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  • 【原创大赛】稀释液对凝血因子效价检测影响研究

    【原创大赛】稀释液对凝血因子效价检测影响研究

    [align=center][/align][align=left][b] 摘要：目的 [/b]确立不同稀释液对凝血因子效价检测的影响，研究因子效价检测的稀释方法，从而完善因子类血液制品效价检测的方法。 [b]方法 [/b]对同一批和连续生产的10批人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物样品进行全自动血凝仪法的效价检测，分别选用全自动血凝仪稀释液和含1%人血白蛋白稀释液进行检测，统计10次以上的检测结果以确定不同稀释液之间的差别。 [b]结果 [/b]本实验确定了在人凝血因子Ⅷ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ的样品进行稀释，无论是对同一批质控品的测定还是对连续批次样品的测定，检测结果之间存在较大的差别。而在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ的样品进行稀释，同一批质控品和连续批次样品检测结果之间差别较小。[b]结论 [/b]因子类血液制品效价检测时，同一样品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别，应对血凝仪是否可用于因子类血液制品进行评估，并应建立起正确的检测操作规程。[/align][b] 关键词: [/b]凝血因子； 稀释液； 效价测定 目前国内血液制品的生产是以健康人血浆为原料，经过分离纯化和病毒灭活制成，主要分为三大类，人血白蛋白、人免疫球蛋白类产品、人凝血因子类产品。国内已上市或在研的人凝血因子类产品主要有人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人纤维蛋白原、人纤维蛋白粘合剂、人凝血因子Ⅸ、人抗凝血酶Ⅲ等。人凝血因子Ⅷ主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状病人的手术治疗。人凝血酶原复合物主要有效成分为人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，主要用于治疗主要用于乙型血友病、 维生素K依赖的凝血因子缺乏症等病症的治疗。 人凝血因子Ⅸ主要用于防治乙型血友病和获得性凝血因子Ⅸ缺乏而致的出血症状病人的手术治疗。因子类血液制品是血液中凝血因子的高纯度浓缩物，在进行效价测定时需要对样品进行稀释，而稀释液中蛋白含量的不同对其检测结果有着影响。因子效价测定方法有一期法、二期法和发色底物法。一期法是目前应用最广泛的检测方法，系用人凝血因子缺乏血浆为基质，在APTT试剂和氯化钙的参与下，根据凝血因子国家标准品和供试品的凝集时间来计算供试品中的人凝血因子效价，实际检测过程中将基于一期法原理的人凝血因子效价测定法分为三种方法，即手工法、半自动血凝仪法、全自动血凝仪法。全自动血凝仪只是对一期法中各反应试剂的加入顺序进行了修订以便实现仪器的自动操作。相对于手工法检测，消除了很多主观因素。在日常工作中，当使用不同种类的稀释剂而采用相同的检测原理和方法进行效价测定应不会对测定结果产生影响，但实际工作中发现使用不同种类的稀释剂对效价测定结果有一定的影响。在人凝血因子Ⅷ效价检测过程中，采用手工法、半自动血凝仪法、全自动血凝仪法进行人凝血因子Ⅷ效价的比对试验，发现手工法、半自动血凝仪法检测结果一致，这两种方法比全自动血凝仪法的检测结果高20%以上。血液制品的原料来源于人血浆，受原料限制，一直较为稀缺，尤其是当前人凝血因子Ⅷ的生产量远远无法满足血友病患者的需求[sup][[/sup][sup]1-5[/sup][sup]][/sup]，不同检测方法间20%以上的检测差别可能影响20%的产品收率，所以建立起因子类产品效价准确的检测至关重要。[b][b]1 实验仪器与试剂1.1 仪器[/b][/b]Stago-compact全自动血凝仪（法国Diagnostica Stago公司），漩涡振荡器（美国Thermo Scientific公司）。[b][b]1.2 试剂[/b][/b]人凝血因子Ⅷ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅸ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），APTT试剂（法国Diagnostica Stago公司），Owren-Koller（稀释液）（法国Diagnostica Stago公司），0.025 mol/L氯化钙溶液（法国Diagnostica Stago公司），Desorb U（清洗液）（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），生理氯化钠溶液（石家庄四药有限公司），咪唑（天津市巴斯夫化工有限公司），氯化钠（天津市巴斯夫化工有限公司），枸橼酸钠（台山新宁制药有限公司），人血白蛋白（公司自产）。[b][b]2 方法2.1 人凝血因子Ⅷ不同稀释液稀释效价测定2.1.1 人凝血因子Ⅷ供试品Owren-Koller（稀释液）稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.1.2 人凝血因子Ⅷ供试品药典稀释液稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标同2.1.1人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ不同稀释液稀释效价测定2.2.1 人凝血酶原复合物供试品Owren-Koller（稀释液）稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《STAGO Compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2.2 人凝血酶原复合物供试品药典稀释液稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标同2.1.1。人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]3 结果3.1 人凝血因子Ⅷ不同稀释液稀释效价测定结果[/b][/b] 2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ为泰邦公司人凝血因子Ⅷ产品的质控品，取自正常生产的产品，用国家标准品标定后用作工作质控品。在进行人凝血因子Ⅷ效价测定时，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ进行再稀释。检验结果见表1，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表1 FⅧ质控品两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,586,268]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141920_02_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图1：[align=center][img=,488,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141921_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图1 FⅧ质控品两种稀释液检测结果对比[/align] 选取泰邦公司生产的连续10个批次的人凝血因子Ⅷ产品，进行人凝血因子Ⅷ效价测定，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ进行再稀释。检验结果见表2，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表2 连续10批FⅧ两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,580,273]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141921_03_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图2：[align=center][img=,499,310]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141922_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图 2 连续10批FⅧ两种稀释液检测结果对比[/align][b][b]3.2 人凝血酶原复合物不同稀释液稀释效价测定结果[/b][/b] 2015ZK0901批人凝血酶原复合物为泰邦公司人凝血酶原复合物产品的质控品，取自正常生产的产品，用国家标准品标定后用作工作质控品。在进行人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定时，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ进行再稀释。检验结果见表3，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表3 PCC质控品两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,580,269]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141923_01_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图3：[align=center][img=,548,288]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141923_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图3 PCC质控品两种稀释液检测结果对比[/align] 选取泰邦公司生产的连续10个批次的人凝血酶原复合物产品，进行人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ进行再稀释。检验结果见表4，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表4 连续10批PCC两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,573,259]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141947_01_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图4：[align=center][img=,548,327]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141947_03_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图4 连续10批PCC两种稀释液检测结果对比[/align][b][b]4 讨论[/b][/b] 本实验确定了在人凝血因子Ⅷ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ的样品进行稀释，无论是对同一批质控品的测定还是对连续批次样品的测定，检测结果之间存在较大的差别，另外对FⅧ质控品两种稀释液检测结果运用软件SPSS17.0进行均值单因素ANOVA比较，计算P值，P＜0.05表明两种方法的结果有显著性差异，含有蛋白的稀释液的检测结果明显高于不含蛋白的稀释液。而在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ的样品进行稀释，同一批质控品和连续批次样品检测结果之间差别较小，另外对PCC质控品两种稀释液检测结果运用软件SPSS17.0进行均值单因素ANOVA比较，计算P值，P＞0.05表明两种方法的结果无显著性差异。在使用全自动血凝仪进行人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物等因子类血液制品效价检测时，一般按照仪器的使用说明书和配套试剂进行稀释检测，但是忽视了血凝仪的开发目的是用于临床血浆样品的检测，而血浆与高纯度的血液制品浓缩物是不同的，用检测血浆样品的方法进行因子类血液制品的效价检测可能影响检测结果。因子类血液制品效价检测时，同一样品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别，应对血凝仪是否可用于因子类血液制品进行评估，并应建立起正确的检测操作规程。因子类血液制品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别可能跟产品本身的性质有关，因子类血液制品经过分离、纯化，去除了众多的杂质蛋白，为高纯度的浓缩物，活性较高，但蛋白质含量较低，人凝血因子Ⅷ的蛋白质含量约为0.1%，人凝血酶原复合物的蛋白质含量约为2.3%，而临床血浆样本的蛋白质含量约为5%，, 人凝血因子Ⅷ加入含1%人血白蛋白的稀释液后对FⅧ效价测定影响较大，PCC中加入含1%人血白蛋白的稀释液后对FⅨ效价测定影响较小，可能是人凝血因子Ⅷ的蛋白质含量远小于血凝仪设计用于检测的血浆样本的蛋白含量，故建立不同蛋白质浓度梯度的稀释液对因子效价进行测定，从而确认蛋白质浓度对因效价测定的影响。[b]参考文献：[/b]Cheng E, Jinzenji D, Lorthiois AP, et al. Purification of coagulation factorⅧ using chromatographic methods. Direct chromatography of plasma in anion exchange resins . Biotechnol Lett, 2010, 32(9):1207-1214.李策生, 周志军, 胡勇, 等. 人凝血因子Ⅷ中试纯化工艺的质量控制 .中国生物制品学杂志, 2013, 26(10):1508-1512.冉曙光, 刘文芳, 赵辉. 凝血因子Ⅷ浓缩物的制备及安全性和有效性 .中国输血杂志, 2008, 21(2):156-159.倪道明, 朱威. 血液制品 . 北京: 人民卫生出版社, 2013:21.王卓, 赵雄, 吕茂民, 等. 血液制品的现状与展望 . 生物工程学报, 2011, 27(5):730-746.[b] [/b]

  • 【分享】凝胶层析的知识（基本原理，凝胶类型与选择，凝胶的处理）

    基本原理凝膠過濾法（gel filtration）也稱為排阻層析（exclusion chromatography）、凝膠層析（gel chromatography）或分子篩層析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年後發展出來的技術。凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，內部具有網狀篩孔，利用球狀凝膠內的篩孔，使分子流過填充凝膠的管柱時，大分子無法進入凝膠篩孔，而只流經凝膠及管柱間的孔隙，很快就可以流出管柱，較小的分子因為進入凝膠內的篩孔，故在管柱內的停留時間較長，由此區分大小不同的分子，亦可與已知大小的分子作比較而定出一分子的分子量。一般狀況下，凝膠不會吸附成份，所有欲分離物質都會被洗出，這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。目前常用的凝膠包括3個主要類型：1. PolydextranPolydextran的商品名稱是Sephadex，它幾乎不溶於溶劑中，親水性強，能迅速在水和電解質溶液中膨脹，在鹼性的環境中十分穩定，所以可以用鹼去除凝膠上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型號，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 後面的數字為凝膠吸水量再乘以10，以G-25為例，表示1克乾燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml 。2. PolyacrylamidePolyacrylamide是一種合成凝膠，商品名Bio-Gel P，乾粉顆粒狀，在溶劑中自動溶成膠體，依膠的分離範圍不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P後面的數字乘以1000為最大過濾限度。Polyacrylamide的化學性質不活潑，但它在極端的pH 下會被水解，水解後產生的COOH-具有離子交換的性質，因此pH 值應盡量控制在2-10之間。3. Agarose商品名Separose，屬於天然凝膠，依凝膠中乾膠的百分含量，分為Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一種大孔凝膠，主要用於像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質，因其顆粒軟，在分離過程有時會阻塞管柱，造成流速減慢，又因其在攝氏50度以上會融化，故需於較低溫的環境中進行層析。Agarose 做成beads後不能再脫水乾燥，所以要在溼態中保存。凝膠和管柱的選擇凝膠的材質需為化學惰性，與分離物不能產生變性（denature）或是其它化學反應，最好具有能長期反覆使用的穩定性，並可以在較大的pH和溫度範圍內使用。由於凝膠上的離子交換基團會吸附帶電荷的物質，產生離子交換的效果，所以凝膠上最好不具有離子交換的基團。此外，凝膠要有一定的機械強度，在層析過程中才不會變形，增加機械強度也可使層析在較高壓力的環境進行，縮短分離時間。凝膠顆粒的粗細與分離效果有直接關係，顆粒細的分離效果好，但流速慢而費時，因此要依據實際的需要來選擇。對於分子量較小的物質，一般採用polydextran或polyacrylamide材質的凝膠，大分子物質則使用agarose。以Sephadex為例，Sephadex G-50可用於區分分子量1,500~30,000之分子，而Sephadex G-75 凝膠可區分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分離分子量10,000及20,000之分子，兩種都適用。如果要分離的分子大小相差很多，則可選用柱高：直徑＝5：1~15：1的管柱，且管柱體積要大於4~15倍的樣品體積；如果要分離的物質之間分子量差異不大，則要選用柱高：直徑＝20：1~100：1的管柱，且管柱體積要大於25~100倍的樣品體積。凝膠的處理 商品凝膠一般是乾燥的顆粒，使用前要先泡在欲使用的沖洗液中，使它充份膨脹，否則有引起凝膠柱破裂的危險。熱脹法是常用的前處理法，即把浸於沖洗液中的凝膠加熱，讓它膨脹並除去氣泡，溫度夠高的話（加溫至近沸騰）也可消毒殺菌。凝膠處理過程不能劇烈攪拌，如此易使顆粒破裂，影響流速。將凝膠裝入管柱的方法有很多種，實驗室常用的方法是先在柱中加入約1/3 體積的沖洗液，邊輕輕攪伴邊將凝膠懸浮液倒入其中，等到底部沉積約1~2公分的凝膠後，打開下方出口讓水流出，上面不斷加入懸浮液，等到沉積到離頂部約3~5公分處停止，讓3~5倍柱床體積的緩衝液流過層析柱。若用polydextran的凝膠，可放入有顏色的蛋白質（如cytochrome c）流過管柱，看看色帶是否均勻下降，不均勻或出現氣泡，凝膠均需倒出重新填裝。衝洗緩衝液僅需留高於柱床2 公分左右，多餘的可用滴管吸去，再將出口打開使衝洗液流到距表面1~2公釐，關閉出口，用滴管緩緩加入樣品再打開出口，樣品完全滲入凝膠內後，加入約4公分衝洗液，出口處接上收集瓶開始層析。由於polydextran 和agarose都屬於多醣類，一旦微生物生長過多，分泌的酶會水解凝膠使其性質改變，為了防止這種情況發生，凝膠最好採用真空或低溫保存，但溫度不能過低使凝膠凍結。加入抑菌劑（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等）也是常用的方法。長時間不用的凝膠可用乾燥保存法，也就是把使用過的凝膠用水除去碎顆粒和雜質，再用不同濃度的酒精，由70%、90%到95%逐步脫水，在攝氏60~80度下烘乾，不能加熱的Sepharose則用乙醚洗滌乾燥。

  • 【讨论】MTO体系不出冷凝液怎么办？

    大家好：我是做甲醇制取烯烃反应（MTO)的，由于需要将水冷凝出来，需要加冷凝器。但是我等了很久也没出现冷凝液，是不是我的空速太小了?我的空速是3h-1，加了0.1g催化剂，也就是每小时使用0.3g甲醇。这样小的量是不是接不到冷凝液啊？要是接不到，岂不是这些水都进色谱了，那不是对色谱柱子有伤害啊？还有我的甲醇量（本来应该在水相中测定的）还怎么测定啊？各位有做过MTO的高手请指教啊，谢谢

  • [转贴]凝胶层析法技术简介

    [转贴]凝胶层析法技术简介凝胶层析法技术凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。　　1. 凝胶的选择 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。　　2. 柱的直径与长度 根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。　　3. 凝胶柱的制备 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。　　凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。　　4. 加样和洗脱 凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。　　5. 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。　　如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。　　6. 凝胶层析的应用　　⑴ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。　　⑵ 用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。　　⑶ 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。⑷ 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

  • 凝胶色谱调料分析

    分离亲水气单胞菌外毒素的 功能高分子凝胶色谱填料 摘要 由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油悬 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝胶 Z S P， 并用 I R、 溶 剂吸收 实验等对合成 的 Z S P的结构进 行了确证 。以商 品葡聚糖凝 胶色谱 S e p h a d d e x — G1 0 0为对 照 ， 研究 了 ZS P 一 1 0对 中华鳖致 病的亲水气单 胞菌外毒素蛋 白的分 离性能 ， 结果 表明经 S e p h a d e x — G1 0 0和 Z S P一 1 0提纯的外毒素蛋白均保留了生物活 ( 毒) 性 ， 纯度高 。 从 S DS — P AGE分析结果 ， 可以 认为经提纯的毒素蛋 白是分 子量 为 3 2 KDa的纯品。与 S e p h a d e x — G1 0 0凝胶相 比， 聚丙 烯酰胺凝胶 色谱填料 Z S P一 1 0对 蛋 白质 的回收率更 高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好 的应 用前景 的蛋 白 质分离色谱填料。 关键词 ： 亲水气 单胞菌外毒素 聚丙烯酰胺凝胶 1 前言 在生物技术制取蛋 白质 的多级纯化过程中， 液相色谱被指定为一个必须步骤 ， 这表明操作条件温和、 又具有分子水平分离能力的液相色谱为开创现代生物大分子化学树立了一个里程碑。在液相色谱 中， 无论是哪一种层析方法 ， 分离介质 的性能都是分离效果 的首要决定 因素。目前所使用的多糖类蛋白色谱分离存在的普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等问题 。开发高效的蛋 白分离介质受到国内外学者的广泛关注。蛋白分离层析介质 的发展趋势可以认为是对以天然大分子为母体 的层析介质不断地进行合成工艺改进 ， 提高性能 ， 使老产品更新换代； 同时大力开发以合成高聚物为骨架 的具有优异性能的新一代产品。 亲水气单胞菌在 自然界尤其在水体环境中分布甚广， 属弧菌科， 能引起人和动物的多种疾病n ， 特别是水生动物暴发性传染病 ， 此病在我 国东南各地广泛流行 ， 尤 以水温较高的夏秋季为剧， 导致水生养殖鱼类大量死亡， 给渔业生产造成重大经济损失 矗 。 亲水气单胞菌在习惯上被认为是条件致病菌 ， 随着细菌本身的研究的深入 ， 这一认识正在被修正 。已有报道该菌的 O抗原、 菌毛及一些表 面的非特异性粘附因子与该菌的致病性有关“ 。 然而， 更多的报道指出致病侏能产生细胞外毒素 ， 而毒素与致病关系密切 ~ 7 。 但是关于毒素的种类和性质诸说不一 ， 未有定论。 我们用自制的凝胶色谱介质对 中华鳖致病的亲水气单胞菌素进行了分离。 2 实验部分 2 ． 1 菌种 亲水气单胞菌菌株从广东省东莞市某养殖场患病的中华鳖中分离鉴定， 取材选取濒死新 2 ． 2 细菌培养 亲水气单胞菌菌株接种合成培养基 中， 摇床培养 3 5 ℃， 1 0 0 r ／ mi n， 2 4 h。 培养物经 4_ C， 1 O 0 0 0 r ／ mi n离心 3 0 mi n ， 取上清液。 将此上清液对小 白鼠( 体重 1 8 ~2 2 g ) 腹腔进行注射( 剂量为 0 ． 4 ml ／ 只) ， 确证其生物活性 。 2 ． 3 聚丙烯酰胺凝胶色谱填料 Z S P的合成在 甲 苯 和 三 氯 甲烷 溶 剂 中加 入 少 量Twe e n 一 8 0和 1 9 ／ 6 聚乙烯醇 ， 滴加丙烯酰胺和甲又丙烯酰胺水溶液 ， 5 0 V水浴恒温 ， 滴加完毕待分散均匀后加入适量过硫酸铵， 待反应完成后 ， 撤去水浴 ， 体系 自然冷却至室温， 减压抽滤 ， 真空干燥 ， 筛选出 2 0 0 ~3 0 0目产物备用。 2 ． 4 红外分析： 采用布鲁克 EQUI NOX 5 5傅里叶变换红外光谱仪 ， 波数范 围为 4 0 0 ~4 0 0 0 c m～， 样品采用 KB r压片法进行测试。 2 ． 5 溶剂吸收实验 将干燥至恒重 的 0 ． 1 ～0 ． 2 g Z S P聚合物凝胶置于一特制的底部带有多孔玻璃砂板的试管中， 在室温下置于溶剂 ( 水) 中浸泡 2 4 h。试管用橡胶盖密封 ， 放到一离心管内， 用 2 0 0 0 ~4 0 0 0 r ／ mi n离心 1 5 mi n除去过量的溶剂 ， 将带 有溶胀剂的树脂的试管迅速转移到密闭的烧瓶中称重。溶剂吸收量用 1 g干树脂 吸收的溶剂重 量来表 示 。 2 ． 6 毒素的提纯 2 ． 6 ． 1 硫酸铵盐析 用 Na OH调节细菌培养物上清液至 p H 6 ， 再加入硫酸铵至 7 O 的饱和度 ， 4 ℃静置 4 h， 1 0 0 0 0 r ／ mi n， 4 ℃离心 3 0 mi n， 去上清液， 沉淀溶于洗脱缓冲液 中， 对相同缓冲液透析过夜 ， 将透析后的样品用 P EG2 0 0 0 0进行浓缩 ， 即为粗提毒素。 2 ． 6 ． 2 S e p h a d e x G一 1 O 0凝胶过滤 将粗提 毒素 于 4 ℃装 S e p h a d e x G1 0 0柱( P h a ma c i a产品， 1 ． 6×5 0 c m， 平均液及洗脱液均为 5 0 mmo l ／ L Tr i s — HC1 ， p H 7 ． 8 ) ， 流速为 1 2 ml ／ h， 每管收集 4 ml ， 用紫外检测仪 2 8 0 n m进 行检测， 合并生物活性部分 ， 冻干浓缩。 2 ． 6 ． 3 Z S P 一 1 0凝胶过滤 将 粗 提 毒 素 于 4 n C装 交 联 度 为 1 O 9 ／ 5 的Z S P 一 1 0 柱 ( 自制 ， 1 ． 6 ×5 0 c m， 平衡液及洗脱液 均 为 0 ． 2 mo l ／ I Na Ac — HAc ， p H5 ． O ) ， 流速为1 2 ml ／· h， 每管收集 4 ml ， 用紫外检测以 2 8 0 n m进行检测 ， 合并生物活性部分， 冻干浓缩 。 2 ． 7 SDS— PAGE采 用 La e mml i 不 连续 S DS — P AGE系统 ， 按常规方法在小型蛋白电泳仪上进行 1 0 0 V恒压电泳约 3 h。 所用分离胶浓度为 1 2 9 ／ 6 ， 浓缩胶浓度为 4 9 ／ 6 ， 用考马斯兰法染色。 2 ． 8 小 白鼠毒性试验小 白鼠体重 1 8 ～2 2 g， 每组 2只， 分别腹腔注射 0 ． 4 ml 毒素样品。 3 结果与讨论 3 ． 1 I R分析 图 1 聚丙烯酰胺凝胶填料的 I R谱图 图 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 渗 透色 谱填 料 而引起的。 3 1 8 8 c m 处的强峰是 N— H伸缩振动Z S P 一 1 0的红外谱图。3 3 9 4 c m 处宽而强的峰是 吸收峰。 2 9 3 2 c m 和 2 7 8 1 c m 处的强峰是 CH 一OH伸缩振动的谱带 ， 由样 品中残留水分存在 基团中不对称和对 称 C— H伸缩振动峰。1 4 0 0 c m～， 1 3 0 0 c m～， l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰 是 C— N伸缩振动和一 NH变形振动引起的。6 2 7 c m 处的峰是 N— H面外变形吸收峰。 3 ． 2 Z S P树脂的吸水率 图 2是 Z S P树脂吸水率一交联度曲线。 很明显， 在交联度为 5 ～2 0 的范围内树脂 的吸水率与交联度成正 比。 由此可推测， 在所合成 的聚合物中交联点的分布是 比较均匀的。 O0 5 ．o o％ I o． 00 ％ l 5 ． O0 ％ 2 0． o( 2 5 |t ) 儡 空娃度 图 2 Z S P树脂吸水率一 交联度 曲线 3 ． 3 毒素的纯化 粗提毒素经 S e p h a d e x- -Gl O 0凝胶色谱柱 纯化后 回收率为 1 8 ． 8 3 ， 经交联度为 1 0 的聚 丙 烯 酰 胺 Z S P 一 1 0柱 纯 化 后 回 收 率 为 6 8 ． 0 5 ， 洗脱液蛋峰分别为图 3和图 4 。 毒素的 S e p h a d e x — G 1 0 0层析 3 ． 4 SDS— PAGE 经 S e p h a d e x—G 1 0 0和聚丙 烯酰胺 Z S P一 1 0柱纯化后的毒素进行 S DS — P AGE， 考马斯兰 图 5 S e p h a d e x纯化 S DS — P AGE 行 M： 分子量标准 ， 行 A： 粗提毒素 ． 行 B： 提纯毒素 1 0天左右即会滋生霉菌， 不能再重复使用。而 Z S P 一 1 0 在 同样的条件下可保存半年。 提纯毒素 经浓缩后注射小 白鼠， 2 4 h后小 白鼠死 亡， 可 以认为两种凝胶色谱柱均保留了外毒素蛋白质 的生物 活性 。 图 6 ZS P 一 1 0纯化 S DS — PAGE 行 M： 分子量标准， 行 A； 粗提毒素 ， 行 B ： 提纯毒素 结论 1

  • 【转帖】压缩空气冷凝液污染问题的介绍

    一、 背景资料 中国水资源现状不容乐观！ 中国是一个干旱缺水严重的国家。淡水资源总量为28000亿立方米，占全球水资源的6%，仅次于巴西、俄罗斯和加拿大，居世界第四位；但人均只有2200立方米，仅为世界平均水平的1／4、美国的1／5，在世界上名列121位，是全球13个人均水资源最贫乏的国家之一。水资源贫乏只是问题的一个方面，水污染状况更是令人触目惊心！ 据监测，目前全国多数城市地下水受到一定程度的点状和面状污染，且有逐年加重的趋势。日趋严重的水污染不仅降低了水体的使用功能，进一步加剧了水资源短缺的矛盾，对中国正在实施的可持续发展战略带来了严重影响，而且还严重威胁到城市居民的饮水安全和人民群众的健康。 二、不易察觉污染源压缩空气冷凝液 压缩空气冷凝液是一种不易察觉的污染源，空压机系统产生的冷凝液的污染物成分主要是碳残油和固体杂质（管道腐蚀或者空气污染杂质）。 在中国，除极少量空气压缩机采用无油润滑以外，绝大部分采用油润滑模式。在油润滑系统中中，压缩空气与润滑油直接相互接触，进入压缩空气，通常气油混合物和水是通过压缩机中三级过滤系统而分离，残油和冷凝液排放出空压系统。以40HP的螺杆压缩机每年运行6000小时为例，空压系统每年残油量排放量约3.59 gallons/year，而全国数以万计的空压机所排放的冷凝液污染物数量是惊人的，若不经处理直接排放将造成的极大污染。 三、残油的污染危害及排放要求 1升含油冷凝液能造成多大污染? 能够污染 1.000.000 升 (!) 地面水 意味着:一个三口之家生活适用14年！ 德国关于废水排放的要求：  间接排放工业废水需要许可证  含油冷凝液必须进行处理  无油冷凝液会低于排放标准, 如：  使用无油润滑空压机生产压缩空气  使用不含矿物油的润滑剂  需要权威部分授权  满足所在区域的排放标准 在欧洲，含油冷凝液属于必须按照废物处理目录 (EuropeanWasteCode 130802)进行无害化处理的污染物。由授权的废物处理公司回收后进行统一处理．  使用经过许可的收集罐  必须使用内部经过处理的石制管道 就地进行处理  根据“通用技术程序”使污染物的含量降至最低  有害物质，如：油，重金属和腐蚀性物质，必须采用先进技术进行处理，决不允许简单稀释  排放标准适用于全国各个地区 　　如：碳氢化合物的含量须低于 20 mg/l.  未经授权排放有害污染物将被追究刑事责任! 三、处理方法 压缩空气含油冷凝液的处理方法大致分为两种： 1、重力/吸附分离：即依靠重力将大油滴从水中分离出来，再利用特殊吸附滤芯吸附残油，此种方式简单易行，维护量低，无须电源，但只能处理非乳化状态的冷凝液，不能分离稳定状态的乳化液。 2、破乳剂分离：即使用破乳剂分离，性能可靠，原理简单，适合于压缩空气系统中乳化状态的冷凝液处理。 在欧、美、日本等发达国家的空压系统油水分离器是空压系统必备设置，根据不同的空气排量使用不同分离能力的油水分离器或乳化液分离站。中国政府的环保部门已经开始规范压缩空气系统中含油冷凝液的排放，同时从2007年开始大幅提高污水处理费用，引导企业控制和减少污水排放。 同时，根据ISO14000环境管理体系的要求，污染物必须在产生地及时、就地处理，防止其与其它污染物混合后再处理。在中国，越来越多的工业企业已经意识到含油冷凝液的危害性，并自觉加入到对含有冷凝液进行净化处理的行列中，承担起了更多的社会责任。

  • 【分享】凝胶层析法测定蛋白质分子量

    一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见“理论部分的凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。凝胶层析分离原理示意动画。对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。有关凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积（V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的参见示意图。凝胶层析柱中的几种层析峰。有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子量范围内，Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系：Kav ＝－b logMw + C --------- (2)其中 b,C为常数。同样可以得到：Ve ＝－b'logMw + C' --------- (3)其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。三、器材与试剂（一）器材1. 玻璃层析柱（(20mm×60cm）2. 恒流泵（或下口恒压贮液瓶）3. 自动部分收集器4. 紫外分光光度计5. 100ml试剂瓶6. 1000ml量筒7. 250ml烧杯8. 50ml、100ml烧杯9. 10ml（或5ml）刻度试管（二）试剂1. 标准蛋白（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）（2）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司）（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司）（4）溶菌酶：Mw =14,3002. 未知蛋白质样品：由实验室准备3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脱液1000ml）4. 蓝色葡聚糖－2000

  • 聚丙烯腈溶液中凝胶含量的测试

    溶液聚合过程中，会生成一定量的聚合物凝胶，为考察工艺和设备对聚合物溶液中凝胶量的影响，需要对其含量进行测试，是否有相应的仪器和标准，请大家提供，谢谢！

  • 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质

    （一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。（5）1.5cm×20cm层析柱。（6）黑、白比色磁盘。

  • 冷凝液泄漏

    最近发现贝克曼的毛细管电泳仪冷凝液有点泄漏。连续用了十天，冷凝液的浮标从两根线中间降到与下线切齐。降的不算多，但是中间没有更换卡盒，也没有发现明显泄漏的地方。这种损耗是正常的吗？我记得刚开始用这台仪器的时候很久都不用补冷凝液的。有没有发生相同情况的。

  • 业内首次1D凝胶分析软件免费啦！

    业内首次1D凝胶分析软件免费啦！

    近期，北京赛智创业科技有限公司将自主研发的Lane1D™凝胶分析软件免费对外开放，可登陆官方网站www.sagecreation.com.cn自行下载。这是世界上首次凝胶分析软件完全免费开放，无需加密狗，无需绞尽脑汁破译，赛智免费为您提供最专业的凝胶分析软件！ 北京赛智创业科技有限公司是专业从事生命科学仪器和软件的研发、生产、销售于一体的高科技企业。主要经营产品为凝胶成像仪、化学发光成像仪等生命科学仪器，同时也大力研发相应的拍摄和分析软件。 Lane 1D™凝胶分析软件是专为凝胶、化学发光（WB）、PCR密度、菌落/克隆计数、斑点杂交等实验所研发的数据分析软件。该软件具有泳道分析、斑点分析、密度分析及菌落计数等功能，为您实验的后期数据处理提供专业的服务。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411121403_522703_2921337_3.jpg更多行业资讯请关注北京赛智官方微信平台：http://weibo.com/bjsage/公众号：bjsagehttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411121404_522704_2921337_3.jpg

  • 凝胶液相的溶剂选择

    丙烯酸酯类共聚物（超高分子量）用凝胶色谱仪测量应该选择什么样的溶剂，什么样的浓度？用氯仿和THF效果都不是很好，溶液澄清但是用一次性样品过滤器比较难过滤，而且手动进样进样针很难排出气泡！

  • 喜炎平,脉络宁注射液问题。

    喜炎平脉络宁注射液引起严重过敏2012年06月27日08:47新华网国家食品药品监督管理局26日发布通报，提示生产企业和医患人员关注喜炎平注射液和脉络宁注射液引起严重过敏反应的问题。据了解，喜炎平注射液的成分是穿心莲内酯磺化物，主要用于解热消炎。2011年，国家药品不良反应监测中心病例报告数据库有关喜炎平注射液的病例报告数共计1476例，其中涉及14岁以下儿童报告达1048例。主要不良反应表现为过敏样反应、过敏性休克、紫绀、呼吸困难等。脉络宁注射液是2009版国家基本药目录品种，其功能与主治为清热养阴、活血化瘀。用于血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症、静脉血栓形成等。2011年，国家药品不良反应监测中心病例报告数据库共收到有关脉络宁注射液药品不良反应病例报告1500例，其中严重病例报告189例。严重不良反应主要为呼吸系统损害、全身性损害和心血管系统损害等。国家食品药品监管局建议，由于这两种注射液易发生过敏反应，建议医护人员在用药前详细询问患者的过敏史，特殊人群和过敏体质者应慎重使用。使用时应严格按照说明书规定的用法用量给药，不得超剂量使用；谨慎联合用药。如确需联合使用其他药品时，应谨慎考虑与此两种药品的间隔时间以及药物相互作用等问题。对于药品生产企业，国家食品药品监管局建议，加强临床合理用药的宣传，确保产品的安全性信息及时传达给患者和医生；完善生产工艺、提高产品质量标准，开展相应安全性研究。(新华网)

  • 【分享】絮凝剂溶液的配制

    1、防止絮凝剂大分子降解现代的聚丙烯酰胺产品的分子量很高，这是它具有良好絮凝性能的基础。但是这种絮凝剂的大分子容易受到外界因素的影响而破坏，使它的性能大大下降。絮凝剂的配制和使用过程必须认真防止出现这个问题。絮凝剂在不良条件下发生的导致絮凝性能下降的变化，通称为降解作用(degradation)，具体表现为分子量下降、溶液粘度降低、絮凝性能变差甚至失效。可能产生这种作用的因素很多。就此而言，高分子量的PAM是相当“娇气”的物质。而且，PAM的分子量越高，越容易产生这些变化，对有关的因素就越敏感。必须十分重视这个问题，否则再好的絮凝剂也不能取得良好效果。导致PAM溶液粘度和絮凝效能降低的主要因素有：1、机械的作用：高速搅拌或在溶液中施加强烈的机械剪切，都会使大分子断裂。如将PAM溶液在离心泵内搅几秒钟，其分子量下降达75%。如用高速搅拌溶解或高速设备输送，都会明显降低它的分子量和絮凝性能。2、铁锈和铁化合物：在PAM溶液中加入很微量(如2mg/L)的铁化合物(如FeCl3)，或微量的铁锈粉末，轻微搅拌使之分散，PAM溶液的粘度和絮凝性能便大幅度降低。将PAM溶液置于生锈的铁器中，４小时后粘度下降78%，絮凝效能大大降低。3、高温的作用：PAM大分子对高温很敏感，如0.1%的PAM溶液在80℃下放４小时，分子量由2100万降至760万，在50℃下放置亦降至1690万；分子量为1050万的PAM，在80℃下放置４小时后分子量降到330万。如在30℃下，分子量下降很慢。若PAM原来的分子量很低，如370万，则受热的降解很少。4、并存杂质的影响：PAM溶液中如有悬浮杂质会降低它的粘度。无机离子特别是高价离子也有很大影响。如一种PAM溶液的粘度为191厘泊，加入含Na+100mg/L的NaCl后，溶液粘度降至140，而加入含Ca2+100mg/L的CaCl2后，粘度降至30厘泊。5、其他：紫外线照射会使PAM迅速降解，强烈照射４小时可使PAM的分子量由1800万下降到1000万，溶液中存有氧化剂亦加速降解。PAM的降解属于通过游离基的链式反应(free radical chain reaction)，凡是能引发产生游离基的因素都会加速PAM的降解。氧和铁的反应能生成游离基，紫外线也是这样，都要注意避免。PAM溶液的性能下降，部分是由于大分子形态的变化：由线形伸张的长链状变为收缩卷曲的球状。PAM分子中含有大量的负电基，它们互相排斥而使大分子呈伸展状态，分子较长并充分露出活性基团，善于起架桥联结作用，絮凝性能较好。但是如果 PAM 溶液中存有较多阳离子，它们在大分子负电基的周围形成双电层，就会减弱负电基之间的相斥力，使PAM大分子转变成卷曲状态。离子浓度越高，这种影响越大。双价离子如Ca2+不但较强烈地被负电基吸附，而且可能使两个负电基桥联起来，更增强了大分子的卷缩。这既造成了溶液粘度下降(球状大分子的溶液粘度比线状分子低很多)，而且也降低了PAM分子中羧基的有效活性，使絮凝性能明显下降。

  • 凝胶成像分析系统

    凝胶成像分析系统

    凝胶成像分析系统用途j用于对各种电泳凝胶图像的采集、保存和分析；基本功能140万像素CCD，电动变焦，智能化分析暗箱，具有开门断紫外线，自动延时关断，变焦镜头保护，RS232接口，触摸软键，可通过鼠标实现CCD设置和变焦镜头调整的遥控功能；配备中文界面图像软件，确保对图像的“观察，拍摄，分析”过程一气呵成，同时兼容tif,jpg,bmp,gif等图像格式；具有开门防护，延时关断，漏电保护等功能；具有“自动曝光、自动白平衡”性能，其方便性远远优于数码相机，以及模拟CCD；具有强制激发紫外透射光的功能；拍摄范围：4.5-6（cm）~20-20(cm)；图像观察：支持TWAIN接口，达到“实时浏览”的效果，可全屏显示，通过鼠标设置CCD关于图片亮度、黑白对比度、∮值等参数，也可以通过鼠标激活变焦镜头驱动串口，获得对观察谱带的放大，缩小，变焦等操作；图像处理：具有添加文字，箭头，图形注释，旋转，缩放，亮度，弧度，对比度的自动、手动调整及图片颜色的调整，负向及3D模拟显示等；图像分析：配合使用凝胶分析软件，可获得诸如泳道，条带的自动，手动识别，谱带分子量，灰度值，样品量，百分比浓度，迁移率等自动计算结果；主要特点ABS模具外壳，流线型设计，大方美观；进口低照度高分辨率数字CCD，便于捕捉弱带，实时浏览，全屏显示，操作简单；配有进口6倍变焦镜头，光圈F1.2~16，遥控电动变焦智能控制，便于凝胶的缩放观察；采用多层镀膜滤光镜组，有效滤除背景干扰噪声；超薄（透射）磷屏转换板和反射白光板；抽屉式操作台，便于对凝胶的各种操作（配备专用剥胶装置）配有品牌计算机和打印机基本参数紫外光源：透射波长：302nm反射波长：254nm、365nm、透射面积：250*210mm外形尺寸及重量外形尺寸（L*W*H）：47*38*81cm重量：26.3kghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/04/201204181016_361982_2470658_3.jpg

  • 凝胶液相的溶剂选择

    丙烯酸酯类共聚物（超高分子量）用凝胶色谱仪测量应该选择什么样的溶剂，什么样的浓度？用氯仿和THF效果都不是很好，溶液澄清但是用一次性样品过滤器比较难过滤，而且手动进样进样针很难排出气泡！

  • 【分享】分子筛凝胶层析法的工作原理

    【分享】分子筛凝胶层析法的工作原理

    在一定的温度下，同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时．该物质在这两种介质中的浓度比是一常数．称分配系数。不同化学物质的分配系数不同。层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法。其两种介质，一为固定不动，称固定相，另一为可相对流动，称流动相。 层析法已广泛应用在生物化学领域中，无论是少量分析还是大量制备，都能体现出它的高效性，简便性等特点。在实脸室中的常用层析法有：凝胶过滤，纸层析．薄层层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析等。 以下介绍几种常用的层析法凝胶过滤 凝胶过滤的别名很多，如凝皎扩散层析，分子筛层析，排阻层析等。这种技术具有操作简便，回收率高(近100％)，条件缓和等特点，但它的分离操作速度较慢。该法常用于蛋白质，多糖，核酸的分离纯化。 凝胶过滤的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为VA，它包括填料的骨架体积VGM。，填料的孔体积Vi(内水体积)及填料颗粒间的体积VO(外水体积)。分布在填料的孔中的溶剂是固定相，分布的填料颗粒间的溶剂是流动相。填料颗粒含有许多不同大小的孔．如果待分离的物质分子大小合适，则可以不同程度地向孔中扩散，大分子物质只能占有较少的大孔，小分子则能占有大孔及另外一些小孔。所以当不同分子量物质的混合物流经凝胶柱时，较小的分子在柱中停留的时间比大分于停留的时间长，于是混合物中各组分即按分于大小分开，最先流出的是最大的分子。示意图如下所示，http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171831_251966_1638724_3.jpg用于生物材料分离的凝胶主要有交联葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex)，聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio—Gel)，琼脂糖凝胶(商品名Sepharose)等。如常用的交联葡聚糖是将葡聚糖(Dextran)悬浮于有机溶剂，加入交联剂表氯醇交联聚合而成多糖链的三维结构，这种聚合物为白色珠状微粒，是多孔性网状结构，凝胶的孔径大小与交联剂的量有关，交联剂多则交联度大，网状结构紧密，孔径小，反之交联剂少则孔径大。 将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。首先将样品小心自柱顶端加入，洗脱，以分步收集器收集洗脱液，测定每管物质浓度，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵坐标即得如下的洗脱曲线：由图可见最先流出的物质是，A，它的分子量最大，大于该种凝胶的排阻限(A物质分子的直径大于凝胶的孔径)，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，与外水体积VO相等。最后流出的物质是C，它的分子量最小，小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫“全渗入”。流经体积是外水体积VO与内水体积Vi的和。而物质B的分子量介于排阻限与渗入限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中，不能全部地不受限制的通过，这叫做“部分排阻”或“部分渗入”。它的流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即 Ve=VO+KdVi式中Kd称作“排阻系数”或“分配系数”。它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。Kd=(Ve-VO)／Vi当Kd=1时，Ve=VO+Vi为全渗入。当Kd=0时，Ve=VO为全排阻。当0t，则说明该物质分子与凝胶有吸附作用。这三种物质的分离过程可见示意图如下：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171832_251967_1638724_3.jpgVi也可通过计算求出：Vi=aWra=凝胶千重Wi=每克干凝胶吸水毫升数Vt=Vo+Vi+VgVg=凝胶骨架体积Vt=可通过测定层析柱内径及高度计算得出：Vt=1／4D2h下表为交联葡聚糖凝胶的种类和规格：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171832_251968_1638724_3.jpg

  • 【分享】凝胶过滤层析如何操作

    [b]1.凝胶的预处理[/b] 交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。表 凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量[table][tr][td=3,1,236]层析柱规格[/td][td=4,1,285]凝胶的规格和用量（g）[/td][/tr][tr][td=1,1,70]直径（cm）[/td][td=1,1,70]高（cm）[/td][td=1,1,97]容量（ml）[/td][td=1,1,52]G[sub]25[/sub][/td][td=1,1,78]G[sub]50[/sub][/td][td=1,1,78]G[sub]100[/sub][/td][td=1,1,77]G[sub]200[/sub][/td][/tr][tr][td=1,1,70]0.9[/td][td=1,1,70]15[/td][td=1,1,97]9.5[/td][td=1,1,52]2.5[/td][td=1,1,78]1[/td][td=1,1,78]0.6[/td][td=1,1,77]0.3[/td][/tr][tr][td=1,1,70]0.9[/td][td=1,1,70]30[/td][td=1,1,97]19[/td][td=1,1,52]5[/td][td=1,1,78]2[/td][td=1,1,78]1.2[/td][td=1,1,77]0.6[/td][/tr][tr][td=1,1,70]0.9[/td][td=1,1,70]60[/td][td=1,1,97]38[/td][td=1,1,52]10[/td][td=1,1,78]4[/td][td=1,1,78]2.5[/td][td=1,1,77]1.2[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]20[/td][td=1,1,97]40[/td][td=1,1,52]10[/td][td=1,1,78]4[/td][td=1,1,78]2.5[/td][td=1,1,77]1.2[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]40[/td][td=1,1,97]80[/td][td=1,1,52]20[/td][td=1,1,78]8[/td][td=1,1,78]5.0[/td][td=1,1,77]2.4[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]70[/td][td=1,1,97]140[/td][td=1,1,52]35[/td][td=1,1,78]14[/td][td=1,1,78]9.0[/td][td=1,1,77]4.4[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]100[/td][td=1,1,97]200[/td][td=1,1,52]50[/td][td=1,1,78]20[/td][td=1,1,78]12.5[/td][td=1,1,77]6[/td][/tr][tr][td=1,1,70]2.6[/td][td=1,1,70]40[/td][td=1,1,97]210[/td][td=1,1,52]50[/td][td=1,1,78]20[/td][td=1,1,78]12[/td][td=1,1,77]7[/td][/tr][tr][td=1,1,70]2.6[/td][td=1,1,70]70[/td][td=1,1,97]370[/td][td=1,1,52]90[/td][td=1,1,78]35[/td][td=1,1,78]20[/td][td=1,1,77]12[/td][/tr][tr][td=1,1,70]2.6[/td][td=1,1,70]100[/td][td=1,1,97]530[/td][td=1,1,52]130[/td][td=1,1,78]50[/td][td=1,1,78]30[/td][td=1,1,77]17[/td][/tr][/table][b]2.装柱[/b] 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。 凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。

  • 【分享】实验一 葡聚糖凝胶层析脱盐

    实验七 葡聚糖凝胶层析脱盐一. 目的学习凝胶层析的工作原理和操作方法掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术二. 原理凝胶层析又称凝胶过滤或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。1. 层析介质的特点（1）遇水为不溶解的固相；（2）是化学惰性物质；（3）离子基团含量少；（4）颗粒大小和网眼均匀；（5）机械强度较强；（6）具有可选择的多种孔径。目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及其衍生物。尤其葡聚糖凝胶（商品名称Sephadex）是最常用的层析介质。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷（ ）交联成的具有三维结构不溶于水的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。当葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定（参见附录五）。2. 分离原理当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析柱的出口处，我们用多个试管分步收集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25（或G-15、G-50），用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。三. 实验材料及设备1. 材料含硫酸铵盐的蛋白质溶液（参见附注３）2. 器材层 析 柱：内径×柱高=1.0cm×25cm滴定台架、螺丝夹：各1刻度试管：10mL×14移 液 管：1mL×1烧 杯：250mL×1 50mL×1滴 管：2洗 耳 球：2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 葡聚糖凝胶Ｇ-25(或G-15、G-50)溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复3～4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。2. BaCl2溶液（1%）3. 考马斯亮蓝G-250称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。4. 脲（6mol/L）5. 洗脱剂应依据被纯化的蛋白质的不同特性而选用不同的缓冲液。五. 操作步骤1. 层析柱的准备(1) 清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。（若玻璃柱较脏，应卸去塑料装置，先入洗液中浸泡2小时。）(2) 安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。(3) 排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分离结果，排气完毕，保留柱内1～2cm高水位，关紧螺旋夹。(4) 标记高度：在距顶端8～10cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（15～17cm）的依据。2. 装柱每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆25～30mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:1即可，否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。3. 平衡取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度≥15cm为宜。4. 准备收集取6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），1～6编号，并在试管2mL处作一标记，插入试管架上，为收集洗脱样品作好准备。5. 上样与收集打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入3～5cm高的洗脱剂。6. 洗脱不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6号管达2mL时，关闭出口。7. 鉴定另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二，即每管1mL，依次在试管架上排成二排。第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第6号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够，需增加7号、8号……试管继续洗脱与收集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。管 号项 目1234567891011白色沉淀量蓝色深浅8. 再生鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。六. 结果处理1. 根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横坐标，颜色深浅程度为纵坐标，绘制二条（蛋白质及(NH4)2SO4）洗脱曲线。2. 分析混合样品分离效果。七. 思考题1. 利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？附注1. 凝胶的再生通常层析柱经洗脱剂再生、平衡后，就可反复使用。但使用过多次后凝胶床体积变小，流速降低，凝胶污染杂质过多，甚至变色，需经再生后才可使用。再生方法有多种：如（1）用水进行逆向冲洗，再用洗脱剂平衡，便可重新使用。又如（2）把凝胶倒出，用6mol/L脲浸泡凝胶半小时，抽滤，再用水漂洗数次，除净脲，必要时重复上述操作即可重新使用。2. 凝胶的保存(1) 湿法保存，可保存几个月至一年，有多种方法： 加入防腐剂硫柳汞，使其浓度为0.005%，下次使用前，水洗除去硫柳汞。 加入几滴氯仿，摇匀存放。下次使用前用热水浴除去氯仿。（沸点60℃）。 凝胶保存在60～70%乙醇溶液中，即凝胶以部分收缩状态保存。(2) 干法保存此法操作不及湿法简便，但处理得好，凝胶存放时间长。先抽取过量水分，再向凝胶逐步加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使凝胶逐步脱水，最后加入95%乙醇，凝胶脱手收缩。抽干，铺与搪瓷盆中，60～80℃经常翻动烘烤。若有结块，在下次膨胀时会散开的，不可用力敲碎，否则会破坏颗粒结构。3. 用盐析法分离提取麦清蛋白取10g小麦种子，粉碎。转入250mL具塞磨口锥形瓶中。加100mL蒸馏水，在康氏震荡器上震荡1小时。静置半小时，上清液以3000转/分钟离心15分钟。将上清液在布氏漏斗上（铺3～4层滤纸）抽滤。滤液应透明。用醋酸酸化滤液至pH4.7。加等体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅动，即有白色絮状沉淀生成。置冰箱过夜，使麦清蛋白全部盐析沉淀出来，以3000转/分钟离心20分钟，弃去上清夜，加10mL无离子水使沉淀溶解，即得麦清蛋白和硫酸铵的混合液。

  • 氨氮分析絮凝沉淀后的空白好像高了点，什么原因？

    刚接触氨氮分析，还望多多指点。纯水空白吸光度大约在0.013—0.020之间，多次用纯水絮凝沉淀后测定吸光度0.080—0.1之间。絮凝沉淀时候加1ml硫酸锌，四滴氢氧化钠，充分静置后取上清液分析，离心后也一样高。最可能的原因是：硫酸锌？氢氧化钠？pH？

  • 【求助】问个小白问题：用凝胶层析只做分离不做测定，也需要专门的色谱柱吗？

    我要测土壤中的抗生素含量，目前计划流程是这样的：提取——HLB固相萃取——凝胶层析——LC/MS/MS检测因为腐植酸会对色谱影响很大，所以有人建议我用分子排阻滤掉大分子，但是我能查到的资料都是用凝胶色谱测定大分子的，想知道如果我只是要层析分离不用测定，是不是也要用专门的凝胶色谱柱？还是买了填料自己做个层析柱就可以？自己做的话怎么控制洗脱时间？从来没接触过凝胶，还请大大们指点！

  • 凝胶消毒液中乙醇的测定

    [align=right][b]SGLC-GC-054[/b][/align][b]摘要：[/b]本文建立了凝胶消毒液中乙醇的GC测定方法。参照国标GB/T 26373-2020色谱条件并进行优化，采用色谱柱SH-FameWax分析乙醇，乙醇峰形良好，理论塔板数82094，满足检测要求。此方法可为凝胶消毒液中乙醇的含量测定提供参考。[b]关键词：[/b]乙醇 SH-FameWax GC[b]1. 实验部分1.1 实验仪器及耗材[/b]Shimadzu GC-2030[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱仪[/color][/url]；色谱柱：SH-FameWax（30 m，0.32 mm × 0.25 μm；P/N：R227-36270-01）；SHIMSEN Arc Disc HPTFE针式过滤器（P/N：380-00341-05）；[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]GC-MS[/color][/url]认证样品瓶LabTotal Vial（P/N：227-34002-01）；SHIMSEN Pipet[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url]：SHIMSEN Pipet PMII-10（P/N：380-00751-02）；SHIMSEN Pipet PMII-100（P/N：380-00751-04）；SHIMSEN Pipet PMII-1000（P/N：380-00751-06）。[b]1.2 标准工作溶液的制备[/b]客户提供。[b]1.3 分析条件[/b]色谱柱：SH-FameWax（30 m，0.32 mm × 0.25 μm；P/N：R227-36270-01）升温程序：初始温度35 ℃，保持2分钟，以每分钟5 ℃的速率升温至60 ℃，保持5分钟载气：N2进样口温度：230 ℃分流模式：分流； 分流比：30：1控制模式：恒线速度模式柱流量：1 mL/min检测器：FID，温度：230 ℃进样量：0.2μL[b]2. 实验结果[/b]按照上述色谱条件（1.3）进行采集，标准溶液色谱图如下：[b]供试品溶液[/b][img=SHIMSEN Styra HLB]https://img.shimadzumall.com/Storage//userfiles/images/Img_articles/SGLC-GC-054_01.png[/img][font=arial, &][size=12px][/size][/font][b]重现性[/b]重现性[img=SHIMSEN Styra HLB]https://img.shimadzumall.com/Storage//userfiles/images/Img_articles/SGLC-GC-054_02.png[/img][font=arial, &][size=12px][/size][/font][b]3. 结论[/b]本文建立了凝胶消毒液中乙醇的GC测定方法。参照国标GB/T 26373-2020色谱条件并进行优化，采用色谱柱SH-FameWax分析乙醇，乙醇峰形良好，理论塔板数82094，满足检测要求。此方法可为凝胶消毒液中乙醇的含量测定提供参考

  • DYE-2000型混凝土压力试验机

    主要结构DYE-2000型混凝土压力试验机主要由主机、液压系统和测力单元等组成。1、 主机主要由上梁、立柱、调节丝杠及手轮、承压板、油缸和活塞等组成。丝杠末端与上压板间装有活动球座，操作时当上压板底面与试件顶面接触后，能自动适应试件高度方向的细微倾斜度，使两平面互相接触全面，从而使度件受力均匀。根据试件大小，可转动手轮和丝杠，以适当调节试验空间。下压板顶面上刻有定位线框，便于将试件放置在中心位置。2、 液压系统由液压泵、送油阀、回油阀、油箱、滤油器及油管等组成。液压泵为轴向五柱塞超高压泵，由电动机直联驱动，送油阀上设有安全阀，过载是可溢流，起安全作用。操纵送油阀手轮，可调节油缸进油量，以达所需加荷速率。打开回油阀，可使油缸内和油泵来的油全部流回油箱。3、 测力单元主要包括测控系统、打印机和压力传感器等。(详见所附《RFP-03智能测力仪使用说明书》4、 电气系统由电动机、启动按钮、停止按钮、交流接触器、熔断器等组成。使用方法　1 操作者必须熟悉DYE-2000型混凝土压力试验机机床操作顺序和性能，严禁超性能使用设备。2 操作者必须经过培训、考试或考核合格后，持证上岗。 　　3 开机前，按设备润滑图表注油，检查油路是否畅通。开启气阀调节系统压力、润滑压力、平衡缸压力，调节油雾装置。 　　4 检查变速箱油标油位，启动主电机空转5分钟后，寸动滑块至下死点，调节滑块高度，锁紧球头丝杆锁紧机构。 　　5 关闭机床电控总开关，关闭电控柜空气开关。 　　6 清洁机床，按设备润滑图表注油润滑混凝土压力机,水泥压力试验机，压力试验机：混凝土压力机主要用于测试混凝土、水泥、高强度砖、耐火材料等建筑材料试块的抗压强度,也可用于其他非金属材料的抗压强度的试验。混凝土压力试验机的横梁可以通过两个很长行程的提升装置进行调整，并且带有可靠的夹紧系统将横梁固定在高刚度的镀铬立柱上，这个设计可以使得可以进行快速、简便以及精确的横梁定位，在测试一些不同高度的试样的时候具有很好的优势。加载架具有很高的轴向和侧向刚度，经过精确调整，可以用于高级的建材测试。混凝土压力机,水泥压力试验机，压力试验机：混凝土试验机采用非常高刚度的四柱式结构加载架，单加载头设计，上下压力板都带有注油式球座装置。立柱经过镀铬处理，液压活塞经过硬化处理并且具有很高的表面加工精度以保证压力试验机的最高性能。弯折测试架上采用双向作动器，提供快速的控制方式并且可以用来测试高强混凝土。混凝土压力试验机采用非常高刚度的四柱式结构加载架，单加载头设计，上下压力板都带有注油式球座装置。加载立柱经过镀铬处理，液压活塞经过硬化处理并且具有很高的表面加工精度以保证试验机的最高性能。试验机经过精确调整，可以连接到带有低噪音液压源组的落地式控制器，或者式连接到其他的带有液压源的其他测量系统。

  • 凝胶层析柱怎么装啊？

    本人现在要做塑化剂，但没有GPC纯化系统，买了bio beads(s-x3)凝胶想自己装，该怎么装呢？装好后怎么活化啊？各位请帮帮忙，多谢了！此外，上样后的洗脱液要全部收集吗？单用正已烷洗脱行不？标准是收集5.5-16.5min的流出液的呀！

  • 液态奶的凝固实验

    液态奶的凝固实验

    原料奶凝固实验实验原理发酵原理是乳酸菌利用原料乳中乳糖作为其生长与增殖的能量来源。在乳酸菌增殖的过程中，其中的各种酶将乳糖转化成乳酸；乳酸的形成使乳清蛋白和酪蛋白复合体因其中的磷酸钙和柠檬酸钙的逐渐溶解而变得越来越不稳定，当体系内的PH值达到酪蛋白的等电点时，酪蛋白胶粒开始聚集沉淀，逐渐形成一种蛋白质网络立体结构，这种变化使原料乳变成了半固体状态的凝胶体；而抗生素对乳酸菌是有抑制作用的，若抗生素残留的数量超出乳酸菌所能抵抗的范围，乳酸菌则不能利用原料乳中的乳糖生长、增殖，所以利用凝固试验的方法来判定原料乳中的抗生素残留。操作方法将60ml原料奶倒入烧杯中煮沸，冷却至45℃，根据菌种活力确定菌种添加量，添加范围3%-5.1%，在温度43℃±2℃的恒温箱培养3.5～4h，最后观察结果。同时进行酸度检测，标准为60-80 T为合格范围，如有异常，结合凝固状态进行判定等级。判定结果如下：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408261957_511741_2227357_3.png样成型好且无乳清析出，组织细腻，小样有酸奶香味结果为A样嫩或有少量乳清析出结果为B样为成型或有大量乳清析出结果为Chttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408261957_511742_2227357_3.png样未凝结果为D当然等级的划分每个实验室的标准都是不一样的

  • 【资料】液凝胶上样缓冲液的配制

    液凝胶上样缓冲液的配制 [img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=51418]液凝胶上样缓冲液的配制 [/url]

  • 贝克曼MDQ冷凝液系统检查

    实验室最近用CE冷凝液消耗的非常快，不知道是操作的问题还是系统的问题，加了冷凝液以后可以正常使用没有问题，但是过几天有需要添加冷凝液。请问对硬件有了解的大大们，我想要检查冷凝液系统是否有问题，应该怎么做？

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