人血白蛋白制剂

仪器信息网讯 8月8日，德国生命科学集团赛多利斯（Sartorius）宣布其法国上市子公司Sartorius Stedim Biotech从私人投资者手中收购Albumedix Ltd.公司100%的股份。此次收购价格约为4.15亿英镑。该交易预计将于2022年第三季度末前完成。Albumedix总部位于英国诺丁汉，致力于重组人白蛋白产品和技术。重组人白蛋白是生物制药行业各种应用所需的重要成分，例如作为细胞培养基的无动物添加剂以及用于稳定疫苗和病毒疗法。该公司成立于1984年，拥有100多名员工，2022年预计将产生约3300万英镑的收入，EBITDA利润率可观达到两位数。Albumedix将成为赛多利斯生物工艺解决方案部门的一部分，Albumedix在英国诺丁汉现有的72,000平方英尺的场地将成为创新和符合GMP要求的关键原材料生产的卓越中心。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2005 /strong 年起，药典增加了以生物制剂（诊断、预防等）为主要内容的第三部。《中国药典》三部源于《中国生物制品规程》。自1951年以来，该规程已有六版颁布执行，分别为1951年及1952年修订版、1959年版、 1979年版、1990年版及1993年版（诊断制品类）、1995年版、2000年版及2002年增补版。2002年翻译出版了第一部英文版《中国生物制品规程》（2000年版）。 /p p style=" text-indent: 2em " 在2020年版《中国药典》三部中检测方法的变化主要体现在3个方面： br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " 1.通则 span style=" font-size: 14px color: rgb(63, 63, 63) " strong 《3208 人血白蛋白铝的检测》 /strong /span 中，增加 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 第二法ICP-MS法 /strong /span 。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2.通则 span style=" color: rgb(63, 63, 63) font-size: 14px " strong 《3129 单抗电荷变异体测定法》 /strong /span 中使用 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " iCIEF毛细管等电聚焦技术 /span 对抗体药物检测。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " 3.通则 span style=" text-indent: 2em font-size: 14px color: rgb(63, 63, 63) " strong 《3130 单抗N糖谱测定法》 /strong /span 中使用UHPLC法检测抗体药物。 /span /p p label=" 标题居中" style=" font-size: 32px font-weight: bold border-bottom: 2px solid rgb(204, 204, 204) padding: 0px 4px 0px 0px text-align: center margin: 0px 0px 20px " span style=" font-size: 18px color: rgb(0, 112, 192) " 3208 人血白蛋白铝残留量测定法 /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 原理： /strong 本法系用 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 原子吸收分光光度法 /strong /span 测定人血白蛋白制品中铝的残留量。& nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 方法： /strong 精密量取供试品、100 ng/mL标准铝溶液（精密量取100 μg/mL标准铅溶液0.1 mL，置100 mL量瓶中，用0.15 mol/L硝酸溶液稀释至刻度），分别制备空白对照溶液、供试品溶液和标准品加供试品的混合溶液。照原子吸收分光光度法（通则0405）测定，选择铝灯，测定波氏为309.3 nm，狭缝为0.7 nm。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 360px height: 85px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/a801e294-19c7-4db9-b6cf-91745bb0fee7.jpg" title=" 48DF010D-2A6B-4131-B9AE-9F270FD01EA8.jpeg" alt=" 48DF010D-2A6B-4131-B9AE-9F270FD01EA8.jpeg" width=" 360" vspace=" 0" height=" 85" border=" 0" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " & nbsp span style=" font-size: 14px " strong span style=" color: rgb(63, 63, 63) " B为空白对照溶液渎数； span style=" text-indent: 2em " S /span sub style=" text-indent: 2em " 0 /sub span style=" text-indent: 2em " 为供试品溶液读数；S为标准铝加供试品的混合溶液读数； /span /span span style=" font-size: 14px color: rgb(63, 63, 63) " 20为标准铝加供试品的混合溶液中标准铝的含量； span style=" font-size: 14px color: rgb(63, 63, 63) text-indent: 2em " 12.5 为供试品稀释倍数。 /span /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 0, 0) font-size: 16px " 设置石墨炉的干燥、灰化、原子化等炉温程序。精密量取空白对照溶液、供试品溶液和标准品+供试品的混合溶液各30 μL分别注入仪器、读数。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" color: rgb(255, 76, 0) " strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px " 新版2020药典增加ICP-MS法测量，准确度更高、灵敏度更好。 /span /strong /span span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 0, 0) font-size: 16px " /span /p p style=" text-align: center" a href=" https://www.instrument.com.cn/zc/293.html" target=" _blank" /a /p p style=" text-align: center" a href=" https://www.instrument.com.cn/zc/293.html" target=" _self" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 214px height: 200px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/ea3d0a09-4ed0-463d-bbb1-c40c7677c419.jpg" title=" ICP-MS.png" alt=" ICP-MS.png" width=" 214" vspace=" 0" height=" 200" border=" 0" / /a /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px color: rgb(147, 137, 83) " 【点击进入 strong ICP-MS专场 /strong 查看更多信息】 /span /p p style=" text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 0, 0) font-size: 16px " strong span style=" color: rgb(0, 0, 0) " 意义： /span /strong span style=" color: rgb(0, 0, 0) " 加强对人和动物来源血液制品杂质控制。 /span /span br/ /p p label=" 标题居中" style=" font-size: 32px font-weight: bold border-bottom: 2px solid rgb(204, 204, 204) padding: 0px 4px 0px 0px text-align: center margin: 0px 0px 20px " span style=" font-size: 18px color: rgb(0, 112, 192) " 3129 单抗电荷变异体测定法 /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px " 单克隆抗体 /span /strong /span span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 是一种复杂的糖蛋白，作为一种全新的生物制剂，可以治疗肿瘤、风湿等多种疾病。复杂的细胞培养工艺、纯化及制剂等制造过程或储存过程可能给单抗制剂引入各种修饰形成的变异体，它们通常呈现微观不均一性。因此，抗体所带的电荷就会存在差异，这些变异体可能会影响抗体的 span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(63, 63, 63) " strong 稳定性，药效，免疫原性 /strong /span 等，因此对电荷变异体的表征和质控至关重要。通过对变异体的分子量及肽图的表征，可以确定其修饰种类及后续QC中的质量监控。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 目前，电荷变异体分析常用的 strong PH梯度 /strong 或 strong 盐梯度 /strong 方法。由于流动相一般含不挥发性盐，需要色谱分离除盐冻干再进质谱分析。这一过程复杂容易造成样品损失及蛋白变性，因此使用低离子强度、挥发性盐的流动体系，在PH梯度条件下分离电荷变异体，同时进质谱分析，能够快速在完整蛋白水平上表征变异体修饰，包括C端赖氨酸变异体、脱酰胺、焦谷氨酸环化、糖化以及抗体相关片段等。 /span 主要步骤为： span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 完整分子量分析，轻重链分析以及肽图分析 /strong /span 。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 原理：药典三部通则中 /span /strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳 strong （iCIEF) /strong ，依据不同电荷变异体的等电点（pI）特征，按 span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(255, 0, 0) " strong 毛细管电泳法 /strong /span （通则0542)将其分离 ，测定单抗产品各电荷变异体的等电点并计算相对百分含量。 /span /p p style=" text-align: center margin-top: 10px " a href=" https://www.instrument.com.cn/netshow/C263761.htm" target=" _blank" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 250px height: 250px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/8c448341-11d0-4e01-9b72-208808933f79.jpg" title=" proteinsimple.jpg" alt=" proteinsimple.jpg" width=" 250" vspace=" 0" height=" 250" border=" 0" / /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 电荷变化是测定单抗药物降解变异最灵敏快速的方法之一，已经被国内外生物制药企业广泛采用。全柱成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）为Proteinsimple首创全景式动态等电聚焦分析技术，已经成为等电点检测及电荷异质性分析的行业金标准。 /p p style=" margin-top: 10px text-indent: 0em text-align: center " span style=" font-size: 14px color: rgb(147, 137, 83) " strong 【点击进入查看更多信息】 /strong /span span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " span style=" text-indent: 2em font-size: 16px " /span strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px " /span /strong /span br/ /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 356px height: 271px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/7bf31f3a-0103-4d57-96f0-4fc042d7e9b5.jpg" title=" 等电标志物.png" alt=" 等电标志物.png" width=" 356" height=" 271" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " strong 注意事项： /strong 1、如供试品的盐浓度较高，需对其进行脱盐前处理。 2、由于 iCIEF 分析仪器品牌不同、毛细管品牌或者规格存在差异，系统适用性对照品的电泳图谱与参考图谱峰型可略有差异。 /p p label=" 标题居中" style=" font-size: 32px font-weight: bold border-bottom: 2px solid rgb(204, 204, 204) padding: 0px 4px 0px 0px text-align: center margin: 0px 0px 20px " span style=" font-size: 18px color: rgb(0, 112, 192) " 3130 单抗N糖谱测定法 /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 第一法 亲水相互作用色谱法： /span /strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 亲水作用色谱柱（HPLC） /span /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" color: rgb(147, 137, 83) " strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px " 第二法 毛细管电泳法：CE /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 第三法& nbsp 高效阴离子色谱法： /span /strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 离子色谱法 /span /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " HPAEC-PAD /span /strong span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 离子色谱具有方便、快速、灵敏度高、选择性好、重现性好、准确度高、可同时分析多种离子化合物等优点。其中的高效阴离子交换色谱－脉冲安培检测法( HPAEC-PAD) 可直接分析糖类物质，应用于 span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 176, 80) " 多糖疫苗 span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 及 /span 多糖蛋白结合疫苗 /span 中多糖的分析。 /span /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " /span /span /p p style=" text-align: center" a href=" https://www.instrument.com.cn/zc/24.html" target=" _blank" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202009/uepic/b6590ab4-2912-4f5c-93aa-80ca30c78ca9.jpg" title=" 离子色谱.png" alt=" 离子色谱.png" / /a /p p style=" margin-top: 10px text-indent: 0em text-align: center " span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " /span span style=" color: rgb(147, 137, 83) " strong span style=" font-size: 14px " 【点击进入IC专场查看更多信息】 /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 5px " span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " 近年来，离子色谱应用在多糖及多糖蛋白结合疫苗的质量控制中，如测定疫苗中的多糖、游离糖、杂质多糖、对人有免疫原性的功能基团等的研究有许多报道。该方法可以加强 span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(255, 0, 0) " strong 多糖疫苗N糖 /strong /span （氨基端糖链的）结构分析与鉴别的质量控制。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 5px " span style=" text-indent: 2em font-size: 16px color: rgb(0, 0, 0) " /span /p p style=" text-align: center margin-top: 10px " a href=" https://www.instrument.com.cn/zt/2020ChP-changes" target=" _self" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202009/uepic/d68e2042-5e48-4019-9898-74375c0edcb3.jpg" title=" w640h1102020ChP.jpg" alt=" w640h1102020ChP.jpg" / /a /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 仪器信息网将特别推出 span style=" color: rgb(255, 10, 10) " strong “2020年版《中国药典》变化盘点” /strong /span 专题，盘点通则增修、药典仪器以及相关资讯。敬请广大读者关注！ /p

Jody Mason博士在美国JBC上发表文章，验证了构建抗α-Syn聚集肽抑制剂的方法，而且为潜在的药物候选分子提供了一种很有前途的肽序列。梅森博士评论道：“使用CEM公司的Liberty Blue做多肽合成实验，它能够快速合成研究所需的多肽，节省了我们大量的成本和时间，我们也愿意尝试更多的研究，面对更多的风险和挑战。Liberty Blue是我们实验室的一个很好的补充，我强烈建议其他研究人员使用这个系统。”帕金森病是神经系统的一种渐进性疾病，约占所有痴呆症的15%。多见于老年人，据国内权威机构统计，我国65岁以上人群患病率大约是1.7%，并随年龄增长而升高，据推算，目前国内帕金森病患者已经超过220万。目前的医学水平对这一病理改变的准确病因仍不清楚，也没有一个明确的诊断方法（主要依靠病史、临床症状及体征），目前药物治疗是最主要的治疗手段，手术治疗是药物治疗的一种有效补充。应用的治疗手段虽然不能阻止病情的进展，也无法治愈疾病，但能改善症状，有效的提高患者的生活质量。对于这个“老大难”，各大药厂使出浑身解数，近几年，上市了几款帕金森新药，像奥匹卡朋（Opicapone）、GOCOVRI （缓释金刚烷胺）等，但对于这个渐进性的疑难病来说，仍未突破既往的作用靶点。迫于研发难度和资金压力，全球最大制药公司辉瑞在2018年年初宣布，将放弃研发治疗阿茨海默症和帕金森症的新药，裁撤时间科学研究和早期发展项目约300个相关职位，足可见研发帕金森类药物的困难程度。帕金森病是神经系统的一种渐进性疾病，约占所有痴呆症的15%。多见于老年人，据国内权威机构统计，我国65岁以上人群患病率大约是1.7%，并随年龄增长而升高，据推算，目前国内帕金森病患者已经超过220万。目前的医学水平对这一病理改变的准确病因仍不清楚，应用的治疗手段虽然不能阻止病情的进展，也无法治愈疾病，但能改善症状，有效的提高患者的生活质量。 帕金森的病理特征是蛋白质团簇的形成，这些蛋白质称为路易体。 α-Syn（一种突触前神经元蛋白质）作为路易体的主要成分，与帕金森病有密不可分的联系，因此引起了科学界极大的兴趣。 目前的研究表明，α-Syn通过中间可溶的寡聚构象(称为原纤维)来帮助路易体。 而这些原纤维在神经元包涵体中沉积，然后通过影响细胞内靶标和突触功能而导致细胞死亡。之前的研究已经证明，α-Syn的71-82区域负责整个140 mer蛋白的聚集。但是梅森博士的小组指出，早发性帕金森病相关的突变是在该蛋白质的另一个片段中发现的。在观察到大多数突变后，发现该突变位于或非常接近46-53区域，他们选择根据这个肽段检测一个10聚体，具体而言，他们创建了45-54序列的209952个成员库，其中包括已知的突变，以及如图1所示的一系列可选的残基选择。然后用多路复用的细胞内蛋白片段互补分析法(PCA)筛选该多肽库。在此基础上，从文库中筛选出约200个候选基因。随后，在序列选择生长条件下进行了基于竞争的主成分分析，阐明了生长速率的差异。竞争主成分分析从最初发现的200个α-Syn结合剂中获得了一个最有前途的序列，可以通过测序来确定。图1. α-Syn(TOP)的45-54原生型序列被用来建立一个209952个成员肽库。包括与早发帕金森病相关的残基位置和选项(下划线和粗体表示部分)。 从竞争的PCA循环中鉴定的前导肽候选物能够与疾病相关的原生型α-Syn结合并降低淀粉样蛋白的形成超过90%。梅森博士然后利用固相多肽合成技术原生型45-54，α-Syn肽(作为对照)和PCA衍生肽候选物，研究其对140聚体原生型α-Syn结合的影响。从PCA研究中得到的肽能够防止原生型α-Syn在1:1化学计量下聚集，与原子力显微镜（图2）和THT染料结合试验一起证实，圆二色性实验证实几乎完全预防了多肽的β折叠二级结构。正如预期的选择方法，抑制剂也导致与α-Syn聚集相关的毒性大幅度降低。因此，该研究不仅验证了构建抗α-Syn聚集肽抑制剂的方法，而且为潜在的药物候选分子提供了一种很有前途的肽序列。图2. 左边显示的是α-Syn蛋白形成的毒性淀粉样纤维的原子力显微镜图像。这些都是在帕金森病患者的大脑中发现的。右边是与新衍生肽混合的同一蛋白质。多肽结合在α-Syn蛋白中的粘性部分，几乎完全阻止了纤维的形成。 梅森博士在2013年底开始使用CEM的?Liberty Blue™ 多肽合成仪。该系统使他能够快速合成研究所需的多肽。相较于之前购买多肽，现在能够节省大量的成本和时间，这对他的工作来说是非常有价值的。另一个好处，梅森博士不再关心是否有足够的肽材料用于实验问题，因为现在他可以快速有效地制造更多的肽。梅森博士评论道：“自从有了Liberty Blue，我们愿意尝试更多的研究，并能面对更多的风险挑战。Liberty Blue是我们实验室的一个很好的补充，我强烈建议其他研究人员使用这个系统。” Jody Mason博士发表的文章：Intracellular Screening of a Peptide Library to Derive a Potent Peptide Inhibitor of a-Synuclein AggregationJournal of Biological Chemistry, 2015, 290 (12), 7426–7435DOI: 10.1074/jbc.M114.620484

KRAS突变是最常见的致癌性突变，常见于包括肺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种高发和高致死率的癌症。在所有KRAS突变中，KRAS（G12C）突变在肺癌中最高发，同时这种突变也常发生在结直肠癌和胰腺癌中。长期以来，由于 KRAS蛋白表面光滑、缺乏有效、稳定的药物结合位点，研发直接靶向KRAS突变蛋白的抑制剂一直未能实现。直到2013年，Shokat实验室首次报道了能够直接靶向KRAS（G12C）突变蛋白的抑制剂【1】：此类抑制剂与突变的半胱氨酸进行共价结合，通过结合非活性状态的KRAS（结合GDP）从而阻断KRAS（GDP）进一步通过“核苷酸循环”被激活 （GTP结合）【2】。经过一系列的发展，现在已有两种抑制剂（分别由Amgen和Mirati公司研制）进入临床试验，并且Amgen公司研发的抑制剂（Sotorasib）目前已通过美国FDA批准上市，用于非小细胞肺癌的治疗。 目前针对这类抑制剂的临床实验的结果表明，此类抑制剂虽然能够对30-40% 相关癌症患者起作用，但对于接受治疗的肺癌患者平均无病存活期只有6个月【3】，表明很大一部分患者在接受抑制剂治疗后会产生耐药。因此研究耐药机制能够有助于更有效的应用这类抑制剂。在2020年，美国斯隆凯特琳癌症研究中心（MSKCC）的Piro Lito 实验室首次报道了癌细胞能够在此类抑制剂作用后通过合成新的KRAS蛋白，后者在EGFR， SHP2及AURKA信号的作用下激活，使细胞无法继续被抑制进而导致细胞对该抑制剂快速耐受（详见BioArt报道：Nature | 癌细胞对KRASG12C抑制剂存在快速耐受性）【4】。然而对于此类抑制剂治疗产生耐药的基因层面的变化尚不清楚。 为了研究与该抑制剂耐药相关的基因变化，2021年11月10日，Piro Lito实验室与MSKCC的临床药物试验研究组以及AMGEN制药公司合作（第一作者为赵玉磊 和Yonina R. Murciano-Goroff, Jenny Y. Xue, Agnes Ang）在Nature上发表了文章Diverse alterations associated with resistance to KRAS(G12C) inhibition，获取了相关临床样本并结合临床前模型及相关基础实验，研究报道了针对Sotorasib耐药性相关的基因改变并提出了相应治疗方案。 该研究收集了共43例进行临床Sotorasib药物试验病人的治疗前、后的组织和/或游离DNA样本。通过对收集的病人样本进行高通量靶向基因测序，发现27位病人在经过该药物治疗产生耐药后的样本中含有包括KRAS，NRAS， BRAF, EGFR, FGFR2, MYC等不同的基因改变。其中～16%的病人样本中检测到RAS基因的改变（KRAS突变，NRAS突变及KRAS拷贝数增多）；另有3位病人存在BRAF突变。此外其他检测到的基因改变还包括：EGFR扩增及突变， FGFR扩增及突变，MET扩增，MYC扩增和IDH1/2突变等。然而从病人样本中检测出的与耐药相关的基因的等位基因突变频率（variant allele frequency，VAF）都非常低，因此并不能确定这些基因的改变是否能够导致耐药。为进一步确定，研究人员获取了8位临床病人样本并用其构建了人源小鼠荷瘤模型(PDX)，通过在这些模型上进行G12C抑制剂的治疗，然后获取分离耐药和对照组肿瘤，进行基因测序。在其中两个模型中检测到了KRAS 、BRAF突变；同时在另外3个对药物不敏感的模型中检测到了高基础拷贝数的KRAS基因，进一步提示BRAF，RAS突变与耐药性密切相关。与此同时，研究人员在体外构建了三株对此类抑制剂耐药的细胞系，并对其进行了单细胞基因测序。结果在三株细胞系中同样发现了RAS及BRAF致癌性基因突变。并且其中一株细胞中含有MRAS突变，MRAS与RAS蛋白家族同源，但MRAS突变在肿瘤中非常少见。通过单细胞测序分析发现，这些突变基因能够与KRAS（G12C）突变同时存在于同一个细胞中。这一发现不同于目前广泛认为的“RAS致癌突变互斥理论”。进一步研究人员对MSKCC临床样本库中8750例含有KRAS突变的未进行抑制剂治疗的肿瘤样本进行分析，结果发现～3%的肿瘤样本中同时含有多种RAS突变；而RAS突变的比例在治疗前、后的临床样本以及耐药模型中明显增高，分别为16% 和 22%。提示G12C抑制剂能够使RAS突变比例增高，同时RAS突变可能参与G12C抑制剂的耐药。 由于通过三种方式发现的治疗后的基因突变都是多克隆性的，为进一步证明所检测到的基因变化能够驱动对KRAS突变蛋白抑制剂耐药，科研人员将这些突变的基因克隆到通过dox诱导表达的载体中并导入对抑制剂敏感的细胞系中。在这些细胞中诱导表达这些突变基因同时进行不同浓度抑制剂作用，发现抑制剂作用下的细胞中KRAS（G12C）仍然处于抑制状态，但下游ERK的抑制状态却减弱，表明突变基因能够激活KRAS下游信号通路从而达到抑制细胞对药物的敏感性；同时发现，即便用很低的dox进行诱导RAS突变基因的表达，也能够降低细胞原本对抑制剂的敏感度，提示即便表达量低或者多克隆状态，这些突变基因也可能达到使肿瘤耐药的状态。为进一步证实这个推测，研究者用不同的荧光蛋白分别标记抑制剂敏感细胞（亲本细胞）和可诱导表达NRAS（Q61K）的细胞，然后将两种细胞按不同的比例进行混合，来模拟肿瘤中可能存在的低等位基因突变率的基因改变。通过进行对抑制剂浓度滴定测试，发现细胞的耐药性随着NRAS突变在混合细胞中所占比例的增高而增强。同时即便NRAS 突变细胞只占混合细胞的7%，也足以使50%的混合细胞丧失对抑制剂的敏感性，提示NRAS突变细胞能够使周围原本对药物敏感的细胞敏感度降低。为进一步证实这一假设，研究人员利用流式细胞仪对不同比例混合的并且经过抑制剂作用后的细胞进行分析，发现敏感细胞存活的比例随着NRAS突变细胞的比例增高而增高。综上证明，RAS及BRAF突变能够通过激活KRAS下游信号通路（细胞内调节）或者影响提高周围敏感细胞的耐药性（细胞间调节）从而引起肿瘤的耐药 。 既然继发性RAS突变能够引起癌细胞对于KRAS（G12C）抑制剂耐药，那么如何能够抑制这类基因改变所引发的耐药呢？为解决这一问题，研究人员利用CRISPR全基因组筛选技术对耐药细胞株（含有NRAS（Q61K）突变）和其相应敏感细胞株在有无抑制剂作用的条件下进行筛选，来寻找能够用来作为抑制此类耐药性的治疗标靶。筛选结果表明，NRAS， SHOC2， 及MAPK信号通路相关基因是引起耐药的主要原因。利用sgRNA 特定敲除SHOC2能够明显提高耐药细胞株对于KRAS（G12C）抑制剂的反应；同样地，siRNA靶向NRAS也能够有效提高耐药细胞株对抑制剂的敏感度。但由于目前尚无有效药物能够靶向上述两个基因，而同时筛选结果表明MAPK信号通路是主要引起耐药的原因，因此，研究人员进一步利用现有针对MAPK 信号通路的抑制剂（RAF 抑制剂，MEK抑制剂和ERK抑制剂）联合G12C抑制剂进行用于检测其对于耐药细胞株以及过表达不同RAS/BRAF突变的细胞系的治疗效果。结果表明，同时联合MAPK信号通路抑制剂能够有效抑制RAS/BRAF突变引起的耐药性细胞的增殖。进一步在小鼠皮下异种移植耐药细胞株或者人源肿瘤构建的模型中也发现联合应用MEK和KRAS（G12C）抑制剂相比单一抑制剂的治疗能够更有效地抑制肿瘤的生长。综上，本研究通过结合临床样本、人源肿瘤异种移植小鼠模型、以及耐药细胞株三种不同体系研究与G12C抑制剂耐药相关的基因变化，发现与耐药相关的基因变化呈现出异质性，多克隆性和低等位基因突变率（VAF）的情况，可能与临床样本取样以及缺乏持续性的药物筛选相关。进一步RAS、BRAF的突变经过验证证明在多克隆的情况下也能引起耐药，并且可能存在细胞间相互作用的调节方式能够驱动耐药。针对此类基因改变引发的耐药情况，研究结果提示联合使用MAPK信号通路抑制剂能够对此类突变引起的耐药性起到改善并且延长KRAS突变蛋白抑制剂的有效作用时间。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04065-2

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry

根据《中华人民共和国食品安全法》及其实施条例有关规定，经第二届江苏省食品安全地方标准审评委员会审查通过，废止《食品安全地方标准 婴幼儿配方乳粉中α-乳白蛋白的测定 凝胶色谱法》（DBS 32/011—2016）等2项食品安全地方标准。其编号和名称如下：DBS 32/011-2016 食品安全地方标准 婴幼儿配方乳粉中α-乳白蛋白的测定 凝胶色谱法DBS 32/012-2016 食品安全地方标准 食品中喹啉黄的检测 高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法特此通告。江苏省卫生健康委员会2023年12月29日

目前大多数治疗性抗体都是以静脉注射的方式进行给药，由于其伴随着病人顺应性差以及高昂的医疗成本等现实问题，使得皮下注射制剂逐渐成为行业关注的热点。相比于静脉注射，皮下注射具有提高病人的依从性，降低医疗成本等优点，而典型的皮下注射需要控制注射体积(一般为1-2ml)，从而需要提高蛋白浓度，而高浓度蛋白伴随着蛋白粘度的急剧增加，是限制皮下注射制剂的重要原因。在现实工艺开发过程中往往面临着各种难点:高粘度蛋白溶液超过粘度注射限，带来可注射性挑战高浓度高粘度蛋白更容易发生聚集，引起蛋白稳定性挑战高粘度蛋白溶液引起TFF过滤步骤的通量、工艺效率、回收率降低等挑战默克高浓度蛋白粘度降低平台 通过发挥辅料组合协同效应，有效降低蛋白粘度，提高蛋白稳定性，实现高浓度制剂皮下注射。市售制剂配方粘度对蛋白浓度的依赖性图1. 市售制剂中抗体浓度与粘度的关系从图1可以看出，随着蛋白浓度的增加，蛋白可能发生分子间相互作用或者分子拥挤，从而引起蛋白粘度的急剧升高，一些蛋白产品在浓度刚刚达到100 mg/mL时，粘度已经很高，甚至超过了粘度注射限(一般皮下注射药液粘度不超过25mPas), 此时通过注射器给药变得十分困难。为了解决这一问题，我们研究了不同的辅料组合，通过加入这些辅料组合来有效降低蛋白粘度，以满足皮下注射的要求。材料与方法选择已经在FDA或EMA注册的单克隆抗体产品进行研究。在本研究中，我们选择pH7.2的抗TNF-α嵌合单克隆抗体(mAbC) 作为模型药物，考察不同的辅料及组合对其粘度的降低效果。其中所有辅料和缓冲试剂产品均购自德国默克公司。采用装有Ultracell-30k超滤膜的Amicon® Ultra-4超滤管进行缓冲液置换和蛋白浓缩。对于辅料研究，以2000 x g的离心力进行离心并置换了5个透析体积，同时用2000 x g离心力进行浓缩。根据Lambert-Beer定律并使用BioSpectrometer® Kinetic (Eppendorf, Hamburg, Germany) 在280 nm处测量来确定蛋白浓度。用相应的缓冲液配制稀释液，使用同样的方法再次验证上述测得结果。粘度测试：将蛋白样品在20°C平衡后，用m-VROC™ 粘度计在1000 - 3000s-1的剪切速率下测量蛋白粘度。将200 μL的蛋白样品装入500 μL气密注射器中(Hamilton, Reno, USA)，重复测量3次。通过Dynapro PRIII (Wyatt Technology, Santa Barbara, USA)的动态光散射(DLS)测量粒子的扩散系数Dt，样品在25°C下采集10次，每次采集5秒。通过对mAb C在3 ~ 14 mg/mL的浓度范围内的扩散进行线性拟合，得到扩散方程Dt = D0 (1+ kD*C)，并外推得到了无限稀释下的蛋白扩散系数D0。通过绘制Dt/D0的归一化图谱从而确定扩散相互作用指数kD。通过以下公式计算注射器的推注力:结果图2. 单一辅料与辅料组合对mAbC粘度的影响图2A(单一辅料): 加入75 mM的辅料后，可以观察到蛋白粘度有轻微的降低，但降粘效果不够明显，依然不能满足皮下给药的要求（25 mPas）。即使提高辅料浓度至原来的两倍，其粘度仍然过高。结果表明，单一辅料无法有效降低mAbC蛋白粘度。图2B(辅料组合):粉红柱和黄柱分别代表将阳离子辅料和阴离子辅料分别单独添加至蛋白制剂后测定的粘度。蓝柱代表加入辅料组合的理论粘度值。紫柱代表加入辅料组合后实际测试的粘度值。结果表明，通过辅料组合的协同效应能够有效降低mAbC蛋白粘度。调整辅料组合配比，提高降粘效果图3为mAbC归一化的扩散系数Dt/D0与蛋白浓度之间的关系图。斜率为0时表示蛋白没有相互作用，斜率的负值越小表明蛋白相互作用越弱。加入不同比例的E1和E5辅料组合后，斜率的负值明显减小，提示蛋白粘度降低。当两种辅料的比例为2:1时，降粘效果最为显著。图3. Dt/D0与蛋白浓度的关系辅料组合发挥降粘协同效应图4结果显示，将几种不同的辅料及其组合分别加入mAbD制剂中，可以观察到几种特定的辅料组合实际粘度值明显低于其理论累加值，说明辅料组合具有协同降粘作用。图4. 辅料组合对mAbD溶液粘度的影响粘度降低可显著提高注射性能图5. 粘度降低对注射力的影响mAbC：当使用27G针注射原始配方的150mg/mL mAbC制剂时，所需注射力为90N，约9公斤——即一个一岁小女孩的重量；添加行标BM和E3的辅料组合后，所需注射力降为35N，约3-4公斤——一只家猫的重量mAbD：当使用27G针注射原始配方的150mg/mL mAbD制剂时，所需注射力为140N，约14公斤——一只小袋鼠的重量。添加E1和E4的辅料组合后，所需注射力降为18N，约2公斤——一个蛋糕的重量辅料组合提高蛋白稳定性I: 强降解实验设计采用自身稳定性差的mAb C作为模型药物，进行强降解实验。将150 mM的单一辅料与包含75mM阳离子和75mM阴离子的辅料组合分别添加至80 mg/mL的mAbC制剂溶液中，置于40 °C，75%相对湿度的环境下，在第0天，第14天，第28天分别取样，通过SEC-HPLC测定单体含量。II: 强降解实验结果图6. 强降解实验后蛋白溶液外观（左图为添加单一辅料，右图为添加辅料组合）图6结果显示，在强降解条件下，使用辅料组合的蛋白溶液澄清度明显优于单一辅料，表明辅料组合应用能够有效提高蛋白稳定性。图7.SEC-HPLC检测强降解实验后的单体比例（左图为添加辅料组合，右图为添加单一辅料）图7左结果表明，经过28天的强降解实验后，使用了辅料组合的制剂与原始制剂配方有相似的单体含量，即降粘辅料组合对制剂的稳定性无负面影响。图7右结果表明，使用单一辅料E1对单抗mAb C的稳定性没有负面影响，但辅料E4和E5单独使用时，会降低抗体的稳定性，从而降低单体含量。默克高浓度蛋白粘度降低平台优势(VRP)助力皮下注射制剂开发，提高可注射性，病人顺应性IP专利保护技术平台Emprove® Expert 辅料支持高风险应用，Emprove® dossiers文档支持，快速响应法规要求强化下游工艺，提高过滤通量，过滤效率，回收率，从而提高整个过滤工艺经济性辅料组合发挥协同效应，显著提高粘度下降水平并且保持蛋白粘度与稳定性之间的平衡市面上实现高剂量皮下注射的不同策略综合对比1.默克VRP平台展现出制剂开发更简单，成本更低，上市速度更快等优势。2.默克VRP平台对比酶，辅助设备，可缩短1-3年开发时间，节省30-50%开发成本，加快药物商业化上市步伐。

当CRISPR 遇见Namocell---微管蛋白聚合抑制剂与癌症研究最新进展微管蛋白是一种在维持细胞结构和促进细胞分裂中起着关键作用的蛋白质。抑制微管蛋白聚合已被证明是抑制癌细胞增殖的有效策略。在以往的研究中，识别能够抑制微管蛋白聚合的化合物需要利用纯化的微管蛋白或固定细胞的免疫荧光分析进行体外实验。2023年1月29日，美国Harutyun Khachatryan研究团队在Biomolecules杂志发表了文章Identifification of Inhibitors of Tubulin Polymerization Using a CRISPR-Edited Cell Line with Endogenous Fluorescent Tagging of β-Tubulin and Histone H1，提出了一种新的方法来识别微管蛋白聚合抑制剂，利用内源性荧光标记β-微管蛋白和组蛋白H1的CRISPR - Hela细胞系来鉴定微管蛋白聚合抑制剂。该方法有助于研究活细胞内源性蛋白，而不使用细胞固定、免疫染色或重组蛋白过表达。本研究使用β-微管蛋白（mCTover3）、组蛋白H1（mTagBFP2）和p62-SQSTM1（mRuby3）荧光蛋白， 用CRISPR和FAST-HDR载体系统开发HeLa细胞，采用Hana单细胞分离仪（Namocell）进行单细胞分选，使用绿色荧光通道，并分选到96孔板中进行单细胞克隆培养，然后选择一个具有均匀明亮β-微管蛋白荧光的细胞克隆大量扩增得到实验细胞。后续实验通过高内涵成像分析来动态观察微管蛋白聚合情况。用已知的微管蛋白聚合抑制剂、秋水仙碱和长春新碱处理此细胞，并证实了由此产生的微管蛋白聚合抑制的表型变化。此外，作者筛选了429个激酶抑制剂文库，鉴定出三种抑制微管蛋白聚合的化合物（ON-01910、HMN-214和KX2-391）。值得注意的是，研究中采用Namocell 单细胞分离仪帮助作者快速、轻柔、高效地获得活性高的CRISPR - Hela单细胞，利于单克隆培养及扩增，为后续更多实验提供足够的细胞工具。Namocell单细胞分离仪 l 轻 柔 - 压力小于2psi，保护细胞活性l 快 速 - 分选快（1min），初始化快（2min），样本切换快（1min）l 精 准 - 配备2-11色荧光通道，精准捕获目的细胞l 无 菌 - 一次性无菌芯片，隔绝样本污染l 轻 松 - 无需调校，开机即用l 轻 巧 - 体积小巧，方便搬动Namocell 是一家成立于美国硅谷的专注于世界领先的单细胞分选技术的生物仪器公司，2022年7月加入Bio-Techne。公司自主研发的微流控单细胞分选平台，使复杂的单细胞分选变得极其简单快速，极大地推动了单细胞分析在基础研究和临床上的应用。我们的单细胞分选仪已在细胞株的构建，单克隆抗体的筛选，细胞基因编辑，基因及细胞治疗，癌症液体活检，癌症免疫治疗，产前基因筛查，噬菌体展示，单细胞基因组学等多方面得到广泛的应用。目前Namocell微流控单细胞分选仪已经被世界各大顶尖研究机构及生物制药公司广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如美国国立卫生研究院(NIH)，美国食品药品监督管理局 (FDA)，美国疾病控制与预防中心(CDC)，哈佛大学，斯坦福大学，麻省理工大学，Genentech，Merck，Biogen，BMS，Janssen，Boehringer-Ingelheim等。

近日，美国明尼苏达大学药学院药理学科学家，利用MFI，在权威杂志Journal of ControlledRelease（IF：7.901）发表文章：Freezing-induced ProteinAggregation - Role of pH Shift and Potential Mitigation Strategies, J Control Release. 2020 Jul 10 323:591-599. --研究背景--在设计用于肠胃外给药的蛋白质药物产品中，聚集体的产生，除了在外观上引起不适之外，最重要的是它们具有细胞毒性作用，或是引起机体免疫原性应答。美国和欧洲药典对肠胃外药物产品中的不溶性聚集物有规定：对于小剂量的肠胃外药物，通过光阻法测量的小颗粒（≥10μm）和大颗粒（≥25μm）的推荐药典规范分别为≤6000/container和≤600/container。因此，预防和减轻蛋白质聚集对于维持蛋白质药物产品的安全性，功效和质量至关重要。药品加工步骤中，如纯化，搅动，冻融，填充，冻干，制剂成分，运输压力，都有可能将天然蛋白质转化为聚集体。而蛋白质溶液在配制为药物产品之前，通常以冷冻状态保存很长一段时间，所以，因反复冻融而产生的蛋白聚集体更应引起关注。蛋白质制剂如缓冲液可确保制剂的pH值在整个保质期内都保持在所需范围内。但在低温过程中，某些缓冲区的有效性可能会受到影响。例如，当冷冻含有磷酸二氢钠和磷酸二钠的水溶液（即磷酸钠缓冲液）时，磷酸氢二钠的选择性结晶导致冷冻浓缩液的pH降低，从而引起蛋白聚集体的产生。因此，本文旨在研究，在不同缓冲溶液的冻融循环过程中，两种模型蛋白质（牛血清白蛋白（BSA）和β-半乳糖苷酶（β-gal））聚集体的产生，以及这两种蛋白对缓冲液pH值变化的影响。同时，评价了添加的非结晶溶质对pH值变化的影响，以及pH改变对蛋白质聚集行为的影响。--研究结果--使用MFI表征冷冻和解冻后蛋白颗粒的形成利用MFI检测发现，无论何种缓冲液，BSA（10mg/mL）在制备和立即分析时均显示出较低的颗粒数。当这些溶液经受五个冻融循环时，在许多系统中颗粒数量都有小幅增加。但冻融循环在磷酸钠缓冲液（100mM）中导致的颗粒计数增加显著。加入纤维二糖（纤维二糖（一种还原糖）被用作模型非结晶溶质，一种冷冻保护剂）后，在磷酸钠缓冲液（100mM）中导致的颗粒数有明显缓解。利用MFI检测发现，β-gal（10mg/mL）在水中冻融后的颗粒数（?100,000）急剧增加，表明该蛋白质对PH值的极端敏感性。同样，β-gal在磷酸钠缓冲液（100mM）中导致的颗粒计数增加显著。加入纤维二糖后，在磷酸钠缓冲液（100mM）中导致的颗粒数有明显缓解。低温pH测定将PBS和磷酸钠（100mM）冷却后，发现pH值变化幅度相似。当磷酸钠浓度为10mM时，冷却时的pH值变化不明显。而蛋白质的添加（10mg/mL）可以降低了PBS和磷酸钠（10mM）中pH值变化的幅度。当磷酸钠浓度很高（100mM）时，蛋白质的作用就不那么明显了，这表明，低蛋白浓度（10mg/mL）似乎不足以抑制缓冲盐的结晶和随之而来的pH偏移。低温XRD测定研究结果发现，当将磷酸钠缓冲溶液（10和100mM）冷却时，在-15°C时Na2HPO4• 12H2O结晶明显（分别参见图4B和4C）。而BSA的添加，可以使Na2HPO4• 12H2O的峰强度降低，特别是在较低的缓冲液浓度（10mM）下更为明显。这与观察到的BSA对缓冲溶液pH值变化幅度的影响密切相关。此外，纤维二糖的添加完全抑制了缓冲盐的结晶（图4D），以及冰峰的强度也受到了抑制。这些结果揭示了非结晶溶质在蛋白质制剂中的附加作用。通过抑制缓冲盐的结晶和随之而来的pH值变化，这些赋形剂可防止蛋白质不稳定性。热分析结果显示，当将BSA添加到PBS中时，在-54.4℃出现玻璃化转变温度（Tg′），随后在-22.4和0.1℃出现两个吸热峰。玻璃化转变温度反映了冷冻浓缩物组成发生了改变。BSA仅对100mM缓冲液的热行为有明显影响，导致Tg’（-47°C）和结晶温度（-30°C）降低。同时，纤维二糖的添加有望改变冷冻浓缩物的成分，这在Tg’（-34°C）中有所体现。结论：磷酸盐缓冲液被广泛用于肠胃外蛋白质制剂中。但在冷冻过程中，磷酸氢二钠（十二水合物）的选择性结晶会降低冷冻浓缩液的pH值，从而导致蛋白质聚集。可以通过降低缓冲液浓度来减小pH偏移。同时，BSA和β-gal可以通过对缓冲液结晶的抑制，减少pH的变化，但其作用程度要取决于缓冲液浓度。其它非结晶性赋形剂（纤维二糖）的添加，可通过抑制缓冲盐结晶，来提高蛋白质的稳定性。

国家药典委员会于2013年3月28-29日在北京召开《中国药典》三部2015年版病毒疫苗专题讨论会。药典委员会病毒制品专业委员会部分委员、国家局药品注册司生物制品处相关负责人、中检院、药品审评中心有关专家、药典会相关工作人员以及病毒性疫苗相关生产企业的代表参加了会议。会议就《中国药典》三部2015年版病毒类制品新增各论起草稿以及相关标准提高课题进行了专题讨论，相关意见和建议经我委将整理汇总后将提交病毒专业委员会全体会议审议和确定。请各有关单位关注会议讨论内容，并结合具体品种开展相关工作，及时提交相关资料。 　　一、《中国药典》三部2015年版病毒类制品新增各论起草稿讨论 　　(一)黄热减毒活疫苗 　　1. 毒种检定项下增订主种子批和工作种子批外源性禽白血病病毒和外源性禽腺病毒检测 主种子批猴体神经毒力检查在嗜内脏性试验的基础上增订嗜神经性试验。相关要求参照WHO技术指南执行,生产企业应参照WHO相关要求开展方法学的研究和验证。 　　2.病毒原液(未加入稳定剂)检定项下增订蛋白质含量测定，由生产企业建立方法并测定多批制品，汇总检测结果提出蛋白质含量限度建议，报送我委后提交病毒制品专业委员会审议。 　　3. 种子批病毒滴定同时采用蚀斑法(PFU)和小鼠法检测， 中间品和成品病毒滴定检测采用PFU法 　　4. 中检院与相关生产单位开展协作研究，采用WHO黄热减毒活疫苗国际标准品建立我国黄热疫苗国家标准品 同时应研究确定效力测定国际单位(IU)与蚀斑单位(PFU) 相关性。 　　(二) 水痘减毒活疫苗 　　1. 建议生产用毒种项下各级种子批毒种代次规定为“各级种子批代次应按批准的执行，工作种子批传一代制备疫苗” 　　2. 建议毒种检定项下猴体神经毒力试验仅限主种子批进行， 工作种子批免做 　　3. 制造项下病毒培养温度建议规定为 “适宜的温度培养适宜的时间” 　　4. 毒种检定项下关于增订工作种子批 “病毒外源因子检查”，并建议作为病毒减毒活疫苗共性问题，提交病毒制品专业委员会审定后作出统一规定 　　二、 病毒类制品相关标准提高课题 　　(一)、肾综合征出血热鉴别试验(ELISA)的建立 　　课题协作单位长春生研所初步完成了肾综合征出血热鉴别试验双抗体夹心酶联免疫法的建立，并就检测试剂的制备、精确性、特异性以及稳定性等初步验证情况进行了汇报。与会专家就进一步完善方法学研究提出如下建议： 　　1. 进一步开展佐剂解离前后检测值的对比研究，以评价佐剂解离对检测方法的影响 　　2. 进一步完善检测试剂盒的稳定性研究 由中检院牵头组织相关生产企业对该方法的扩大验证 　　4. 关于检测试剂是否需要同时对两个型的病毒进行鉴别需提交病毒制品专业委员会进一步讨论确定。 　　(二)、乙型脑炎减毒活疫苗猴体神经毒力试验 　　建议中国生物技术集团公司牵头将成都所、武汉所和兰州所委托中检院开展的猴体神经毒力研究结果及总结报告予以汇总并提出具体修订建议，尽快反馈我委后提交病毒制品专业委员会审议并确定。 　　对于成都所研究结果中接种高剂量(毒种病毒量超过6.6 lg PFU/ml)试验组猴体神经组织细胞出现病变的情况应予以高度关注， 并进一步开展相关研究。 　　(三)、 宿主细胞蛋白标准品制备方案讨论 　　根据药典委员会病毒制品专业委员会2012年第二次会议提出关于建立宿主细胞蛋白(HCP)参考品，以及完善HCP残留量测定方法的意见，经进一步讨论，建议采用收取细胞培养上清和裂解细胞蛋白混合后进行定量，经标化后制备HCP检测参考品。中检院将根据上述意见和建议，进一步确定相关研究方案开展研究工作。 　　三、人用狂犬病疫苗标准相关问题的讨论 　　(一)关于灭活剂β-丙内酯对人用狂犬病疫苗质量和安全性的相关影响 　　基于1987年巴斯德公司生产的人用狂犬病疫苗因β-丙内酯导致人血白蛋白变性致疫苗接种后过敏反应发生的报道，本次会议就进一步完善人用狂犬病疫苗及相关产品病毒灭活工艺问题进行了讨论，并提出如下建议： 　　1.生产企业加强人用狂犬病疫苗使用后不良反应发生的监测，并对接种后出现过敏反应与使用β-丙内酯导致人血白蛋白改变所致的相关性进行调查 　　2.生产企业进一步开展完善生产工艺的研究，包括在病毒培养过程中取消人血白蛋白稳定剂的工艺改进研究 比较纯化前灭活与纯化后灭活对疫苗安全性有效性的影响，为优化生产工艺提供相关依据 　　(二)基于病毒制品专业委员会关于《中国药典》三部2015年版病毒类制品遴选的意见，强调《中国药典》2015年版三部将不再收载人用狂犬病疫苗(Vero和地鼠肾细胞)(液体剂型)， 以鼓励和推动相关生产企业加快产品工艺优化、开展冻干制剂的工艺研究。 　　四、麻腮风减毒活疫苗生产用人二倍体细胞管理相关问题 　　建议相关单位对已批准的生产用人二倍体细胞延长代次用于病毒疫苗生产开展相关研究。有关MRC5细胞株的限定代次的具体修订意见， 提交病毒制品专业委员会审定。

石子园主前话：2020年，疫苗被全球人高度关注，佐剂是一种能够增强对疫苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应的物质，氢氧化铝佐剂是疫苗中最常使用的一种，其含量的高低影响疫苗的安全性；人血白蛋白，其工艺中所用的原材料及包装材料均有可能产生铝污染，铝残留的测定对于生物制品的安全是必不可少的环节。 2020版《中国药典》第三部，生物制品新增的通则和指导原则涉及金属检测： 013650 氢氧化铝佐剂 “本通则适用于疫苗佐剂氢氧化铝（包括原位吸附疫苗的铝稀释剂）的质量控制。”“3 . 检定 (5 ）铝含量 依法检查（通则3106）或采用其他适宜方法检查，应符合批准的要求。” 岛津推荐检测方法 电感耦合等离子体质谱法（ICPMS-2030系列）岛津ICPMS-2030系列 -智能方法开发-自动结果诊断-低运行成本消耗-完全符合法规的DB、CS版软件 应用案例 ICP-MS测定疫苗铝佐剂中铝的含量 ● ICPMS-2030仪器参数● 标准曲线图图1 铝标准曲线线性图（r=0.9999） ● 实验结果 表 1 疫苗铝佐剂测定结果表 2 样品加标测试结果023208 人血白蛋白铝残留测定法（第二法） 2020版药典和2015版药典相比，新增人血白蛋白铝残留测定第二法-ICP-MS法，第一法-原子吸收法与2015版保持不变，两种检测方法优缺点及推荐使用领域比较如下表： 岛津推荐检测方法 电感耦合等离子体质谱法（ICPMS-2030系列）岛津ICPMS-2030系列 应用案例 ICPMS-2030快速测定人血白蛋白中铝残留量 ● ICPMS-2030仪器参数● 标准曲线图图2 Al元素的标准曲线（r=0.9999） ● 实验结果 表3. 人血白蛋白样品分析结果3#样品加标结果图3 3#样品重复进样实验结果（RSD:1.3%，N=10） 人血白蛋白含量通常为20%，粘度较高，有机质也较高，在连续检测不同的稀释人血白蛋白样品4小时后，观测采样锥的积碳情况，结果令人满意，采样锥上无明显积碳。 更多详细信息，请联系岛津。

大家好，本周向大家分享Nature Communications上的一篇文章，题目为Native metabolomics identifies the rivulariapeptolide family of protease inhibitors，文章共两位通讯作者，分别为加州大学圣地亚哥分校的William H. Gerwick教授与德国图宾根大学的Daniel Petras博士，两课题组分别研究海洋天然产物与功能代谢组学。天然产物指各种生命体中化学结构丰富、生物活性多样的特殊代谢物，在药物发现中发挥了十分重要的作用。目前，传统的正向、反向化学遗传学，均依赖于纯化的代谢物小分子进行生物活性的研究，使得系统发现药物活性小分子面临着周期长、工作量大等一系列不足。本篇工作结合超高效液相（UHPLC）、天然质谱（native MS）、串联质谱（tandem MS），发展了一种功能代谢组学的分析技术，在推进新颖天然产物的反向化学遗传学研究上具有重要意义。首先对该技术的实验流程进行简要介绍。在获得天然产物的甲醇粗提物后，对其进行RP-UHPLC分离。考虑到色谱分离一般使用酸性条件，且使用乙腈作为流动相，与native MS并不兼容，作者在柱后引入辅助泵，通过醋酸铵水溶液将pH值调节到类似天然的条件。最终，使用第二个辅助泵向体系中注入目标蛋白，并通过质谱测量产生的蛋白质-代谢物复合物。考虑到潜在的非特异性相互作用，作者选择全离子碎裂模式（all-ion fragmentation），并设置碰撞能量阈值为20 %。此外，作者还进行了不注入蛋白的实验组，作为参照的代谢组学分析结果。在本文中，研究人员选择的模式目标蛋白为糜蛋白酶（chymotrypsin），模式代谢粗提物来自蓝藻，以筛选新颖的蛋白酶抑制剂。在建立上述方法的过程中，研究人员优化了native MS的pH与乙酸铵浓度，并使用已知糜蛋白酶抑制剂molassamide，揭示该方法检测蛋白-代谢物相互作用的检测限约为0.1-1 µ g/mL，并证实在含有40 %有机溶剂的场景下研究上述相互作用的可行性。接下来，研究人员对所获得的数据进行分析。相比于未结合糜蛋白酶，代谢物-糜蛋白酶复合物会产生一定的m/z迁移，其质量对应于与该蛋白质结合的小分子。同时，复合物相对于未结合糜蛋白酶的质谱峰强度比一定程度上揭示了在实验条件下的特定代谢物结合的亲和力。基于天然质谱中复合物出现的洗脱时间以及代谢物的分子质量，研究人员进一步从不含糜蛋白酶的代谢组学结果中寻找对应的代谢物小分子串联质谱图，并利用化学信息学手段初步分析代谢物的分子结构。随后，基于上述信息，研究人员对目标小分子进行针对性纯化，利用多种NMR技术实现精确的结构鉴定，并将获得的这类新颖结构的小分子命名为rivulariapeptolide，于体外证实上述分子对糜蛋白酶活性的抑制。综上，本篇工作结合超高效液相、天然质谱、串联质谱技术，发展了一种功能代谢组学的分析技术，并将其应用于蓝藻生物膜中糜蛋白酶抑制剂的筛选，发现了rivulariapeptolide这类新颖的nM水平蛋白酶抑制剂。原文地址：https://www.nature.com/articles/s41467-022-32016-6

今年年初，河北省石药集团药物制剂及释药技术国家重点实验室、英利集团太阳能光伏发电技术国家重点实验室等5家实验室获批为企业国家重点实验室。从河北省科技厅获悉，5大实验室经过近一年建设取得全方位突破，共投入资金3.65亿元，申请专利157项，获授权专利52项，取得国外授权16项。一批重大科研成果的取得和应用有力促进了新能源、医药等行业技术水平升级。 　　据河北省科技厅有关负责人介绍，2010年，5家国家重点实验室共购置仪器设备150台套，价值1亿元；改建或新建实验用房近20000平方米，投入经费2.65亿元。各实验室均制定完善了引进培养优秀科研人才的优惠政策。2010年，5家企业国家重点实验室引进急需的科研人才79人，其中海外高层次人才5人。“一大批重要科研项目在这些实验室中取得突破。”河北省科技厅有关负责人介绍，如华药集团抗体药物研制国家重点实验室研制的重组人源狂犬病毒抗体和重组人血白蛋白2个一类新药已进入Ⅰ期临床阶段，英利集团太阳能光伏发电技术国家重点实验室开发的新硅烷法产品能耗实现较常规方法低50%以上。在河北省科技厅支持下，5家实验室一年内承担了国家和省部级科研项目37项，争取专项资金24698万元，共获得省级以上科技奖励3项。 　　据介绍，由于5大实验室众多研发项目直接面向市场，许多研发成果得以迅速转化。同时各大实验室还充分发挥行业公共技术研发服务平台作用，为领域内其他企业的发展提供技术指导和支持，带动行业整体水平的提升。目前，英利集团太阳能光伏发电技术国家重点实验室已建立起针对企业需求的“订单式”服务机制，现已承担光伏行业8家企业共计100余项自立应用型研究项目。 　　河北省科技厅有关负责人表示，2011年，河北省将继续实施建设企业国家重点实验室科技专项，2011年专项经费将增至1500万元，用于支持实验室开展基础研究和应用研究。

p 　　近日，在Nature杂志上发表了关于COVID-19的M sup Pro /sup 靶点的抑制剂的文章。文章报道了我国科研团队基于计算机辅助设计技术鉴定出了一种新的针对COVID-19病毒结构的抑制剂N3。这是一种基于COVID-19的M sup Pro /sup 的抑制剂。研究团队通过高通量筛选并结合细胞实验筛选出6种具有活性的化合物，其中包括Ebselen(依布硒)这一款抗炎的“老药”。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 576px height: 240px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202004/uepic/d0156cff-6fab-437d-aa2b-254b4c9e3db4.jpg" title=" Nature文章标题.jpg" alt=" Nature文章标题.jpg" width=" 576" vspace=" 0" height=" 240" border=" 0" / /p p 　　抑制剂的发现主要有三种方式：从头合成，模拟实验以及高通量筛选。通过模拟实验和高通量筛选结合的机制，使用计算机辅助技术设计出了抑制剂N3。根据COVID-19病毒与M sup Pro /sup 的复合物的晶体结构，一共分析了10,000多种化合物后得到6种有潜力的抑制剂。其中有双硫仑(disulfiram)、卡莫氟(carmofur)、依布硒(ebselen)、紫草素(shikonin)、Tideglusib和PX-12。在细胞水平实验中，IC sub 50 /sub 值(半数抑制浓度)在0.67-21.4 μM之间，具有较好的研究潜能。结果证明了这种筛选策略的有效性，可以快速发现具有临床潜力药物的线索，以应对没有特定药物或疫苗的新的传染病。 /p p 　　M sup Pro /sup 是病毒主蛋白酶的英文名称，该结构的抑制剂可以作用在病毒上，成为有吸引力的药物靶点。Ebselen的衍生物依布硒啉PZ51是一种小分子硒化合物，具有毒性小而且稳定的特点。它有抗氧化、抗肿瘤以及抗微生物等药理活性，是一种非甾体抗炎药NSAID。（下图为依布硒的结构式，图片来源于网络） /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 360px height: 202px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202004/uepic/44af4371-5ee0-4e82-8f3c-2e0605d64b09.jpg" title=" Ebselen.jpg" alt=" Ebselen.jpg" width=" 360" vspace=" 0" height=" 202" border=" 0" / /p p 　　该实验的通讯作者为上海药物所研究员蒋华良院士、清华大学教授饶子和院士以及上海科技大学杨海涛研究员。共同参与的“抗新冠病毒攻关联盟”是由上海科技大学-清华大学、中科院上海药物所、军事科学院军事医学研究院以及中科院武汉病毒所等相关实验室研究专家组成。国家蛋白质科学中心(上海)，澳大利亚昆士兰大学也参与了此项研究。攻关“联盟”中饶子和院士研究团队自从2003年SARS暴发以来，17年间致力于冠状病毒关键药物靶点的研究及抗病毒新药的研发。曾在SARS暴发期间解析了首个SARS病毒蛋白质(M sup Pro /sup )的三维空间结构，为人类战胜冠状病毒奠定了基础。 /p p strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " [ span style=" color: rgb(0, 112, 192) " Nature /span 原文链接] /span /strong a href=" https://www.nature.com/articles/s41586-020-2223-y?utm_source=sn& utm_medium=referral& utm_content=RMarketing& utm_campaign=BSLB_4_CA01_GL_BSLB_USG_CA01_GL_LSGR_PubH_Coronavirus_LandingPage" target=" _blank" Jin, Z. et al. Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors. i Nature /i https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y (2019). /a /p

p 　& nbsp & nbsp （博晖创新）2016年三季报发布,今年1-9月公司实现营业收入2.81亿元,同比增长108.55% 归属于母公司的净利润2059.60万元,同比增长31.68% 归属于上市公司股东的扣非后净利润2,033万元,同比增长8.21%。公司收入大幅提高源于去年同期只合并了河北大安6月至9月以及Advion7月至9月的收入。经营活动产生的现金流量净额同比减少53.78%,公司经营状况良好,业绩增长稳健。 /p p 　　河北大安血液制品业务全面改善,毛利率水平大幅提高。上半年河北大安实现销售收入8,177万元,收入占比达到42%,实现净利润分别为 1,982万元,归属母公司净利润 951.2万元,占归属母公司净利润的77.6%。 /p p 　　大安的主要产品人血白蛋白销售收入7,801万元,由于人血白蛋白投产量大幅增长、分摊到单位产品的成本和期间费用减少,毛利率显著提高,从 2015年的 19.6%上升至上半年的34.3%。大安制药按照年初制定的投浆计划投料生产,人血白蛋白产品销售保持稳定。三季度大安制药研发的人凝血酶原复合物产品注册申请获得河北省食品药品监督管理局受理,静丙开发仍处于临床实验过程中,预计2017年后获得注册。 /p p 　　HPV检测产品市场推广工作稳步推进:公司分别在2015年12月和2016年6月取得了人类乳头瘤病毒(HPV)的核酸检测仪器认证和人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(生物芯片法)认证,至此公司的微流控平台技术的第一款产品,全自动HPV病毒检测系统完成。从三季度开始在不同区域不同类型的客户中进行了一定范围的试用,不仅获得了非常正面的市场反馈,而且得到了行业专家的认可 公司计划在四季度逐步加快HPV产品销售进度,同时密切关注此项新技术在大范围应用后可能遇到的反馈,根据客户不同的实际需求对产品进行持续研发,力争将公司微流控技术产品打造成技术先进、工艺领先、品质过硬的高端精品。我们认为,公司基于微流控技术平台研发的全自动病毒检测设备技术优势突出,未来必将成为公司业绩增长的高速推进器。 /p p 　　盈利预测和投资建议:我们预测,2016-2018年预计归属母公司净利润分别为 2,951万元、 5,758万元和 9,172万元,对应摊薄后 EPS 分别为 0.04元、0.07元和 0.11元。公司血制品业务改善明显,同时具有稀缺的资源性质,未来业绩提 升空间依然巨大。检测业务,公司已经形成了微量元素、微流控与质谱仪三大技术。其中微流控和质谱仪是具有垫付性质的检测平台型,目前 都处于市场开发的初期,其爆发潜力不可估量。我们维持增持评级。 br/ /p

p 　　用于生物样品分析的蛋白指纹法，该专利技术被国际顶级科学杂志《科学》以及医学界权威杂志《柳叶刀》评为世界蛋白指纹图谱和蛋白质芯片排名第一的技术。针对这项技术的一些问题，火石创造对许洋博士进行了深度的专访。 /p p style=" text-align: center " img width=" 300" height=" 385" title=" 001.png" style=" width: 300px height: 385px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/ebf3be8e-c0c2-49d6-9891-a76d207d183f.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 　　许洋博士 /strong /p p 　　许洋博士一直致力于蛋白质组学研究开发，怀揣近五十项蛋白分子质谱诊断技术的自主发明专利。2009年他创办了湖州赛尔迪生物医药科技有限公司，凭借专利产品蛋白指纹图谱仪成为行业领头羊，也成为此类器械行业标准的起草者。 /p p strong 　　火石：请问您为什么做蛋白质谱? /strong /p p 　　许洋博士：我研究蛋白质谱是偶然也是必然。在美国纽约著名的Sloan-Kettering研究所单克隆抗体实验室早期研究治疗白血病时，我们制造了全世界第一枚人源化单克隆抗体(抗CD33人源化单抗)。后来我又和顶尖美国公司合作第一个将人源化单克隆抗体做成了靶向药。有了扎实的基础，必然能在更窄的蛋白质谱领域做的更好。 /p p 　 strong 　火石：蛋白质谱当前的临床应用情况如何? /strong /p p 　　许洋博士：只有拿到医疗器械注册证才算进入临床，蛋白质谱目前只有三种临床应用：对肿瘤的筛查 对早期肾脏疾病的分析 在细菌上的鉴定应用。蛋白质谱在国内仍处于非常早期的阶段，且具有垄断性，极少人能做且在做。 /p p strong 　　火石：作为国家“千人计划”医疗器械特聘专家，您认为蛋白指纹图谱仪在医疗器械中的角色是什么? /strong /p p 　　许洋博士：蛋白指纹图谱仪分析的大数据可以生动地比喻为人体疾病的健康地图。 /p p 　　蛋白指纹究竟是什么?把质谱仪的显示屏中的每一个蛋白质都用一个分子量来表达，这些分子量组合起来就叫蛋白指纹。就像每个人的指纹都是不同的，每种疾病的特定蛋白质表达物也不同，称之为指纹图谱。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器——表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征。这种方法具有微量、精确、简易、快速的特点，适应于基础和临床等各个领域。 /p p 　　之所以将蛋白指纹图谱仪分析的大数据比喻为人体疾病的健康地图(MAP)，是因为既然β2—微球蛋白是11731、人绒毛膜促性腺激素是37580、转甲状腺素蛋白是13761(数字对于计算机的应用更好管理)，而每个蛋白质在质谱仪分析中都是数字，它本身就是大数据。任何物质在质谱底下都是数字，综合起来就是大数据。我把大数据串联起来，就能将分子在身体的MAP做出来。譬如一位吸烟的男士来体检，能发现他吸了烟数年之后肺部出现影像学病理性位点，结合质谱仪分析发现相关的疾病标志物，我们能够模拟出肺部疾病的健康地图，即通过质谱仪检测的健康大数据，可以模拟出该患者肺部出现了数个小红点，点击每个红点后都会解释原因，如显示铅、铬等数据是否超标，以及告诉你相应的对策。这样的技术开启了全智能健康4.0时代。 /p p 　　Tips：β2—微球蛋白(β2—MG)被认为是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要参考价值，因此β2—微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。 /p p 　　 strong 火石：您和您的团队在蛋白质组学研究的技术或者方法上有什么突破吗? /strong /p p 　　许洋博士：蛋白质作为标志物对肿瘤的诊断，确实没有太大的进展。 /p p 　　一直以来蛋白质组学研究面临的重大瓶颈是蛋白质分离问题：人体内有十万种蛋白质与衍生物，多数可能与疾病有关联，但这十万种蛋白质与衍生物只有分开后，质谱才能分析清楚。此前蛋白质组学技术中最流行、最通用的蛋白质分离方法是双向电泳，基本上能分离近二千种血浆蛋白质，远远不及十万种，所以成为了瓶颈。 /p p 　　2006年我提出了一个设想：和蛋白有关的抗体至少有一万多种，那为什么不用抗体来分离蛋白质?这件事一直有人在做，但之前都没有人想到用抗体组把一千个蛋白质一次性快速、实时地分离出来。之后就诞生了免疫质谱分析方法(专利号ZL 200610140652.0)，可以在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析，还可以同时检测多个生物标志群。用免疫组质谱技术能测定抗原变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。 /p p 　　Tips:免疫质谱分析方法：质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。 /p p 　　双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)：是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。目前是快速成长的蛋白质组学技术中最流行最通用的蛋白质分离方法。目前2D-PAGE能够在同一块凝胶上同步检测和定量数千个蛋白质。 /p p 　　从整个2015年的政策看，医疗器械行业是受到国家大力扶持的，行业地位与重要性大幅提升，法规向国际化看齐，行业监管不断趋严，医疗器械正成为与药物齐头并进的新兴产业。 /p p 　　 strong 火石：是什么驱动着行业的高增长? /strong /p p 　　许洋博士：一是需求，老龄化加剧，家庭支付能力增强，导致医疗需求高增长 二是政府加大医疗卫生投入，《医疗器械科技产业“十二五”专项规划》表示，“十二五”期间将扶植形成8～10家产值超过50亿元的大型医疗器械产业集团 三是为配合新医改完善基层医疗建设的目标 四是国内生物技术研发应用进入突破期。 /p p 　　 strong 火石：您认为接下来医疗器械未来发展的特点和前景会是怎么样的? /strong /p p 　　许洋博士：未来5年，医疗器械和制药占比将会达到1:1。近十年，我国医疗器械市场规模快速增长，国内医疗器械工业总产值从2003年的189亿人民币上升到2013年的1889亿，2013年同比增长21%，增长速度远快于药品。预计在未来5年左右，我国医疗器械行业仍然将保持高速增长。医疗器械行业涉及到医药、机械、电子、塑料等多个行业，中高端医疗器械更是多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，研发成本高，决定了只有大型厂商才能在大中型医疗器械方面有所作为。此外，器械“国产化”也会成为必然趋势。 /p p 　　 strong 火石：赛尔迪当前开展的业务、研发的产品有哪些?公司部署战略是怎么样的? /strong /p p 　　许洋博士：我们现在正在做一张人类的大健康MAP。通过精准医疗计划，基于环境健康大数据，通过蛋白指纹图谱仪完成健康管理。现在的疾病市场最关注的问题分别是：检测0～6岁儿童智力、优生优育(为什么生不出聪明宝宝)、高达5千万的肿瘤人群以及3.5亿的高血压、糖尿病人群。 /p p 　　其中糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的并发症之一，是糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常那个渐进性肾功能损害。而微量白蛋白尿即早期糖尿病肾病是可逆的，这不同于大量白蛋白尿即临床糖尿病肾病，因此积极防治早期糖尿病肾病就显得尤为重要。去年底，赛尔迪公司与中国医学科学院北京协和医院签署协议，承担国家对糖尿病肾病体内铅、镉毒素的临床大样本检测。全新升级的蛋白指纹图谱仪，是目前唯一获国家药监局批准、能检测含微量白蛋白、β2—微球蛋白以及泛素3项指标的医疗器械。这对糖尿病肾病的早发现、早治疗具有重大意义。 /p p 　　赛尔迪接下来将按照个体化精准检测所附带的信息，由这些信息与大数据库交流，提出符合个体化治疗的方案，向个体化精准医学管理方式转变。 /p p 　　随着大数据时代的来临，“互联网+”概念的提出让医疗健康事业呈现出了新的发展势态和特征。医学知识体系正被大数据、精准医疗所重构，信息化进程提高了知识传递速度与医疗协同效率。 /p p strong 　　火石：蛋白质组学技术如何助推精准医疗? /strong /p p 　　许洋博士：常识知道铅、镉会引起糖尿病性肾病。但铅、镉指标不是医院常规检测的项目。如果采取个体化精准治疗，每年常规检查一次体内铅与镉的指标，发现异常就能进行针对性的从尿液排泄的治疗。已经得了肾病正在透析的病人，检测铅与镉指标后进行针对性排泄也会增强治疗效果。利用蛋白指纹图谱仪能够发现早期的肿瘤和心血管标志物，这就会对疾病的治疗带来极大的希望。随着质谱技术在精准医疗的应用，越来越多的个体化标志物将会被发现，人体的蛋白指纹图谱测定将会成为医院的常规工作。 /p p 　　精准医疗，即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。正确的选中一个工具，解决关键问题，这就是精准医疗。基于基因组测序技术、生物医学工具以及大数据工具逐步成熟和完善，精准医疗能够为个体基因特征、环境以及生活习惯进行疾病干预及治疗，但如何尽快与大数据结合才是发展重点。日前我与北京协和医院合作，创立了中国特色的首个百万人疾病与环境毒素数据库与IMS(爱睦世)特检中心：HZIMS2008，首次在复杂疾病系统中构建了基于环境毒素大数据的移动网络数据库的质量控制体系，使我国重大疾病，如高血压、糖尿病、肿瘤的大数据病因学研究处于世界领先。 /p p /p

国家药典委员会于2012年12月11-13日在北京召开第十届药典委员会病毒制品专业委员会2012年第二次会议。病毒制品专业委员会委员、中检院、药品审评中心有关专家、国家食品药品监督管理局药品注册司相关负责人、国家药典委员会相关工作人员以及部分病毒性疫苗生产企业的代表参加了会议。会议就2015年版《中国药典》三部病毒类制品各论品种遴选、各论增修订及新增各论、病毒类制品相关标准提高课题、共性通则、附录等内容进行了审议，并就疫苗中硫柳汞使用问题进行讨论。现将会议确定的相关内容予以发布，请各有关单位予以关注并结合具体品种开展相关工作，及时提交相关资料。 　　一、《中国药典》2015年版三部病毒类制品品种遴选 　　1. 基于对人用狂犬病疫苗效期和稳定性等方面的综合考虑，为进一步保证人用狂犬病疫苗的质量，《中国药典》2015年版三部不再收载2010年版三部”人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)”、”人用狂犬病疫苗(Vero细胞)” 两个液体剂型的人用狂犬病疫苗，生产企业应加快开展人用狂犬病疫苗冻干剂型的研究，逐步取代同品种疫苗液体剂型。 　　2. 基于对风疹减毒活疫苗(兔肾细胞)生产用细胞来源动物等级和种群建立，以及与风疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)相比存在的潜在污染外源病毒的风险考虑，《中国药典》2015年版三部不再收载2010年版三部“风疹减毒活疫苗(兔肾细胞)”。 　　3. 增订“水痘减毒活疫苗”和“黄热减毒活疫苗”品种的收载。 　　二、病毒类制品相关各论增修订内容 　　1. 乙型脑炎减毒活疫苗 　　(1)SPF地鼠特定病毒检查增订淋巴细胞脉络丛脑炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型基础上，增加大鼠K病毒、汉坦病毒、小鼠微小病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠脊髓灰质炎病毒、猴病毒5、吐兰 H-a病毒以及逆转率病毒和地鼠多瘤病毒检测。 　　(2)脑内致病力试验用小鼠由原来的以体重计修订为按日龄计。 　　(3)乳鼠返祖试验增订“将脑内接种供试品后最早发病的乳鼠处死，取脑制成脑悬液”的规定 　　(4)对新制备的工作种子批连续制备的前三批疫苗原液增订“应进行病毒全基因序列测定，应与原始种子批保持一致”的规定。 　　(5)培养液使用的新生牛血清取消“灭能”的描述 “分装及冻干”项下取消半成品放置温度的描述，分装温度要求按“生物制品分装及冻干规程”通则的相关规定执行 取消病毒收获中可进行多次病毒收获的描述。 　　2. 人用狂犬病疫苗 　　(1)效价测定 　　增订检测方法成立的相关条件，包括(i)供试品和参考品小鼠50%保护剂量(ED50)的范围 (ii)检测攻击毒LD50病毒量 (iii)检测可信限范围(25%-400%)。 　　(2)病毒灭活工艺 　　根据相关报道，已经证明病毒灭活剂β-丙内酯可改变人血白蛋白结构致其产生致敏性。目前，国内绝大部分生产企业的病毒灭活工艺是“前灭活”，即在病毒收获液纯化前进行，由于病毒收获液中人血白蛋白保护剂没有经过纯化工艺去除，“前灭活”工艺将增加上述风险。基于以上考虑，《中国药典》2010年版三部收载的该品种生产工艺需进一步完善，以提高产品的质量和安全性。相关生产企业应尽快开展“后灭活“工艺(即病毒收获液纯化后进行灭活)研究、验证以及工艺变更的申报工作。国家药典委员会将根据生产企业工艺变更的情况另行组织讨论，确定相关品种的具体修订。 　　3. 其他各论共性修订 　　(1)根据最新WHO 相关指南的要求，原代细胞基质制备的疫苗，种子批检定增订分支杆菌检查。检测方法经验证后提交相关专业委员会审定，确认后纳入药典三部附录。 　　(2)冻干制剂成品增订pH测定, 各生产企业积累相关检测数据，据此制定各自制品的检测范围。 　　三、新增品种标准起草稿审定 　　标准起草承担单位中检院根据以下意见，结合批签发和生产企业提交的相关数据，对起草标准进行复核，并提出具体意见，提交专业委员会确定。 　　1. 黄热减毒活疫苗 　　(1)根据WHO “黄热减毒活疫苗质量、安全和有效性指南”中对我国使用黄热毒种来源和谱系分析结论，将毒种名称由17D修订为17D-204。 　　(2)种子批检定增订禽白血病病毒和禽腺病毒的检查，相关规定参照“流感病毒裂解疫苗”种子批禽外源病毒检查要求。 　　(3)成品残留卵清蛋白量和与细菌内毒素含量标准应与欧洲药典标准相一致，建议残留卵清蛋白量由“应不高于30ug/剂”修订为“应不高于5ug/剂” 细菌内毒素含量由“应不高于50EU/剂”修订为“应不高于5EU/剂” 　　(4)相关生产企业应尽快将原液蛋白质含量检测结果和统计学数据提交标准起草单位中检院复核。 　　2. 水痘减毒活疫苗 　　(1)人二倍体细胞MRC5细胞株生产用细胞限定代次确定为“应不超过第35代”。 　　(2)生产用毒株Oka株主种子批按批准的执行，工作种子批应不超过第47代，生产的疫苗中的病毒代次应不超过第48代。 　　(3) 毒种检定病毒滴度标准为应不低于3.7 LgPFU/ml 　　(4)免疫原性检查免疫后采血时间规定为免疫后4-6周 间接免疫荧光法测定抗体标准维持FAMA1:4为阴性，≥1:4为阳性 　　(5)鉴于各生产企业配方成分各异，疫苗复溶后颜色各不相同，外观项下复溶规定为“澄清液体，无异物”，复溶后液体的颜色不作一致性规定。 　　四、标准提高课题 　　1. 外源性DNA残留量测定法(DNA探针杂交法)修订 　　(1) 为避免对检测结果的干扰， DNA稀释液中取消鱼精DNA的加入 　　(2)蛋白酶缓冲液成分中取消“5mol/L氯化钠溶液2.0ml”以避免样品处理过程中出现白色絮状沉淀 　　(2) 点膜操作DNA固定增加紫外交联法 　　(4)检测方法中不规定采用酚-三氯甲烷抽提，生产也可采用其他方法或试剂进行抽提，无论采用何种方式进行抽提，检测Vero细胞DNA参考品至少应能够达到10pg的检测限。 　　2. 宿主蛋白残留量测定法 　　《中国药典》2010年版三部收载的相关病毒疫苗成品测定项下规定的残留宿主细胞蛋白检测及限度是基于产品工艺相关的宿主细胞残留蛋白，由于不同厂家制备试剂盒包被用抗体和酶标抗体所用的细胞蛋白(抗原)制备的方式不同，所检测到的宿主细胞残留蛋白存在相当的差异，因而导致检测结果的差异。生产企业在选择和变更试剂盒时应进行适用性验证，以确定所用试剂能检测疫苗生产工艺残留的相关细胞蛋白。中检院将尽快开展相关宿主细胞蛋白质参考品的研究，以保证该项检测的标准化。 　　3. 病毒性疫苗生产用毒种基因库建立 　　生物制品生产检定用菌毒种管理规程增订对病毒性性疫苗三级种子批全基因序列测定要求，规定“工作种子批毒种基因序列应与原始种子批(或主种子批)保持一致”。生产企业应建立生产用毒种的基因背景资料 对于病毒性疫苗，特别是减毒活疫苗，相关生产企业应进一步开展病毒毒力、保护性抗原基因以及基因变异对病毒特性的影响等方面的分析研究。 　　4. 疫苗生产用胰酶的质量控制 　　根据目前国内外相关要求，制定疫苗生产用胰酶的质量控制标准，包括理化检定、生物安全控制以及病毒外源因子控制，暂不包括生产工艺以及病毒灭活的相关要求。国家药典委员会将组织相关参与单位开展标准起草，方法验证等工作。 　　五、相关通则、附录增修订建议 　　1. 生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程 　　(1)在规程总论中增订生产用昆虫细胞的概述要求。 　　(2)将电镜检查法作为外源病毒检查通用方法 　　(3)新型细胞均要求进行致瘤性和致癌性检查 　　(4)中检院开展PCR法进行支原体检查的方法学研究，在完成方法验证后，提交病毒专业委员会审议。 　　2. 病毒外源因子检查法 　　(1)在确认细胞规程与附录中的病毒外源因子检查法要求无差别的情况下，细胞规程中取消病毒外源因子检查法，统一按照附录中的检查法执行。 　　(2)根据生物技术专业委员会讨论的意见，确定重组制品病毒外源因子检查法单列还是与附录的“病毒外源因子检查法”整合 　　(3)增订特异性外源病毒检查的要求，根据疫苗生产毒种的来源和使用细胞基质进行相应特定外源病毒的检查，检测外源毒的种类和方法可在各论中作出规定。 　　3. 新生牛血清质量要求 　　(1) 概述中增订“胎牛血清”的定义，以明确对使用牛血清的分类 　　(2) 蛋白质含量测定采用现行药典三部附录VI B第一法或其他适宜方法。 　　(3)中检院进一步开展血红蛋白含量测定替代方法的研究，方法验证后提交病毒专业委员会审议检测方法的修订。 　　(4) 血红蛋白总量单位表示由“XXX %”修订为“XXXmg/dL” 　　(5) 积累不同企业更多批次的渗透压摩尔浓度检测数据，缩小现行检测限度范围 　　(6) 中检院开展牛腹泻病毒抗体检测方法学研究，方法验证后提交专业委员会审议。 　　六、关于疫苗中使用硫柳汞防腐剂的问题 　　目前我国上市的单剂量冻干疫苗均取消硫柳汞的加入，部分单剂量液体疫苗仍含有硫柳汞防腐剂。基于联合国环境署的全球限汞议案以及WHO对于疫苗中硫柳汞防腐剂使用的观点和我国疫苗生产企业的实际情况，建议相关生产企业加快开展单剂量液体疫苗取消硫柳汞防腐剂的工艺研究、验证工作和相关变更的申报 对于多剂量规格的疫苗，取消硫柳汞防腐剂可能存在一定的安全性风险，因此不建议取消防腐剂的添加，生产企业可开展硫柳汞防腐剂替代的相关研究。

博晖创新公告称，公司于6月18日签署股权转股协议，约定公司以现金1.5亿元收购贵州德弘昌持有的广东卫伦生物制药有限公司30%股权。 　　资料显示，广东卫伦拥有通过国家GMP认证的血液制品生产线以及符合国家标准的动物实验室一座，目前已取得包括人血白蛋白、冻干静注人免疫球蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白等多个血液制品再注册批准文件，技术实力较强。

博晖创新12月5日晚间公告，公司与贵州德弘昌生物科技有限公司签署了关于广东卫伦生物制药有限公司(简称&ldquo 广东卫伦&rdquo )股权收购框架协议，公司拟收购广东卫伦30%股权，最终价格待审计、评估后确定。 　　公告显示，广东卫伦拥有《药品生产许可证》及《药品GMP证书》，广东卫伦下属单采血浆子公司拥有《单采血浆许可证》。此外，广东卫伦拥有通过国家GMP认证的血液制品生产线以及符合国家标准的动物实验室一座，目前已取得的血液制品再注册批准文件包括人血白蛋白(5个规格)、冻干静注人免疫球蛋白(pH4)(2个规格)、人免疫球蛋白(1个规格)、乙型肝炎人免疫球蛋白(2个规格)、破伤风人免疫球蛋白(1个规格)、狂犬病人免疫球蛋白(3个规格)等。 　　交易完成后的广东卫伦将继续从事血液制品的研究、开发、生产、销售业务，并加大投入，针对当前市场旺盛需求，进行深度开发，提高血浆原料的综合利用度。博晖创新承诺，未来三年，将按照市场化和合作共赢原则，每年由公司关联公司向广东卫伦调拨不低于100吨血浆或100吨血浆对应的组分(II+ III 等)。 　　博晖创新表示，血液制品行业具有需求刚性、资源稀缺、特许经营等特点，因此一直以来行业景气度较高，并受到国家政策的重点扶持。公司拟通过此次股权收购，进入血液制品行业，在原有业务基础上，在医药行业拓展新的业务领域和产业机会。

GEWestern Blot实验相关产品秋季开学特惠 活动日期： 2012年即日起至10月31日 GE从蛋白制备、电泳、转印及杂交到显色、成像，为您带来完全的蛋白印迹方案。 详情请见www.reagent.com.cn 细胞组织裂解 -- 样本研磨试剂盒 蛋白抽提 -- 蛋白抽提缓冲液试剂 蛋白稳定化 -- 混合蛋白酶抑制剂及核酶 混合物 蛋白分级化 -- 蛋白分级试剂盒 蛋白定量 -- 蛋白定量试剂盒 垂直电泳 -- SE250/SE260 电泳试剂 蛋白Marker -- 彩虹分子量标准 蛋白Marker -- Amersham ECL DualVue 免疫 印迹标准

胰蛋白酶消化，质谱法轻松鉴定蛋白质，已经是非常成熟的工作流程。即使是刚接触MS的使用者也可以很快掌握。在质谱法鉴定蛋白的工作流程中，蛋白质鉴定是通过使用搜索引擎，例如 Mascot或Matrix Science进行简单的数据库搜索来实现的。然而，对于数据库中未列出的蛋白质鉴定需求，或需要进行蛋白质末端序列分析的这两种情况，通常采用更昂贵的高端仪器和更复杂的工作流程，需要熟练的操作员。此外，蛋白质测序仪也通常用作蛋白质末端序列分析的方法，但遇到 N 端封闭的蛋白质，去封闭是必要的。作为样品序列分析前的预处理，预处理效果取决于蛋白质类型，可能效果不佳，对操作人员有一定要求，需要一定程度的技能和经验，这些可能会限制其使用。 近年来，利用MALDI-TOF离子源（ISD：In-Source Decay）中发生的蛋白质碎裂离子，可以分析N末端被封闭或未在数据库中登记的蛋白质序列MS图谱。此外，ISD理论上不受每个样品质量的限制，因此无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质进行测序。结合电泳胶提取蛋白和岛津台式机MALDI-8020，通过N端封闭蛋白的分子量测定和序列分析的例子，让我们来了解下大蛋白分子直接测序技术MALDI-ISD。 将模型样品N 端被乙酰化的牛碳酸酐酶 (Sigma-Aldrich)溶解在缓冲溶液中进行电泳， 95 °C 下加热 5 分钟，然后在聚丙烯酰胺凝胶（ATTO 12.5 %，预制 e-PAGEL）上进行电泳。所得聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色以检测蛋白质斑点。使用含有表面活性剂的提取缓冲溶液，我们从凝胶分离的碳酸酐酶的条带中提取蛋白质。使用氯仿/甲醇在提取缓冲溶液中沉淀蛋白质以去除表面活性剂和盐，并使用 MALDI-TOF 质谱仪进行测量。芥子酸用作 MALDI 基质用于蛋白质分子量测量，1,5-二氨基萘 (DAN) 用于 ISD 的序列分析。 图1、碳酸酐酶电泳图图2、从凝胶中提取的碳酸酐酶MS图（基质芥子酸） 接下来，从25 pmol凝胶蛋白条带中提取碳酸酐酶，与基质DAN混合，MALDI-8020线性模式进一步分析。结果如图3所示，主要检测到c离子（从蛋白质N段产生的片段）质量一致的峰。通过使用免费软件Mass++ TM和蛋白质氨基酸序列比对工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，我们对从检测到的峰中获得的氨基酸序列进行了同源性搜索。 图3、MALDI-ISD鉴定结果 鉴定结果显示匹配结果最高的是碳酸酐酶。通过检测到的c离子片段质量和数据库中已有的碳酸酐酶氨基酸序列，我们可以推断出N段序列是SHHWGYGKH...，并且是N-乙酰化的。 MALDI-8020线性模式MALDI-ISD技术，无需复杂的工作流程，无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质（如本文所述m/z 29030示例）进行N端测序。 该方法在岛津应用专家与美国佛罗里达州立大学、日本爱媛大学高级研究支持中心生物医学分析部、利物浦大学生化与系统生物学系等共同发表的一篇文献中也有应用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝胶的预分馏，实现质谱法鉴定完整蛋白或蛋白复合物。凝胶分离回收14种人血清蛋白，提取后，用MALDI-8020的MALDI-ISD产生的产物离子鉴定人血清白蛋白N端氨基酸序列。 MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧，性能卓越的特色产品。荣获2018 IBO工业设计大奖银奖。 主要特点：● 线性台式MALDI-TOF● 200Hz固态激光器，355nm波长● 进样速度快● TrueClean™ 自动源清洁功能。配备大口径离子光学系统，使仪器长期使用中源的污染风险降到最低。配备基于紫外激光器的源清洁功能，可自动快速实现源自清洁。● 静音（参考文献：岛津应用新闻 No.B83J. Proteome Res. 2020, 19, 3779−3791

博晖创新与沃森生物6月24日晚间公告，将就大安制药的股权进行双向质押，以此来加强双方的合作。 　　2014年10月，沃森生物、博晖创新的实际控制人杜江涛以及河北大安制药有限公司签署了股权转让协议书，杜江涛受让了沃森生物持有的大安制药46%股权。2014年12月，杜江涛与博晖创新签署协议，约定博晖创新向杜江涛发行股份购买其持有的目标公司46%股权。 　　博晖创新表示，为继续履行股权转让协议书项下的相关事项，经各方友好协商，公司拟与沃森生物签订《股权质押协议》，将公司持有的大安制药46%股权质押给沃森生物。同时沃森生物也拟与公司签订《股权质押协议》，将其持有的大安制药44%股权质押给公司。本次股权质押有利于公司与沃森生物更好地履行股权转让协议书中约定的各项权利与义务，共同促进大安制药的持续发展。 　　大安制药从事血液制品的研发、生产和销售，主要产品包括人血白蛋白和人免疫球蛋白。

蛋白质作为生命活动的执行者,通过自身结构的动态改变,以及与其他蛋白质相互作用组装为蛋白质复合物,调控各种生物学过程。因此,如何实现蛋白质复合物的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。化学交联结合质谱(CXMS)技术作为蛋白质复合物解析的新兴技术,利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质分子内或分子间的氨基酸残基以共价键连接起来,再利用液相色谱-质谱联用对交联肽段进行鉴定,实现蛋白质复合物的组成、界面和相互作用位点的解析。该技术具有分析通量高、灵敏度高、可提供蛋白质间相互作用的界面信息、普遍适用于不同种类和复杂程度的生物样品等优势,已成为X射线晶体衍射、低温冷冻电镜、免疫共沉淀等蛋白质复合物研究技术的重要补充。化学交联位点的鉴定覆盖度和准确度决定着该技术对于蛋白质复合物结构的解析能力。目前,为了实现蛋白质复合物的高覆盖度交联,研究人员发展了可用于共价交联赖氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基、精氨酸(R)的胍基以及半胱氨酸(C)的巯基等多种活性基团的新型交联剂。进而,为了提高低丰度交联肽段的鉴定灵敏度,体积排阻色谱法、强阳离子交换色谱法,及亲和基团富集策略被提出用于交联肽段的高选择性富集,如可富集型化学可断裂交联剂——Leiker,与不具备富集功能的交联剂相比,通过亲和富集可以将交联位点鉴定数目提高4倍以上。胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)的酶切位点与胰蛋白酶互为镜像,可特异地切割赖氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特点,电荷主要分布在交联肽段的N端,在碰撞诱导裂解(CID)和高能诱导裂解(HCD)模式下产生以b离子为主的碎片离子,与胰蛋白酶酶切肽段以y离子为主的碎片离子互为镜像补充,为胰蛋白酶酶解肽段在质谱鉴定中b离子缺失严重的问题提供了很好的解决办法。由于具有较高的酶切特异性和酶活性,镜像酶已经成功地应用于蛋白质C末端蛋白质组鉴定、磷酸化蛋白质组研究、甲基化蛋白质组鉴定等方面,然而在CXMS中的应用仍未见报道。为进一步提高对蛋白质复合物结构及相互作用位点的解析能力,本文发展了LysargiNase与胰蛋白酶联合酶切的方法,基于镜像酶正交切割的互补特性,通过产生赖氨酸及精氨酸镜像分布的交联肽段,以增加特征碎片离子数量和肽段匹配连续性,从而提升交联肽段的谱图鉴定质量,达到提高交联位点的鉴定覆盖度和准确度的目的。通过分别对牛血清白蛋白及大肠杆菌全蛋白样品的交联位点鉴定结果的考察,评价该策略对单一蛋白样品和复杂细胞裂解液样品蛋白质复合物表征的应用潜力。蛋白质样品制备称取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作为缓冲体系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。大肠杆菌细胞(种属K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培养基培养24 h,然后于4 ℃以4000 g离心2 min,收集细胞沉淀。细胞沉淀采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后,悬浮于细胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制剂)中,冰浴超声破碎180 s(30%能量,10 s开,10 s关)。匀浆液于4 ℃以20000 g离心40 min,收集上清,采用BCA试剂盒测定所得蛋白质含量。稀释大肠杆菌蛋白裂解液至蛋白质含量为0.5 mg/mL。化学交联样品制备以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)为溶剂配制浓度为20 mmol/L 的BS3交联剂母液 将交联剂母液加入牛血清白蛋白的缓冲溶液及大肠杆菌蛋白裂解液中,使交联剂的终浓度为1 mmol/L,在室温条件下反应15 min 通过添加终浓度为50 mmol/L的淬灭溶液NH4HCO3进行交联反应淬灭,并在室温下孵育15 min 在冰浴条件下,将交联样品逐渐滴入8倍体积的预冷丙酮中,于-20 ℃静置过夜 在4 ℃条件下,以16000 g转速离心,去除丙酮,然后将交联蛋白用预冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室温挥发掉残余的丙酮 以8 mol/L尿素溶液复溶蛋白质沉淀 将牛血清白蛋白交联样品以5 mmol/LTCEP作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原 将大肠杆菌样品以5 mmol/LDTT作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原,避免大肠杆菌蛋白在酸性条件下发生变性 添加终浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室温下反应30 min 以50 mmol/LNH4HCO3稀释样品至尿素浓度为0.8 mol/L后,将样品均分为两份,一份以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈50:1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,另一份加入终浓度为20 mmol/L的CaCl2,以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈20:1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃温度下酶解过夜。液相色谱-质谱鉴定及数据搜索上述所有样品经过除盐,使用0.1%甲酸(FA)溶液复溶,用超微量分光光度计测定肽段浓度,进行反相高效色谱分离和质谱分析。牛血清白蛋白样品采用Easy-nano LC 1000系统偶联Q-Exactive质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA) 流动相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~10 min, 2%B~7%B 10~60 min, 7%B~23%B 60~80 min, 23%B~40%B 80~82 min, 40%B~80%B 82~95 min, 80%B。Q-Exactive质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 300~1800,分辨率为70000(m/z=200),自动增益控制(AGC)为3×106,最大注入时间(IT)为60 ms,母离子分离窗口为m/z 2。MS/MS扫描的分辨率为17500(m/z=200),碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量(NCE)为35%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms,仅选择电荷值为3~7且强度高于1000的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。大肠杆菌样品采用EASY-nano LC 1200系统偶联Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液 流动相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~28 min, 5%B~16%B 28~58 min, 16%B~34%B 58~77 min, 34%B~48%B 77~78 min, 48%B~95%B 78~85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 350~1500,分辨率为60000(m/z=200), AGC为4×105, IT为50 ms,母离子分离窗口为m/z 1.6。MS2扫描的分辨率为15000(m/z=200),碎裂模式为HCD, NCE为30%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms。仅选择电荷值为3~7且强度高于2×104的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。质谱数据文件(*.raw)采用pLink 2软件(2.3.9)对交联信息进行检索和鉴定。使用从UniProt于2019年4月27日下载的牛血清白蛋白序列和大肠杆菌序列,搜索参数如下:酶切方式为胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端) 漏切位点个数为3 一级扫描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5 二级扫描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5 每条肽段的质量范围为500~1000 Da 肽段长度的范围为5~100个氨基酸 固定修饰为半胱氨酸还原烷基化(carbamidomethyl [C]) 可变修饰为甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白质N端乙酰化(acetyl [protein N-term]) 肽段谱图匹配错误发现率(FDR)≤5%。映射胰蛋白酶与LysargiNase酶解样品的交联位点在牛血清 白蛋白晶体结构(PDB: 3V03)的映射 LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品的交联位点对及单一交联位点的互补性LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品共同得到的交联位点鉴定打分比较b+/++与y+/++离子碎片分别在α/β-肽段的碎片覆盖度LysargiNase与胰蛋白酶酶解的交联肽段质谱图大肠杆菌样品中LysargiNase与胰蛋白酶酶切鉴定蛋白质复合物信息互补性带点击了解原文：https://www.chrom-china.com/article/2022/1000-8713/1000-8713-40-3-224.shtml

2014年3月28日，国家药典委员会官网发布关于《中国药典》2015年版通则(草案)公开征求意见的通知。通知中称，目前国家药典委组织相关专业委员会已完成了通则(附录)编制及编码的研究工作，并于2014年1月通过国家药典委员会官网的药典论坛向全体药典委员征求意见。 　　《中国药典》2015年版总（草案）则征求意见稿显示，2010年版《中国药典》中药、化学药、生物制品三部分别收载的附录凡例、制剂通则、分析方法指导原则、药用辅料等三合一，独立成卷作为第四部。 　　2015版《中国药典》通则目录及增修订征求意见稿增订了多种仪器和方法，如电感耦合等离子体质谱法，(拟)新增了拉曼光谱法、超临界流体色谱法、临界点色谱法、农药残留量测定法、黄曲霉毒素测定法，(拟)新增了抑菌效力检查法、组胺类物质检查法、中药材DNA条形码分子鉴定法、元素形态及其价态测定法等。 　　通知原文如下： 关于对《中国药典》2015年版通则(草案)公开征求意见的通知 　　各有关单位： 　　根据《中国药典》2015年版编制大纲有关要求，我委组织相关专业委员会开展了药典一、二、三部附录整合、增修订及单独成卷工作。经过各相关专业委员会的努力和各有关单位的大力配合，目前已完成了通则(附录)编制及编码的研究工作，并于2014年1月通过我委网站的药典论坛向全体药典委员征求意见。根据反馈意见和建议，目前已形成了&ldquo 《中国药典》2015年版总则(草案)&rdquo 的整体框架和内容。现将有关事项通知并说明如下： 　　一、为进一步完善新版药典总则内容，我委将对药典总则(草案)整体框架和药典通则内容(征求意见稿)分批在网站公开征求意见，现将第一批征求意见稿予以公示，即日起公示期为三个月。 　　二、独立一卷的名称为&ldquo 《中国药典》2015年版总则&rdquo ，包括现有药典一部、二部、三部的附录内容和药用辅料品种正文(详见附件1)。 　　三、通则编码拟采用&ldquo XXYY&rdquo 两层四位罗马数字来表示，其中XX代表现有附录编码的大罗马字母(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ&hellip &hellip )，YY代表现有附录编码的英文字母(A、B、C&hellip &hellip )。新旧附录/通则编码对照表详见附件2。 　　四、根据文字整合和试验研究，已完成的增修订通则草案详见附件3。请相关单位认真研核，若有异议，可填写反馈意见表(见附件4.)，并附相关说明及/或实验数据，以来文来函或电子邮件的方式反馈我委。未完成的增修订内容将在第二批进行公示。 　　五、为保证《中国药典》2015年版的顺利实施，我委对药典通则内容在网上公示的同时，也将其进行汇编成册，并于2014年4月份举办新版药典通则增修订内容的宣讲班，以便广大药品标准工作者更好地了解《中国药典》2015年版总则的编制情况，请予以关注。 　　六、联系人及联系方式： 　　许华玉(电话：010&ndash 67079521) 　　靳桂民(电话：010&ndash 67079527) 　　洪小栩(电话：010&ndash 67079593) 　　传 真：010&ndash 67152769 　　E-mail: ywzhc@chp.org.cn 　　附件： 　　1. 《中国药典》2015年版总则(草案) 　　2. 新旧附录/通则编码对照表 　　3. 《中国药典》2015年版通则目录及增修订内容 　　0100 制剂通则 　　0101 片剂 　　0102 注射剂 　　0103 胶囊剂 　　0104 颗粒剂 　　0105 眼用制剂 　　0106 鼻用制剂 　　0107 栓剂 　　0108 软膏剂 　　0109 乳膏剂 　　0110 糊剂 　　0111 吸入制剂 　　0112 喷雾剂 　　0113 气雾剂 　　0114 凝胶剂 　　0115 散剂 　　0116 滴丸剂 　　0117 糖丸 　　0118 糖浆剂 　　0119 搽剂 　　0120 涂剂 　　0121 涂膜剂 　　0122 酊剂 　　0123 贴剂 　　0124 贴膏剂 　　0125 口服溶液剂口服混悬剂口服乳剂 　　0126 植入剂 　　0127 膜剂 　　0128 耳用制剂 　　0129 洗剂 　　0130 冲洗剂 　　0131 灌肠剂 　　0181 丸剂 　　0182 合剂 　　0183 锭剂 　　0184 煎膏剂(膏滋) 　　0185 胶剂 　　0186 酒剂 　　0187 流浸膏剂与浸膏剂 　　0188 膏药 　　0189 露剂 　　0190 茶剂 　　0200 其他通则 　　0211 药材和饮片取样法(未修订) 　　0212 药材和饮片检定通则(第二增补本) 　　0213 炮制通则(未修订) 　　0251 药用辅料通则 　　0261 制药用水 　　0271 药包材通则(待定) 　　0272 玻璃容器(待定) 　　0291 国家药品标准物质通则(第二增补本) 　　0300 　　0301 一般鉴别试验(第二增补本) 　　0400 光谱法 　　0401 紫外-可见分光光度法 　　0402 红外分光光度法 　　0405 荧光分光光度法 　　0406 原子吸收分光光度法 　　0407 火焰光度法 　　0411 电感耦合等离子体原子发射光谱法 　　0412 电感耦合等离子体质谱法(增订) 　　0421 拉曼光谱法(新增) 　　0431 质谱法 　　0441 核磁共振波谱法 　　0451 X射线衍射法 　　0500 色谱法(未修订) 　　0501 纸色谱法 　　0502 薄层色谱法 　　0511 柱色谱法(未修订) 　　0512 高效液相色谱法 　　0513 离子色谱法 　　0514 分子排阻色谱法 　　0521 气相色谱法 　　0531 超临界流体色谱法(拟新增) 　　0532 临界点色谱法(拟新增) 　　0541 电泳法 　　0542 毛细管电泳法 　　0600 物理常数测定法 　　0601 相对密度测定法(未修订) 　　0611 馏程测定法 　　0612 熔点测定法 　　0613 凝点测定法 　　0621 旋光度测定法 　　0622 折光率测定法(未修订) 　　0631 pH值测定法 　　0632 渗透压摩尔浓度测定法 　　0633 黏度测定法 　　0661 热分析法(第二增补本) 　　0681 制药用水电导率测定法(未修订) 　　0682 制药用水中总有机碳测定法(未修订) 　　0700 其他测定法Other Assays 　　0701 电位滴定法与永停滴定法(未修订) 　　0702 非水溶液滴定法 　　0703 氧瓶燃烧法(未修订) 　　0704 氮测定法 　　0711 乙醇量测定法 　　0712 甲氧基、乙氧基与羟丙氧基测定法(未修订) 　　0713 脂肪与脂肪油测定法(未修订) 　　0721 维生素A测定法(未修订) 　　0722 维生素D测定法(未修订) 　　0731 蛋白质含量测定法 　　0800 限量检查法 　　0801 氯化物检查法(未修订) 　　0802 硫酸盐检查法(未修订) 　　0803 硫化物检查法(未修订) 　　0804 硒检查法(未修订) 　　0805 氟检查法(未修订) 　　0806 氰化物检查法 　　0807 铁盐检查法(未修订) 　　0808 铵盐检查法(第二增补本) 　　0821 重金属检查法(第一增补本) 　　0822 砷盐检查法(未修订) 　　0831 干燥失重测定法 　　0832 水分测定法 　　0841 炽灼残渣检查法(第二增补本) 　　0842 易炭化物检查法(未修订) 　　0861 残留溶剂测定法(未修订) 　　0871 甲醇量检查法 　　0872 合成多肽中的醋酸测定法(未修订) 　　0873 2-乙基己酸测定法(未修订) 　　0900 物理特性检查法 　　0901 溶液颜色检查法 　　0902 澄清度检查法 　　0903 不溶性微粒检查法 　　0904 可见异物检查法 　　0921 崩解时限检查法 　　0922 融变时限检查法(未修订) 　　0923 片剂脆碎度检查法(未修订) 　　0931 溶出度测定法(合并释放度测定法) 　　0941 含量均匀度检查法 　　0942 最低装量检查法 　　0951 吸入制剂微细粒子的空气动力学评价方法(原雾滴粒分布测定法) 　　0952 贴膏剂黏附力测定法 　　0981 结晶性检查法(未修订) 　　0982 粒度和粒度分布测定法(第一增补本) 　　0983 锥入度测定法 　　1000 分子生物学技术 　　1001 核酸分子鉴定法(待定) 　　1100 生物检查法 　　1101 无菌检查法 　　1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 　　1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 　　1107 非无菌药品微生物限度标准 　　1121 抑菌效力检查法(第三增补本、新增) 　　1141 异常毒性检查法 　　1142 热原检查法 　　1143 细菌内毒素检查法 　　1144 升压物质检查法　　1145 降压物质检查法(未修订) 　　1146 组胺类物质检查法(新增) 　　1147 过敏反应检查法(未修订) 　　1148 溶血与凝聚检查法 　　1200 生物活性测定法 　　1201 抗生素微生物检定法(未修订) 　　1202 青霉素酶及其活力测定法(未修订) 　　1205 升压素生物测定法 　　1206 细胞色素C活力测定法(未修订) 　　1207 玻璃酸酶测定法(未修订) 　　1208 肝素生物测定法(第三增补本) 　　1209 绒促性素生物测定法 　　1210 缩宫素生物测定法 　　1211 胰岛素生物测定法(未修订) 　　1212 精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用检查法(未修订) 　　1213 硫酸鱼精蛋白生物测定法(未修订) 　　1214 洋地黄生物测定法(未修订) 　　1215 葡萄糖酸锑钠毒力检查法(未修订) 　　1216 卵泡刺激素生物测定法 　　1217 黄体生成素生物测定法 　　1218 降钙素生物测定法 　　1219 生长激素生物测定法(未修订) 　　1401 放射性药品检定法(未修订) 　　1421 灭菌法(未修订) 　　1431 生物检定统计法(未修订) 　　2000 中药相关检查方法 　　2001 显微鉴别法(第二增补本) 　　2002 中药材DNA条形码分子鉴定法(新增) 　　2101 膨胀度测定法(第二增补本) 　　2102 膏药软化点测定法(未修订) 　　2201 浸出物测定法(未修订) 　　2202 鞣质含量测定法(第二增补本) 　　2203 桉油精含量测定法(未修订) 　　2204 挥发油测定法(未修订) 　　2301 药材和饮片杂质检查法 　　2302 灰分测定法(未修订) 　　2303 酸败度测定法(未修订) 　　2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法(未修订) 　　2322 元素形态及其价态测定法（拟新增） 　　2331 二氧化硫残留量测定法 　　2341 农药残留量测定法（第二增补本+增订） 　　2351 黄曲霉毒素测定法（第二增补本+增订） 　　2400 中药注射剂有关物质检查法(拟修订) 　　2401 中药注射剂蛋白质检查法(待定) 　　2402 中药注射剂鞣质检查法(待定) 　　2403 中药注射剂树脂检查法(待定) 　　2404 中药注射剂草酸盐检查法(待定) 　　2405 中药注射剂钾离子检查法(待定) 　　2406 中药注射剂高分子聚合物检查法(待定) 　　3000 生物制品相关检查方法(待定) 　　3100 含量测定法 　　3101 固体总量测定法 　　3102 唾液酸测定法 　　3103 磷测定法 　　3104 硫酸铵测定法 　　3105 亚硫酸氢钠测定法 　　3106 氢氧化铝(或磷酸铝)测定法 　　3107 氯化钠测定法 　　3108 枸橼酸离子测定法 　　3109 辛酸钠测定法 　　3110 乙酰色氨酸测定法 　　3111 苯酚测定法 　　3112 间甲酚测定法 　　3113 硫柳汞测定法 　　3114 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯含量测定法 　　3115 O-乙酰基测定法 　　3116 己二酰肼含量测定法 　　3117 高分子结合物含量测定法 　　3118 人血液制品中糖及糖醇测定法 　　3119 人血白蛋白多聚体测定法 　　3120 人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法 　　3121 人免疫球蛋白类制品甘氨酸含量测定法 　　3122 重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定法 　　3123 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法 　　3124 IgG含量测定法 　　3200 化学残留物测定法 　　3201 乙醇残留量测定法 　　3202 聚乙二醇残留量测定法 　　3203 聚山梨酯80残留量测定法 　　3204 戊二醛残留量测定法 　　3205 磷酸三丁酯残留量测定法 　　3206 碳二亚胺(EDAC)残留量测定法 　　3207 游离甲醛测定法 　　3208 人血白蛋白铝残留量测定法 　　3300　 微生物检查法 　　3301 支原体检查法 　　3302 病毒外源因子检查法 　　3303 鼠源性病毒检查法 　　3400　 生物测定法 　　3401 免疫印迹法 　　3402 免疫斑点法 　　3403 免疫双扩散法 　　3404 免疫电泳法 　　3405 肽图检查法 　　3406 质粒丢失率检查法 　　3407 SV40核酸序列检查法 　　3408 外源性DNA残留量测定法 　　3409 抗生素残留量检查法(培养法) 　　3410 激肽释放酶原激活剂测定法 　　3411 抗补体活性测定法 　　3412 牛血清白蛋白残留量测定法 　　3413 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法 　　3414 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法 　　3415 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法 　　3416 类A血型物质测定法 　　3417 鼠IgG残留量测定法 　　3418 无细胞百日咳疫苗鉴别试验(酶联免疫法) 　　3419 抗毒素、抗血清制品鉴别试验(酶联免疫法) 　　3420 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法 　　3421 伤寒Vi多糖分子大小测定法 　　3422 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 　　3423 人凝血酶活性检查法 　　3424 活化的凝血因子活性检查法 　　3425 肝素含量测定法 　　3426 抗A、抗B血凝素测定法 　　3427 人红细胞抗体测定法 　　3428 人血小板抗体测定法 　　3429 猴体神经毒力试验 　　3500　 生物活性/效价测定法 　　3501 重组乙型肝炎疫苗(酵母)体外相对效力检查法 　　3502 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法 　　3503 人用狂犬病疫苗效价测定法 　　3504 吸附破伤风疫苗效价测定法 　　3505 吸附白喉疫苗效价测定法 　　3506 类毒素絮状单位测定法 　　3507 白喉抗毒素效价测定法 　　3508 破伤风抗毒素效价测定法 　　3509 气性坏疽抗毒素效价测定法 　　3510 肉毒抗毒素效价测定法 　　3511 抗蛇毒血清效价测定法 　　3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法 　　3513 人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法 　　3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法 　　3515 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(E玫瑰花环形成抑制试验) 　　3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验) 　　3517 人凝血因子Ⅱ效价测定法 　　3518 人凝血因子Ⅶ效价测定法 　　3519 人凝血因子Ⅸ效价测定法 　　3520 人凝血因子Ⅹ效价测定法 　　3521 人凝血因子Ⅷ效价测定法 　　3522 重组人促红素体内生物学活性测定法 　　3523 干扰素生物学活性测定法 　　3524 重组人白介素-2生物学活性测定法 　　3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法 　　3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法 　　3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法 　　3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法 　　3529 重组链激酶生物学活性测定法 　　3600　 特定生物原材料/动物 　　3601 无特定病原体鸡胚质量检测要求 　　3602 实验动物微生物学检测要求 　　3603 实验动物寄生虫学检测要求 　　3604 新生牛血清检测要求 　　3611 细菌生化反应培养基 　　8000 试剂和标准物质(待定) 　　8001 试药 　　8002 试液 　　8003 试纸 　　8004 缓冲液 　　8005 指示剂与指示液 　　8006 滴定液 　　8061 标准物质 　　9000 指导原则 　　9001 原料药与药物制剂稳定性试验指导原则(待定) 　　9011 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则(待定) 　　9012 生物样品定量分析方法指导原则(待定) 　　9013 缓释、控释和迟释制剂指导原则(未修订) 　　9014 微粒制剂指导原则(待定) 　　9015 注射剂制备指导原则(拟新增，待定) 　　9101 药品质量标准分析方法验证指导原则 　　9102 药品杂质分析指导原则 　　9103 药物引湿性试验指导原则(未修订) 　　9104 近红外分光光度法指导原则(未修订) 　　9105 多晶型药品的质量控制技术与方法指导原则(新增) 　　9106 基于基因芯片技术的药物安全性和有效性评价技术指导原则(新增) 　　9201 药品微生物检验替代方法验证指导原则(未修订) 　　9202 微生物限度检查法应用指导原则 　　9203 药品微生物实验室质量管理指导原则(第三增补本) 　　9204 微生物鉴定指导原则(新增) 　　9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则(新增) 　　9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则(新增) 　　9301 注射剂安全性检查法应用指导原则 　　9302 有害残留物限量制定指导原则(新增) 　　9401 中药生物活性测定指导原则 　　9501 正电子类放射性药品质量控制指导原则(未修订) 　　9502 锝[99mTc]放射性药品质量控制指导原则(未修订) 　　9701 药用辅料性能指标研究指导原则(第三增补本、拟新增) 　　9901 国家药品标准物质制备指导原则(第二增补本) 　　附表 原子量表(未修订) 　　附表 国际单位转换表(待定) 　　4. 《征求意见稿》反馈意见表 国家药典委员会 2014年3月28日

每支移液器的液程通常都用纯水和正向移液技术校准过。因此我们推荐使用正向移液技术移取水性溶液，如缓冲液，稀释酸或碱。当移取不同于水的液体时，由于具有不同的液体特性，其移液量可能偏离所选的量程。比如一些生物溶液的移液，可能会在移液器尖端或试管中产生气泡或泡沫，这将使移液量产生偏差。在这种情况下，我们推荐使用反向移液技术移取高粘度或者容易产生泡沫的液体。反向移液技术减少了喷溅，泡沫和气泡形成。这种方法尤其适用于移取小体积的液体。 下面先介绍一下正向移液和反向移液技术的操作。 1.将按钮压至第一停点。 2.将吸头浸入液面下1cm处，缓慢释放按钮使其滑回原位。将吸头从液体中移出，接触容器边缘除去多余的液体。 3.排液时，吸头紧贴容器壁先轻按按钮至第一停点，略作停顿后， 将按钮按至第二停点（这个操作会将吸头内的液体彻底排尽），将吸头从容器中沿容器壁移出。 4.松开按钮至准备位置。 1.将按钮压至第二停点。 2.将吸头浸入液面1cm处，缓慢释放按钮使其滑回原位。这将时液体充满吸头。将吸头从液体中取 出，接触容器边缘去掉多余液体。 3.放液到接收容器时平稳地轻按按钮至第一停点。保持在这个位置。一些液体会残留在吸头中不能被放出。 4.残留在吸头内的液体能够被吹回原溶剂中或者同吸头一起丢弃。 5.松开按钮到准备位置。 选择合适的移液器对于微量移液的精准性也很重要，Thermo Scientific F系列移液器的超强吹出设计则满足了微量移液对精准性的需求。低于50&mu l液程的Thermo F系列移液器均采用双活塞设计，与其它普通移液器相比，其空气吹出能力增大50%-60%，因此在小体积的液体吹出时会非常干净完全，大大提高了移液的精准性。 我们使用Thermo Scientific Finnpipette F2 1-10 &mu l移液器，配合Thermo Scientific Finntip Flex 10吸头，同时分别使用正向移液和反向移液，移取1%牛血清白蛋白（BSA，Sigma A7030）进行移液精准性测试。 图1 表明当使用反向移液技术时，移液量的变化比使用正向移液技术处于更狭窄的一个范围。 图2 表明使用两种移液方式的不精确度。不精确度是估量移液的重复性的。反向移液技术可以使不精确度相对于正向移液技术降低50%。 这是因为，BSA溶液含有易被疏水移液器吸头壁吸附的疏水成分。当使用正向移液技术时，每次移液后少量的液体易残留在吸头中。这种趋势会增加吹出液体体积之间的偏差，因为当重复移液时吸头中累积的残余液体可能增加下一次移液的移液量。而反向移液技术中有额外的液体被吸入吸头中，这些额外的液体作用似一个蓄水池它使连续移液的移液量均等。这个蓄水池也能阻止空气在吹出液体的最后从吸头口进入，这样可以降低液体起泡的可能性。这使反向移液技术在移取小液量液体时尤其有用。由此可见，选择Thermo Scientific F2移液器，同时配合反向移液技术，可较好的提高移取蛋白溶液的精确度和重复性。 这是个移液器的王国，每个人都能找到最适合自己的移液器。这是一个富于创新的品牌，传承40年移液器的深厚底蕴。&ldquo 先锋源于创新，全新精准体验&rdquo 是赛默飞世尔科技移液器的真实写照。Thermo Scientific Finnpipette的历史可追溯到1971年，凭借着以人为本的设计理念，坚持不断创新，缔造了许许多多世界&ldquo 第一&rdquo 的记录。我们推出了全球第一支连续可调微量移液器、第一支多道移液器、第一支可整支高压消毒的移液器、第一支彩色标记移液器。Finnpipette特别重视客户反馈，不断努力改善产品。我们始终追求提高性能、精准性和客户满意度。更多Thermo Scientific移液解决方案请查看：Thermo移液器。

根据《中国药典》2015年版编制工作进度安排，第一批拟增修订通则草案已于2014年3月在国家药典委员会网站面向社会各界公开征求意见。2014年6~7月国家药典委员会陆续组织召开各相关专业委员会对《中国药典》2015年版通则内容进行了全面审定，并对第一批公示内容的反馈意见和建议进行了研讨，根据会议讨论审核意见，经整理形成了第二次总则(草案)征求意见稿(详见附件)。 　　现将有关事项通知并说明如下： 　　一、为进一步完善2015年版药典总则内容，现将药典总则(草案)整体框架和药典通则第二次征求意见稿内容在我委网站公开征求意见，即日起公示期一个月。 　　二、独立一卷的名称为&ldquo 《中国药典》2015年版总则&rdquo ，包括现有药典一部、二部、三部的附录(现改为&ldquo 通则&rdquo )内容和药用辅料品种正文(详见附件1)。 　　三、通则编码按照&ldquo XXYY&rdquo 四位罗马数字表示，其中XX代表现有附录编码的大罗马字母(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ&hellip &hellip )，YY代表现有附录编码的英文字母(A、B、C&hellip &hellip )。新旧附录/通则编码对照表详见附件2。 　　四、拟增修订的通则草案详见附件3。请相关单位认真研核，若有异议，请附相关说明及/或实验数据，及时来文来函(见附件4)。 　　五、联系人及联系方式： 　　许华玉(电话：010&ndash 67079521) 　　尚 悦(电话：010&ndash 67079578) 　　靳桂民(电话：010&ndash 67079527) 　　传 真：010&ndash 67152769 　　E-mail: ywzhc@chp.org.cn 　　附件： 1. 《中国药典》2015年版总则（草案） 2. 新旧附录/通则编码对照表 3. 药典通则目录及增修订内容 《中国药典》2015年版通则目录 编号 通则名称 0100 制剂通则 0101 片剂 0102 注射剂 0103 胶囊剂 0104 颗粒剂 0105 眼用制剂 0106 鼻用制剂 0107 栓剂 0108 丸剂 0109 软膏剂、乳膏剂 0110 糊剂 0111 吸入制剂(第一次公示) 0112 喷雾剂 0113 气雾剂(第一次公示) 0114 凝胶剂 0115 散剂 0116 糖浆剂 0117 搽剂 0118 涂剂 0119 涂膜剂 0120 酊剂 0121 贴剂 0122 贴膏剂 0123 口服溶液剂 口服混悬剂 口服乳剂 0124 植入剂 0125 膜剂 0126 耳用制剂 0127 洗剂 0128 冲洗剂 0129 灌肠剂 0181 合剂 0182 锭剂 0183 煎膏剂(膏滋) 0184 胶剂 0185 酒剂 0186 膏药 0187 露剂 0188 茶剂 0189 流浸膏剂与浸膏剂 0200 其他通则 0211 药材和饮片取样法（未修订） 0212 药材和饮片检定通则（第二增补本） 0213 炮制通则（未修订） 0251 药用辅料 0261 制药用水 0291 国家药品标准物质通则（第二增补本） 0300 0301 一般鉴别试验（第二增补本） 0400 光谱法 0401 紫外-可见分光光度法 0402 红外分光光度法 0405 荧光分光光度法 0406 原子吸收分光光度法 0407 火焰光度法 0411 电感耦合等离子体原子发射光谱法 0412 电感耦合等离子体质谱法 0421 拉曼光谱法 0431 质谱法 0441 核磁共振波谱法 0451 X射线衍射法 0500 色谱法（未修订） 0501 纸色谱法0502 薄层色谱法 0511 柱色谱法（未修订） 0512 高效液相色谱法 0513 离子色谱法 0514 分子排阻色谱法 0521 气相色谱法（未修订） 0531 超临界流体色谱法 0532 临界点色谱法 0541 电泳法 0542 毛细管电泳法 0600 物理常数测定法 0601 相对密度测定法（未修订） 0611 馏程测定法 0612 熔点测定法 0613 凝点测定法 0621 旋光度测定法 0622 折光率测定法（未修订） 0631 pH值测定法 0632 渗透压摩尔浓度测定法 0633 黏度测定法 0661 热分析法（第二增补本） 0681 制药用水电导率测定法（未修订） 0682 制药用水中总有机碳测定法（未修订） 0700 其他测定法 0701 电位滴定法与永停滴定法（未修订） 0702 非水溶液滴定法 0703 氧瓶燃烧法（未修订） 0704 氮测定法 0711 乙醇量测定法 0712 甲氧基、乙氧基与羟丙氧基测定法（未修订） 0713 脂肪与脂肪油测定法（未修订） 0721 维生素A测定法（未修订） 0722 维生素D测定法（未修订） 0731 蛋白质含量测定法 0800 限量检查法 0801 氯化物检查法（未修订） 0802 硫酸盐检查法（未修订） 0803 硫化物检查法（未修订） 0804 硒检查法（未修订） 0805 氟检查法（未修订） 0806 氰化物检查法 0807 铁盐检查法（未修订） 0808 铵盐检查法（第二增补本） 0821 重金属检查法（第一增补本） 0822 砷盐检查法（未修订） 0831 干燥失重测定法 0832 水分测定法 0841 炽灼残渣检查法（第二增补本） 0842 易炭化物检查法（未修订） 0861 残留溶剂测定法（未修订） 0871 甲醇量检查法 0872 合成多肽中的醋酸测定法（未修订） 0873 2-乙基己酸测定法（未修订） 0900 物理特性检查法 0901 溶液颜色检查法 0902 澄清度检查法 0903 不溶性微粒检查法 0904 可见异物检查法 0921 崩解时限检查法 0922 融变时限检查法（未修订） 0923 片剂脆碎度检查法（未修订） 0931 溶出度测定法（合并释放度测定法） 0941 含量均匀度检查法 0942 最低装量检查法 0951 吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法 0952 粘附力测定法 0981 结晶性检查法（未修订） 0982 粒度和粒度分布测定法（第一增补本） 0983 锥入度测定法 1000 分子生物学技术 1100 生物检查法 1101 无菌检查法 1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 1107 非无菌药品微生物限度标准 1121 抑菌效力检查法 1141 异常毒性检查法 1142 热原检查法 1143 细菌内毒素检查法 1144 升压物质检查法 1145 降压物质检查法（未修订） 1146 组胺类物质检查法 1147 过敏反应检查法（未修订） 1148 溶血与凝聚检查法 1200 生物活性测定法 1201 抗生素微生物检定法（未修订） 1202 青霉素酶及其活力测定法（未修订） 1205 升压素生物测定法 1206 细胞色素Ｃ活力测定法（未修订） 1207 玻璃酸酶测定法（未修订） 1208 肝素生物测定法（第三增补本） 1209 绒促性素生物测定法 1210 缩宫素生物测定法 1211 胰岛素生物测定法（未修订） 1212 精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用检查法（未修订） 1213 硫酸鱼精蛋白生物测定法（未修订） 1214 洋地黄生物测定法（未修订） 1215 葡萄糖酸锑钠毒力检查法（未修订） 1216 卵泡刺激素生物测定法 1217 黄体生成素生物测定法 1218 降钙素生物测定法 1219 生长激素生物测定法（未修订） 1401 放射性药品检定法（详见药典委网站：关于&ldquo 附录ⅩⅢ放射性药品检定法&rdquo 修订草案的公示） 1421 灭菌法（未修订） 1431 生物检定统计法（未修订） 2000 中药相关检查方法 2001 显微鉴别法（第二增补本） 2101 膨胀度测定法（第二增补本） 2102 膏药软化点测定法（未修订） 2201 浸出物测定法（未修订） 2202 鞣质含量测定法（第二增补本） 2203 桉油精含量测定法（未修订） 2204 挥发油测定法（未修订） 2301 药材和饮片杂质检查法 2302 灰分测定法（未修订） 2303 酸败度测定法（未修订） 2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法（未修订） 2322 汞和砷元素形态及其价态测定法 2331 二氧化硫残留量测定法 2341 农药残留量测定法 2351 黄曲霉毒素测定法 2400 中药注射剂有关物质检查法（未修订） 3000 生物制品相关检查方法 3100 含量测定法 3101 固体总量测定法 3102 唾液酸测定法 3103 磷测定法 3104 硫酸铵测定法 3105 亚硫酸氢钠测定法 3106 氢氧化铝（或磷酸铝）测定法 3107 氯化钠测定法 3108 枸橼酸离子测定法 3109 辛酸钠测定法 3110 乙酰色氨酸测定法 3111 苯酚测定法 3112 间甲酚测定法 3113 硫柳汞测定法 3114 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯含量测定法 3115 O-乙酰基测定法 3116 己二酰肼含量测定法 3117 高分子结合物含量测定法 3118 人血液制品中糖及糖醇测定法 3119 人血白蛋白多聚体测定法 3120 人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法 3121 人免疫球蛋白类中甘氨酸含量测定法 3122 重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定法 3123 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法 3124 IgG含量测定法 3200 化学残留物测定法 3201 乙醇残留量测定法 3202 聚乙二醇残留量测定法 3203 聚山梨酯80残留量测定法 3204 戊二醛残留量测定法 3205 磷酸三丁酯残留量测定法 3206 碳二亚胺（EDAC）残留量测定法 3207 游离甲醛测定法 3208 人血白蛋白铝残留量测定法 3209 羟胺残留量测定法 3300 微生物检查法 3301 支原体检查法 3302 病毒外源因子检查法 3303 鼠源性病毒检查法 3400 生物测定法 3401 免疫印迹法 3402 免疫斑点法 3403 免疫双扩散法 3404 免疫电泳法 3405 肽图检查法 3406 质粒丢失率检查法 3407 SV40核酸序列检查法 3408 外源性DNA残留量测定法 3409 抗生素残留量检查法 3410 激肽释放酶原激活剂测定法 3411 抗补体活性测定法 3412 牛血清白蛋白残留量测定法 3413 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法 3414 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法 3415 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法 3416 类A血型物质测定法 3417 鼠IgG残留量测定法 3418 无细胞百日咳疫苗鉴别试验 3419 抗毒素、抗血清制品鉴别试验 3420 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法 3421 伤寒Vi多糖分子大小测定法 3422 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 3423 人凝血酶活性检查法 3424 活化的凝血因子活性检查法 3425 肝素含量测定法 3426 抗A、抗B血凝素测定法 3427 人红细胞抗体测定法 3428 人血小板抗体测定法 3429 猴体神经毒力试验 3430 人血浆病毒核酸检测技术要求 3431 单抗纯度茨顶方法-CE-SDS毛细管电泳（还原和非还原） 3500 生物活性/效价测定法 3501 重组乙型肝炎疫苗（酵母）体外相对效力检查法 3502 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法 3503 人用狂犬病疫苗效价测定法 3504 吸附破伤风疫苗效价测定法 3505 吸附白喉疫苗效价测定法 3506 类毒素絮状单位测定法 3507 白喉抗毒素效价测定法 3508 破伤风抗毒素效价测定法 3509 气性坏疽抗毒素效价测定法 3510 肉毒抗毒素效价测定法 3511 抗蛇毒血清效价测定法 3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法 3513 人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法 3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法 3515 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(E玫瑰花环形成抑制试验) 3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验) 3517 人凝血因子Ⅱ效价测定法 3518 人凝血因子Ⅶ效价测定法 3519 人凝血因子Ⅸ效价测定法 3520 人凝血因子Ⅹ效价测定法 3521 人凝血因子Ⅷ效价测定法 3522 重组人促红素体内生物学活性测定法 3523 干扰素生物学活性测定法 3524 重组人白介素-2生物学活性测定法 3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法 3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法 3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法 3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法 3529 重组链激酶生物学活性测定法 3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法 3531 尼妥珠单抗生物学活性测定法 3532 白介素-11-生物活性测定方法 3600 特定生物原材料/动物 3601 无特定病原体鸡胚质量检测要求 3602 实验动物微生物学检测要求 3603 实验动物寄生虫学检测要求 3604 新生牛血清检测要求 3611 细菌生化反应培养基 8000 试剂与标准物质（待定） 8001 试药 8002 试液 8003 试纸 8004 缓冲液 8005 指示剂与指示液 8006 滴定液 8061 标准物质 9000 指导原则 9001 原料药与药物制剂稳定性试验指导原则（未修订） 9011 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则（第一次公示） 9012 生物样品定量分析方法验证指导原则（第一次公示） 9013 缓释、控释和迟释制剂指导原则（未修订） 9014 微粒制剂指导原则（第一次公示） 9015 药品晶型研究及晶型质量控制指导原则 9101药品质量标准分析方法验证指导原则 9102 药品杂质分析指导原则 9103 药物引湿性试验指导原则（未修订） 9104 近红外分光光度法指导原则（未修订） 9105 中药生物活性测定指导原则 9106 基于基因芯片药物评价技术指导原则 9107 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则 9201 药品微生物检验替代方法验证指导原则（未修订） 9202 非无菌药品微生物限度检查指导原则 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 9204 微生物鉴定指导原则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则 9301 注射剂安全性检查法应用指导原则 9302 中药有害残留物限量制定指导原则 9303 色素检测指导原则 9304 中药中铝、铬、铁、钡元素测定指导原则 9305 中药中真菌毒素测定指导原则 9401 生物制品定量分析方法指导原则 9501 正电子类放射性药品质量控制指导原则（未修订） 9502 锝［99mTc］放射性药品质量控制指导原则（未修订） 9601 药用辅料功能性指标研究指导原则（第三增补本） 9621 药包材通用要求指导原则（第一次公示） 9622 药用玻璃材料和容器指导原则（第一次公示） 9901 国家药品标准物质制备指导原则（第二增补本） 附表 原子量表 附表 国际单位转换表 一部正文品种后 成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片 4. 反馈意见单 国家药典委员会 2014年7月30日

重组人红细胞生成素（rhEPO）是全球最重要的生物制品之一，可用于治疗由慢性肾脏病、肿瘤化放疗或骨髓增生症导致的贫血。rhEPO是一种高度糖基化的糖蛋白药物，几乎rhEPO分子量的一半是由翻译后修饰的多糖组成。这些多糖包括N端链接寡糖链，其末端为唾液酸残基。唾液酸残基在控制rhEPO在体内半衰期起重要作用，并且影响其稳定性和电荷异质性。 电荷异质性（电荷变异体），即蛋白质表面电荷的改变。改变可以是由于电荷数量增减的直接改变，也可以是由于蛋白构象改变而间接引起的改变。产生电荷异质性的原因有很多，例如异构化、氧化、聚合、末端改变、脱酰胺化和糖基化等。 rhEPO电荷变异体产生最主要的原因是其高度糖基化，尤其是高度唾液酸化。电荷异质性是反应糖基化水平的重要表征之一，属于关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQA），监管机构要求必须在整个生产和贮存中对rhEPO的电荷异质性进行检测和表征。使用CZE方法表征rhEPO存在如下难点制剂中rhEPO含量相对较低，μg级别，需要浓缩样品提高检测灵敏度；制剂中含多种辅料组分，可能会对分析结果造成干扰。例如，促红素制剂中含有mg级别的人血白蛋白（HSA），使用CZE方法会对结果造成干扰；CEZ方法需对样品进行复杂前处理，去除辅料干扰。NIFDC解决方案 2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）依据ICH（国际人用药品注册技术协调会）指导原则，利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术（iCIEF）自发荧光通道表征8种商品化rhEPO电荷异质性，并评估该方法的精密度、准确性、线性、范围和耐用性。 紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。而自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料，提高检测灵敏度。 结果表明，对比CZE-UV（毛细管区带电泳-紫外）方法，iCIEF方法自发荧光通道检测具有更高的分辨率和灵敏度，同时具有快速检测、无需样品前处理、消除辅料干扰等优势。结果展示图1. A：紫外通道检测 B：自发荧光通道检测 图1结果显示，紫外通道检测（A）的信号很低；自发荧光通道检测（B），可以明显看到信号增强，且各个变异体分离效果较好。表1. 紫外通道检测和自发荧光通道检测对比 研究结果表明，两种通道检测下各变异体峰面积比例含量完全一致（表1）。图2. 自发荧光通道检测不同浓度样品表2. 文献报道其它方法定量限 研究人员考察了利用自发荧光通道检测1.25μg/m至20μg/ml浓度范围内样品（图2），各变异体面积比例含量和浓度线性关系良好，R方均不低于0.99。该方法定量限（LOQ）为0.1ug/ml（表2），根据文献报道显示，本方法灵敏度为最高。图3. 不同稀释度下的回收率 研究人员配制了7个不同浓度的样品对该方法准确性进行验证（图3），通过实际测定总峰面积和理论总峰面积来计算回收率，回收率在80-105%之间。图4. 耐用性评估 研究人员对方法耐用性进行评估（图4），比较不同两性电解质浓度、尿素浓度、不同毛细管以及不同样品放置时间情况下的各变异体等电点和峰面积百分比的差异。结果表明，变异体等电点差异不超过0.1，峰面积百分比RSD%不超过5%，方法耐用性良好。图5. 自发荧光检测模式表征8种商品化rhEPO电荷变异体 为了证明该方法对商品化rhEPO表征的适用性，研究人员利用所建立方法，对不同企业的8种商品化rhEPO电荷变异体进行表征（图5）。DP1-6有相似峰型，在DP3和DP6中，有一额外明显的小峰。DP7峰形独特，可能由于与其他DP相比糖基化不同所造成。结论 NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术自发荧光检测通道建立并证明了用于rhEPO电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点：无需样品预处理，可直接表征rhEPO；自发荧光通道检测的rhEPO峰型与紫外吸收通道检测得到的峰型相同；与CZE-UV或icIEF紫外吸收通道检测相比，自发荧光检测灵敏度更高；不受高浓度辅料干扰（如人血清白蛋白和聚山梨酯，会干扰CZE分析，CZE 分析前，须通过多步分离步骤去除这些辅料）；该平台方法快速且操作简易。扫描下方二维码，获取ProteinSimplerhEPO表征解决方案参考文献：1. Li, Xiang et al. “Capillary isoelectric focusing with UV fluorescence imaging detection enables direct charge heterogeneity characterization of erythropoietin drug products.” Journal of chromatography. A vol. 1643 (2021): 462043.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

日前，国家科技部公布了56家第二批企业国家重点实验室建设计划名单，华药集团抗体药物研制国家重点实验室位列其中。在抗体药物领域同时获批的还有上海张江生物技术有限公司。 　　抗体药物是现代生物制药的核心组成部分，以靶向性好、疗效高、副作用小等优点日益受到重视，凭借快速的市场增长率已成为当今国际生物技术药物发展的主流。我国在此领域与国际先进水平差距巨大，攻克以抗体药物为重点的重大疾病防治和新药创制的关键技术，被列为国家中长期科技发展的战略目标之一。建设抗体药物研制国家重点实验室的目的在于，通过建立起国际水平的抗体药物开发基地，开发出具有自主知识产权的抗体药物及其生产工艺，实现我国在抗体药物开发技术领域的跨越式发展，改变我国生物技术药物低水平重复的局面。 　　华北制药集团自1985年以来相继开发出基因工程乙肝疫苗、吉姆欣、吉赛欣、济脉欣等产品，并建成符合国际GMP标准的现代化模块式生物制药产业化基地金坦公司。近年又开发多个生物技术药物，其中重组人源抗狂犬病毒抗体是我国第一个具有自主知识产权的重组人源抗体，作为国家一类新药已获国家药监局临床批文 重组人血白蛋白也已进入临床申报并开始建设产业化基地。目前，华药已建成了较为完整的生物技术药物研发体系，并拥有按照国际标准建设的完整的生物技术药物质量控制及检测平台，为国内生物技术药物研发提供了与国际接轨的通道。

大家好，本周为大家分享一篇发表在J Proteome Res.上的文章，Systematic Identification of Proteins Binding with Cisplatin in Blood by Affinity Chromatography and a Four-Dimensional Proteomic Method，该文章的通讯作者是华中科技大学药学院的杜支凤教授。以顺铂为代表的铂类抗癌药物广泛应用于治疗多种癌症肿瘤，如胃肠道癌、头颈部癌和卵巢癌等。在静脉滴注后，这些药物水解形成活性分子，与DNA结合并抑制DNA链的合成与复制，最终致使细胞死亡。然而，由于铂与硫醇的高亲和力，大多数铂在静脉注射后会与血液中的蛋白质结合；例如，人血清白蛋白 (HSA) 是含量最丰富的血清蛋白，也是血液中铂类药物的主要结合蛋白；另外，在红细胞中负责运输氧气的血红蛋白 (HB) 也被发现与铂结合，因此，有必要研究铂类药物在血液中的蛋白结合行为。先前的研究已经证明，利用质谱方法可以实现对高丰度蛋白质的可靠鉴定；然而，由于高丰度蛋白的干扰，占总蛋白的 80% 以上的低丰度蛋白则很少被鉴定。此外，由于缺乏足够信息，以及在胰蛋白酶消化过程中还原和烷基化剂的使用导致蛋白上的铂化位点无法被确定。更重要的是，目前排除假阳性结果的唯一方法是根据铂化肽的特征同位素模式，人工对比理论同位素和实验同位素，从而导致鉴定过程非常耗时并且具有较强的主观性。因此，有必要开发一种可靠、高效的方法来鉴定血液中铂类药物的结合蛋白质组。在血液蛋白质组学研究中，免疫亲和层析常用于消耗高丰度蛋白并富集低丰度蛋白。它有利于低丰度蛋白的鉴定和定量，从而可以提高血液中的蛋白质组覆盖范围。除了色谱分离外，离子淌度质谱 (IM−MS) 根据离子的迁移率差异进行分离，同样有助于低丰度蛋白质的分析。在金属化蛋白的鉴定中，金属化肽和游离肽的同位素分布模式明显具有差异，这有助于确定这些肽是否与金属药物结合。已经开发了一些数据处理软件程序来自动分配金属药物在已知蛋白质上的结合位点，如智能数字注释程序 (SNAP) 算法和 Apm2s 。本文结合高丰度蛋白分离和4D蛋白质组学方法 (IM-MS) ，系统、全面地鉴定了血液中顺铂的结合蛋白，并利用铂化肽的特征同位素模式和相似性算法来消除假阳性的识别。如图1所示，首先用超滤去除游离药物，然后使用多亲和去除柱分离血液样本中的高丰度和低丰度蛋白；用FAIMS Pro界面的nano-LC−MS/MS进行消化和分析；用MaxQuant对铂化的多肽和蛋白进行鉴定，用相似性算法Apm2s排除假阳性结果。在此基础上，采用基于平行反应监测 (PRM) 的方法测定了血浆中多肽与顺铂的结合率。本研究为系统鉴定血液中金属药物的结合蛋白提供了一种新方法，鉴定出的蛋白可能有助于了解铂类抗癌药物的毒性。图1 铂化蛋白的分离和鉴定以及用蛋白质组学方法测定顺铂与多肽之间的结合率的示意图本研究采用顺铂与人血浆的反应混合物建立了一种分析方法。为了与文献进行比较，样品的制备方法与文献中的制备方法相同1。选择CID作为碎裂方式，结果表明，从低丰度部分共鉴定出212个蛋白，从高丰度部分共鉴定出169个蛋白。在低丰度部分，共鉴定出1192个游离肽和208个铂化肽。其中，154个铂化肽被排除为假阳性结果，如文中表S1所示。高丰度部分的游离肽数和铂化肽数分别为1124个和169个，其中，144个铂化肽被排除为假阳性，如表S2所示。低丰度结合蛋白的鉴定在以往的研究中，由于高丰度蛋白的干扰，很少发现低丰度蛋白与铂的结合。本研究在高丰度蛋白被消耗后，从29个蛋白中共鉴定出54个铂化肽。APOA4中铂化肽的理论和实际质谱如图2所示，前体离子和铂化产物离子表现出特征的同位素峰。图片显示了关键的碎片离子的质谱图，用于分配铂化位点。在鉴定出的铂化蛋白中，CERU、FETUA、ITIH1和B4E1Z4有4个或更多的含铂肽，这表明铂可以与这些蛋白质的多条肽段结合。虽然低丰度蛋白只占血液中蛋白的一小部分，但它们具有非常重要的功能，对于维持正常生理活动不可或缺。例如，CERU可以将Fe2+氧化为Fe3+，并在铁代谢中发挥重要作用；B4E1Z4与补体激活相关。顺铂与这些蛋白的结合是否会对其功能产生影响仍有待进一步研究。图2 从低丰度蛋白部分鉴定出的铂化蛋白APOA4。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图高丰度结合蛋白的鉴定IGHG1中一个铂化肽的理论和实验质谱如图3所示，其前体离子和铂化产物离子表现出特征同位素峰。根据关键的碎片离子确定了铂化位点。在已鉴定的蛋白中，ALBU（白蛋白）和CO3（补体C3）有4个或更多的含铂多肽。HSA负责血液中药物和小分子的运输，CO3在补体系统的激活中起着重要作用。高丰度蛋白与顺铂的结合已被用于提高肿瘤化疗的疗效和选择性，而新发现的高丰度结合蛋白有助于相关研究。与低丰度组分鉴定的铂化蛋白相比，大部分与低丰度组分蛋白不同，两个组分中仅共同检测到FETUA和CFAH作为铂化蛋白，这表明亲和层析对高丰度蛋白和低丰度蛋白的分离效果较好。图3 从高丰度蛋白部分鉴定出铂化蛋白IGHG1。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图IM−MS分离铂化肽异构体如图4所示，通过nano-LC−IM−MS/MS成功分离了低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。同分异构体a和b是典型的铂化肽，由质谱图的同位素模式显示，它们被很好地分离。它们的MS/MS不同，根据关键碎片离子，异构体a和b的铂化位点分别被划分为M和H/T。这个例子显示了IM−MS对复杂样品的分辨能力。图4 用nanoLC−IM−MS/MS分离的低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。(A)m/z=764.67提取离子色谱和异构体a、b的质谱，理论质谱见中间；(B)异构体的MS/MS和关键碎片离子的质谱图结合蛋白的铂化位点在本文的两项研究中，His 和 Met 是首选的铂结合位点。此外，D、E、S和Y也被发现是铂结合位点。这也是合理的，因为血清蛋白的供氧氨基酸已被证明是顺铂的动力学首选结合位点。很少有Cys残基被鉴定为结合位点，这可能是由于没有还原和烷基化。肽的半胱氨酸常形成二硫键，不经还原和烷基化就无法识别，因此，序列覆盖率会很低。在未来的研究中，应使用替代还原剂来提高肽序列覆盖率。生物信息学分析 为了揭示铂化蛋白质的定位、功能和途径，将从高丰度和低丰度部分中鉴定的蛋白质组合起来并通过生物信息学工具进行分析。如图5A所示，GO分析表明大部分结合蛋白位于细胞外区域，发挥蛋白结合、金属离子结合、酶抑制剂等功能；因此，镀铂蛋白的定位证实了鉴定的可靠性。此外，这些蛋白质参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调节。为了阐明所涉及的途径，对鉴定的蛋白质进行了KEGG途径富集分析，结果表明最显着的富集途径是补体和凝血级联途径（图5B）。补体和凝血级联途径已被证明在造血干/祖细胞的动员中发挥关键作用，这对造血具有重要意义。顺铂的血液学毒性与其在补体和凝血级联途径中与血液蛋白的结合之间的相关性值得进一步研究。图5 (A)通过GO 分析确定的铂化蛋白的定位、分子功能和生物学过程；(B)铂化蛋白的富集途径血液蛋白与顺铂的结合率 由于未检测到一些铂化肽的游离形式，因此仅使用高丰度组分中的13种肽进行亲和力研究。可靠地计算了属于五种蛋白质的六种铂化肽的结合率。PRM分析中这些肽的信息见表S5，定量结果见图6。其中，富含组氨酸的糖蛋白的一种肽与顺铂的结合率最高，这可能是由于顺铂对含组氨酸和带负电荷的生物分子的高亲和力。Apoa1 蛋白的一个肽与顺铂的结合率最低。在本研究中可以确定结合率的铂化肽数量较少，这主要是由于某些肽的质谱响应低以及某些肽存在氧化形式。因此，这些肽的结合比率不能通过 PRM 方法确定。然而，与以往的研究相比，根据属于同一蛋白质的肽的质谱计数粗略估计某种蛋白质的丰度，这种方法可以更准确地确定高丰度肽与铂的结合率。图6 根据PRM分析多肽与顺铂的结合亲和力顺铂与血液蛋白的结合与其药代动力学、活性、毒性和副作用密切相关。然而，血液蛋白质组的复杂性限制了低丰度结合蛋白的鉴定。在本研究中，基于亲和色谱和nanoLC-IM-MS/MS 的 4D 蛋白质组学方法被用于分离低丰度和高丰度蛋白质并分析这两个部分。基于铂化肽的特征同位素分布和相似性算法，排除了假阳性鉴定。结果，共有 39 种蛋白质被鉴定为铂化蛋白质，这比之前研究中的数量要高得多。随后的生物信息学分析表明，这些结合蛋白位于细胞外区域，主要参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调控。最显着的富集途径是补体和凝血级联，这可能与顺铂的血液学毒性有关。高丰度部分的 PRM 分析表明，富含组氨酸的糖蛋白中的肽与高丰度组分中的顺铂的结合率最高。综上所述，本研究揭示了人类血液中与顺铂结合的蛋白质组，并计算了顺铂与血液蛋白的结合率。这种方法虽然在数据分析方面比较耗时，但它可以识别复杂系统中金属药物的低丰度结合蛋白，并且可以准确测量药物与血液蛋白的结合率。

2016年12月12日，北京博晖创新光电技术股份有限公司(以下简称“公司”)发布公告称，董事会同意公司与云南沃森生物技术股份有限公司(以下简称“沃森生物”)签订《北京博晖创新光电技术股份有限公司与云南沃森生物技术股份有限公司关于广东卫伦生物制药有限公司股权的转让协议》(以下简称“本协议”)，以人民币11,000万元的价格受让沃森生物持有的广东卫伦生物制药有限公司(以下简称“广东卫伦”)21%股权，以强化其血液制品业务。　　本次股权转让前广东卫伦的股权结构为：　　本次股权转让后广东卫伦的股权结构将变更为：　　公告显示，广东卫伦生物制药有限公司成立于1994年4月26日，位于汕头市濠江区珠浦工业区内，注册资本3,000万元人民币，前身系汕头经济特区卫伦生物制品公司，公司主营业务包括：血液制品生产，生物工程产品生产 血液制品经营，生物工程产品经营 医药产品开发及研究 企业生产所需原料收购 货物进出口、技术进出口。　　云南沃森生物技术股份有限公司创立于2001年，总部位于云南省昆明市，是国内专业从事疫苗、血液制品等生物药品研发、生产、销售的现代生物制药企业,为国家认定的高新技术企业和国家企业技术中心。公司于2010年11月在中国深圳证券交易所创业板上市(股票简称：沃森生物 股票代码：300142)。　　据12日博晖创新发布的另一篇公告显示，由于在约定期间的年血浆采集规模达不到承诺量，沃森生物拟将其持有的大安制药31.65%股权转让给博晖创新公司控股股东杜江涛，公司董事会同意公司与杜江涛及沃森生物签署《杜江涛先生、北京博晖创新光电技术股份有限公司及云南沃森生物技术股份有限公司关于云南沃森生物技术股份有限公司相关权利义务转移的协议》，由杜江涛基于其所受让沃森生物所持大安制药的部分股权，代替沃森生物履行在《前股权转让协议》中约定的向公司补偿大安制药股权的责任。　　河北大安制药有限公司成立于2004年5月，位于石家庄市鹿泉绿岛火炬开发区，注册资本14,300万元人民币，经营范围：体外诊断试剂[乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)、丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)、梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)、人类免疫缺陷病毒(HIV)1 2型抗体诊断剂盒(酶联免疫法)等 血液制品(人血白蛋白、静注人免疫球蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白)。