积矩(cumulant)法、双指数(double-exponential, DE)法、直方图(histogram)法，离散变换(discrete inversion)法、熵最大化(maximum entropy method, MEM)法、非负值最小二乘法(nonnegatively least squares, NNLS)法、指数抽样(exponential sampling, ES)法和CONTIN法等. 关于各算法的优劣，可参考具体文献[33~36]. 在这些方法中，CONTIN是使用较为广泛且适用大多数多分散体系的算法.2.2.3稀溶液中静态光散射和动态光散射的结合应用不难看出，静态光散射和动态光散射是对同一个样品的浓度系列进行了2种不同方式的测量. 2种测量方式的有机结合，能够得到关于样品更多或更深入的信息.首先，对于单分散样品，比值Rg/Rh反应了粒子的拓扑结构. 表2列出了一些常见粒子的Rg/Rh的理论值.其次，对于双分布或多分布样品，静态光散射只能得到样品Rg和Mw的平均值. 而如果动态光散射能够在不同的散射角对多分布，特别是双分布，进行明确区分，就可以把在该角度的散射总光强按照峰的比例进行分配，从而得到各个组分的光强角度依赖性，再利用静态光散射理论，得到不同组分的Rg和Mw[37~39].最后，结合静态散射理论，能够把动态光散射测到的线宽分布G(Γ)转换为分子量的分布G(M)，前提是需要知道样品分子量和扩散系数的标度关系[40~42].2.2.4非稀溶液中的动态光散射非稀溶液体系中的动态光散射研究近年来取得了较多进展，已有不少成功应用的例子，并可以预期它在未来的科研中将发挥更重要的作用. 非稀溶液动态光散射主要面临2个共性问题：多重散射和非遍历(non-ergodicity). 扩散波谱也是一种特别且重要的非稀溶液动态光散射技术. 下面将分别进行介绍.非稀溶液中的多重散射可以通过设计特殊的仪器设备来进行削弱或抑制. 例如：扁平池光散射仪[43]就是采用光程非常小的扁平样品池(厚度可小至10 μm)，并辅以相应的散射体积校正，从而大幅减少多重散射，使得测量体系浓度可以比通用光散射仪大1000倍左右.光纤准弹性光散射仪(FOQELS)[11,12]是利用背散射来消除多重散射的影响. 入射光通过光纤导入到待测溶液中，该光纤同时也是信号接收器，接收(180±3)°范围内的散射光，背散射光和主光束用单模光纤定向耦合器进行区分. 浓度高达40 wt%的浑浊乳胶样品中也能利用该仪器进行DLS研究，且无需除尘.利用2束激光进行交叉相关是抑制多重散射的有效方式[14,44]. 双色交叉相关仪采用2束不同波长的激光同时照射样品；3D交叉相关仪则采用2束同波长但分别略高和略低于散射平面的激光同时照射样品. 这2种仪器大致上是利用非相干光的相关性为0，来消除有限次多重散射对相关函数的影响，从而得以对高浓体系进行光散射的测量. 这类仪器的测量角度也是大幅度可变的，在这一点上比FOQELS具有明显的优势. 双色交叉相关仪对光路准直的要求非常高，甚至0.01 oC的温度涨落所导致的光路波动都有可能破坏仪器的准直性. 相对而言，3D交叉相关仪对此的要求低得多.在非稀溶液中，由于粒子运动过慢或粒子过大等因素，导致实际的测量结果不是对样品所有可能状态的综合，这就是非遍历问题. 非遍历测量的直接后果就是数据不具有统计性，导致测得的g2(τ)数据无法解出样品真实的g1(τ).解决非遍历问题的首要思路是如何尽可能多地得到g2(τ)的信息. 可采用的方法包括对同一个体系用不同的方法测得g2(τ)，如用CCD面探测器测得多个光斑的变化然后进行互相关，对不同位置的测量结果取平均，或是用串联的双样品池进行目标样品和参考溶液的相关等.如何从g2(τ)中解出接近真实的g1(τ)也是解决非遍历问题的必经步骤. 目前常用的方法是对西格特关系式(公式(30))进行变换，如其中f(g1(τ))是与实验装置相关的函数，具体的装置设计和对应的算法可参考文献[45]. 根据公式(37)可在非遍历条件下求得较准确的g1(τ).扩散波谱是针对极浓溶液的一种特殊的动态光散射方法，基本思路和常规的动态光散射法相同：仪器测定g2(τ)，算出g1(τ)，通过变换得到扩散系数Ds，从而算出Rh. 所不同的是，从g1(τ)到Ds涉及了特殊的理论，具体的推导过程可参考文献[17,45,46]. 对于单分散样品，g1(τ)和Ds的关系式可表示为：将ln(g1(τ))对τ−−√作图，数据将呈现一条直线，从斜率即可求出Ds. 可以看出，对于极浓溶液，g1(τ)和q或散射角无关，这也是合理的.更重要的是，扩散波谱能够测定介质的储能模量G' 和损耗模量G' ' 的频率依赖性，也就是介质的黏弹性[47~49]，这类似于流变仪扫频实验得到的数据. 由Stokes-Einstein方程(公式(35))可知，扩散系数D与ηR的乘积呈反比关系，这3个参数可以知二求一. 对于常规的动态光散射而言，溶剂黏度η已知，可求出Rh. 在极浓溶液中放入给定尺寸Rh的小球，根据小球的D(τ)能够得到η*(ω)，即溶液复合黏度随频率的变化曲线. 由该曲线可计算求得G' (ω)和G' ' (ω).2.3固体光散射固体光散射在高分子球晶的研究中发挥了重要作用，可得到球晶分布、取向和尺寸信息. 虽然球晶也可用偏光显微镜(POM)和原子力显微镜(AFM)进行观测，但偏光显微镜有光学分辨极限，对尺寸小于5 μm的球晶几乎无法观测，而原子力显微镜对样品制备有着较为严格的要求，也无法观测固体内部的球晶形态. 因此，在球晶研究方面，固体光散射有着不可替代的优势. 球晶固体光散射的理论比较复杂[19~21], 本节仅简单介绍球晶呈现的四叶草瓣形状的散射图样和球晶尺寸的求算.2.3.1球晶的VH散射四叶草瓣图样光穿过具有取向的结构后，沿非取向方向偏振的光将被抑制或滤去(图6(a))，这也是许多偏振片的工作原理. 常用的VH固体光散射的光路设计是在样品的前后分别放置偏振片，偏振方向相互垂直(图6(b)). 这样的实验设计滤去了偏振不变的散射光，只有改变了偏振方向的那部分散射光才能被检测到. 对于许多结晶高分子而言，球晶的散射信号是唯一偏振有变化的散射信号.Fig. 6Spherulite studied by solid light scattering.球晶内部的取向结构是中心对称的(图6(c)). 经过第一个V偏振片的入射光，在球晶的V方向和H方向上遇到的球晶内部的取向结构均是垂直或平行于V方向的，光将直接通过或是被完全滤去，方向不发生偏转. 因此，在这2个方向上的散射光在第二块H偏振片后面，完全不会被检测到. 而除了V方向和H方向，散射光均和球晶内部的取向结构有一定夹角，光将偏转方向，得以被最终检测到. 因此，散射图样常出现黑十字消光现象(图6(d))，呈现四叶草瓣形状. 消光十字的方向分别平行于2个偏振片的取向方向. 图6(d)还表明散射图样不是连续的，而是由多个分散的斑点所构成，其中每一个亮斑都是之前动态光散射理论中所说的斑点(speckle). 这不是因为检测器的精度不够造成的.2.3.2球晶的尺寸计算球晶属于大粒子，其固体散射也存在形状因子P(θ). 在VH光路下[19]，其中：R' 为球晶半径.对于无取向的球晶时，理论和实验均表明，在花瓣散射光强最亮点处，近似有U=4.0[19]. 因此：其中θm即最亮点处的散射角. 公式(42)即广泛使用的无取向球晶的尺寸计算公式. 对于有取向的球晶，最亮点处的U值有时会发生变化. [21]3实验技巧在上面介绍的光散射技术中，稀溶液体系的光散射应用目前最为广泛，所得到的信息也最丰富，但相应的样品制备和实验过程也比较复杂. 本节将简要介绍稀溶液光散射的实验技巧和数据处理方式.3.1样品溶解首先是要选择合适的溶剂来溶解样品. 重点考虑光散射衬度，即(dn/dc)的大小. 若(dn/dc) = 0，将得不到任何散射信号. 在保证溶解性能的前提下，通常选择折射率和溶质差别较大的溶剂. 对于共聚物体系而言，需要根据体系的性质和实验的需求来选择溶剂. 例如：在测定有机共聚物的精确分子量时，则应当选择多种良溶剂或共溶剂进行实验.其次是要选择合适的样品浓度来进行测量. 一方面浓度要足够稀，使得分子间的相互作用可以忽略. 高分子的临界交叠浓度(overlap concen-tration) c*是浓度上限的参考点. 另一方面，浓度越稀，散射信号也越弱，测量将变得困难. 对于未知且不易估算c*的高分子体系，0.1 mg/mL可以作为初始的浓度进行尝试.最后需要溶解样品，形成均一体系. 高分子的溶解过程耗时较长，通常需要2~24 h. 搅拌仅能有限地加速溶解过程. 升温会使得高分子体系氧化，应尽量避免. 超声也是不推荐的.3.2除尘由于散射光强与粒子尺寸的4~6次方成正比，直径在微米级的灰尘粒子会对高分子样品的散射实验造成毁灭性的破坏，因此要尽量避免样品溶液中掺杂有灰尘粒子. 灰尘是极性的. 水溶液体系的除尘往往比有机溶液体系要困难. 除尘操作包括样品瓶除尘和溶液样品除尘.光散射样品瓶的除尘通常采用类似于索式提取的装置，利用蒸发后再冷凝的丙酮间歇性地对倒置样品瓶的内部进行多次冲刷. 除尽灰尘的样品瓶要封口并倒置保存.样品的除尘通常有过滤法和离心法. 过滤法更易操作，需要在空气尽量净化的环境中，使用孔径在样品尺寸之上，且在灰尘粒径之下的滤膜，用注射器将待测样品过滤后注入到除尘后的样品瓶中. 可供选择的商业化滤膜有很多，可选用的孔径在200~600 nm之间. 过滤时滤膜上的压力不宜过大，因此过滤需缓慢进行. 如果所测体系较为复杂，没有合适的滤膜可选，则可考虑离心法.3.3仪器准直仪器的准直性是光散射实验的前提. 溶剂分子(一般选甲苯)的散射光强在校正散射体积后是没有角度依赖性的(图1)，可用来验证仪器的准直程度. 对除尘后的甲苯样品进行角度扫描，角度范围一般在20°~150°. 如果每个角度的散射光强都围绕某一平均值波动，且波动不超过2%，则可认为仪器的准直是良好的. 若该条件不满足，则需要对仪器的准直进行校准.3.4实验过程静态光散射实验中散射角度的选择很重要. 原则上，只有在qRg 1的情况下才能用公式(13)准确测定粒子的回转半径. 对于尺寸较大的样品，需要在小的散射角度或q范围内测量多个数据点(减小角度间隔)，以保障角度外推的可靠性. 另外，在小角度时，灰尘的影响会变得更加明显，这对样品特别是水溶液中的样品的除尘提出了更高的要求. 大尺寸样品的光强角度依赖性很强，小角度的光强比大角度会高出有4~5个数量级，因此要注意检测器的线性响应范围，必要时可用非偏振类滤光片调节入射光的强度.动态光散射数据的根源是g2(τ). 在样品除尘合格的前提下，选择合适的延迟时间τ范围，并累积足够长的时间是获得可靠g2(τ)的前提.检测器前端的小孔(pinhole)或狭缝是可调的. 对于静态光散射，通常需要选择较大尺寸(如1 μm)以测得具有统计性的散射光强. 对于动态光散射，通常需要选择较小的尺寸(如200 nm)，以保证只测到单一光斑，从而使得西格特关系式中的β值趋近于1.对于碳纳米管、石墨烯、金纳米颗粒、荧光分子等具有光吸收能力的样品，静态光散射和动态光散射的校准方式也是不同的. 静态光散射需要通过测定光吸收系数，通过朗伯比尔定律来校正不同角度的净剩散射光强；而动态光散射则需要测定在不同入射光强下的样品扩散系数，通过外推到零入射光强的方式来消除光吸收对扩散的影响. 如果样品的吸光性太强，引入的误差增加，不提倡用光散射进行测量.3.5数据处理绘制Zimm图是静态光散射最常用的数据处理方法. 这是一个初学者经常会出错的处理过程，其中最关键的是各物理量单位的转化. 简单的处理方式是采用非国际单位：q以nm作为长度单位，其他所有物理量的长度单位均转化为cm. 光学常数H和质量浓度的单位则分别为cm2⋅g-2⋅mol和g⋅cm-3. 在绘制Zimm图时，如果数据点偏离了线性，可以从样品是否多分散、是否聚集以及是否满足qRg 1等方面进行分析.尺寸小于激光波长1/20的粒子通常不会出现散射角度的光强依赖性，不需要做角度扫描. 为了尽量降低灰尘对散射实验的影响，一般选择90°进行各浓度溶液的测量，然后直接运用公式(9)计算M和A2.如果实验中只关注回转半径，且要求的准确度不高，可选择一个较低的样品浓度进行角度扫描，不需要dn/dc的测量. 具体处理如下：取x列为散射角度θ，y列为光强值I原始数据，将x列转换为q2，单位为nm-2，将y值转换为(I - Isolvent)⋅sinθ(即只做净剩光强校正与散射体积校正)，单位任意；(2)将x和1/y作图，线性拟合，取3倍截取/斜率，并开平方，即得到回转半径Rg，单位为nm.对于多组分体系的动态光散射，尺寸相差2倍以上的粒子才有可能被分辨为2个组分. 如果体系中组分的数量大于3，或得到的Rh分布图的峰数量大于3，则需要对结果的准确性持较谨慎的态度，需要从原理上判断结果是否合理，或通过其他手段适当进行辅证.3.6(dn/dc)测量(dn/dc)通常需要专用的仪器进行测量. 折光指数和原子极化率相关，极大地受原子序数的影响. 相对于C和H元素而言，Na和K等元素的原子序数要大得多，因此溶剂中的微量溶盐将极大地影响(dn/dc)的测量准确性. 为了确保对未知体系的准确测量，最好使用同一批溶剂，分别进行(dn/dc)的测量以及所有的光散射实验.4典型应用光散射技术在高分子表征中的应用非常广泛. 感兴趣的人士可以查阅相关书籍、专著和文献. 从掌握光散射基本理论和实验技巧、了解光散射技术发展趋势的角度出发，结合实验体系的代表性， 我们选取了4个经典的应用案例，来具体说明动、静态光散射的使用技巧，二者相结合的必要性，时间可分辨光散射技术的优势，以及如何开发光散射技术在复杂溶液体系中的应用.4.1动、静态光散射相结合表征溶液中高分子行为动、静态光散射技术相结合能够对溶液中的高分子进行深入、系统的表征. 跟踪高分子链从线团到球的转变(coil-to-globule transition)过程是该技术最典型的应用之一. 在不良溶剂中，高分子链会发生塌陷，同时会伴随着高分子链之间的聚集. 如果观测单个高分子链在不良溶剂中的构象转变，要考虑多方面的因素[50,51]，一般采用尽可能高的分子量、尽量窄的分布、并在尽可能稀的溶液中来进行. 一方面可以避免分子链之间的聚集，另外也可以保持较高的净剩散射光强. 吴奇课题组结合分级和过滤得到了分子量极高、多分散度窄的水溶性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)样品(Mw=1.3×107 g/mol，Mw/Mn 1.05)，并配制了10-7 g/mL级别的极稀水溶液，用光散射首次观测到了高分子单链塌缩的构象转变.PNIPAM的低临界溶液温度(lower critical solution temperature，LCST)约为32 °C. 图7对比了6.7×10-7 g/mL PNIPAM在相变前后的动、静态光散射结果. 在35.9 °C时，水是PNIPAM的不良溶剂，Rg从30.1 oC的127 nm减小到17.9 nm，Rh也发生了类似变化. Rg/Rh在2个温度的数值分别为1.5和0.72，表明PNIPAM在30.1 oC时为线团构象，而升温到35.9 °C时则转变为密实球的构象.Fig. 7Typical angular dependence of Hc/Rvv of PNIPAM in water at two different temperatures, where the polymer concentration is 6.7×10-7 g/mL. The inset shows the corresponding hydrodynamic radius distributions f(Rh) of the PNIPAM chains respectively in the coil and the globule states. (Reprinted with permission from Ref.[50] Copyright (1998) American Chemistry Society).在连续的升温和随后的降温过程中，Rg/Rh随温度并不是单调变化的. 如图8(a)所示，在升温过程至30.6 °C之前，Rg/Rh基本保持在1.5左右，表明PNIPAM为无规线团构象；在30.6~31.6 °C 温度区间，Rg/Rh 从1.5快速降低到1.0，此时的链构象可归结为褶皱的线团(crumpled coil)；继续升温到32.4 °C时，Rg/Rh骤降到0.56，所对应的是熔融球构象(molten globule)，即表面密度低、内部密度高的球体；在随后的升温过程中，Rg/Rh逐渐增加到0.775, 所对应的是常规的球体. 图8(b)对比了不同温度时PNIPAM的链构象示意图及相应的链密度分布. 在随后的降温过程中，Rg/Rh的变化过程出现了明显的滞后，这可能是在球体状态下形成了某种链内结构所造成的.Fig. 8(a) Temperature dependence of Rg/Rh of PNIPAM chains during coil-to-globule (heating) and globule-to-coil (cooling) transitions. (b) Schematically showing the four thermodynamically stable states and their corresponding chain density distributions (W(r)) along the radius during coil-to-globule transitions. (Reprinted with permission from Ref.[50] Copyright (1998) American Chemistry Society).4.2光散射测定超支化分子的标度关系除线性高分子外，光散射在测定具有复杂构型的高分子样品中也具有独到的优势. 以支化高分子为例，李连伟课题组制备得到了支化点间长度等同的“完美”支化高分子，并利用光散射技术确定了支化高分子尺寸和聚合度之前的标度关系[52].对于满足支化随机、支化点间长度等同的单分散高分子样品，其回转半径Rg与支化分子总的单体数Nt以及临界支化点间的单体数Ns之间存在如下的标度关系：其中b是库恩长度. 对于在θ溶剂中ν值的大小，不同理论有着不同的认识. 平均场理论认为 ν=0.25，而Flory理论则预测ν=0.44. 由于理想的支化高分子难以得到，在此之前尚无实验数据进行验证.李连伟课题组合成了不同分子量的支化聚苯乙烯(h-PS)，并用静态光散射测定了重均分子量. 对于高分子量样品，qRg 1，采用Berry plot(参见公式(14))进行数据处理. 低温下，环戊烷是h-PS的不良溶剂，而高温下是良溶剂. 通过测量多个温度下体系的第二维里系数A2，找到其由正值转变为负值的临界点，即可得到θ温度，其值为304~307 K.通过对静态光散射数据进行处理得到了形状因子Rvv(q)/Rvv(0) (图9(a)). 线性拟合qRg 3的数据，利用公式(27)得到支化分子的分形维数为2.4，并进一步求得ν约为0.42. 另外，ν值还可以从支化样品的Rg~Mw 的双对数关系中直接得到. 如图9(b)所示，h-PS在环戊烷溶剂中302.1 K的ν约为0.47. 2种方法得到的结果是吻合的，均支持Flory理论的预测.Fig. 9(a) qRg dependence of the normalized excess Rayleigh ratio [RVV(q)/RVV (q=0)] for h-PS and (b) weight-average molar mass (Mw) dependence of chain size (R) for different h-PS in cyclopentane at 302.1 K (Reprinted with permission from Ref.‍[52] Copyright (2020) American Chemistry Society).4.3用时间分辨光散射表征体系的动态变化前文中介绍的光散射理论都是针对平衡态体系的. 如果体系发生变化所需的时间远超过光散射的采样时间，就能够在保证准确度的情况下，利用光散射技术原位、在线跟踪聚合、组装、解离、降解等过程，获得分子量、尺寸等随时间变化的信息，并以此来剖析机理，也就是常说的时间分辨的光散射技术. 这里以聚合诱导的胶束化过程为例来说明该技术的特点和优势[53]. 类似的经典案例还有利用GPC-LLS联用技术监测高分子的降解过程[54]，监测支化高分子的聚集与解散[55]，以及监测噬菌体喷射DNA的过程[56]等.氯仿是聚氧乙烯(PEO)的良溶剂, 苯乙烯(S)和马来酸酐(MAn)交替共聚物的不良溶剂. 运用可逆加成断裂转移(RAFT)活性聚合技术，让含有PEO(聚合度114)的大分子链转移剂在氯仿中进行苯乙烯和马来酸酐的交替共聚，生成PEO-b-P(S-alt-MAn). 当P(S-alt-MAn)的聚合度达到某临界值时，就会发生胶束化. 取决于浓度、温度、链长等因素，该过程的时间跨度可达10 h，因此适合用时间可分辨的光散射技术进行表征.聚合反应的各种试剂和溶剂经滤除尘后，收集于无尘的光散射样品瓶中，并用高纯氮吹扫5 min以除去体系中的氧气. 把样品瓶放入恒温(55±0.01) °C散射仪中，计时开始，交替进行SLS和DLS测量. 取决于散射光强，DLS的采样时间从10 s到2 min不等. 图10 是PEO引发剂为1.38 mg/mL时，Rh分布随时间的变化情况. 在229 min时，体系中除了聚合物单分子外(Rh为2~3 nm)，还出现Rh约100 nm聚集体(图10(A))，但散射光强弱，证明此类聚集体比较松散. 随时间推移，单分子含量减少，聚集体含量增加，尺寸分布也变窄(图10(B)). 在373 min时，体系中出现了Rh约20 nm的另外一种聚集体(图10(C))，并伴随着大分子单体和100 nm聚集体含量的减少(图10(D))，此时散射光强开始急剧增加，说明新聚集体的链密度较高. 最终体系中仅存在尺寸为20 nm的聚集体，即大分子胶束.Fig. 10Distribution of hydrodynamic radius during polymerization at different time at 30°. The concentration of PEO macro-CTA is 1.38 mg/mL. (Reprinted with permission from Ref.[53] Copyright (2008) American Chemistry Society).由于在373 min之前体系中存在多分布，用静态光散射测定分子量和Rg没有实际意义. 当体系中只存在20 nm的聚集体时，就可以用静态光散射测定Rg，并结合动态光散射的结果，对粒子构象进行分析. 由于光强随时间在发生变化，而Rg的测定需要同一时间的光强角度依赖性数据. 可行的做法是依次测量30°、45°、60°、75°、90°这5个角度下光强数据，并记录时间，直至反应结束. 这样就得到了5条不同角度的散射光强随时间的变化曲线. 使用MATLAB中的cubic spline平滑拟合并插值，可得到任意时间下的光强角度依赖性数据，从而分析得到Rg和分子量. 尽管胶束化过程与浓度相关，无法进行浓度外推，但从严格意义上来讲，这种单一浓度测定的胶束尺寸仍然是表观数据. 如图11所示，随着聚合反应的进行，Rh,app从380 min的23 nm单调增加至840 min的40 nm；而Rg,app在500 min之前快速减小，从53 nm减至20 nm，后基本保持不变. Rg,app/Rh,app则从~1.8降低至~0.5，说明了该聚集体的构象从松散的聚集体向密实球转变. 由于最终聚集体的核是P(S-alt-Man)形成的密实球，而外围的PEO链仍然处在良溶剂中，为线团构象，因此Rg,app/Rh,app可低至0.5左右，类似熔融球构象. 这些结果表明，当P(S-alt-MAn)的聚合度到达临界聚集值时，嵌段共聚物并不是一步组装成胶束结构，而是首先形成具有松散结构的聚集体，继而发育成胶束结构.Fig. 11Time dependence of Rg,app and Rh,app in the polymerization-induced self-assembly process. The inset shows the changes in Rg,app/Rh,app. The concentration of PEO macro-CTA is 1.38 mg/mL. (Reprinted with permission from Ref.‍[53] Copyright (2008) American Chemistry Society).4.4去偏振光散射表征生理介质中的纳米粒子随着现代生物医学技术的发展，纳米粒子在药物缓释、基因传递、生物传感和成像等领域得到了长足发展. 纳米粒子与生物介质的相互作用决定了纳米粒子的细胞中的归宿，包括吸附、分布、代谢和清除，因此原位、无扰跟踪纳米粒子在生物介质中的动态过程就显得尤为重要. 荧光标记是目前最常用的方法，但荧光基团毫无疑问会改变纳米粒子的表面性质.原位、无扰对体系进行检测是光散射技术的优势. 由于生物介质中高含量的蛋白质等物质会严重干扰纳米粒子的散射光，这使得常规的偏振光散射(VV)并不适于复杂生物体系的研究(图12(a)). 但由于多晶结构的存在，无机纳米粒子不会是完美的球形，总会存在非均质的内部结构，从而能够改变偏振光的方向. 因此采用去偏振动态光散射(depolarized DLS，DDLS)，即入射光为V方向偏振，但收集H方向偏振的散射光，就能够有效滤除生物介质产生的背景散射光(图12(b))[57].Fig. 12Depiction of nanoparticles and the bio-matrix background as seen in standard polarized (a) and depolarized (b) dynamic light scattering experiments, respectively. (Reprinted with permission from Ref.[57] Copyright (2015) The Royal Society of Chemistry).Balog团队利用DDLS技术对比研究了柠檬酸稳定的金纳米颗粒以及不同端基聚乙二醇链包覆的金纳米颗粒在四种不同的生物介质(磷酸盐缓冲液PBS、牛血清白蛋白的PBS溶液、培养基DMEM以及添加了牛血清蛋白的DMEM)中的动态行为. 所使用的仪器是商业化的3D光散射仪. 激光光源为21 mW，632.8 nm的氦氖激光器，散射光信号由装有集成准直光学元件的单模光纤收集，并传递至2个高灵敏度的APD探测器进行分析. 结果表明，DDLS有效地屏蔽了背景散射光，从而能够跟踪金纳米颗粒在不同介质中的聚集过程. 如图13所示，金纳米颗粒形成的聚集体尺寸及其分布既与颗粒表面的涂层有关，更受介质组分的影响. 所得结果得与扫描电镜的结果一致，证明了DDLS原位、无扰跟踪研究复杂体系动力学过程的可靠性.Fig. 13Time-resolved DDLS study started promptly after incubating the Au NPs in the biological media. The dashed lines correspond to the Au NPs in PBS buffer. (Reprinted with permission from Ref.[57] Copyright (2015) The Royal Society of Chemistry).5结语与展望本文介绍了分别对应高分子稀溶液、浓溶液和固体的光散射技术. 其中针对高分子稀溶液的动、静态光散射技术和针对高分子球晶的固体散射技术都是比较成熟的手段，在高分子体系的研究中发挥着不可替代的作用. 光散射技术最显著的优势是能够对体系实现原位、无扰的表征. 伴随着生物医学、活性软物质等领域的发展，针对复杂体系的光散射技术将具有更广阔的应用前景.致谢感谢赛普瑞生的牛爱珍博士和布鲁克海文的王继军工程师提供商业化仪器的相关资料.参考文献1Rayleigh L. Phil Mag, 1871, 41: 107-1202Rayleigh L. 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J Chem Phys, 1981, 74: 260-262. doi:10.1063/1.44088414Pusey P N. Curr Opin Colloid Interface Sci, 1999, 4: 177-185. doi:10.1016/s1359-0294(99)00036-915Meyer W, Cannell D, Smart A, Taylor T, Tin P. Appl Opt, 1997, 36: 7551-7558. doi:10.1364/ao.36.00755116Zakharov P, Bhat S, Schurtenberger P, Scheffold F. Appl Opt, 2006, 45: 1756-1764. doi:10.1364/ao.45.00175617Maret G, Wolf P E Z. Phys B, 1987, 65: 409-413. doi:10.1007/bf0130376218Brillouin L. Ann Phys, 1922, 17: 88-122. doi:10.1051/anphys/19220917008819Stein R S, Rhodes M B. J Appl Phys, 1960, 31: 1873-1884. doi:10.1063/1.173546820Stein R S, Chu W. J Polym Sci, Part A: Polym Chem, 1970, 8: 1137-1157. doi:10.1002/pol.1970.16008070921Van Aartsen J J, Stein R S. J Polym Sci, Part B: Polym Phys, 1971, 9: 295-311. doi:10.1002/pol.1971.16009020622Huglin M B. Light Scattering from Polymer Solutions. London: Academic Press, 1972. 204-28923Wolfgang S. Light Scattering from Polymer Solutions and Nanoparticle Dispersions Series. Translated by Zheng Cui, Liang Dehai. Beijing: China Machine Press, 2012. 1-2524Chu B. Laser Light Scattering: Basic Principles and Practice. 2nd ed. New York: Academic Press Inc, 1991. 19. doi:10.1016/b978-0-12-174551-6.50005-725Hua W. Chem Phys, 2010, 367: 44-47. doi:10.1016/j.chemphys.2009.10.01926Zhao Zeqing(赵择卿), Lu Danian(陆大年), Yang Dingchao(杨定超). Light Scattering Technology(光散射技术). Beijing(北京): China Textile&Appare lPress(纺织工业出版社), 1989. 28-3027Bushuk W, Benoit H. Can J Chem, 1958, 36: 1616-1626. doi:10.1139/v58-23528Wu C, Fai K, Luo W, Zhu X, Ma D. Macromolecules, 1994, 27: 6055-6060. doi:10.1021/ma00099a01829Teraoka I. Polymer Solutions: An Indroduction to Physical Properties. New York: John Wiley&Sons, Inc. 2002. 168-171. doi:10.1002/047144026430Chu B. Laser Light Scattering: Basic Principles and Practice. 2nd ed. New York: Academic Press Inc, 1991. 84. doi:10.1016/b978-0-12-174551-6.50005-731Kanematsu T, Sato T, Imai Y, Ute K, Kitayama T. 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2021年，《高分子学报》邀请了国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写从基本原理出发的高分子现代表征方法综述并上线了虚拟专辑。仪器信息网在获《高分子学报》副主编胡文兵老师授权后，也将上线同名专题并转载专题文章，帮助广大研究生和年轻学者了解、学习并提升高分子表征技术。在此，向胡文兵老师和组织及参与撰写的各位专家学者表示感谢。更多专题内容详见：高分子表征技术专题高分子表征技术专题前言孔子曰：“工欲善其事，必先利其器”。 我们要做好高分子的科学研究工作，掌握基本的表征方法必不可少。每一位学者在自己的学术成长历程中，都或多或少地有幸获得过学术界前辈在实验表征方法方面的宝贵指导！随着科学技术的高速发展，传统的高分子实验表征方法及其应用也取得了长足的进步。目前，中国的高分子学术论文数已经位居世界领先地位，但国内关于高分子现代表征方法方面的系统知识介绍较为缺乏。为此，《高分子学报》主编张希教授委托副主编王笃金研究员和胡文兵教授，组织系列从基本原理出发的高分子现代表征方法综述，邀请国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写。每篇综述涵盖基本原理、实验技巧和典型应用三个方面，旨在给广大研究生和年轻学者提供做好高分子表征工作所必须掌握的基础知识训练。我们的邀请获得了本领域专家学者的热情反馈和大力支持，借此机会特表感谢！从2021年第3期开始，以上文章将陆续在《高分子学报》发表，并在网站上发布虚拟专辑，以方便大家浏览阅读. 期待这一系列的现代表征方法综述能成为高分子科学知识大厦的奠基石，支撑年轻高分子学者的茁壮成长！也期待未来有更多的学术界同行一起加入到这一工作中来.高分子表征技术的发展推动了我国高分子学科的持续进步，为提升我国高分子研究的国际地位作出了贡献. 借此虚拟专辑出版之际，让我们表达对高分子物理和表征学界的老一辈科学家的崇高敬意！小角中子散射技术及其在大分子结构表征中的应用The Basic Principle of Small Angle Neutron Scattering and Its Application in Macromolecules作者：左太森，马长利，韩泽华，李雨晴，李明涛，程贺作者机构：中国科学院高能物理研究所 中国散裂中子源 2.散裂中子源科学中心,东莞,523803 中国科学院大学,北京,100049作者简介：程贺，男，1978年生. 中国科学院高能物理研究所东莞研究部研究员. 1996年考取中国科学技术大学，2006年在吴奇教授课题组获得博士学位. 随后赴中国科学院化学研究所韩志超研究员课题组工作，建设我国第一台SANS(2012年国家验收). 2014年加入中国散裂中子源，中国科学院高能物理研究所东莞研究部，现正在主持建设世界上第二台基于散裂中子源的VSANS. 致力于使用和发展散射方法，研究软物质多相多尺度结构和动态学行为.摘要小角中子散射(SANS)是一种表征从纳米到微米尺寸物质特征结构的有力工具，配合中子的强穿透性和同位素辨识等特性，在软物质大分子结构表征方面发挥着独特的作用. 随着中国散裂中子源(CSNS)在2018年正式对外接受机时申请，国内SANS用户群逐年扩大. 本文首先简要介绍小角中子散射技术的基本原理、谱仪结构和实验技巧，然后紧扣小角谱仪的特点和方法学方面的最新进展，介绍小角中子散射在高分子溶液、高分子共混物和复合材料、高分子结晶、凝胶、多孔材料、生物大分子等研究领域的结构表征方面的典型应用. 小角中子散射和其他表征手段，如小角X射线散射(SAXS)相互紧密配合和补充，成为连接大分子内部多相多尺度的微观结构和宏观性的桥梁.AbstractSmall angle neutron scattering (SANS) is a powerful tool to characterize multi-scale structures in macromolecules. Deep penetration and H/D isotope labeling make it a unique scattering method. To make it more familiar to the users, basic principle of SANS, instrumentation and experimental skills were firstly demonstrated. Then typical applications in the fields of polymer solution, polymer blends, nanocomposites, crystallization, gels, porous materials and biomacromolecules were introduced. As for the data analysis of complex systems, such as biomacromolecules, in addition to the traditional data analysis methods, advanced methods such as the ab initial analysis and Reverse Monte-Carlo (RMC) simulations provide more detailed information. Combine with small angle X-ray scattering (SAXS), static light scattering (SLS), electron microscope (EM)et al., SANS enables us to solve the structure and interaction of more complicated systems such as interaction of biomacromolecues and solvation of polymers in mixed solutions. As the China Spallation Neutron Source (CSNS) was officially opened to the users around the world in 2018 and SANS instruments equipped with various sample environments are being built, more opportunities are opened to the SANS communities domestically and abroad.关键词小角中子散射  大分子  多相多尺度  结构表征  中国散裂中子源KeywordsSmall angle neutron scattering  Macromolecules  Multi-scale and multi-phase  Structure characterization  China spallation neutron source 小角散射，通常包括小角光散射(SLS)、小角X射线散射(SAXS)和小角中子散射(SANS)，都是表征物质纳米到微米的多尺度特征结构的有力手段[1,2]. 它们的基本原理[3]和数据处理分析方法[4]十分类似，三者可以互补和互相验证. 3种散射方法有两点主要不同之处：一是光源与样品的作用机理不同，所以使用不同散射方法时样品的衬度不同；二是波长不同，所以研究的特征尺度范围不同. 首先，衬度直接决定了散射实验的可行性. 光散射衬度来自样品的微分折光指数；X射线与核外电子相互作用，衬度来自于电子云密度，所以原子序数高的元素衬度高；对于中子，由于中子直接作用于原子核，与核的性质有关而与原子序数无关，反而同一元素的各种同位素的中子衬度有很大不同. 小角中子散射的衬度等于样品与分散剂的相干散射长度密度之差，这里的相干散射长度密度(ρcoh，单位：Å-2)是散射体中所有的元素或同位素的相干散射长度(bcoh, 单位：Fermi，1 Fermi = 10-15 m)的加权平均与散射体的摩尔体积之比；同位素的散射截面相当于原子核与中子相互作用被散射的概率( σσ，单位barn, 1 barn = 10-24 cm 2)，正比于散射长度的平方. 中子与原子核相互作用，除了被散射外，还会有一定的概率被吸收. 常见天然元素和同位素对于1.8 Å中子的相干散射长度、相干和非相干散射截面以及吸收截面的数据如表1所示[5]. 设计SANS实验的第一步需要估算样品的中子衬度和透光率，前者决定了SANS实验的可行性，后者决定了数据分析的可行性. 根据表1，已知大分子体系的元素、同位素组成和密度，可以计算中子衬度，溶液体系衬度为溶质和溶剂的中子相干散射长度密度差，二元共混体系衬度为二元组分大分子的中子相干散射长度密度差. 衬度低的样品无法进行SANS实验(比如一般的非晶碳氢化合物样品，化学组成一般为CH2，根据表1，bc+2bH≈0bc+2bH≈0，在不进行氘代的情况下无法进行SANS实验)；而样品对中子的透过率可以通过式(1)所示的朗伯-比尔定律计算.其中：d为样品厚度.nini为样品中第ii种元素的原子比例，pij、σij(λ)σij(λ)和ρijρij分别为第i种元素的第j种同位素的丰度、全截面和数密度. 其中全截面包含相干、非相干和吸收截面，同位素截面相关数据可以参考ENDF数据库[6]. 传统的散射基本理论是建立在单次散射的基础上的，如果样品太厚，透光率较低，可能在实验中引入多次散射，造成数据无法用常规分析方法解析，所以一般的SANS实验要求 Ttrans85%，如果是溶液样品，尽量采用氘代溶剂.Table 1Coherent scattering length and coherent, incoherent and adsorption scattering cross section of common elements in macromolecules and commonly used isotopes in SANS experiments[5].一些吸收截面非常大的天然元素或者同位素通常用于中子吸收材料，如表1中的B-10，在实验样品中要尽量避免这类对热中子具有强吸收的同位素，除B-10外，还有Cd-113、Gd-155、Gd-157、Sm-149、Eu-151等同位素.对于结构表征的各类技术，能够覆盖的尺寸范围很大程度上决定了这一技术的应用范围. 用于光散射的激光波长在可见光范围，所以小角激光光散射观察尺度在微米的数量级，而静态激光散射的观察尺度在20~300 nm；由于X射线和中子的波长在埃的数量级，所以常规的SAXS和SANS可以测量1~300 nm的特征尺度.表2总结了3种小角散射方法的一些基本特征，可以看到每种方法都有其特点和不足. 小角光散射波长较长，需要样品透明并且容易受到灰尘的影响；小角X射线散射的优势是亮度非常高，特别是同步辐射X射线小角，缺点是穿透能力一般，容易被吸收(当然共振散射赋予了它另外的特点)；小角中子散射的特点是穿透能力强，可以加载各类样品环境，同时还能够识别同位素，可以得到样品的绝对散射强度，缺点是中子源亮度太低. 所以实际使用中，用户需要依据自身样品的特点和需要观察的特征尺度范围，选择合适的散射手段，互相验证和补充.Table 2Comparison between SLS, SAXS and SANS.随着小角中子散射方法的应用越来越广泛，谱仪和方法学上出现了2种趋势，一方面通过中子束的聚焦或准直向更小散射矢量方向扩展1~2个量级，研究特征尺度更大的体系，典型的就是发展微小角(VSANS)[7]甚至超小角(USANS)中子散射谱仪[8]；另一方面利用波长更短的中子的散射将散射矢量扩展到50 Å-1以上，研究无序体系在原子尺度上的结构，即所谓的无序大分子中子全散射方法[9]. 谱仪技术发展的驱动力在于实现通过一次散射实验来表征样品从原子到分子，再到组装体，甚至相区的多相多尺度结构的梦想. 虽然这些谱仪的设计思路和物理结构千差万别，但是它们的基本散射原理完全相同. 下文将着重介绍SANS谱仪.1小角中子散射谱仪、基本原理、实验技术和方法小角中子散射谱仪通常分为两类，一类是基于反应堆的固定波长小角谱仪[10]，国内有绵阳研究堆的狻猊谱仪和中国先进研究堆的小角中子散射谱仪；另一类是基于强流脉冲中子源的飞行时间小角谱仪[11]，国内有CSNS的小角中子散射谱仪. 固定波长小角谱仪，利用速度选择器将中子单色化后进行散射实验；而飞行时间小角谱仪则采用白光中子进行散射实验，利用脉冲中子从中子源运动到探测器的飞行时间标定中子波长. 两类SANS的基本原理完全一样，准直系统通常为如图1所示的小孔几何，源光阑和样品光阑用于中子准直，1个或者多个探测器接收散射中子[7].Fig. 1(a) Schematic diagram of the SANS instrument (b) The relationship between the characteristic length scaled and the scattering vector q⇀q⃑ (Bragg's Law). 运动的中子从量子力学的观点可以看成一种物质波，其波长λ = h/(mnv)(其中h为普朗克常数，mn为中子质量，v为中子速度)，入射中子的波矢量记作k⇀i，其绝对值为2π/λ，中子被样品散射后，散射波矢量记作k⇀s，如果是弹性散射，中子波长不变，其绝对值仍为2π/λ.散射前后，入射波矢量和散射波矢量的差值k⇀s−k⇀i定义为散射矢量q⇀.图1是CSNS的VSANS谱仪在小角模式下的示意简图. 根据如图 1所示的几何关系和矢量加减规则得到布拉格公式：其中θ为散射角. 如果样品的特征长度为d，根据如图1几何关系和布拉格方程，两束被样品散射的中子的波程差为2dsin(θ/2)，当波程差等于波长λ的整数倍时，散射中子相干增强，即：当n取1时，由公式(4)可知，正空间的样品特征长度与散射矢量q是倒易关系，即1/q是正空间的尺子，在计划实验时，需要对样品的特征尺寸范围有一个预判. 根据香农采样定理[12]：如果谱仪q范围为0.001~0.3 Å-1，其可表征的样品特征尺寸范围为300~1 nm. 如果能将中子聚焦，或者放弃一个方向的分辨率，将最小q向低q方向推进1~2个量级，从而能够表征的样品的特征尺度将增加1~2个量级. 我们将这类谱仪称为微小角中子散射谱仪(qmin=10-4 Å -1)[7]和超小角中子散射谱仪(qmin=10-5 Å -1)[13].考察一个由N个大分子链组成的链间有相互作用的体系，假设每根链聚合度为n，并粗粒化单体作为基本的散射单元. 为了方便表示，如图2所示，考察体系中的链α和链β. 链α和链β的质心距离坐标原点分别为Rα和Rβ，链α和第i个单体距离链α的质心为Sαi，链β的第j个单体距离链β的质心为Sβj，链α和链β之间的距离为Rαβ，i，j距离原点分别为rαi和rβj. 根据散射基本原理，中子入射到单个单体后形成球面波，其散射振幅：Fig. 2Schematic draw of the polymer chain and the vectors between atoms and polymers.一条链的散射振幅：考虑大分子与周围介质的散射长度密度差为Δρ，大分子单体的体积为υ，体系总体积为V.α和β遍历体系中的每一根链，i，j遍历链的每一个单体，得到体系的宏观散射截面可表示为公式(8).公式(8)右边第2项可以近似为倒易2根链的质心相互作用的相干散射得到公式(9).根据如图2所示的几何关系，代入(9)得到：其中F(q)为形状因子的散射振幅，定义单粒子的形状因子P(q)，注意，这里的i,j位于同一个散射体或者同一条链上.散射体可近似视为连续介质，P(q)可改写为：其中，Vpart为散射体的体积，ρpart(r)为散射体内部的密度空间分布.定义散射体之间的结构因子SI(q)，式(11)适用于所有散射体系对于密度分布均匀的散射体，∣∣F(q)2∣∣=|F(q)|2，而这里的dΣ(q)dΩ是散射矢量为q时的绝对散射强度(单位为cm-1). 小角中子散射实验中，经过样品散射进入立体角为ΔΩ的探测器的中子计数Is(q)(单位为count/s)与q的关系为：其中T(λ)为样品透过率，d为样品厚度，定义入射中子强度I0(λ)：Φ(λ)为入射中子波长分布，ε(λ)为探测器效率，A为样品光阑面积，t为数据采集时间.所以对于典型的小角散射实验，如果实验的q值范围已经覆盖了样品的多相多尺度结构，通过一次SANS实验，可以得到Δρ(衬度)，n(分子量)，P(q) (基本形状)和SI(q) (相互作用)，但需要注意的是SANS用了一个粗粒化的模型，所能观察的最小尺度是π/qmax，一般不小于1 nm.2小角中子散射实验一个完整的小角中子散射实验过程包括(1)计划实验：根据科学目标准备合适大小和数量的样品；(2)确定实验方案，并采集小角中子散射数据；(3)对散射数据进行处理和分析.2.1样品准备和要求在样品准备阶段需要注意几个问题，第一，衬度：样品中散射体与周围介质的散射长度密度的差异是否足够. 一般而言，如果衬度Δρ≥1×10-6 Å -2就完全没有问题，否则就需要与谱仪科学家进行沟通，依据谱仪本身的信噪比进行调整. 如果衬度不够就可能需要对溶剂或者散射体进行氘代. 第二，样品的特征尺寸是否在谱仪的测量范围内，通常谱仪的测量范围在π/qmax到π/qmin内；第三，做一些前置实验，如小角X射线散射、电镜等确定合成的样品状态是否由于聚集、结晶等过程的发生而改变. 此外，还需要注意样品的使用量和样品厚度. 根据样品内散射体的尺寸和与周围介质之间的衬度，样品量从300~1500 mg不等，样品厚度根据散射强度选择，通常为1和2 mm. 对于强散射样品，如果样品太厚会产生多重散射；对于溶液样品需要注意样品的结构与浓度有关，稀、亚浓和浓溶液结构会随着样品间相互作用而改变，为区分‍P(q)和‍SI(q)对‍I(q)的影响，除硬球体系之外，一般需要在稀溶液中先确定样品P(q)，这时也许需要在0.1 wt%~5 wt%之间做多个样品，从而外推到无限稀溶液的情况.2.2实验数据处理实验数据处理是通过对原始实验数据进行一系列的物理校准和校正，最终得到与实验仪器和样品厚度等无关的，体现样品本质特征的绝对散射强度(dΣ(q)dΩ，cm-1)随着散射矢量(q，Å-1)变化的信息. 一个完整的实验通常包括5组数据的采集：空样品池透过率数据Tc(λ)、空样品池散射数据Iexpcb(q)、样品加样品池透过率数据Tsc(λ)、样品加样品池散射数据Iexpscb(q)、空背底测量Ibackground(下标s表示样品，下标c表示样品池，下标b表示背底). 小角中子散射实验中，散射信号Iexpscb(q)有以下来源：样品、样品池和各种背底(如天然背底、空气散射和电子学噪声等).各种散射信号之间的关系可以用式(1)和式(2)表示，其中I0(λ)代表零散射角度的散射强度. 扣除样品池的散射和其他各种背底，最终计算得到dΣ(q)dΩ. 式(1)和式(2)只是简化和近似，真实SANS数据处理还需要考虑探测器效率、死时间和入射中子波长分布等因素[14].2.3实验数据分析SANS数据分析方法多种多样. 一般来说，可分为不依赖于模型的分析方法和依赖于模型的分析方法. 不依赖于模型的分析方法植根于数学，是数据分析的起点. 具体来说，包括吉尼尔(Guiner)、Porod、Kratky等分析方法. Guiner分析方法是样品的散射强度的自然对数对散射矢量的平方作图，即1n(I(q))对q2作图，在qRgPorod分析方法是主要用于分析散射体尺寸的局部结构信息，要求qRg1. Porod作图即是将散射强度对散射矢量作图，即1g(I(q))对lgq作图，其斜率即为散射体的Porod因子n. 高q的散射数据通常可表示为或者对于长棒形散射体，n=1；对于二维光滑散射体，n=2；如果三维散射体拥有光滑表面，n=4； 否则，n为3~4之间. 对于大分子链，Porod因子与排斥体积参数ν有关，即n=1/v，对于稀溶液中的有排斥体积高斯链n=5/3(或者1/0.588)，对于稀溶液中没有排斥体积的高斯链n=2，对于完全蹋缩的大分子链n=3.n为2~3之间可能是枝状大分子或者是形成网络结构.图3为半径为R=50 nm的硬球的散射模型，可以用贝塞尔方程拟合. 对曲线低q区域(qRg≤1)进行Guinier拟合，如图3中的小插图所示，得到均方旋转半径为38.94 nm，与理论值500 × (3/5)0.5 = 38.73 nm相符. 需要注意的是在得到 Rg之后需要进行一次验证，验证拟合区间确实满足qRg≤1.Fig. 3Guinier and Porod fit of the form factor of the hard sphere with a radius of 50 nm.对高q区域(qRg1)进行Porod拟合，得到斜率为-4.0，符合光滑球体表面分形维数. 更详细的关于Guiner、Porod和Kratky作图的图文解释和示例，读者可以参考Hammouda的SANS TOOLBox的第15章[15].常用的依赖于模型的分析方法是借助已知的样品信息，以有限多个初始参数建立正空间中散射体的几何模型，并根据公式(13)计算与之对应的倒空间的数学曲线，采用最小二乘法，不断迭代输入参数，直到模型的计算散射曲线与实验曲线的偏差在可接受范围内. 常用的分析软件有Igor[16]和SASView[17]等. Svergun和McGreevy等发展了新从头算起(ab initio)和逆蒙特卡罗模拟的分析方法[18~21]，可以将正空间三维结构的傅里叶变换与散射曲线进行比较.对依赖模型的分析方法，初始模型的设计至关重要. 所以在SANS实验之前，需要进行一系列的前置散射、光谱或者成像实验，估计样品的初始结构. 根据不依赖于模型的Guinier和Porod等方法对一维散射曲线的分析结果，验证初始模型的选择是否正确. 需要注意的是，拟合参数或者基本假设越少，分析结果的准确性越高. 拟合参数多的方程可以拟合大多数SANS曲线，但必须通过结合其他研究手段固定大部分的参数.3大分子相关领域典型应用小角中子散射在物理学、化学、材料、生命科学和工业界等均有大量应用. 本文主要聚焦于大分子领域，即合成高分子、生物大分子和大分子材料领域的典型应用. 为方便讨论，依据样品的特点进行分类，分为高分子溶液、高分子共混物和复合材料、高分子结晶、凝胶、多孔材料、生物大分子. 以下就这些方面的一些经典案例和最新发现进行讨论. 由于小角中子散射应用领域众多，并且各个领域之间还会出现交叉和重叠，所以以下分类讨论并不一定严格和全面，本文只是抛砖引玉，旨在说明小角中子散射的特点和在各领域的典型应用.3.1高分子溶液体系大多数用户使用SANS研究溶液体系是为了得到溶质的多尺度形貌，所以高分子溶液体系的样品处理，实验方法，数据处理与分析具有普适性[22,23]. 大分子在溶液中的基本构象(confor-mation)的确定需要使用SANS进行证明，一般在稀溶液测定. 1974年，Cotton等使用SANS研究了线形聚苯乙烯(PS)在二硫化碳(良溶剂)和环乙烷(θ溶剂)中的构象，验证了高分子在良溶剂中是有排斥体系的高斯链，分形维数5/3，在θ溶剂中是无扰高斯链，分形维数是2[24]. 随着高分子化学的进步，科学家们合成了不同几何形状的单分散大分子. 2014年，Goossen等使用SANS研究了环形PS在氘代甲苯(良溶剂)，氘代环乙烷(θ溶剂)和氘代线形PS(类θ本体)中的构象，如图4所示[25]. 环形PS在良溶剂中，Porod区间的表观分形维数1.56，小于线形PS在良溶剂中的5/3，作者解释是由于第2维利系数(A2)的影响，通过扣除A2，得到没有端基的环形PS在良溶剂中的分形维数；环形PS在θ溶剂和相同分子量的PS本体中，分形维数为2. 我们需要着重指出两点：一是对θ溶剂体系，或者高分子本体体系，图4的拟合区间在0.006~0.2 Å-1，对于低q区间，0.002 Å-1qP(q)的基本定义(公式(13))进行计算[15].Fig. 4Scattering functions and representative slopes for the overall and internal structure of ring polystyrene in good andθ solvents at different length scales. The linear polymeric matrix in the ring/linear blend is congruent with the θ‍-solvent. (Reprinted with permission from Ref.‍[25] Copyright (2015) American Chemical Society).相分离过程的研究是高分子溶液研究领域的重点之一. 大多数情形下，基于平均场理论的Ornstein-Zernike方程可以描述溶液中相分离过程的浓度涨落的变化[26,27]. Jia等使用SANS，研究了聚(N,N′-二乙基丙烯酰胺)(PDEA)在氧化三甲胺(TMAO)水溶液中的相分离发生前浓度涨落(concentration fluctuation)的变化，如图5所示[28]. 浓度涨落的强度和幅度都随温度升高而增大，随TMAO含量的增高而增大；通过外推零散射角度散射强度的倒数随着温度的倒数曲线，得到浓度涨落趋近无穷时的温度，就可以得到该共混体系的旋节线相图. 同样，这里需要注意两点：一是SANS是唯一的直接测量旋节线相图的研究手段，其他研究手段，例如浊度法，测量的都是双节线相图；二是越靠近相边界，浓度涨落的尺度越大(图5)，这与温敏性高分子靠近最低共溶温度(LCST)时体积收缩[29]并不矛盾：由于图5的SANS实验的衬度来源于浓度涨落的微区，而不是单链高分子. 如果需要看到PDEA单分子链的LCST塌缩(就像使用动静态激光光散射观察PDEA极稀水溶液一样)，需要使用衬度匹配技术. 典型的例子可以参考Hammouda等的实验，使用氘代和氢化聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)在衬度匹配的重水/水混合溶剂中，用SANS观察PNIPAM单链的塌缩过程[30].Fig. 5SANS profiles of 4% mass fraction PDEA in TMAO-d9/D2O mixtures. (a) Temperature dependence of PDEA atcTMAO = 0.28 mol/L the arrow is used to guide the eye, indicating the increase of concentration fluctuations with temperature. (b) TMAO concentration dependence at 15 °C when TMAO concentrations are 0, 0.1, 0.28, 0.44, 0.58, 0.76, 0.90, 1.13 and 1.25 mol/L, respectively. (Reprinted with permission from Ref.[ 28] Copyright (2017) American Chemical Society).随着大分子在溶液中的浓度增加，分子之间相互作用(SI(q))逐渐变强，这时相互作用在散射曲线上将会表现为最小散射矢量附近的散射强度相对无相互作用时变小，中间q区间的散射强度相对无相互作用时变强. 如果体系中存在复杂的相互作用，如氢键相互作用、静电相互作用、憎水相互作用、π-π堆叠作用[31]等，在溶液中将形成亚稳的并且能够响应外界刺激的微相自组装结构，在污水净化、废油回收、药物输送等方面有着广泛的应用[32]. 小角中子散射是研究这类体系的非常有效的方法，既可以研究大分子或组装体在溶液中的结构(P(q))的变化[33]，又可以研究组装体的结构在溶液中的相互作用(SI(q)).大分子组装结构是小角中子散射研究的一个热点. Sternhagen等合成了一系列的两亲性离子类肽嵌段共聚物，这些共聚物唯一不同的是肽链序列的离子单体的位置不同. SANS研究表明，这些肽嵌段共聚物组装成星形胶束结构，并且离子单体的位置越靠近星形胶束中心，胶束的均方旋转半径越小，并且二者呈现一定的指数关系[34]. 此项研究为利用肽键氨基酸序列调控组装胶束结构开辟了新的道路.3.2高分子共混物和复合材料通过将高分子共混、复合，石油化工工业只需要生产常见的几十种高分子材料，如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺等，就可以大致满足人们日常生活对高分子材料的硬度、弹性、机械强度、疲劳强度、导电性、透光性、耐热性、阻燃性、吸水性、耐酶性等多方面的需求. 这表明高分子共混物和复合材料的多相多尺度微观结构及其演化过程与宏观性能密切相关. 小角中子散射适用于实时追踪这类体系的微观结构的变化.通常非晶高分子本体或者共混物中，由于要观察的目标大分子与其周围环境的化学结构大致相同，对大部分研究手段而言衬度几乎都为0，无法看到单一高分子链或者选择性观察某一相高分子. 少部分的观察手段，包括单分子荧光或者核磁虽然有选择性地观察能力，但是前者引入了大尺寸的荧光基团，有可能影响体系的动力学和动态学行为；后者直接观察的是能量空间. 只有SANS可以通过衬度匹配具有选择性地观察单链结构的能力[35].高分子共混物在双节线相区，初级成核过程究竟是如何发生的？到现在仍然是一个非常具有挑战性的课题. Balsara课题组曾进行了深入的研究[36]. 他们使用时间分辨SANS，研究了氘代聚乙基丁烯(dPE)、聚甲基丁烯(PM)和聚(甲基乙烯-b-乙基丁烯)的三元共混物相分离初期的成核过程，如图6所示. SANS的中子束流强度低，需要较长时间(通常大于3 min，依赖于不同中子源或者SANS谱仪)才能得到满足统计误差的散射谱图. 嵌段共聚物hPM-hPE的加入是为了增强dPE/hPM的相容性，降低相分离温度并延长相分离时间，从而满足SANS采样所需时间.图6(a)表明，相分离未发生时，体系为均相，相对散射强度不随散射矢量q变化；随着相分离发生，低q散射曲线随相分离时间增长，不断向上倾斜，这说明有相分离成核的尺寸逐渐增大，零散射矢量处散射强度随之增长. 使用不依赖具体模型的Guinier方程对SANS数据进行拟合(图6(b))，可以得到零散射矢量处散射强度(In)随其均方旋转半径(Rg)变化的标度关系，分形维数1/0.54，说明初级成核也许并不是Gibbs成核过程(分形维数3)，而是浓度涨落诱导过程(分形维数2).Fig. 6(a) Dependence of SANS profiles on time during the early stage of the sample with 50 vol% block copolymer. The solid lines in represent fits to the Guinier model. (b) A lg-lg plot ofRg at a given time versus In(In = I(Q=0,t)/I(Q=0,t=0)) at that time. The solid line represents the best power law fit. (Reprinted with permission from Ref.‍[36] Copyright (1996) The American Physical Society).复合大分子材料在工业界有着十分广泛的应用. Liu等利用小角中子散射和电子显微镜研究纳米二氧化硅球(20 nm左右)和橡胶复合体系，发现SiO2会形成24~97个硅球的聚集体，聚集体尺寸随着SiO2球体积分数增加线性变小，最佳的二氧化硅的体积分数在40%~50%之间[37,38].具有刺激响应的智能大分子材料，如自愈(self-healing)复合材料是目前研究的热点. Staropoli 等利用小角中子散射和流变实验研究靠氢键结合而成的瞬态枝化梳状大分子在熔融状态下的氢键形成机理[39]. 结果表明，瞬态链合结构对此类材料至关重要.3.3高分子结晶高分子结晶过程极为复杂，尽管科学家们进行了多年不间断地研究，一些基础性的问题仍有疑问. 1977年，Sadler等使用SANS研究了氘代聚乙烯经过溶液和熔融结晶生成的晶体内部的单链构象[40]，在一系列假设下(氘代和氢化聚乙烯无相分离、同时结晶)，证明了高分子单链在溶液中优先按照近邻折叠模型结晶；在熔融过程中，优先按照插线板模型结晶. 这个结果争议不大，已经写入了高分子物理的教科书. 而串晶(shish-kebab)中shish的生成机理则至今仍争议不休：究竟是高分子链的拉伸、缠结网络变形或者是壁滑导致了shish的产生？Kimata等的SANS研究使shish成核理论的研究向前迈出了关键的一步[41]. 实验观察结晶过程中分子链结构变化的关键难点还在于衬度：如何能够在shish的狭小范围内看到高分子链的结构. 如之前表2所示，X射线的衬度来源于电子云密度的差别，因此SAXS可以看到二维的大分子片晶结晶区与非晶区片层之间的电子云密度差别，从而得到片晶厚度，但是SAXS看不到一根结晶大分子链与其周围链段之间的任何差别；而常规的SANS均聚物氘代和氢化二元共混同样存在问题，它虽然提供了氘代分子与周围分子之间的衬度差别，但是也引入了结晶的氘代大分子与非晶的氘代大分子之间的衬度差别. 所以Kimata之前，科学家们没有设计出合适的可以在shish中提取分子链结构的实验方法. Kimata等使用了氘代短链(S)，中等链(M)和长链(L)等规丙烯(iPP)与多分散非氘带iPP进行共混，在不同温度下进行剪切实验，用SANS观察散射图样的变化，如图7所示.图7(a)中S链的各向异性散射更加显著，温度升高到168 ℃时shish开始熔化，各向异性开始逐渐消失. Kimata等用166 ℃ 时shish刚刚开始取向的散射图样减去168 ℃或者180 ℃完全熔融的背景散射，如图7(b)所示，成功得到了d-iPP链在shish中的取向信息.图7证明了长链在shish中只起引发作用，但扩散较慢，不是shish的主体.Fig. 7(a) Temperature dependence of SANS profiles of deuterium labeled iPP during heating from 25 °C to 180 °C. The labeled fraction is denoted by S, M, and L for short D, medium D, and long D, respectively. (b) The change in SANS scattering intensity between 166 and 180 °‍C (left) and between 168 and 180 °‍C (right) for each of the three deuterium-labeled blends. (Reprinted with permission from Ref.[41] Copyright (2007) American Association for the Advancement of Science).3.4凝胶溶胶或者溶液中的胶体粒子或者大分子在合适条件下相互连接，形成空间网络结构，最后失去流动性，整个体系变成一种外观均匀，并保持一定形态的弹性半固体，这种弹性半固体称为凝胶. 凝胶在有机体的组成中占重要地位，人体内的肌肉、皮肤、细胞膜、血管壁，以及毛发、指甲、软骨等都可看作是凝胶. 相对于稀溶液，凝胶体系中的结构和相互作用更加复杂，小角中子散射方法，可用于研究此类体系的微观结构[42,43]、凝胶相的形成过程[44]和形成机理等[45].Endo等利用SANS研究不同浓度的间规聚丙烯(sPP)在氘代十氢萘溶剂中形成的物理凝胶的结构[46]，散射曲线如图8(a)所示. 散射曲线在某一q范围的斜率表示在相应正空间尺度上散射体的分形维数. 浓度最低的sPP十氢萘溶液(2 wt%)的散射曲线低q区间分形维数1，说明在交联点之间有棒状结构，中等q值范围内分形维数4，类似光滑球形外表面. 所以假设sPP纳米晶为球形结构(用贝塞尔方程拟合)，纳米晶之间存在的非晶sPP链形成的网络结构(用Ornstein-Zernike方程拟合)，纳米晶球之间进行Percus-Yevick近似，就可以得到交联点形状、尺寸随sPP浓度和温度变化的定量关系(图8(b)).Fig. 8(a) SANS profiles of the nitrogen quenched gel with differentsPP concentrations (symbols) and corresponding fitting results (solid lines). The profiles are vertically shifted to avoid the overlap. (b) Schematic illustration of hierarchical structures in gel LN suggested by the SANS profiles. (Reprinted with permission from Ref.‍[46] Copyright (2019) The Royal Society of Chemistry)3.5多孔材料中子直接作用于原子核，具有很强的穿透性，可以轻松穿透较厚的多孔材料，从而在1~100 nm范围内研究其内部孔隙的孔隙率、尺寸分布、各向异性、孔的连接性和比表面积，并且可以追踪这些参数对其容纳和吸附性能的影响.Yang等利用小角中子散射研究我国四川盆地龙马溪页岩的多孔结构[47,48]. 用多分散球形孔模型和Porod方法分析中子散射数据得到的比表面积和孔隙率，都大于压汞法得到的结果，说明样品中存在盲孔. 随着样品埋藏深度的增加，盲孔数量也随之增加，并且与有机碳含量存在相关性. 这个例子需要注意样品多重散射对散射曲线的影响，通常页岩样品厚度在200 μm的情况下可以保证单次散射；具体实验中需要测量不同厚度样品散射曲线来避免多重散射.碳纤维是重要的工业材料，小角中子散射可以对碳纤维内的孔隙缺陷进行精确的表征. Jafta等利用小角中子和小角X射线对多孔碳纤维内的孔隙率和比表面积进行了精确的分析[49]. 同时还用弦长分布函数分析了体系中孔隙的空间分布，发现孔的分布相对无序. 如果多孔材料的孔隙分布比较窄，就可以用于研究液体在空间受限行为、各种气体在孔隙内的吸附和脱吸附. Melgar等利用多金属氧酸盐为水分子提供含有不同配体的孔隙，研究水分子在孔隙内的分布情况[50]，研究表明，当孔隙小于1.1 nm，水分子将不能进入孔隙从而去润湿. Bahadur等利用小角中子散射研究二氧化碳在多孔碳材料内的高压吸附行为[51]. 观察到二氧化碳在微孔内随着压强的非线性吸附，微孔尺寸从约5 Å增加到7 Å. 但氩气在同样压强作用下的吸附并没有引起孔隙尺寸的变化. 说明吸附二氧化碳后，孔隙内的压强大于外界压强，推测孔内存在很强的吸附引起的溶解压.3.6生物大分子生物大分子种类丰富，多尺度结构复杂，其内部结构和作用原理的解析对解开生命的奥秘、开发新型药物等意义重大. Shi和Li对小角X射线在该领域的研究进展和一般分析方法进行了详细的阐释[52]，介绍的分析方法和研究方向与本小节介绍的内容有一些类似和重叠，有兴趣的读者可以自行查阅. 中子凭借其特性和与X射线的互补在生物大分子方面的应用前景也十分广阔[53].生物大分子的小角中子散射表征难度相对较高，第一，氘代样品的制备难度大，需要利用氘水和氘带碳源培养特定的细菌，粉碎后再纯化需要的氘带样品；第二，小角中子散射是一种低空间分辨率的表征手段，对于复杂体系的散射，人们通常将小角中子散射与其他实验手段和分析方法如透射电镜、X射线晶体衍射、核磁共振以及模拟方法等结合起来对散射数据进行分析，如图9所示. David等综述了利用小角散射研究生物大分子[54]. 在生物大分子方面小角中子散射的研究内容包括但不限于：(1)肽链、核酸、蛋白质[55]、双层磷脂膜、淀粉、纤维素等生物大分子在不同环境下的结构；(2)肽链、核酸、蛋白质和双层磷脂膜等的相互作用和组合结构；(3)病毒、细胞器等.Fig. 9A scheme of an SAS experiment, structural tasks addressed and the joint use with other methods. The nominal resolution of the scattering data is indicated asd = 2 p/s. (Reprinted with permission from Ref.[56] Copyright (2007) Elsevier Ltd.).对于生物大分子这类复杂体系，在能够达成科学目标的前提下，模型设计需要尽可能地简单，将变量维持在可接受范围内. 如果散射体非常复杂，由多个具有不同结构、功能的部分组成，需要使用氘代对各个部分进行衬度匹配. 数据分析方面，第一步，对散射数据做定性或半定量的分析，例如稀溶液，可以通过Guinier作图分析散射体均方旋转半径，Porod作图分析体系拓扑结构或者分形维度；第二步，依据已知数据建立模型，分析数据. 数据分析模型通常有以下2种：第一种是依赖于散射数据的可迭代优化模型，依据模型的计算曲线和实验曲线的均方差对模型的一些变量进行迭代优化，如规则几何模型拟合、逆蒙特-卡洛(RMC)方法[21,57]、从头计算(ab initio)方法[20]等；第二种是不依赖于散射数据的独立模型(强烈依赖于所用力场)，例如独立的分子动力学或者蒙特-卡洛模型，独立模型的计算SANS曲线可以与实验曲线对比，或者依据实验曲线与模型得到的可能结构进行筛选[58].限于篇幅，以下举几个有代表性的实例. 如图10为天冬氨酰-tRNA合成酶(Aspartyl-tRNA synthetase complexed)与tRNA复合物结构的小角X射线和小角中子散射联合研究图示[59]. Petoukhov和Svergun分别利用ab initial的串球模型分析复合体系的低分辨结构，如图10(A)和10(B)所示，然后利用复合物各个部分的X射线晶体学结构和刚体建模方法拟合X射线和中子散射数据，得到体系在溶液中的高分辨结构模型.Fig. 10(A) Aspartyl-tRNA synthetase complexed with tRNA. (a, b) Comparisons of the crystal structure with the ab initio bead models generated by the program MONSA. In the high resolution model, the protein and tRNA are shown as blue and magenta backbones, in the bead model corresponding phases are presented in gray and yellow, respectively. (c) Best rigid body model generated by SASREF. (d) A SASREF model with different orientations of tRNA. Right view is rotated by 90° about horizontal axis. (B) Scattering profiles from the Aspartyl-tRNA synthetase complex with tRNA. The simulated data are shown by dots, the fits obtained by the program MONSA and the program SASREF are displayed as red solid and blue dashed lines, respectively. 1 and 2 are X-ray scattering curves of the dimeric protein and the entire complex, respectively. 3-7 are neutron scattering patterns at 0, 40%, 55%, 70% and 100% D2O, respectively. The patterns are displaced in logarithmic scale for better visualization. (Reprinted with permission from Ref.[59] Copyright (2006) Springer European Biophysics Journal).同步辐射和X射线晶体学是研究生物大分子结构的利器，在得到蛋白质的晶体结构后，利用刚体建模方法，或者分子动力学模拟，结合小角X射线和小角中子散射，可以研究各类蛋白在溶液中的结构和相互作用. Shrestha等利用小角中子散射、小角X射线散和分子动力学模拟研究天然无规蛋白(intrinsically disordered protein)结构[60]，发现Flory指数为0.54，介于理想链的0.5和自避行走链的0.588之间.4总结小角中子散射技术在基础、应用、产业化的各个领域中都有广泛的应用. 由于篇幅所限，本文只是首先从原理和实践两个方面对这一技术进行了简要的介绍，然后列举了小角中子散射在高分子溶液、高分子共混物和复合材料、高分子结晶、凝胶、多孔材料和生物大分子等体系结构表征方面的一些典型应用，希望能够进一步扩展我国的SANS用户群体. 如果需要更深一步了解SANS或者中子散射技术在高分子科学中的应用，可以参考一些专业书籍[12,61,62].参考文献1Borsali R,Pecora R.Soft-Mattter Characterization.Springer,2008.377-9522Cebe P,Hsiao B S,Lohse D J.Scattering from Polymers Characterization by X-rays, Neutrons, and Light.Washington DC:American Chemistry Society,2000.1-1163Roe R J.Methods of X-ray and Neutron Scattering in Polymer Science.Oxford:Oxford University Press,2000.1-804Feigin L A,Svergun D I.Structure Analysis by Small-Angle X-Ray and Neutron Scattering.New York and London:Plenum Press,1987.275-320.doi:10.1007/978-1-4757-6624-0_95Dianoux A J,Lander G.Neutron Data Booklet Second Edition (July 2003).2020-10-25.https://www.ill.eu/fileadmin/user_upload/ILL/1_About_ILL/Documentation/NeutronDataBooklet.pdf6National Nuclear Data Center.Evaluated Nuclear Data File (ENDF).2020-10-25.https://www.nndc.bnl.gov/exfor/endf00.jsp.doi:10.2172/9818137Zuo T S,Cheng H,Chen Y B,Wang F W.Chinese Phys C,2016,40(7):76204.doi:10.1088/1674-1137/40/7/0762048Carpenter J M, Agamalian M.J Phys:Conference Series,2010,251:012056.doi:10.1088/1742-6596/251/1/0120569Han Z,Zuo T,Ma C,Cheng H.Instrum Sci Technol,2019,47:448-465.doi:10.1080/10739149.2019.159773310Zhang H,Cheng H,Yuan G,Han C C,Zhang L,Li T,Wang H,Liu Y T,Chen D.Nucl Instrum Meth A2014,735:490-495.doi:10.1016/j.nima.2013.09.06511Anderson K.Reactor & Spallation Neutron Sources.Oxford:Oxford School of Neutron Scattering,2013.55-7612Higgins J S,Benoît H C.Polymers and Neutron Scattering.Oxford:Clarendon Press,1994.86-9513Rehm C,Barker J,Bouwman W G,Pynn R.J Appl Crystallogr,2013,46(2):354-364.doi:10.1107/s002188981205002914Du R,Tian H L,Zuo T S,Tang M,Yan L,Zhang J R.Instrum Sci Technol,2017,45(5):541-557.doi:10.1080/10739149.2016.127822915Hammouda B.Probing Nanoscale Structures-The SANS Toolbox.Gaithersburg:National Institute of Standards and Technology Center for Neutron Research,2010.31-19116Kline S.J Appl Crystallogr,2006,39(6):895-900.doi:10.1107/s002188980603505917Butler P,Doucet M,Jackson A,King S.SasView for Small Angle Scattering Analysis (July 2020).2020-10-25.https://www.sasview.org/18Konarev P V,Svergun D I.IUCrJ,2018,5(Pt 4):402-409.doi:10.1107/s205225251800590019Petoukhov M V,Svergun D I.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2015,71(Pt 5):1051-1058.doi:10.1107/s139900471500257620Volkov V,Svergun D.J Appl Crystallogr,2003,36:860-864.doi:10.1107/s002188980300026821Gereben O,Pusztai L,McGreevy R L.J Phys Condens Matter,2010,22(40):404216.doi:10.1088/0953-8984/22/40/40421622Li Z,Cheng H,Li J,Hao J,Zhang L,Hammouda B,Han C C.J Phys Chem B,2011,115(24):7887-7895.doi:10.1021/jp203777g23Hu W T,Yang H,He C,Hu H Q.Chinese J Polym Sci,2017,35(9):1156-1164.doi:10.1007/s10118-017-1969-724Cotton J P,Decker D,Benoit H,Farnoux B,Higgins J,Jannink G,Ober R,Picot C,des Cloizeaux J.Macromolecules,1974,7(6):863-872.doi:10.1021/ma60042a03325Goossen S,Bras A R,Pyckhout-Hintzen W,Wischnewski A,Richter D,Rubinstein M,Roovers J,Lutz P J,Jeong Y,Chang T,Vlassopoulos D.Macromolecules,2015,48(5):1598-1605.doi:10.1021/ma502518p26Hao J,Cheng H,Butler P,Zhang L,Han C C.J Chem Phys,2010,132(15):154902.doi:10.1063/1.338117727Hore M J A,Hammouda B,Li Y,Cheng H.Macromolecules,2013,46(19):7894-7901.doi:10.1021/ma401665h28Jia D,Muthukumar M,Cheng H,Han C C,Hammouda B.Macromolecules,2017,50(18):7291-7298.doi:10.1021/acs.macromol.7b0150229Cheng H,Wu C,Winnik M A.Macromolecules,2004,37(13):5127-5129.doi:10.1021/ma049620130Hammouda B,Jia D,Cheng H. OAJoST,2015,3:101152.doi:10.11131/2015/10115231Datta S,Kato Y,Higashiharaguchi S,Aratsu K,Isobe A,Saito T,Prabhu D D,Kitamoto Y,Hollamby M J,Smith A J,Dagleish R,Mahmoudi N,Pesce L,Perego C,Pavan G M,Yagai S.Nature,2020,583(7816):400-405.doi:10.1038/s41586-020-2445-z32Zhang H V,Polzer F,Haider M J,Tian Y,Villegas J A,Kiick K L,Pochan D J,Saven J G.Sci Adv,2016,2(9):e1600307.doi:10.1126/sciadv.160030733Wang Z,Faraone A,Yin P,Porcar L,Liu Y,Do C,Hong K,Chen W R.ACS Macro Lett,2019,8(11):1467-1473.doi:10.1021/acsmacrolett.9b0061734Sternhagen G L,Gupta S,Zhang Y,John V,Schneider G J,Zhang D.J Am Chem Soc,2018,140(11):4100-4109.doi:10.1021/jacs.8b0046135Zuo T,Ma C,Jiao G,Han Z,Xiao S,Liang H,Hong L,Bowron D,Soper A,Han C C,Cheng H.Macromolecules,2019,52(2):457-464.doi:10.1021/acs.macromol.8b0219636Balsara N P,Lin C,Hammouda B.Phys Rev Lett,1996,77(18):3847-3850.doi:10.1103/physrevlett.77.384737Liu D,Song L,Song H,Chen J,Tian Q,Chen L,Sun L,Lu A,Huang C,Sun G.Compos Sci Technol,2018,165:373-379.doi:10.1016/j.compscitech.2018.07.02438Liu D,Chen J,Song L,Lu A,Wang Y,Sun G.Polymer,2017,120:155-163.doi:10.1016/j.polymer.2017.05.06439Staropoli M,Raba A,Hövelmann C H,Krutyeva M,Allgaier J,Appavou M S,Keiderling U,Stadler F J,Pyckhout-Hintzen W,Wischnewski A,Richter D.Macromolecules,2016,49(15):5692-5703.doi:10.1021/acs.macromol.6b0097840Sadler D M,Keller A.Macromolecules,1977,10(5):1128-1140.doi:10.1021/ma60059a04541Kimata S,Sakurai T,Nozue Y,Kasahara T,Yamaguchi N,Karino T,Shibayama M,Kornfield J A.Science,2007,316(5827):1014.doi:10.1126/science.114013242Shibayama M,Li X,Sakai T.Colloid Polym Sci,2018,297:1-12.doi:10.1007/s00396-018-4423-743Gao J,Tang C,Elsawy M A,Smith A M,Miller A F,Saiani A.Biomacromolecules,2017,18(3):826-834.doi:10.1021/acs.biomac.6b0169344Srivastava S,Andreev M,Levi A E,Goldfeld D J,Mao J,Heller W T,Prabhu V M,de Pablo J J,Tirrell M V.Nat Commun,2017,8:14131.doi:10.1038/ncomms1413145Nishi K,Fujii K,Katsumoto Y,Sakai T,Shibayama M.Macromolecules,2014,47(10):3274-3281.doi:10.1021/ma500662j46Endo F,Kurokawa N,Tanimoto K,Iwase H,Maeda T,Hotta A.Soft Matter,2019,15(27):5521-5528.doi:10.1039/c9sm00582j47Yang R,He S,Hu Q,Sun M,Hu D,Yi J.Fuel,2017,197:91-99.doi:10.1016/j.fuel.2017.02.00548Sun M,Yu B,Hu Q,Zhang Y,Li B,Yang R,Melnichenko Y B,Cheng G.Int J Coal Geology,2017,171:61-68.doi:10.1016/j.coal.2016.12.00449Jafta C J,Petzold A,Risse S,Clemens D,Wallacher D,Goerigk G,Ballauff M.Carbon,2017,123:440-447.doi:10.1016/j.carbon.2017.07.04650Melgar D,Zhou Q,Chakraborty S,Porcar L,Weinstock I A,Ávalos J B,Wu B,Bo C,Yin P.J Phys Chem C,2020,124(18):10201-10208.doi:10.1021/acs.jpcc.0c0101951Bahadur J,Melnichenko Y B,He L,Contescu C I,Gallego N C,Carmichael J R.Carbon,2015,95:535-544.doi:10.1016/j.carbon.2015.08.01052Shi Ce(史册),Li Yunqi(李云琦).Acta Polymerica Sinica(高分子学报),2015, (8):871-883.doi:10.11777/j.issn1000-3304.2015.1504853Fitter J,Gutberlet T,Katsaras J.Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications.Berlin Heidelberg and New York:Springer,2006.doi:10.1007/3-540-29111-354Jacques D A,Trewhella J.Protein Sci,2010,19(4):642-657.doi:10.1002/pro.35155Koruza K,Lafumat B,ÁVégvári,Knecht W,Fisher S Z.Arch Biochem Biophys,2018,645:26-33.doi:10.1016/j.abb.2018.03.00856Petoukhov M V,Svergun D I.Curr Opin Struct Biol,2007,17(5):562-571.doi:10.1016/j.sbi.2007.06.00957Ma Chang-li(马长利),Cheng He(程贺),Zuo Taisen(左太森),Jiao Guisheng(焦贵省),Han Zehua(韩泽华),Qin Hong(秦虹).Chinese Journal of Chemical Physics(化学物理学报),2020,33(6s):727-732.doi:10.1063/1674-0068/cjcp200507758Jiao G,Zuo T,Ma C,Han Z,Zhang J,Chen Y,Zhao J,Cheng H,Han C C.Macromolecules,2020,53(13):5140-5146.doi:10.1021/acs.macromol.0c0078859Petoukhov M V,Svergun D I.Eur Biophys J,2006,35(7):567-576.doi:10.1007/s00249-006-0063-960Shrestha U R,Juneja P,Zhang Q,Gurumoorthy V,Borreguero J M,Urban V,Cheng X,Pingali S V,Smith J C,O’Neill H M,Petridis L.Proc Natl Acad Sci,2019,116(41):20446-20452.doi:10.1073/pnas.190725111661Han C C,Akcasu A Z.Scattering and Dynamics of Polymers: Seeking Order in Disordered Systems.Singapore:John Wiley & Sons (Asia) Pte Ltd,2011.1-98.doi:10.1002/978047082484962Zemb T,NeutronLindner P.X-rays and Light.Scattering Methods Applied to Soft Condensed Matter.Amsterdam:Elsevier,2002.1-552.doi:10.1107/s0021889803001808原文链接：http://www.gfzxb.org/thesisDetails#10.11777/j.issn1000-3304.2020.20242&lang=zhDOI：10.11777/j.issn1000-3304.2020.20242《高分子学报》高分子表征技术专题链接：http://www.gfzxb.org/article/doi/10.11777/j.issn1000-3304

大咖亲授|“生物药表征与质控的关键环节”系列讲座di一场-单抗表征新进展飞飞 赛默飞色谱与质谱中国关注我们，更多干货和惊喜好礼Biopharmacy生物药大咖亲授 中国生物药的发展正处在历史分水岭，如何接轨国际，创造属于中国的di一，无论是冲刺真正属于中国的first in class，还是研发具有临床特色的me-too，在全力加速的同时，如何保证“高质量”发展，仍然是生物药企业的核心议题。只有全面夯实研发与质控的各个关键环节，才能在角力竞速的同时，确保核心竞争力全面ling先。生物药表征的关键环节和关键要素有哪些？又有哪些全球zui佳实践和前沿应用？作为生物药表征方案的ling导者，赛默飞在全球范围邀请生物药专家大咖现身说法，讲述他们与关键环节的诸多故事与应用，提供给您更直接的沟通机会，全面助力您高“质”高速实现生物药研发突破！Sara Carillo, Ph.D.应用开发团队负责人NIBRT 爱尔兰国家生物工艺研究所简介：Sara Carillo博士是爱尔兰国家生物工艺研究所（NIBRT）的表征与可比性实验室应用开发团队负责人。Carillo博士于2013年在那不勒斯大学完成了化学科学博士学位，曾致力于细菌糖复合物的结构表征。Carillo博士于2015年加入Jonathan Bones博士在NIBRT的研究小组，致力于CHO细胞糖原和生物治疗药物表征。主题Multiple Levels of Confident Biopharmaceutical Characterization using a New Hybrid Quadrupole-Orbitrap Platform Dan Bach Kristensen, Ph.D.首席科学家Symphogen简介：Dan Bach Kristensen拥有生物学博士学位和化学学士学位。Dan专门从事蛋白质化学和质谱分析，最初活跃于日本的蛋白质组学研究领域，后来又拓展至丹麦的蛋白质组研究领域。在过去的15年中，Dan一直在生物制药行业中从事分析与开发工作，涉及从早期发现到注册的各个环节。临床适应症包括出血性疾病，中性粒细胞减少，自身免疫性疾病和肿瘤等。Dan目前是Symphogen的首席科学家，该公司专门研究用于癌症治疗抗体的开发。主题Alternative strategies for peptide mapping of challenging monoclonal antibodies in clinical development 时间：4-28日下午1:30-3:00扫码报名 他山之石可否攻玉？报名并留下您最想了解的问题，看看大咖如何解答你的疑惑，助力您在生物药表征和研发中实现加速与突破。

2021年，《高分子学报》邀请了国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写从基本原理出发的高分子现代表征方法综述并上线了虚拟专辑。仪器信息网在获《高分子学报》副主编胡文兵老师授权后，也将上线同名专题并转载专题文章，帮助广大研究生和年轻学者了解、学习并提升高分子表征技术。在此，向胡文兵老师和组织及参与撰写的各位专家学者表示感谢。更多专题内容详见：高分子表征技术专题高分子表征技术专题前言孔子曰：“工欲善其事，必先利其器”。 我们要做好高分子的科学研究工作，掌握基本的表征方法必不可少。每一位学者在自己的学术成长历程中，都或多或少地有幸获得过学术界前辈在实验表征方法方面的宝贵指导！随着科学技术的高速发展，传统的高分子实验表征方法及其应用也取得了长足的进步。目前，中国的高分子学术论文数已经位居世界领先地位，但国内关于高分子现代表征方法方面的系统知识介绍较为缺乏。为此，《高分子学报》主编张希教授委托副主编王笃金研究员和胡文兵教授，组织系列从基本原理出发的高分子现代表征方法综述，邀请国内擅长各种现代表征方法的一流高分子学者领衔撰写。每篇综述涵盖基本原理、实验技巧和典型应用三个方面，旨在给广大研究生和年轻学者提供做好高分子表征工作所必须掌握的基础知识训练。我们的邀请获得了本领域专家学者的热情反馈和大力支持，借此机会特表感谢！从2021年第3期开始，以上文章将陆续在《高分子学报》发表，并在网站上发布虚拟专辑，以方便大家浏览阅读. 期待这一系列的现代表征方法综述能成为高分子科学知识大厦的奠基石，支撑年轻高分子学者的茁壮成长！也期待未来有更多的学术界同行一起加入到这一工作中来.高分子表征技术的发展推动了我国高分子学科的持续进步，为提升我国高分子研究的国际地位作出了贡献. 借此虚拟专辑出版之际，让我们表达对高分子物理和表征学界的老一辈科学家的崇高敬意！拉曼光谱技术在高分子表征研究中的应用Application of Raman Spectroscopy in the Characterization of Polymers作者：袁媛，王梦梵，曲云菲，张泽军，张建明作者机构：青岛科技大学高分子科学与工程学院 橡塑材料与工程教育部重点实验室,青岛,266042 北京化工大学 碳纤维及复合材料教育部重点实验室,北京,100029 北京航空航天大学化学学院,北京,100191作者简介：张建明，男，1973年生. 山东省泰山学者特聘教授，博士生导师. 2003年毕业于中科院化学所并取得博士学位，师从著名的光谱学家沈德言先生. 自2009年1月起在青岛科技大学工作. 研究方向为高分子凝聚态结构及其相变行为、生物质纳米材料制备及功能复合材料构筑，已发表SCI学术论文130余篇，所发论文被引6000余次，H-指数为38，获批中国发明专利20余件. 先后获日本JSPS博后奖、德国洪堡资深学者、山东省泰山学者、山东省杰出青年、山东省自然科学二等奖及中国石化联合会青年科技突出贡献奖等荣誉或奖励.摘要拉曼光谱作为一种强大的工具，被广泛应用于聚合物结构的表征. 随着共振拉曼光谱、扫描角度拉曼光谱、高分辨率拉曼成像、极化拉曼光谱、表面增强拉曼散射等拉曼技术的迅速发展，拉曼光谱的应用范围不断扩大. 本文首先介绍了拉曼光谱设备的基本原理和组成，总结了拉曼技术的实验技巧和数据处理中需要注意的问题，讨论了红外光谱和拉曼光谱的区别，在此基础上，综述了近十年来拉曼技术在聚合物结构表征领域的最新应用和研究进展. 其应用包括以下六个方面：高分子链的构象、聚合物的聚集状态、聚合物结晶度的计算、高分子链的取向、外场作用下的结构转化、高分子共混物化学或物理成分的识别. 最后，对拉曼光谱在聚合物研究中的发展进行了展望. 希望本文能够对试图从拉曼光谱中获取聚合物结构信息的学者有所帮助.AbstractAs a powerful tool, Raman spectroscopy is widely used in the characterization of polymer structures. Along with the rapid development of Raman technology such as resonance Raman spectroscopy, scanning angle Raman spectroscopy, high-resolution Raman imaging, polarized Raman spectroscopy, and surface-enhanced Raman scattering, the application range of Raman spectroscopy has been continuously extended. In this paper, we first introduced the basic principle and the composition of the Raman equipment, and then we summarized the experimental skills of Raman technology and the issues that need attention in data processing. The difference between the infrared spcectroscopy and the Raman spectroscopy was discussed. Afterwards, we reviewed the latest applications and research progress in the fields of polymer structure characterization by using Raman technology in recent decade. The applications include the following six aspects: the macromolecular chain conformation, the aggregation state of polymers, the calculation of the polymer crystallinity, the macromolecular chain orientation, the structural transformation under the external fields, and the identification of the chemical or physical composition in polymer blends. Last, the development of Raman spectroscopy in polymer research was prospected. It is hoped that this review could be helpful for the one who tried to obtain the information about the polymer structure from Raman spectroscopy.关键词拉曼光谱  结构表征  原理  应用KeywordsRaman spectroscopy  Structure characterization  Principle  Application 拉曼散射现象是由印度科学家Raman于1928首先发现并报道的，但拉曼散射信号只相当于瑞利散射百万分之一，在拉曼散射现象被发现之初由于没有足够功率的光源而并未被广泛的应用. 近半世纪以来随着激光光源以及显微技术在拉曼光谱仪中的应用，拉曼光谱迸发出了旺盛的生命力.拉曼光谱与红外光谱同属分子振动光谱，但其原理与红外光谱截然不同. 如今拉曼光谱在高分子领域中已经有广泛的应用，包括分子链构象、取向、结晶度等方面的研究等. 本文在结合拉曼基本原理及实验技巧的基础上，总结了近年来拉曼光谱在高分子表征中的最新研究进展.1基础原理1.1光的散射当光线遇到分子时，绝大部分的光子(多于99.999%)都会发生弹性散射(即瑞利散射)，瑞利散射具有与入射光相同的波长. 然而，少部分的光子(少于0.001%)会发生能量(频率)偏离的非弹性散射(即拉曼散射). 光散射过程可以用量子力学进行描述，如图1所示，当一束光照射到某体系时，体系中粒子吸收光的能量而被激发，从而发生能级跃迁过程，同时辐射出散射波. 不同的跃迁方式决定了不同的散射类型，例如(拉曼)斯托克斯散射、瑞利散射、(拉曼)反斯托克斯散射(高分子样品测试中常用的拉曼散射范围)[1~7]. 在拉曼测试过程中，经常也会出现荧光信号，与拉曼散射不同，荧光过程中粒子被激发至能量更高的电子能级而非拉曼散射中的虚态. 因此短波长比长波长激光更易产生荧光效应.Fig. 1Quantum mechanics description of Rayleigh, Raman scattering and florescence.1.2拉曼散射与拉曼光谱1.2.1拉曼散射的基本原理假设一束频率为v0的光照射在一个分子上，分子中电子会被入射光的电场激发做受迫局域运动而出现极化现象，产生电偶极矩，假设入射光电场可以表示为:式中E0为光电场的振幅，则由于分子运动所产生的偶极矩可以表示为:式中α为极化率，极化率的变化是分子的核外电子云受外部电场诱导而产生的(通过平衡位置两边的)形变而导致的.如果分子的极化电场所释放出的光与入射光频率相同，则把这种散射过程称为瑞利散射. 而如果α被分子的振动所调制(modulated)，则α可以展开为关于振动简正坐标q的级数:q由以下公式得出:则有:以上公式表明在当前情况下频率为(v0±vk)的(拉曼)散射会与频率为v0的瑞利散射同时出现. 某一分子振动为拉曼散射活性的前提条件为(∂α∂q)0的值不为0，也就是说分子的极化率随分子振动而改变[8,9].如图2所示，假设频率为v0电场(入射光)可以诱导分子的偶极矩P产生同频率(v0)的振动. 如果此时分子极化率具有随时间变化的极低频的振动vm，那么经过以上2种不同频率的振动调制后的散射光将包含3种不同频率的光，分别为v0(瑞利散射)、v0+vm(反斯托克斯散射)、v0-vm(斯托克斯散射). 反之如果分子的振动不能使极化率产生低频振动，则不会有调制的出现，进而不会出现拉曼散射效应[8,10].Fig. 2Schematic representing of Rayleigh and Raman scattering: (a) the incident radiation makes the induced dipole moment of the molecule oscillate at the photon frequency (v0) (b) the molecular vibration can induce the polarizability,α,to have a frequency ofvm the result as shown in (c) is an amplitude modulated dipole moment oscillation,and three components with steady amplitudes which can emit electromagnetic radiation can be achieved as:v0 (Rayleigh component), v0+vm (Raman anti-Stokes component), and v0+vm (Raman Stokes component), as shown in (d).由于诱导分子偶极矩P与电场E均为矢量，且一般情况下两者方向不同，因而连接这2个物理量的极化率α可以用一个二阶张量来表达，则P=αE可以表示为其中，x，y，z为分子在笛卡尔坐标系中的坐标. 极化率为对称的二阶张量矩阵，包含了6个独立的元素，αxx、αyy、αzz、αxy、αyz、αxz. 上式的意义为，例如沿x方向电场Ex诱导了沿y方向的偶极矩Py，则可表示为Py=αxyEx. 此式在通过偏振拉曼研究分子对称性时具有重要意义[9].1.2.2拉曼活性的判据如上所述，非弹性散射源于在平衡位置附近分子的极化率关于简正坐标q的导数不为0，这一关系为小分子的拉曼散射提供了“选择定律”的基础. 以对称双原子分子的对称伸缩振动(symmetric stretching vibration)为例，如图3(a)所示，当两原子的位置无限接近时，体系电子密度分布类似于单一原子的电子密度；而当两原子的位置无限远离时，体系电子密度分布近似于2个独立的单原子的电子密度. 因此对于双原子分子的对称振动，其极化率沿简正坐标方向成单调增长模式，因此其在平衡位置导数不为0，为拉曼活性振动. 而对于分子偶极矩，对称伸缩振动过程中其正负电荷中心并没有产生位移，所以偶极矩没有发生变化，因此为红外非活性振动. 例如氧气与氮气分子的对称伸缩振动只能使用拉曼光谱进行研究，因为在红外谱图中不会出现吸收峰.Fig. 3The derivatives of polarizability (red) and dipole moment (blue) are schematically depicted for the normal modes of a two (a) and a three (b) atomic molecule. Based on these intuitive considerations,conclusions on the IR and Raman activity of the modes can be drawn.线性三原子分子比双原子分子稍显复杂，例如二氧化碳分子. 对于其对称伸缩振动，如图3(a)所示，极化率的变化类似于双原子分子的对称伸缩振动，为拉曼光谱活性，红外光谱非活性. 对于非对称伸缩振动(antisymmetric stretching vibra-tion)以及变角振动(bending vibration) (图3(b))，极化率在平衡位置两边的变化虽不为0，但是其变化是关于平衡位置对称的. 因此极化率在平衡位置周围变化可以认为是简谐的，也就是说(∂α∂q)q0=0，因此非对称伸缩振动与变角振动均为拉曼非活性；而偶极矩在平衡位置两侧的方向是反转的，因此(∂μ∂q)q0≠0，表现为红外活性[11].2实验技巧为了得到更丰富的样品信息，我们希望拉曼光谱在准确的基础上具有尽可能高的信噪比(signal-noise ratio，SNR). 关于拉曼散射的强度IR一般有如下关系式:其中，v和I0为入射激光的频率及强度；N为参与散射过程的分子数量；(∂α∂q)2是与分子结构有关的参数.上式表明，使用短波长激光并增加激光能量密度的同时增加样品量可以增强拉曼散射信号(注：拉曼光谱位移不随入射波长的变化而改变). 但在实际的测试过程中，不同类型的样品需要根据其自身的特点选择与其匹配的波长的激光以及激光能量，不能为了增强拉曼信号就去用短波长激光去测试所有样品，很多高分子样品在短波长激光下可能没有拉曼信号或者拉曼散射被很强的荧光信号所淹没.2.1样品制备2.1.1固态样品相对于无机样品,有机高分子样品的拉曼信号相对较弱(一部分原因是由于高分子样品中存在大量的无序结构). 对于高分子粉末或膜样品,一般需要保证沿光的入射方向有一定的厚度并同时使其表面尽量平整，以便于显微镜的聚焦. 对于透明样品，可将其放置于铝箔上进行测试(因为金属一般都有增强拉曼信号的作用，用铁片作为基底同样有着很好的效果). 或者，由于拉曼接收的是散射光，太薄的透明样品极易被激光穿透从而打到基底上，因此为了得到更好的拉曼信号，制样时要尽可能增大薄膜厚度. 另外由于激光一般都是偏振的，因此对于取向样品，例如纤维，需首先确定入射光的偏振方向，之后再确定样品的(某一)取向轴与入射光偏振方向平行(或垂直)，再开始测试，这样才能得到正确的结构信息.2.1.2液态样品由于拉曼可以聚焦到几十微米下检测一定深度的样品信号，无需担心盖玻片和毛细管对拉曼信号的影响，因此高分子液态样品的拉曼测试相对于红外测试比较便捷，可以直接进行测试. 一般可以使用凹面载玻片或者金属制液体样品槽承载液体样品. 测试时可先将激光聚焦于液体表面，然后将样品平台沿激光方向上抬，使激光聚焦于液体样品内部，这样可以得到较好的光谱. 如果液体易挥发，可以使用盖玻片将样品封闭于容器内或将液体封入毛细管内.2.2设备调试2.2.1拉曼装置的构成随着拉曼仪器的发展，如今在一般情况下，背散射模式，也就是入射激光与散射激光平行，已经足够应对大部分高分子样品的测试需求. 对于一些特殊情况，例如取向或单晶样品的偏振拉曼测试，需要使用到90°入射的模式，也就是入射光路方向与散射光路方向为90°，原因可以参考上节极化率的二阶张量公式.以雷尼绍(Renishaw，UK) inVia型拉曼光谱仪为例，如图4所示，拉曼装置一般包括入射激光光源、入射光路系统(包括扩束器)、显微镜及样品台系统、滤波器、衍射光栅及CCD检测器. 在实际测试过程中，我们需要选择合适的入射光波长及显微镜物镜.Fig. 4Schematic diagram of the Raman instrument.当今市场上主要的拉曼仪器根据应用的场景可分为手持型、便携型以及桌面型拉曼光谱仪. 手持型拉曼光谱仪集成性很高，小巧轻便，操作非常简单，几乎可以在各种需要的地点、时间对从原材料到成品进行鉴定分析. 便携型拉曼光谱仪集成性相对较高，并具有一定的扩展性，可作为小型移动实验室使用. 桌面型拉曼光谱仪体积较大且不可移动，如图4中示意图即为桌面型拉曼光谱仪，但这类光谱仪具有极强的扩展性，几乎可以变更从入射激光光源、入射光路、样品平台至光栅等所有组成部分，从而可以为不同样品以及不同条件的测试创造可能.2.2.2激光波长的选择激光波长与能量密度成反比，使用短波长激光可以得到较强的拉曼散射信号，例如532 nm要比785 nm激光的拉曼散射强度强. 但对于高分子样品来说使用532 nm激光产生荧光干扰的可能性也会增加. 所以在一些情况下可以选择785 nm的光源. 如前所述，样品产生的拉曼位移不会随激发光源的波长改变而改变，因此只要可以避开荧光效应可以自由选择激光波长. 需要注意，虽然拉曼位移不随激光波长而改变，但使用同一物镜下，不同波长可以到达的空间分辨率不同. 例如，物镜的数值孔径(NA)为0.9，532 nm激光的空间分辨率可达0.72 μm，而在同样条件下使用785 nm激光时，空间分辨率仅为1.1 μm.另一种情况，如果样品内的分子振动与入射激光可以产生共振效应，那么可以以此来选择入射激光波长，则可以得到较强的拉曼散射信号.2.2.3显微镜的选择通常显微镜的物镜上会标注2个参数，分别为放大倍数(5×、10×、20× 等)与数值孔径(numerical aperture，NA，是与镜头光通量有关的参数，一般为0.05~0.95). 一般放大倍数与数值孔径成正相关关系，而数值孔径决定空间分辨率，有如下公式 [12]：其中，R为最大空间分辨率. 在实际测试时需要注意激光能量会随光斑尺寸(空间分辨率)变化，更高的空间分辨率意味着激光密度会更大，此时需要注意样品可能会被激光热解. 对于高分子样品来说，一般要先从低激光功率测试开始尝试，如果此时拉曼散射信号很弱，则少量增加激光功率，但同时要注意观察样品是否被热解，如此反复尝试直到找到最适宜测试的激光强度.2.2.4Ne灯校准一般除用单晶硅对拉曼位移进行校准，另外使用内置的Ne灯也可以达到校准的效果. 一般在测试样品时与Ne灯同时使用，则所得到的拉曼谱图中同时包括样品与Ne灯的峰，由于Ne灯的拉曼峰位置已确定，因此可用于校正样品的峰位置.2.2.5测试参数设置在确定适宜样品的激光波长及显微镜倍数的前提下，为了提高信噪比，可以首先在不损伤样品的前提下尽量提高入射激光的强度，其次适当延长曝光时间(有效的提高散射信号强度)，同时也可以增加循环(cycling)测试的次数(有效降低噪音的影响). 但需要注意曝光时间不宜过长，因为过长会导致检测器的饱和，例如当同时需要较强与较弱的拉曼散射峰时，较弱的散射峰由于信噪比较低而难以使用时，可以固定曝光时间并增加循环测试次数来降低最终谱图中噪音的干扰.2.3数据处理2.3.1高分子样品拉曼谱的初判在取得拉曼光谱后，首先需要对谱图的构成进行判断，因为其中可能同时包含样品以及非样品的拉曼信号. 如果可以排除样品不纯净的可能，那么非样品的拉曼信号可能来自于宇宙射线、自然光或照明光等所产生的干扰，另外如果样品透光性好，激光可能透过样品打到基底上，也可能产生部分非样品信号.宇宙射线所产生的特征峰强度高且十分尖锐，并且可能在任意波数出现. 而如果在测试时对照明光抑或显示器背光的屏蔽不彻底，则也会出现一些尖锐的谱峰，这些谱峰的位置与光的类型有关. 但同宇宙射线不同的是，这些峰不是随机出现，而是会在相同的位置重复出现.对于结晶性高分子样品来说，由于内部存在大量的晶格缺陷及非晶组分，通常即使是结晶特征峰也不会是非常尖锐的峰，这种情况类似于红外测试的结果. 一般来说，对于同一振动模式，相较于非晶峰，结晶峰的峰强较强，峰宽较窄. 对于未知的结晶性高分子样品，可以通过分别测试结晶与熔融状态下的样品来确定结晶与非晶的特征峰. 确定特征峰是进一步测试分析的基础.由于我们常规使用的拉曼散射的波束范围恰好与中红外测试波段相似(400~4000 cm-1)，并且两者均为分子的基团振动光谱，所以兼具红外与拉曼活性的同一分子基团振动在两谱图中的频率相似，两者可以互为参考. 而在低波数范围(400 cm-1)，也就是远红外区间(一般反应分子链主链的振动)，由于空气中的水气对测试有极大的干扰，所以远红外测试需要对样品仓抽真空，这也极大地限制了远红外光谱的应用，因此在实际测试中远红外与中红外区不能同时测试. 而拉曼的测试范围可以直接覆盖远红外及中红外波束段，并且测试过程中无需进行硬件切换，这也为高分子的研究提供了极大的便利.2.3.2谱线的平滑与拟合在一些情况下，由于样品或仪器的原因，即使已经选择了最优的测试条件，所得的光谱仍可能存在信号起伏大，信噪低的情况. 此时为了便于数据分析，可以对光谱进行平滑或拟合处理. 但是由于平滑后光谱会发生微小的变化，例如肩峰可能会因此消失，所以在对样品光谱没有十足把握的情况下，进行平滑处理时要十分谨慎. 一般如果噪声水平在中整条光谱中都比较均一，可以对光谱进行平滑处理，在平滑时，尽量选用最少的数据点个数为平滑单位，不能以牺牲数据准确来换取谱线的平滑美观. 在其他情况下，例如存在非拉曼信号，则不能使用平滑处理来消除，而应改变测试条件来避免非拉曼信号的产生.当谱图中有2个或多个峰重叠时，为了便于分析数据，需要进行分峰拟合(通常使用高斯加洛伦兹函数拟合)，要注意虽然拟合的目标是尽量还原原始光谱，但不能为了达到这个目标而任意增加分峰的个数而忽略了每个峰的物理意义，这样便失去了分峰的价值.总之，不论何时原始数据都是最重要的，任何数据处理方法都需要在遵从原始数据的基础上进行.3拉曼光谱应用举例2010年至今，拉曼光谱在高分子多层级结构解析中的应用主要涉及6个方面，分别是：分子链构象研究、分子聚集态研究、结晶度计算、分子链取向研究、外场作用下的结构转变研究、化学/物理组成研究. 应用到的拉曼光谱种类主要为：共振拉曼光谱(resonance Raman spectro-scopy)、扫描角度拉曼光谱(scanning angle Raman spectroscopy)、高分辨拉曼成像(high-resolution Raman imaging)、偏振拉曼光谱(polarized Raman spectroscopy)及表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering, SERS).3.1分子链构象研究Gao等[13]利用共振拉曼光谱识别了聚(2,5-双(3-十四烷基噻吩-2-基)噻吩[3,2-b]噻吩)(PBTTT)与电子受体[6,6]-苯基C61丁酸甲酯(PCBM)共混的体异质结太阳能电池中PBTTT的有序和无序构象. 作者提出PBTTT噻吩环C＝C对称伸缩振动(νs(C＝C))包括主链有序构象和无序构象2个组分的贡献：如图5所示，有序构象的特征峰位置在1489 cm-1，半峰宽约为15 cm-1；无序构象的特征峰位置在1500 cm-1，半峰宽约为25 cm-1. PBTTT不同构象的相对含量随PCBM含量、退火温度与拉曼激发能的改变而变化. 共振拉曼图像进一步证实有序的PBTTT链集中在富含PCBM的双分子晶体中. Martin 等[14]同样借助共振拉曼光谱结合光电流成像技术，考察了高分子-富勒烯共混物中依赖于构象变化的电荷沿主链的传输特性. 实验及理论计算的结果均证实当共轭高分子的主链呈现平面构象时，电荷传输率最高. 体系形貌表征的结果表明当高分子与富勒烯达到良好共混状态时，高分子主链构象更易于平面化.Fig. 5Simulated Raman spectra (a) of the BTTT-C2 monomer and structures (b) (Reprinted with permission from Ref.‍[13] Copyright (2014) American Chemical Society).原位共振拉曼表征被成功地应用于研究ps尺度上聚(3-己基噻吩)(P3HT)分子链在氯苯中的构象松弛过程[15]. 如图6(a)所示，基于激发态拉曼特征的时间依赖性及与其他高分子的拉曼光谱进行对比，作者归属了构象松弛过程中不同结构的拉曼特征峰. 通过绘制拉曼特征峰的强度变化对时间的关系曲线(见图6(b))，揭示了松弛过程中主链共轭长度的变化，据此提出了P3HT分子链在氯苯中的构象松弛动力学机理.Fig. 6(a) Valence-bond structures of the quinoidal excited state of P3HT and the time-resolved resonant-Raman spectra of P3HT in chlorobenzene photoexcited at 510 nm. (b,c) Time dependence of Raman band intensities in figure (a). Integrated intensities (b),black lines correspond to biexponential fits with constrained lifetimes of (9±1) and (220±20) ps. Relative change in feature intensities attributed to torsion-induced exciton conformational relaxation (c). (Reprinted with permission from Ref.[15] Copyright (2012) American Chemical Society).3.2分子聚集态研究Gao等[16]在对P3HT/PCBM共混薄膜分子聚集态的研究中区分了不同聚集态对P3HT主链C＝C伸缩振动νs(C＝C)的贡献. 对样品光谱的拟合结果(如图7(a)所示)表明，共混膜的(νs(C＝C))峰来自于聚集分子链与非聚集分子链的双重贡献，前者的特征拉曼频率约为1450 cm-1，后者约为1470 cm-1. 聚集态与非聚集态峰强度的相对比值R(R = IC=Cagg/IC=Cun)在样品退火后增加(如图7(b)所示)，R值与不同聚集态的相对密度相关. 如图7(c)所示，作者进一步应用共振拉曼成像来考察R值变化对共混形貌的依赖关系，通过R值对比，对退火的共混薄膜中4种聚集程度不同的P3HT分子链进行了识别与成像分析. 在此工作基础上，作者通过分析拉曼特征峰的强度变化，考察了P3HT聚集态对共混物体系中局部光电流产生效率[17]、激发态结构变化及初期振动动力学[18]的影响. 共振拉曼结合成像技术分析也被成功地应用于其他共轭聚合物结构与性能的对应关系研究中[19].Fig. 7(a, b) Raman spectra of as-cast (a, red) and annealed (b, blue) blend films excited with 488 nm light show theνs(C=C) band of P3HT represented by the shaded regions of the complete spectra shown as insets. The band is fitted with two Lorentzian functions (dashed traces), showing the relative contributions of both aggregated (IC=Cagg) and unaggregated (IC=Cun) components. (c1 and c2)IC=CaggandIC=Cuncenter frequency dispersion images for P3HT/PCBM as-cast films,and (c3) histograms of frequency components. (c4 and c5)IC=Cagg and IC=Cuncenter frequency images for P3HT/PCBM annealed films,and (c6) histograms of frequency components (Reprinted with permission from Ref.[16] Copyright (2012) American Chemical Society).拉曼光谱结合高空间分辨成像技术可用于高分子多晶型结构，例如针对聚己二酸丁烯酯(PBA)的环带球晶研究[20]. 在此工作中作者首先识别了2种晶型(α晶与β晶)及非晶结构的拉曼特征峰，选择能够反映不同聚集态相对含量的特征峰(C-peak)，在此基础上通过拉曼成像考察了球晶内部多晶型晶体的分布及分子链取向. 通过对比球晶的偏光照片(图8(a))与拉曼成像照片(图8(b))可知，2种晶型的晶体在球晶中心、环带区域及外层非环带区域呈现非均匀分布，二者能够在相同的温度区间(31~33 ℃)成核和生长，然而环带区域α晶的相对含量会随结晶温度而提高. 2种晶型的拉曼成像数据结合Hermans取向函数分析(见图8(c))结果证实，环带区域的分子链沿球晶半径方向和基底平面取向，且沿环带球晶径向方向的取向呈周期性变化.Fig. 8(a) Optical micrographs of PBA31-33. (b) Raman imaging of C-peak position for the same area in (a). (c) Hermans orientation function image calculated by using the C-peak area of PBA32 measured with polarization parallel (0°) and perpendicular (90°‍) to the horizontal direction (Reprinted with permission from Ref.‍[20] Copyright (2017) American Chemical Society).拉曼成像技术作为一种强有力的表征手段，可以精确表征(分辨率最高可达0.1 μm)单片层石墨烯或氧化石墨烯在片层不同区域的氧化结构. Zhang等[21]通过拉曼成像技术对具有不同氧化结构的单片层氧化石墨烯进行了表征，通过D/G峰的比值差异分析了单片层在不同区域的氧化程度. 如图9所示，JGO纳米片与GO差异显著，后者呈现出统一的颜色(图9(a)和9(b)). 此外，从图9(c)和9(d)可以看出，在蓝色区域(低氧化区域)，JGO的ID/IG比值较低(~0.72)，而在红色区域(高氧化区域)，ID/IG比值较高(~1.07)，与GO的ID/IG比值存在显著差异(整个区域的ID/IG比值为~1.02). Badi等[22]同样借助拉曼成像技术，通过D峰与G峰的光谱解析，考察了石墨烯纳米片在聚苯胺(PANI)中的分散情况.Fig. 9(a-d) Raman mapping of a GO sheet (a) and JGO (c) using theID/IG ratio from the corresponding Raman spectra (b, d) (Reproduced with permission from Ref.[ 21] Copyright (2020) Elsevier).3.3结晶度计算包括拉曼光谱在内的波谱技术经常被用于计算高分子晶体的结晶度. Mannanov等[23]利用原位拉曼光谱直接表征了应用于太阳能电池的P3HT:‍富勒烯基受体活性层中、P3HT在50~150 ℃温区的结晶动力学，并考察了溶剂、富勒烯基受体种类与结晶温度对P3HT结晶度的影响[14]. 结晶度的计算在选择合适的结晶特征峰与非晶特征峰基础上，结合光谱分峰/拟合处理及选择合适的结晶模型实现. 例如：Agarwal等[24]利用2种光谱分析方法计算了纤维素I晶体的结晶度，一种方法称为“单变量方法(univariate method)”，借助结晶峰/非晶峰强度的比值计算；另一种方法称为“多变量方法(multivariate method)”，应用偏最小二乘回归模型(partial least squares regression model)计算. 通过与已知结晶度的参比样品对比证实，2种方法在评价结晶度处于0%~80.5%范围内的纤维素样品时结果可靠，且由单变量方法得到的结晶度数值比由WAXS表征得到的更理想. Wang等[25]应用针尖增强拉曼光谱技术结合随机生长结晶模型，估算了合成的二维聚合物单层的结晶度，据此揭示了二维聚合物单层生长的交联本质[26].3.4分子链取向由于激光本身具有偏振性，如果使用偏光片对入射激光以及散射光的偏振方向进行调制，则可以获得高分子链中分子基团的取向信息，进而解析高分子链的取向结构，这种方法称为偏振拉曼[26~28]. 例如Richard-Lacroix等[26]使用偏振拉曼手段对使用不同收丝方法所得的静电纺聚氧化乙烯(PEO)单根纤维中PEO分子链的取向情况进行了研究. 测试过程中对于每一根纤维均需测试4组不同偏振角度的入射光与散射光的组合拉曼光谱，例如假设平行纤维轴方向为Z轴，垂直于纤维轴方向为X轴(Y轴暂不考虑)，那么4组拉曼光谱分别为(X(入射光偏振方向)X(散射光偏振方向))、(XZ)、(ZX)与(ZZ). 不同的偏振组合所得的拉曼光谱中峰的强度有较大差别，说明分子链有取向存在，利用这些数据再通过进一步的计算便可以得出分子链的取向分布方程(orientation distribution function). Richard-Lacroix等的研究结果表明，单根纤维中的分子链总具有较高的取向并且与收丝方法无关.近年来，新的偏振拉曼数据分析手段也在不断地涌现，例如Richard-Lacroix等[28]提出了最可几分布(most probable distribution, MPD)方法，用以更加精确地定量分析分子链取向. Papkov等[29]利用一种改进的偏振拉曼分析方法，对直径分布在140~1000 nm范围的单根聚丙烯腈电纺纳米纤维的分子链取向进行了定量研究. Svenningsson等[30]基于包绕洛伦兹函数(wrapped Lorentzian function)，开发了一种新的偏振拉曼光谱分析方法，并应用于确定再生纤维素纤维的分子取向研究. 这种方法的优势在于消除了偏振拉曼测试时对偏振角度的限制，所得结果能够与广角X-射线衍射与固体核磁的数据直接比较. 测量散射光偏振度随偏光片旋转角度的变化可以提供取向分布函数形状的半定性信息，Park等[31]据此分析了聚乳酸(PLLA)薄膜内部特征振动散射强度的角度依赖性，对结构单元的取向性进行了量化.3.5外场作用下的结构转变研究借助原位拉曼表征技术，能够对诸如温度变化[32~34]、时间改变[35]、拉伸过程[36,37]等的高分子结构演变进行追踪. Jin等[32]利用变温拉曼考察了高密度聚乙烯(HDPE)多重熔融行为中的构象变化. 作者对与熔融相关的变温拉曼光谱进行了如图10(a, b)所示的二维相干光谱分析(least squares moving-window method, LSMW)，通过整个熔融过程中构象变化的相似性结合与“熔融-再结晶”、“中间相预熔融”及“多层片晶熔融”模型的比对，提出了如图10(c)所示的HDPE熔融时晶相直接转变为非晶相的机理. Kasiouli等[33]研究了β-环糊精包封的聚(4,4' -二苯基乙烯基) (PDV.Li)构象随温度的变化. 特征拉曼振动的强度变化证实，包封前后PDV.Li的主链平面性没有变化. 更高温度下主链构象的改变归因于由热诱导聚集引发的相邻苯环之间的扭转角度降低.Fig. 10(a,b) Least squares moving-window (LSMW) analysis of the HDPE Raman spectra with the window size of 11 spectra (ΔT = 1 °C). (a) A contour map of the first order derivative (d I/dT) as a function of Tave of a moving window. (b) The dI/dT of six Raman peaks are plotted after numerically integrated over frequency ranges to cover the Raman peaks: 1415-1425, 1115-1136, and 1299-1325 cm -1. (c) The schematic of the multithickness lamellae model. (Reprinted with permission from Ref.[32] Copyright (2017) American Chemical Society).基于拉曼光谱的多技术联用能够实现拉伸过程中高分子结构变化的表征与分析. Lόpez-Barrόn等[36]利用原位偏振拉曼技术，考察了线性低密度聚乙烯(LLDPE)拉伸过程中的单链构象及分子链取向变化. 结果表明，反式构象随拉伸程度的增加呈线性增加，分子链的伸展分为3个阶段，即弹性伸展阶段、塑性伸展阶段与应变硬化阶段. 取向因子受分子量影响，低分子量部分取向因子小. Kida等[37]利用原位偏振拉曼光谱与原位拉伸测试联用，考察了分子量分布对单轴拉伸过程中高密度聚乙烯形貌及变形行为的影响. 结果表明，连接片晶的带分子(tie molecules)数量随分子量分布的增大而增加，而晶体结构不受分子量分布影响. 晶区分子链沿拉伸方向的取向程度及连续的反式构象链的形成均在高分子量分布的样品中得到提高.3.6化学/物理组成研究表面增强拉曼光谱是一种能够在高分子共混结构的组分研究中提供潜在选择性与垂直分辨的强大技术. Razzell-Hollis等[38]借助此光谱探索了P3HT:聚((9,9-二辛基芴)-2,7-二基-alt-[4,7-双(3-己基噻吩-5-基)-2,1,3-苯并噻唑]-2' ,2"-二基)(F8TBT)共混薄膜的界面组成与分子有序性. 作者首先分别表征了P3HT与F8TBT的光谱，识别了由于样品退火引起的、与本体/界面形貌相关的光谱变化. 随后为了确定共混薄膜的化学组成，表征了不同共混样品的光谱并对光谱进行了分峰处理，获得了代表P3HT含量的强度值α与代表F8TBT含量的强度值β，结果见图11. 光谱分析的结果表明热退火改变了共混体系的界面组成：预退火增加了低表面能P3HT的含量，而后退火增加了高表面能F8TBT的含量. 此外，表面增强拉曼光谱还成功地应用于对纳米厚度尺度上高分子薄膜表面与底面的化学组分识别[39].Fig. 11Raman (a) and SERS (b) spectra for an as-cast sample of quartz (quartz) Q/Ag/P3HT:F8TBT, fitted using RR-P3HT (as ordered fraction), RRa-P3HT (as disordered fraction) and F8TBT spectra to obtain relative contributions of P3HT (α) and F8TBT (β). Normalized Raman (c) and SERS (d) spectra for P3HT:F8TBT blends in five different sample configurations, with variation in the relative intensity of the F8TBT peak at 1356 cm-1 shown in each inset (Reprinted with permission from Ref.‍[38] Copyright (2016) American Chemical Society).共聚焦显微拉曼技术近几年被广泛地应用于高分子多组分体系的化学/物理组成研究. 化学组分识别的相关研究涉及药物输送体系中聚乳酸-羟基乙酸共聚物[40]、聚己内酯和聚环氧乙烷的复合电纺纤维[41]、聚二甲基丙烯酰胺-甲基丙烯酸二苯甲酮共聚物[42]等. 物理组分识别方面，Hu等[43]研究了左旋聚乳酸/右旋聚乳酸(PLLA/PDLA)共混物球晶的等温结晶行为. 在如图12(a)和12(b)所示的800~600 cm-1波数范围内分别选择736与754 cm-1峰作为均晶与立构复合晶的特征峰，通过对球晶内部与外部两峰强度的成像分析(见图12(c)和12(d)，证实大球晶内部包含均晶与立构复合晶2种晶体，立构复合晶均匀地分散在非晶区与球晶区域.Fig. 12Peak fitting results in the 800-600 cm-1 region at the single point at the position of 1# and 2# (a) and the peak fitting spectra of PLA with different crystal forms (b) Imaging result with imaging parameter: band intensity at 754 cm -1 (c) band intensity at 736 cm -1 (d) (Reproduced with permission from Ref.[ 43] Copyright (2019) Elsevier).其他成像方式如共振拉曼光电流成像(resonance Raman-photocurrent imaging, RRPI)[44,45]、飞秒激发拉曼成像(femtosecond stimulated Raman microscopy, FSRM)[46]、针尖增强拉曼成像(tip-enhanced Raman mapping, TERM)[47]、宽带相干反斯托克斯拉曼散射(broadband coherent anti-stokes Raman scattering, CARS)显微镜[48]、反转显微拉曼光谱(inverse micro-Raman spectroscopy, IMRS)[49]、等离子体波导共振拉曼光谱(plasmon waveguide resonance Raman spectroscopy, PWRRS)[50]等也应用于高分子化学组成分析.扫描角度拉曼光谱适用于分子有序程度的研究，能够同时获取增强的拉曼信号、薄膜厚度及分子有序程度的信息，此外结合均方电场计算(MSEF)可以确定聚合物薄膜中是否产生拉曼散射[51,52]. Meyer等[51]利用此光谱(示意图见图13(a))研究了P3HT:PCBM共混物在蓝宝石、金和铟锡氧化物界面处的形貌，考察了P3HT结构有序程度对基底的依赖性. 选择性激光入射角度下薄膜在蓝宝石基底上的拉曼光谱如图13(a)所示. 扫描角度从35°增加到60°，P3HT膜的拉曼强度呈现下降趋势，而当扫描角度进一步增加时拉曼强度提高. 与之不同，共混薄膜的拉曼强度随扫描角度的增加而持续下降. MSEF计算(见图13(b))揭示了拉曼信号在z方向上的距离依赖性，用于拉曼光谱的辅助解析，预期的拉曼信号与整个聚合物厚度上的积分MSEF成正比，这与实验的拉曼光谱一致. 此外，研究表明噻吩环C＝C伸缩振动峰的宽度对P3HT的分子有序程度敏感，据此作者考察了分子有序程度对基底的依赖性.Fig. 13(a) Schematic of the SA Raman interface used to collect the data shown in B and C (A). SA Raman spectra at the indicated incident angles for (B) P3HT and (C) 1:1 P3HT:PCBM deposited on a sapphire substrate. (b) Calculated MSEF as a function of distance and incident angle for the interface: 0-1000 nm sapphire/1000-1230 nm P3HT:PCBM/1230-6000 nm air (A), 0-1000 nm sapphire/1000 to 1300 nm P3HT/1300 to 6000 nm air (B). The MSEF in the sapphire layer (0-1000 nm) and the majority of the air layer (greater than 1500 nm) are omitted for clarity. The calculated plots show the expected distance dependence of the experimental Raman signal in theZ direction. (Reprinted with permission from Ref.[ 51] Copyright (2013) American Chemical Society).4拉曼光谱应用展望激光拉曼光谱虽与红外光谱同属于分子振动光谱，但其拥有诸多红外光谱不可比拟的优势，例如高的空间分辨率、高解析度、测试范围横跨远红外与近红外光谱波段并且可以直接对水体系进行测试等. 如今伴随着新型高分子材料的不断涌现与应用，诸如高分子水凝胶，高分子纳米或多层复合材料等，以及表面增强拉曼，针尖增强拉曼以及共聚焦拉曼成像等新技术的接连出现，必将会使拉曼光谱在高分子材料的研究领域中迸发出强大的活力.然而与此同时，仍有一些问题限制了拉曼光谱的应用，例如在拉曼成像中，样品表面的高空间分辨率可以实现，但是垂直于入射激光深度方向上的空间分辨率则不佳，虽有研究使用金属粒子包埋在高分子样品中，再借助表面增强拉曼技术以实现高深度方向分辨率，但是这种方法的普适性稍显不足. 另外，如今拉曼成像技术一般仍为逐点扫描(mapping)模式，而红外成像则已多采用阵列扫描(imaging)模式，这就意味着拉曼成像需要较长的时间，从而很难使用拉曼成像进行过程研究，这也严重影响了拉曼成像的应用. 现今高分子的研究中多设备同步协同测试是一个趋势，例如X射线散射、拉曼及红外光谱同步在线测试，这也对拉曼设备的小型化以及快速响应提出了更高的要求. 相信通过拉曼设备以及技术的不断升级，这些问题都会迎刃而解，彼时拉曼光谱技术将会在高分研究领域占有更加举足轻重的地位.参考文献1Zhang Shulin(张树霖).Raman Spectroscopy with Low Dimensional Nanometer Semiconductors(拉曼光谱学与低维纳米半导体).Beijing(北京):Science Press(科学出版社),2008.3-352Koenig J L.Spectroscopy of Polymers.Netherlands:Elsevier,1999.207-252.doi:10.1016/b978-044410031-3/50005-03Chalmers J,Griffiths P.Handbook of Vibrational Spectroscopy, 5 volumes set.New Jersey:John Wiley & Sons,2002.1-174Sasic S,Ozaki Y. Raman,Infrared, andNear-Infrared Chemical Imaging.New Jersey: John Wiley & Sons,2011.1-215Schrader B.Infrared and Raman Spectroscopy: Methods and Applications.New Jersey:John Wiley & Sons,2008.7-616McCreery R L.Raman Spectroscopy for Chemical Analysis.New Jersey:John Wiley & Sons,2000.15-30.doi:10.1002/04717216467Colthup N B,Daly L H,Wiberley S E.J Am Chem Soc,1965,87(5):1155-11568Wilson E B,Decius J C,Cross P C,Sundheim B R.J Electrochem Soc,1955,102(9):235C.doi:10.1149/1.24301349Tadokoro H.Structure of Crystalline Polymers.New Jersey:John Wiley & Sons,1979.179-322.doi:10.1002/macp.1979.02002197911010Larkin P.Infrared and Raman Spectroscopy.Netherlands:Elsevier,2011.7-25.doi:10.1016/b978-0-12-386984-5.10002-311Dieing T,Hollricher O,Toporski J.Confocal Raman Microscopy.Berlin:Springer,201112Gautam R,Samuel A,Sil S,Chaturvedi D,Dutta A,Ariese F,Umapathy S.Curr Sci,2015:341-356.doi:10.1140/epjti/s40485-015-0018-613Gao J,Thomas A K,Johnson R,Guo H,Grey J K.Chem Mater,2014,26(15):4395-4404.doi:10.1021/cm501252y14Martin E,Bérubé N,Provencher F,Côté M,Silva C,Doorn S,Grey J.J Mater Chem C,2015,3(23):6058-6066.doi:10.1039/c5tc00847f15Yu W,Zhou J,Bragg A E.J Phys Chem Lett,2012,3(10):1321-1328.doi:10.1021/jz300329816Gao Y,Grey J K.J Am Chem Soc,2009,131(28):9654-9662.doi:10.1021/ja900636z17Gao Y,Martin T P,Thomas A K,Grey J K.J Phys Chem Lett,2010,1(1):178-182.doi:10.1021/jz900038c18Gao J,Grey J K.J Chem Phys,2013,139(4):490319Gao J,Thomas A,Yang J,Aldaz C,Yang G,Qin Y,Grey J.J Phys Chem C,2015,119(16):8980-8990.doi:10.1021/acs.jpcc.5b0216620Wang M,Vantasin S,Wang J,Sato H,Zhang J,Ozaki Y.Macromolecules,2017,50(8):3377-3387.doi:10.1021/acs.macromol.7b0013921Zhang Z , Qin J , Diao H , Huang S,Yin J,Zhang H,Duan Y,Zhang J.Carbon,2020,161:316-322.doi:10.1016/j.carbon.2020.01.07822Badi N,Khasim S,Roy A S.J Mater Sci Mater Electron,2016,27(6):6249-6257.doi:10.1007/s10854-016-4556-823Mannanov A A,Bruevich V V,Feldman E V,Trukhanov V A,Pshenichnikov M 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W.Macromolecules,2017,50(17):6819-6828.doi:10.1021/acs.macromol.7b0103750Meyer M,McKee K,Nguyen V H T,Smith E.J Phys Chem C,2012,116(47):24987-24992.doi:10.1021/jp308882w51Meyer M W,Larson K L,Mahadevapuram R C,Lesoine M D,Carr J A,Chaudhary S,Smith E A.ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(17):8686-8693.doi:10.1021/am402322552James D T,Kjellander B K C,Smaal W T T,Gelinck G H,Combe C,McCulloch I,Wilson R,Burroughes J H,Bradley D D C,Kim J.ACS Nano,2011,5(12):9824-9835.doi:10.1021/nn203397m原文链接：http://www.gfzxb.org/thesisDetails#10.11777/j.issn1000-3304.2020.20251&lang=zh《高分子学报》高分子表征技术专题链接：http://www.gfzxb.org/article/doi/10.11777/j.issn1000-3304DOI：10.11777/j.issn1000-3304.2020.20251

近日，南开大学张新星研究员团队针对微液滴化学的独特性质，受邀总结了40余个单电子介导的水微液滴表面自发的氧化还原反应，并通过动力学研究，证明了电子的提供和捕获——而非化学键的直接断裂——是介导水微滴界面上氧化还原反应的关键决速步骤。该工作发表在了近期的JACS Au 杂志上，并被遴选为封面文章。　　近几年与微液滴相关的纳微界面反应机制的研究吸引了大量的研究目光。在技术上，质谱作为微液滴反应的主要表征手段，一方面是由于其在分析化学反应中具有捕获短寿命自由基中间体、揭示化学反应机理等方面的天然优势，另一方面更是由于微液滴是一种可以直接喷雾进入质谱仪中进行检测的物质形式，导致质谱技术成为了近年来微液滴化学发展最简单、最重要、最主要的表征方法。因此作者们在本文中列举了使用质谱方法学研究微液滴化学的优势和注意事项。此外，作者也在合成化学和大气化学的大背景下讨论了微液滴自发氧化还原能力的潜在影响。首先，微液滴对反应的加速能力在有机合成中已经得到了广泛的认可，现有的部分微液滴化学研究已经实现了克级的合成。微液滴反应由于只需要将底物的水溶液喷洒成小水滴，无需催化剂、额外的能量输入、复杂的反应装置，完全符合绿色化学的特征，因此有望在合成化学中展现更多的潜力。其次，微液滴化学在大气化学方面也具有重要启示。大气的总体氧化还原能力决定了污染的生成、天气甚至气候的形成和变化。大气水，如云、雾和海洋飞沫，都是微米大小的微液滴。由于微液滴可以促进自发的氧化还原反应，文章建议在未来的大气研究中，也许可以将微液滴效应考虑进来。在科学上，水对许多化学反应来说是一种惰性环境。然而，通过简单地将水喷洒成为微米尺寸的微液滴，就可以展现大量独特的性质，这些性质包括异常的pH值、反应物的统一取向和部分溶剂化、极高的反应速率以及极高的气液界面电场等。在微液滴的这些独特性质中，其强大的自发氧化还原能力尤其引人关注。现有大量理论和实验研究表明，或由于界面双电层的形成，或由于大量水分子的自发统一取向，或由于水分子之间的部分电荷转移(H2O+---H2O-)，在微液滴的气-液界面浅层可以自发产生极高的电场(约109 V/m)。该电场大到足以可以触发氢氧根或其他底物分子的单电子氧化过程，生成相应的自由基和一个电子(图1)。生成的电子还可以继而触发其他底物分子的单电子还原过程。　　图1. 微液滴化学气-液界面处的氧化还原机制和质谱分析方法示意图　　图1展示了典型的微液滴化学质谱实验，并阐述了发生在微液滴表面的单电子介导的氧化还原机制。含有某种溶质的水溶液由注射泵强制推入极细的毛细管，高压氮气鞘气可将毛细管推出的液体分散成微液滴，由此产生的微液滴被喷向质谱仪的入口。以这种方式产生的微液滴的大小取决于鞘气的压力，范围在几到几十微米之间。在其表面上即可以自发发生大量的单电子的氧化还原过程。　　本文总结了40余个在水微液滴表面上发生的电子介导的氧化还原反应(表1、2)，认为在水微液滴表面上电子的产生和捕获——而非化学键的直接断裂——是微液滴大多数氧化还原反应的关键决速步骤。　　表1. 微液滴表面呈现单电子氧化过程的物种(电子供体)　　表2. 微液滴表面呈现单电子还原过程的物种(电子受体)　　在单电子是微液滴表面氧化还原反应的载流子的前提下，OH-在微液滴上可以作为电子供体，如果在溶液中加入上述电子供体(表1中的分子)，那么水微液滴上应该有更多的电子，在动力学上就应该可以加速电子受体的还原反应，进一步巩固电子确实是介导水微液滴上氧化还原反应的载流子的观点。　　为了验证这一假设，本文作者从表1中选择了三种电子供体：四硫富瓦烯(TTF)、羟甲基二茂铁(FM)、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺(TMPA)，并将这三者分别和电子受体EV2+(乙基紫精二价阳离子)的水溶液喷洒成微液滴。其中图2a为喷洒纯EV2+溶液的质谱图，OH-是唯一的电子供体，EV2+转化为EV•+ (m/z = 214)，m/z 150~200的峰是不稳定EV•+的降解产物。图2b−2d分别为喷撒TTF与EV2+、FM与EV2+、TMPA与EV2+的混合溶液的质谱图。在这些混合体系中，还原产物EV•+的强度明显增加，表明电子供体的加入加速了EV2+的还原。图2e展示了4个系统中EV•+/EV2+的相对强度的比较，清楚地显示了添加电子供体后还原产物增加了2到7倍。图2f−2h还显示了混合体系中氧化过程的加速动力学，TTF、FM和TMPA的氧化过程也应该随着EV2+的加入而加速。TTF•+、FM•+和TMPA•+自身的绝对质谱强度随着EV2+的加入增加了2倍左右。这些结果清楚地表明电子确实是介导水微滴上氧化还原反应的载流子，且简单的动力学研究证明了电子提供和电子捕获是两个相互加速的过程。而后续的进一步化学反应(如化学键的断裂和生成)在微液滴中成为了超快的非决速步骤。　　　　图2. 微液滴单电子氧化还原过程的动力学研究　　南开大学研究生金水慧、陈欢、苑旭为本文并列第一作者 南开大学张新星研究员为本文通讯作者。本文被遴选为JACS Au杂志本期封面论文。　　原文：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.3c00191　　The Spontaneous Electron-Mediated Redox Processes on Sprayed Water Microdroplets Shuihui Jin,# Huan Chen,# Xu Yuan,# Dong Xing, Ruijing Wang, Lingling Zhao, Dongmei Zhang, Chu Gong, Chenghui Zhu, Xufeng Gao, Yeye Chen, and Xinxing Zhang*JACS Au, 2023, DOI: 10.1021/jacsau.3c00191　　张新星课题组网站：http://www.zxx-lab.com/

1月18日上午，中共中央、国务院在北京隆重举行国家科学技术奖励大会，我所邹汉法研究员等人完成的“复杂生物样品的高效分离与表征”研究成果获国家自然科学二等奖。这是我所在分析化学领域第一次获得国家自然科学二等奖这一殊荣。　　由邹汉法研究员和张玉奎院士领导的研究团队根据分析化学的特点和国际前沿研究领域的发展趋势，以色谱分离分析研究为立足点，开展复杂生物样品高效分离与表征的新方法和新技术研究，在：(1)磷酸肽高选择性富集亲和色谱固定相、(2)低分子量化合物的高通量基体辅助激光解析飞行时间质谱新方法、(3)基于分子体积排阻和吸附效应的高选择性多肽富集新技术、(4)蛋白质和多肽的高效分离分析新技术和新方法、(5)新一代整体柱材料制备技术等方面取得了系统性的创新成果。相关研究成果在包括Angew. Chem. Int. Ed.、Mol. Cell. Proteomics、Anal. Chem., J. Proteome Res., J. Chromatogr.A等分离分析刊物发表了一系列重要研究论文，在国内外获得广泛好评和引用。此外，有关分离材料的制备技术还申请美国和中国发明专利多项并进行了技术转化。这些研究成果的取得显著提升了我国在复杂生物样品的高效分离与表征领域的研究水平和国际地位。相关研究成果曾获2004年度和2011年度辽宁省自然科学一等奖。

落户于怀柔科学城的中科合成油技术股份有限公司联合北京大学、中科院，共同攻克了乙烯聚合可视化的难题，首次以分子电影形式展示了表面乙烯聚合的反应过程，让这一微观反应原理具有了“眼见为实”的证据支撑。该成果于近日登上了全球顶级学术期刊《科学》杂志。当下，乙烯聚合反应用于生产聚乙烯塑料，其每年产量超过一亿吨，是全球产量最大的塑料制品原料，被广泛应用于制造薄膜、容器、纤维和管材等生活用品，但其在催化剂作用下的微观反应过程一直没有被影像捕捉到，也因此，其反应机制一直存在着学术争议。“如果能将乙烯聚合的反应过程用分子电影记录下来，那么对于解释其如何实现分子链引发将有了‘眼见为实’的证据。”中科合成油公司总经理李永旺介绍。为何这么多年始终无法用视频捕捉表面乙烯聚合的微观反应过程？李永旺告诉记者，这是由于当下的聚合反应很多催化剂的成份较为复杂，很难拍下单纯的分子链引发机制。如何找到一个成份相对单一的催化剂来进行乙烯聚合反应拍摄？中科合成油表面科学实验室周雄研究员等人敏锐地发现，有一个现成的拍摄对象。那就是利用公司目前主营业务中的费托合成技术。通过这一技术，公司实现了将液态煤转化成合成油。“费托合成也可视为聚合体系，费托合成催化剂碳化铁极有可能也能活化乙烯聚合，因而解决了乙烯聚合体系模型化的困难。”周雄表示。有了“演员”，实验室找到北京大学吴凯教授团队来做“摄影师”，利用超高空间分辨的单分子表征技术，从而得以在微观尺度上直观观察到这一经典聚合反应。研究团队综合多种实验手段和理论计算，确定了在没有引发剂存在时碳化铁表面的乙烯聚合机理。3月11日，这一成果以《表面乙烯聚合乙烯插入机制的可视化》为题发表在世界学术顶刊《科学》杂志，杂志还将其列为当期置顶论文。德国慕尼黑大学Joost Wintterlin教授撰写专文评论，认为该工作“不仅会引发学术兴趣，还可以对工业应用产生重要影响，相关过程决定了合成聚合物的物理性质和质量”。值得一提的是，该成果也是少有的以企业为第一完成单位的顶刊论文，体现了怀柔科学城鼓励产学研合作的理念。

蛋白新药的设计得益于重组DNA技术的发展。融合蛋白是指通过基因融合两个或更多蛋白质结构域来创造一个具有新功能的嵌合蛋白。每个融合体的功能通常分为一个载体结构域和一个效应结构域，前者有助于提高稳定性和药代动力学，后者具有从细胞毒性到识别和结合等不同的功能。截至2019年，已有11种Fc融合蛋白疗法被FDA批准。 生物制药的电荷变异体（电荷异质性）来自翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和脱酰胺化，须在整个生产过程中密切监测，因为它可能影响产品的安全性和有效性。全柱成像毛细管等电聚焦（icIEF）已被证明有诸多良好检测性能特征，如高分辨率、自动化、定量准确、重现性好和易用性。凭借这些优势，它已成为生物制品，特别是单克隆抗体电荷变异体表征的主流技术。 与单克隆抗体等传统生物药相比，融合蛋白的电荷异质性差异更大，这使得表征融合蛋白成为一个挑战。建立一种适用于分析多种融合蛋白的平台方法可以方便方法开发并且简化生产流程。2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术的双通道（紫外&自发荧光）表征9种融合蛋白药物的电荷异质性，其中6种蛋白为商业化蛋白。紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料。 结果表明，icIEF方法可用于重组蛋白类药物电荷异质性及等电点分析。该方法快速、准确、重复性好，为保障融合蛋白类产品生产工艺的稳定性及质量控制提供了一种可靠的平台分析方法。9种融合蛋白9种融合蛋白治疗剂（在本研究中被命名为样品1-9），其中6种已商业化，包括：样品1：安进公司的依那西普；样品2：百时美施贵宝公司的阿巴泰普；样品3：再生元公司的阿夫利贝特；样品5：重组人肿瘤坏死因子-α受体II：海正药业的IgG Fc融合蛋白；样品6：嘉宏药业的康柏西肽；样品7：百时美施贵宝的贝拉塔塞普；三个样品正处于不同临床试验阶段，包括VEGFR-Fc融合蛋白样品4，血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白样品8和胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白样品9。结果通用稳定剂SimpleSol 大多数融合蛋白在传统电聚焦凝胶电泳（IEF）分析过程中会聚集或沉淀，需要添加剂来保持稳定性。尿素已被证明可以减少蛋白质聚集，并提高IEF分析的重复性。因为本研究的目的是开发一个平台方法，所以需要确定一种能在多种融合蛋白中发挥作用的稳定剂。为此，研究人员比较了尿素和商业稳定剂SimpleSol（来自ProteinSimple）对三种不同的融合蛋白治疗剂（样品1-3）的影响。 在没有稳定剂的情况下，样品1在电泳分析过程中发生聚集，形成不可重复的峰型（图1）。在加入2M尿素的情况下，样品1的峰型重复性得到提升。然而，在有尿素的情况下，峰高明显降低，约为无尿素情况的25%。相比之下，当样品1在含50%的SimpleSol的体系下进行分析时，峰型变得可重复，而且峰高和分辨率都保持不变（图1）。因此，对于样品1，SimpleSol比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。图1 对于样品2，在没有添加稳定剂的情况下也观察到了聚集现象，导致了峰型的不可重复（图2）。与样品1不同，加入2M尿素并没有改善峰型的分离。只有当加入4M尿素时，峰型才变得可重现。然而，在这两种条件下，峰高和分辨率也都明显降低。在SimpleSol的存在下，峰高和分辨率都得到了保持（图2），再次证明SimpleSol在稳定样品方面优于尿素。对于样品2，SimpleSol同样比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。数据表明，SimpleSol可以作为一种通用的蛋白质稳定剂用于融合蛋白的icIEF分析方法。图2紫外吸收和自发荧光双通道检测 在紫外吸收检测模式下研究人员分析样品1，样品峰从嘈杂的基线中区分不明显（图3）。为了克服这一挑战，研究人员同时利用自发荧光通道检测。与紫外吸收检测相比，荧光检测的每个峰组都显示出更高的信号，并且荧光检测的基线噪音更小。图3与传统IEF方法对比 icIEF方法与平板凝胶IEF方法产生了相似的峰型（图4）。然而，icIEF方法的每个峰的分辨率均得到了改善。此外，icIEF方法的灵敏度明显高于IEF方法；在获得凝胶IEF结果时，每个泳道要上样大约20μg的蛋白质，而利用icIEF分析时，最终样品溶液进样浓度为0.225μg/μL至0.45μg/μL。每次进样量约为5μL。相当于2.25μg-4.5μg的蛋白质，极大节约了样品。图4. icIEF方法与平板IEF方法检测融合蛋白对比图总结 NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术建立并证明了用于融合蛋白电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点： 使用了通用的蛋白质稳定剂SimpleSol，可以有效避免融合蛋白发生聚集或沉淀。对于一些样品，无需任何添加剂就能获得可重复峰型，与没有稳定剂的相同蛋白质的峰型相比，添加这种稳定剂对蛋白质的峰型的不利影响很小。使得该方法可以广泛用于分析多种融合蛋白，而不需要根据不同的样品更换稳定剂。同时可通过紫外和自发荧光双通道来检测蛋白质。自发荧光检测模式利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现且无需染料，可以提高灵敏度，减少由载体两性电解质引起的背景噪音。通过icIEF分离得到的每个峰组分的峰面积百分比和表观pI值，重复性好。总共对9种融合蛋白药物进行表征，每个组分的峰面积百分比和表观PI值的定量分析都有极佳的重复性。扫描下方二维码，获取ProteinSimple融合蛋白表征解决方案参考文献：1. Wu, Gang et al. “A platform method for charge heterogeneity characterization of fusion proteins by icIEF.” Analytical biochemistry vol. 638 (2022): 114505.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com