碎裂性质

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物技术研究部生物分子高效分离与表征研究组研究员张丽华团队，研制了一种基于糖苷键的质谱可碎裂型交联剂，显著地提高了交联信息的检索通量和鉴定准确度，同时具有良好的两亲性和生物兼容性，实现了活细胞内蛋白质复合物原位交联和规模化精准解析。 　　作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合物等形式行使其特定的生物学功能，其中，细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合物结构和功能至关重要。化学交联技术(Chemical cross-linking mass spectrometry，CXMS)，尤其是原位化学交联质谱技术(in-vivo CXMS)具有规模化分析蛋白复合物原位构象和相互作用界面的优势，已成为活细胞内蛋白质复合物解析的重要技术。然而，目前活细胞原位交联面临着细胞扰动大、交联肽段谱图复杂程度高等问题。因此，如何实现活细胞低扰动下的原位快速交联是蛋白质原位构象和相互作用精准解析的先决条件。 　　本工作基于糖分子的高生物兼容性和糖苷键的质谱可碎裂特征，将糖苷键引入到功能交联剂的骨架设计中，筛选并获得了高生物兼容性的海藻糖作为骨架分子，研制了质谱可碎裂型交联剂——海藻糖二琥珀酰亚胺酯(TDS)。该交联剂较目前已报道的可透膜型化学交联剂，展示了更优异的细胞活性维持能力，可在低扰动状态下实现细胞内蛋白质复合物的高效交联。在此基础上，低能量的糖苷键-高能量的肽键的质谱选择性碎裂模式，可将“工字形”的交联肽段数据分析降幂为常规交联剂片段修饰的线性肽段数据检索，降低了交联肽段谱图分析的复杂性，提高了交联肽段的鉴定效率与准确度。该团队从Hela细胞中鉴定到对应于3500对以上交联肽段的1453个蛋白质的构象以及843对蛋白质间的相互作用信息，实现了活细胞中蛋白质复合物的原位交联与规模化分析，为活细胞中蛋白质功能的调控提供了重要的技术支撑和关键的互作位点信息。 　　近年来，张丽华团队致力于原位化学交联质谱新技术研究，通过开发一系列新型多功能型化学交联剂，并系统建立深度覆盖的化学交联分析方法等，不断提升原位化学交联技术对于蛋白质复合物原位动态构象的深度捕获和精准分析能力。目前，该团队研制了多种类型的具有不同富集基团、正交反应活性基团的可透膜交联剂，并发展了相应的原位快速交联方法，低丰度交联位点的高效酶解和富集方法，以及基于化学交联距离约束的蛋白质原位构象和相互作用解析方法等，为蛋白质复合物功能状态下原位构象的规模化精准解析提供了关键技术支撑。 　　相关研究成果以A Glycosidic-Bond-Based Mass-Spectrometry-Cleavable Cross-linker Enables In vivo Cross-linking for Protein Complex Analysis为题，发表在《德国应用化学》上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和中国科学院青年创新促进会等的支持。

2019年，BioArt曾解读Nature Reviews Cancer上的一篇观点文章（这篇观点文章是3月发表），讲述了染色体外DNA的（Extrachromosomal DNA，ecDNA）过去和未来（详见BioArt报道：特别推荐丨环状DNA的过去和未来），详细介绍了癌基因在ecDNA上扩增的重新发现的过程，强调ecDNA在肿瘤发病机制和加速癌症进化中的重要性。然而ecDNA的结构如何呢？同年11月21日，美国加州大学圣迭戈分校的Paul Mischel教授团队（注：Mischel正是Nature Reviews Cancer的通讯作者之一另外在2017年，Mischel团队曾发表一篇Nature文章揭示了染色体外癌基因扩增与肿瘤的关系）发表了Nature文章对ecDNA进行了详细解析，利用各种技术手段证明了ecDNA的存在形式是—环状，即ecDNA变成了eccDNA（详见BioArt报道：Nature亮点 | 吴思涵等首次解析肿瘤染色体外DNA的环状结构与功能）。功能上，eccDNA在癌症中扮演了重要的角色，尤其是原癌基因（详见BioArt报道：Nat Genet 丨ecDNA：在癌症基因组图谱上画出浓墨重彩的一笔）；来源上，eccDNA不仅来自于染色体，甚至可以整回到染色体中（详见BioArt报道：再一篇！Nat Genetics报道染色体外环状DNA新功能：驱动神经母细胞瘤基因组重排），那么，还有一个问题，eccDNA是否有序列或位置特异性，表观遗传学领域大佬哈佛医学院张毅教授于今年10月20日在Nature上给出了否定的回答，并提到eccDNA可能是基因组DNA随机断裂产生片段的环化产物（详见BioArt报道：专家点评Nature | 突破！张毅团队揭秘染色体之外环状DNA的前世今生）。再回到癌症，基因扩增对于癌症的发展“功不可没”，其扩增可以分为染色体外扩增（如双微体，double minutes，DM）和染色体内扩增（如均匀染色区，homogeneously staining regions，HSR）。除了DM和HSR，还有一种是巨型标记染色体（giant marker chromosomes）或者新染色体（neochromosomes）。这些概念也说明了癌症基因扩增中演化的复杂性。尽管扩增演化中的部分形式的机制已经相对比较明确了，比如串联重复等，但大部分还是不甚清楚。2021年11月15日，德国科隆大学儿童医院Matthias Fischer在Nature Genetics上发表了文章Chromothripsis followed by circular recombination drives oncogene amplification in human cancer，利用小儿神经母细胞瘤的全基因组测序发现一种新型扩增，并命名为“地震扩增”（seismic amplification，注：这一术语原本属于地质学或者地震相关学科），这一扩增的特点为多重重排和不连续的拷贝数，并且在38种不同类型肿瘤的发生率为9.9%（在38种不同类型肿瘤共计2756例病人中，出现例数为274，占9.9%）。机制上，地震扩增起始于染色体碎裂，产生染色体外环状DNA，之后是环状重组，由此导致原癌基因拷贝数增加、表达升高，从而促进癌症的发生。首先，研究人员检测了79例神经母细胞瘤样本的全基因组数据，对其基因扩增进行了详细分析，并将经历过14次及以上内部重排的扩增子定义为“地震扩增”。根据这一定义，神经母细胞瘤中228个扩增子中有20个属于“地震扩增”，并且影响了79例样本中的19例。其热点区域主要有两个，2p24（内部有MYCN）和12q13/12q15（内部有CDK4和MDM2）。除了神经母细胞瘤，研究人员进一步分析了TCGA上37种不同类型癌症的2677个肿瘤样本，对其“地震扩增”进行了描述。由于染色体碎裂可产生大规模的基因重组，研究人员比对了染色体碎裂和“地震扩增”的区域，发现77.6%的地震扩增子与染色体碎裂区域至少部分重合，其中34.9%是完全重合。同时研究人员排除了断裂—愈合—染色体桥循环（breakage-fusion-bridge cycles）是地震扩增起始事件的可能性。之后，研究人员对重排和扩增事件进行了分析，描述了“地震扩增”的过程模型：1）一个或多个染色体区域发生染色体碎裂；2）将随机片段整合为环状DNA；3）发生环状重组事件（这些环状重组事件与肿瘤细胞高频突变有关）；4）扩增区域或保留在双微体中、或以均匀染色区形式整合进染色体中、或形成新染色体。重要的是，“地震扩增”在肿瘤细胞中是稳定的，而非变化的。总之，该研究定义了一种复杂的基因扩增形式——“地震突变”，并描述了其扩增过程，为理解癌症基因组演化包括染色体外环状DNA提供了新的解读。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41588-021-00951-7

仪器信息网讯，2009年11月7日，由中国质谱学会有机质谱专业委员会与中国分析测试协会联合举办的“2009年中国有机质谱年会”在北京成功召开，会议为期三天，出席会议人数达300人。仪器信息网作为特邀媒体也应邀参加。　　此次质谱年会为与会代表准备了丰富的报告内容，内容涉及生命科学、医学、药学、环境科学、食品安全、毒物分析中的质谱应用研究以及质谱仪器研发的新技术、新进展等。仪器信息网将进行系列报道。　　北京大学化学学院的袁谷教授以手性物质为研究对象，创新地选用质谱作为分析手段进行研究。北京大学化学学院的袁谷教授 其主要做了以下几个方面工作：ESI质谱法鉴别环肽非对映异构体、环肽质谱碎裂机理研究、环肽识别乙肝病毒发卡型DNA研究、环肽识别HIV-1双链DNA研究。课题组利用ESI-MS测定了8个4对环肽非对映异构体特征离子的相对强度，成功区别了8个异构体，同时用MS鉴别了非对映异构体混合物并确定了相对含量，建立了鉴别环肽非对映异构体混合物的标准曲线和计算方法。　　研究发现：MS/MS是鉴别异构体的有用方法 环肽分子对DNA具有识别功能 质谱是分析分子间相互作用力的好方法。

大家好，本周为大家分享一篇2024年发表在Analytical Chemistry上的文章，Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的常乘研究员以及中国科学院大连化学物理研究所的王方军教授。　　在过去的十年里，UVPD (193nm)因其出色的碎裂效率而备受关注。它能够产生a/x, b/y, c/z等多种类型离子，并能够对小于30 kDa的蛋白质提供近乎完整的序列裂解。它是完整蛋白表征的有利工具，能够提供序列、PTM、次级结构等丰富信息。常规的UVPD分析主要依赖于识别N-端或C-端碎片(a/x, b/y, c/z)，尽管已经满足大部分的小分子蛋白质(20 kDa)的需求，而对于大分子蛋白质的表征仍然有限。通过解析内部碎片(ax, ay, az, bx, by, bz, cx, cy, cz)而进一步获得更深度的序列信息是常用的策略。但由于内部片段数量庞大和匹配的低置信度，导致内部片段在很大程度上仍未得到充分利用。为了解决这一问题，作者开发Panda-UV这一新型软件工具，通过结合质谱校准技术和皮尔逊相关系数(PCC)评分系统，实现了UVPD内部碎片的有效识别和高精准匹配。Panda-UV有非常友好的界面，即便不具备编程技能也能使用(图1)。使用者需要提供蛋白序列、去卷积后的质谱数据、固定修饰信息、甚至非共价结合配体还能作为unlocalized modification添加进去用于holo-fragmemts的搜索。PCC评分系统将对碎片离子实验测定的同位素分布与理论计算的同位素分布进行比较，由此过滤掉低置信度的匹配。此外，软件中还增加了Mass Calibration用于校正实验测定的m/z或去卷积后的mass，以便获得更准确的内部碎片匹配和打分。　　图1. Panda-UV使用界面　　具体工作流程如图2所示，当设定好所有参数提交后，程序会先进行碎片匹配。首先以20 ppm进行N-端或C-端的碎片匹配，计算所有匹配上离子的平均质量误差(ppm)，此误差将带入以下公式mass_calibrated = mass/(1 + error × 10-6)，用于去卷积后的质量校正。该步骤可以尽可能扣除由仪器测定引入的误差，以便后续更准确的打分和匹配。完成校准后，再使用用户自定义ppm对校准后的去卷积质量进行第二轮碎片匹配。完成碎片匹配后，进入碎片PCC打分阶段。通过根据碎片离子的带电荷量以及化学式生成理论的同位素分布，将其与实验测定的同位素分布进行比较，主要比较同位素峰之间强度的变化趋势。完成PCC打分之后，需要删除不明确的匹配。由于理论搜索空间大，一个实验碎片可以在定义的质量误差范围内(ppm)匹配多个理论碎片，综合考虑质量误差和PCC评分，以去除歧义匹配。完成碎片匹配后，Panda-UV会根据蛋白序列和碎片匹配结果绘制蛋白整体的碎裂图以及各个残基位点的末端/内部碎片强度汇总图。　　图2. Panda-UV工作流程　　通过在三种模型蛋白质上进行全面基准测试，展示了Panda-UV强大性能(图3)。内部片段的加入使得识别的片段数量提高了26%，并将平均蛋白质序列覆盖率提高到了93%，解锁了模型蛋白质中最大蛋白碳酸酐酶II的隐藏区域。此外，平均65%的内部片段可以在多次重复实验中被识别，展示了Panda-UV识别片段的高置信度。与现有的内部片段匹配软件ClipsMS进行对比，Panda-UV通过对代码框架的优化，搜索模型蛋白的一个质谱数据不超过9分钟，比ClipsMS快50倍。最后，在分析单克隆抗体时，Panda-UV将识别的片段数量翻倍，mAb亚基的序列覆盖率可以提高到86%，并且CDR几乎完全测序，显著提高了mAb的识别准确性(图4)。　　图3. A) B)Panda-UV与C) D)Clips MS解析CA、Mb、Ub三种蛋白的UVPD数据对比　　图4. Panda-UV在mAb UVPD数据分析中的应用　　总的来说，Panda-UV赋予研究人员解锁UVPD数据中内部片段的能力。尽管Panda-UV是专门为UVPD设计开发的，但是用一般解离方法(例如：HCD、ETD)得到的质谱图也是兼容的。Panda-UV揭露了完整蛋白质表征的隐藏深度，为蛋白质组学top-down深度分析提供了帮助。　　撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳文章引用：Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Zhu Y, Liu Z, Liu J, et al. Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry. Anal Chem. 2024 96(21): 8474-8483.

据德国弗劳恩霍夫研究所网站报道，该所科学家研发的一个特殊传感器系统可以检测到玻璃幕墙上微小的裂纹，并对即将发生的玻璃破碎的危险发出警告。相关技术将在5月18日至20日举行的纽伦堡国际传感器、测试测量技术展上进行展示。　　玻璃幕墙体现了现代建筑学与美学结构设计的最佳结合。不过，玻璃幕墙上的玻璃破碎坠落危及行人的情况也时有发生，而迄今为止，相关安全检查一般仅依靠敲打玻璃的声音来判断。这样的检测只能确认已经形成整条裂痕的玻璃，而不能警告即将发生的危险。　　现在，位于维尔茨堡的德国弗劳恩霍夫硅酸盐研究所(ISC)与行业合作伙伴共同开发了一个传感器，它可识别5毫米长的微裂纹，并在玻璃实际破裂之前就及时发出维修提示。负责该研究的伯恩哈德布伦纳博士介绍说，他们在一块玻璃上按照一米的间距安装多个压电传感器执行器模块(piezoelektrische Sensor-Aktor-Module)，一个传感器执行器模块产生超声波，其他传感器接收这种注册过的超声波。如果超声波信号保持不变，说明玻璃是完好的 如果信号发生变化，就表明玻璃产生了裂痕。通常，这些裂纹从玻璃的边缘产生，最初是不可见。随着时间的推移，例如在环境温度变化的影响下，它才会逐渐扩大。　　该传感器通过电缆连接到建筑物的控制系统，所有传入的数据都会被自动分析，当玻璃出现微小裂缝时就会触发警报。研究者还成功将传感器安装到层压玻璃面板间。由于这些传感器在层压玻璃的生产过程中就已经被整合到两块玻璃板之间，因此，它们能在玻璃安装前就检测到玻璃在运输过程中出现的缺陷。　　这一新的安全系统不仅可以提前预测玻璃碎裂，还能提供舒适的功能：该传感器执行器模块同温度和光传感器相连，可以根据光照情况选择开关百叶窗，从而控制室内环境。

贾伟沃特世科技（上海）有限公司实验中心 PEG修饰蛋白及多肽类药物后，可在不产生毒性、不损害药效的情况下，通过增加蛋白类药物的溶解性、减少免疫原性、增加稳定性、延长体内药物半衰期等功效增强大分子药物的疗效。PEG的这种功效在1970年代后期被发现，到了1990年PEG化修饰的Adagen被美国FDA批准，至今已有若干个PEG修饰的大分子药物上市销售，这些药物在癌症、肝炎、痛风、糖尿病等疾病治疗中为患者带来了福音。 明确PEG修饰位点、确定修饰位点的数量、以及表征PEG的聚合度分布性是PEG化大分子药物运用于临床前以及药品质量监控必须且非常重要的工作。由于PEG的高分子聚合物性质，由PEG修饰后的蛋白及多肽的结构变得极为复杂。在早期对其进行质谱分析，特别是对PEG的聚合度分布性分析方面，多使用MALDI离子源类型的质谱。这是因为MALDI源离子化的样品，所带电荷数较少（单电荷离子居多），因此其质谱图相对简单；而通过ESI源离子化的样品将携带多个电荷，这使离子信号复杂，致使其质谱图谱较难解析。随着LC-ESI技术的发展， 美国Indiana大学的Lihua Huang等学者通过在色谱分析柱后加胺的技术，使样品的ESI离子化时的荷电数适当减少，从而使PEG化样品的ESI图谱得到高效的解析[1]。而MALDI TOF类质谱由于质谱分辨率的限制（目前MALDI TOF分辨率在8万内），面对分子量动辄十几万甚至更高的PEG化蛋白，其可获得的数据质量较差，因而MALDI方法可得到的PEG化蛋白的有效结构信息非常有限。 Lihua Huang等学者进一步开发了ESI Q-TOF分析PEG化蛋白的修饰位点的质谱方法[2]。这种方法包括源内裂解（ISF，In Source Fragmentation）与二级质谱（MS/MS）两个步骤。在第一步ISF过程中，PEG化多肽的PEG部分被裂解而变短；在第二步MS/MS过程中，多肽被打碎产生b、y离子碎片。通过分析携带缩短的PEG链的b、y离子信息，最终得出确切的PEG化修饰位点。ISF与MS/MS为什么可以分别 &ldquo 选择&rdquo 碎裂PEG化多肽的PEG与多肽两个部分呢？推测与PEG化多肽的电荷分布有关。在PEG化多肽的离子化过程中，PEG的醚键附着了大量的H+，并在ISF下完全断裂，而使冗长的P EG链缩短到一两个单位大小。之后的MS/MS过程中，由于缩短的PEG链已无H+附着不再断裂。而多肽在MS/MS中获得了碎裂的机会，并产生携带&ldquo PEG短标签&rdquo 的b、y离子碎片。论文中，研究人员运用此方法成功地分析了IgG4与胰高血糖素的PEG修饰位点。 参考文献(1) Huang L, Gough PC, Defelippis MR. Characterization of Poly(ethylene glycol) and PEGylated Products by LC/MS with Postcolumn Addition of Amines. Anal Chem. 2009, 81, 567-577.(2) Lu X, Gough PC, DeFelippis MR, Huang L. Elucidation of PEGylation site with a combined approach of in-source fragmentation and CID MS/MS. J Am Soc Mass Spectrom. 2010, 21, 810-818

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

大家好，本周为大家分享一篇李惠琳课题组最近发表在Mass Spectrometry Reviews上的综述，Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes1。结构生物学的快速发展极大地促进了蛋白结构表征工具的开发。其中，基于质谱的分析方法凭借其快速、灵敏、高通量的优势从中脱颖而出。相比于原子水平的高分辨结构表征工具如X-射线晶体学、核磁共振（NMR）、冷冻电镜（Cryo-EM）等，基于质谱的分析方法能够有效地补充蛋白动力学结构变化的信息，并且不受蛋白纯度、分子量大小的限制。而相较于低分辨的蛋白表征工具如圆二色光谱、动态光散射等，基于质谱的分析方法能够提供更高的肽段或残基水平分辨率，获取额外的序列、翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）、局部空间结构等信息。常见的结构质谱包括：氢氘交换质谱（hydrogen‐deuterium exchange MS, HDX-MS）、交联质谱（cross‐linking MS, CX-MS）、表面标记质谱（covalent labeling MS, CL-MS）等。已有相当多的文献对这些方法进行了详细的介绍2,3，在此不再赘述。而此篇综述将重点介绍非变性至上而下质谱（native top‐down MS, nTDMS）在蛋白及其复合物结构表征中的应用。在过去的十年，非变性质谱（native MS, nMS）特别是nTDMS发展迅速。nMS作为一个桥梁将蛋白质组学与结构生物学相连，其保留非共价相互作用的特性使其广泛用于蛋白复合物四级结构表征，如推断亚基组成、化学计量比、亚基排布等。然而，对于一些深层次的结构信息，如氨基酸序列、PTMs、配体结合位点、亚基结合界面等，仅靠单一的nMS是无法获取的。与之对应的，变性条件下的自上而下质谱（TDMS）能够在完整蛋白水平下直接获得序列以及PTMs信息，虽然有助于PTM的准确定位以及蛋白、蛋白异质体（Proteoform）的鉴别，但却丢失了涉及非共价相互作用的高级结构信息。受限于质谱仪器的发展，在早期，nMS与TDMS通常在两个独立的实验中进行，随着质量分析器以及多种活化/碎裂方式的开发，nMS与TDMS的能够有效的结合，充分发挥各自的优势，在实现多层次结构信息获取的同时，也在不断挑战更加复杂的生物体系，如核糖体、膜蛋白、内源蛋白混合物等。实验设计nTDMS已成为表征蛋白质和复合物的初级到高级结构的重要工具。随着蛋白质样品的大小和复杂性的增加，用于nTDMS的仪器不仅需要符合某些特定标准，还需要不断提高其性能以满足这些增加的需求。nTDMS分析中几个关键的步骤包括：样品前处理、ESI离子化、二级碎裂、质量检测以及数据处理。样品前处理为了维持蛋白的自然状态，通常需要在生理环境中进行nMS分析。然而，缓冲液中的非挥发性盐会产生大量盐簇并与蛋白离子形成非特异性加合物，从而抑制离子信号、降低检测的准确度和灵敏度。因此，样品前处理过程中最重要的环节就是除盐。然而适当的离子强度有助于维持蛋白的三维结构，所以通常的步骤是对蛋白进行缓冲液置换，将蛋白置换至醋酸铵或碳酸氢铵等挥发性盐溶液中。目前已开发了多种在线或离线的除盐方法，详细内容的可在综述原文中查看，此处不再赘述。除了使用非挥发性缓冲盐，减小ESI喷针孔径大小也可以提高系统耐盐能力。碎裂/活化方式二级碎裂方式是实现nMS到nTDMS的关键。常见的活化方式按照原理可分为三类：基于碰撞（CID, SID）、基于电子（ECD, ETD, EID等）以及基于光子（UVPD, IRMPD）的活化/碎裂方式。值得注意的是，CID与IRMPD都属于慢加热的活化方式，能量累积的非常慢，以至于在发生碎裂之前已经进行了能量重排，一些较弱的或者不稳定的键会优先发生断裂，最终导致非共价相互作用在活化的过程中被破坏。而SID、ExD与UVPD则属于快加热的活化方式，碎裂发生在能量重排之前，非共价相互作用得以在这一过程保留下来，碎片化程度受到非共价相互作用的限制，因此可被用于表征蛋白的空间结构。此外，将多种活化方式的结合或与离子淌度技术串联也是获取多层次结构信息的关键。质量检测与变性条件下的质谱分析相比，蛋白复合物在天然环境下通过电喷雾电离产生的电荷数相对较少，因此需要具有较大m/z 范围的质量分析仪（高达m/z = 20,000 Da甚至更高）。最初，nMS分析高度依赖基于飞行时间（time of fight, TOF）质量分析器，因为TOF具有理论上无限的m/z范围。近年来，高分辨质量分析器如轨道阱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）为生物大分子的nTDMS分析带来了新的活力。在综述中，我们简要介绍了每种质量分析器的最新进展，并重点强调了FTICR和Orbitrap在nTDMS分析中的发展和应用。数据处理除了基本的硬件设施，配套的数据处理软件也十分重要。nTDMS数据处理流程通常包括以下4个步骤：同位素峰选取、去卷积、数据库搜索、验证和可视化。正文中，我们对每个步骤进行了简要描述，并重点介绍用于数据库搜索和异质体鉴别的软件。多层次结构信息的获取得益于多种活化/碎裂方式的开发，nTDMS分析可同时获得多层次的结构信息（图1）。主要有以下两种策略：第一种策略，完整蛋白复物（MS1）首先被CID或SID碎裂至亚基（MS2），亚基可进一步碎裂肽段（MS3），在MS1及MS2中可获蛋白复合物结合计量比、拓扑结构、蛋白异质性等信息，在MS3阶段则可获取蛋白序列、PTMs定位以及异质性来源等信息。第二种策略则是完整蛋白复合物（MS1）直接被UVPD或ExD碎裂成肽段（MS2），受益于UVPD以及ExD独特的碎裂方式，发生碎裂的区域主要位于蛋白复合物的表面可及区，而未发生碎裂的区域可能位于蛋白复合物的核心区域或参与亚基相互作用界面。不同的碎裂情况反映不同的空间结构，带有配体的肽段碎片可以用于配体结合位点的定位。综述中，我们详细阐述了如何利用nTDMS获得蛋白复合物的多层次结构信息以及如何将碎片信息与结构信息相关联。图1. nTDMS可提供的多维度结构信息复杂生物体系中的应用蛋白质的空间结构决定了其生物功能，而蛋白质-蛋白质/配体相互作用是大多数生物进程的基础。通过突变、翻译后修饰、或者与金属、小分子配体、蛋白质、DNA、RNA等分子发生共价或非共价的相互作用，蛋白质功能在活细胞中不断受到调节。随着MS仪器、方法的不断开发和数据处理软件的逐渐成熟，nTDMS已被广泛应用于各种生物系统，从小蛋白质、蛋白质-配体复合物到大分子组装体，如膜蛋白、蛋白酶体、核糖体、病毒衣壳，甚至是内源性蛋白混合物。它们中的许多都是极具挑战性的体系，即便是采用NMR、X-射线晶体学或Cryo-EM等生物物理方法分析也是非常困难的。因此，来自nTDMS的见解对于理解这些蛋白质和复合物至关重要。在这里，我们总结nTDMS在所有生物体系中的应用实例，旨在全面了解nTDMS在解决生物学问题方面的潜力。小蛋白的结构表征和区分最初，nTDMS主要用于50 kDa以下单体蛋白的结构表征，大部分的研究都是围绕蛋白质气相结构与溶液相结构对比展开的。根据nTDMS的碎裂情况，推断蛋白的气相空间结构，并与NRM获得的溶液结构进行对比。此外，如果在二级碎裂前增加离子预活化有助于蛋白分子的展开，以便研究蛋白气相展开路径以及获取蛋白质内部空间结构信息。得益于碎片离子对蛋白空间结构的高度敏感性，nTDMS还被用于区分不同蛋白亚型、蛋白突变体的结构差异。蛋白-小分子配体相互作用随后，nTDMS应用到了蛋白-配体复合物中，不同的配体类型适合不同的活化/碎裂方式，除了金属离子、RNA/DNA等以静电作用为主的蛋白配体能够在CID活化时存活，大部分复合物的碎裂都需要选择ECD或UVPD等方式。nTDMS可用于蛋白-配体结合计量比、亲和力、结合位点、作用机制、结构动力学/变构效应的研究。它是一种强大的结构表征工具，其在抑制剂筛选、酶催化监控、RNA-蛋白质互作机制的应用实例在正文中已有详细的介绍。蛋白-蛋白相互作用随着仪器设备的快速发展，nTDMS已应用到更大的体系如蛋白-蛋白复合物，通过组合不同的活化/碎片化技术，在一次实验中可以获得多层次的结构信息。nTDMS可以帮助区分不同的蛋白异质体，并在完整复合物、亚基、肽段三个水平上确定异质性的来源。蛋白的异质性与其生物学功能密切相关，通过调整蛋白的异质性可以实现蛋白功能的转变，具体的应用案例已在正文详细介绍。除此之外，nTDMS还可以用作蛋白-蛋白复合物结合界面、气相展开以及深层次结构探索。治疗性抗体和抗原-抗体复合物在过去的几十年中，治疗性抗体已成为最受欢迎的候选药物之一，它们的高特异性和低副作用促进了治疗性抗体的快速增长。在综述中，我们还详细地介绍了nTDMS在治疗性抗体和抗原-抗体复合物体系中的应用。nTDMS可用于抗体可变区的测序、具有不同药物计量比（DARs）的抗体耦联药物的结构表征、以及抗体-抗原复合物中互补决定区及抗原表位区的鉴别。膜蛋白无论是对于传统的结构表征工具如：X-射线晶体学、NMR还是nTDMS，膜蛋白的结构表征一直以来面临着诸多困难。膜蛋白具有低丰度以及低溶解性等特点，最常见的方法是利用与nMS兼容的膜模拟物如：去污剂胶束、纳米微盘等去溶解膜蛋白，在nTDMS分析时再将膜蛋白从胶束中释放出来，释放出的蛋白可在nTDMS中进一步碎裂获取结构信息。具体的实验流程和应用实例可在综述正文中查看。大分子组装体正文中，还介绍nTDMS在极具挑战性的大分子组装体如：核糖体、蛋白酶体、病毒衣壳中的应用实例，这些生物体系普遍存在的问题是分子量非常大（接近MDa），且具有较高的异质性。对这些大分子机器进行nTDMS分析要求仪器具有较高的质量范围以及分辨率。大分子机器的结构表征充分说明nTDMS方法无论在深度还是广度上都有极大的提升。Native top-down MS蛋白质组学值得注意的是，当质谱前端结合非变性分离技术，如native GELFrEE，尺寸排阻色谱，毛细管区带电泳，离子交换色谱等，nTDMS还可以在靶向模式或发现模式下用于复杂蛋白质组的高通量分析，如内源性蛋白混合物。nTDMS分析最大的优势在于它能区分不同的蛋白异质体，并对每种蛋白异质体进行结构表征，这是其他在肽段水平进行分析的结构质谱法如：HDX-MS, CL-MS所无法实现的。总结与展望总之，在这篇综述中我们重点介绍了nTDMS的最新进展和在不同生物体系中的应用，强调通过nMS与TDMS结合可以获得额外的多层次结构信息。新技术的出现以及仪器的进步使nTDMS能够应用于结构生物学中日益复杂的生物样本体系，包括蛋白质配体、多聚蛋白复合物、大分子组装体和内源性复合物。尽管这样，nTDMS分析仍面临着的挑战，包括但不限于前端的样品分离、离子化、去溶剂化、高质荷比分子传输、异质性样本的分析以及软件的开发。未来nTDMS将与其他的一些结构表征方法相结合以获取更加全面的结构信息。正文中对未来发展趋势进行了讨论并提到了其他一些令人兴奋的创新技术如：基于MALDI离子源的质谱成像技术用于蛋白原位分析、电荷检测质谱（CDMS）用于异质性样本分析，多重技术的结合将为蛋白质复合物的nTDMS研究开辟新的道路。我们希望这篇综述能让读者更好地理解nTDMS提供的独特结构信息，并推动该方法的广泛应用。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. 参考文献1.Liu RJ, Xia SJ, Li HL. Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. Mass Spec Rev. 2022 e21793. https://doi.org/10.1002/mas.217932.Britt HM, Cragnolini T, Thalassinos K. Integration of mass spectrometry data for structural biology. Chem Rev. 2022 122(8):7952-7986. 3.Liu XR, Zhang MM, Gross ML. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: fundamentals and applications. Chem Rev. 2020 120(10):4355-4454.

仪器信息网讯 2016年6月2日，正值“蛋白和肽类药物及诊断试剂研发与质控国际研讨会”举办期间，部分女学者共聚蓉城，在成都香格里拉大酒店召开了“女学者联谊报告会”。仪器信息网编辑参与活动并进行报道。　　与会女学者合影　　联谊报告会由北京大学化学与分子工程学院赵美萍教授主持。　　北京大学赵美萍教授　　吉林大学化学院教授国新华、国家纳米科学中心研究员杨延莲、北京化工大学生命科学与技术学院副教授吕永琴、中国合格评定国家认可委员会贾汝静等分别就“从肽的气体相碎裂到核酸结构研究”、“从多肽分子结构到液体活检” 、“基于先进功能材料的生物分离和分析” 、“传递信任 证实能力”等内容进行了报告。　　吉林大学国新华教授　　吉林大学国新华教授介绍了课题组应用质谱技术开展的工作，包括肽碎裂的规律研究、MALDI靶的修饰和基质的开发、核酸二级结构性质及核酸互补序列之间的相互作用的研究。　　国家纳米科学中心杨延莲研究员　　国家纳米科学中心研究员杨延莲介绍到，多肽组装过程是复杂的多次组装过程，其组装机理和可控组装是重要的科学问题，并且多肽组装结构的识别特性有助于发展高灵敏度体外诊断纳米技术。课题组研究内容包括多肽组装规律、组装结构和动力学调控、多肽和纳米材料相互作用和基于多肽纳米结构的循环肿瘤富集和体外诊断技术。杨延莲研究员还与大家分享了如何处理事业与家庭关系的宝贵经验。北京化工大学吕永琴副教授　　北京化工大学生命科学与技术学院吕永琴副教授介绍了基于功能化整体柱的快速高效分离技术，包括整体柱的原理和优点，以及其在纳米生物探针的设计和构筑方面的工作 吕永琴另一部分工作则是基于先进功能的二氧化碳及甲烷的高值利用，吕老师介绍了这项工作的研究背景及初步研究结果。　　中国合格评定国家认可委员会贾汝静　　中国合格评定国家认可委员会贾汝静介绍了中国合格评定国家认可委员会(CNAS)的工作内容、“合格评定”的定义，并着重介绍了国内法庭科学的相关内容，包括毒品毒物的鉴定及DNA的鉴定等。加拿大AES公司联席首席执行官牟一萍女士　　联谊报告会最后，加拿大AES公司联席首席执行官牟一萍女士与大家分享了工作与生活心得。

20世纪60年代物理学家约翰哈伯德提出的Hubbard模型是一个简单的量子粒子在晶格中相互作用的物理模型，该模型被用于描述高温超导，磁性缘体，复杂量子多体中的物理机制。Hubbard模型在二维材料中的验证可以当做是量子模拟器，用以解释强关联量子粒子中的问题。近期，美国康奈尔大学的Jie Shan课题组在《自然》杂志上发表了WSe2/WS2超晶格中的低温光电与磁光性质新进展，验证了Hubbard模型在二维材料体系中的实用性。文章通过对对角相排列的二硒化钨（WSe2）与二硫化钨（WS2）的研究，得到二维三角晶格Hubbard模型的相图。如图1a所示，由于双层WSe2/WS2的4%晶格失配而形成三角形的莫尔超晶格。通过调控双层WSe2/WS2器件的偏置电压来调控载流子浓度与填充因子，从而研究其电荷和磁性能。值得注意的是，WSe2/WS2之间的扭转角不同，两者的反射光谱展现出不同的性质（见图1d与图1e）。同时，在反射对比中观察到准周期调制，这可能与半整数莫尔代填充有关。图1. WSe2/WS2超晶格晶胞(a)，能带(b)与器件示意图(c), WSe2/WS2扭转角分别为20度（d）与60度（e）时候的反射光谱数据。 通过测量WSe2/WS2超晶格器件的电阻，作者发现当填充因子是0.5（半填充）或者1（完全填充）时，电阻变化大（见图2c），该结果表明该器件在半填充与完全填充的时候具有缘态。图2. a: 温度1.65K，WSe2/WS2超晶格反射光谱随载流子浓度调控变化图。b: 反射光谱强度与填充因子的关系图。c: 不同温度下，器件电阻与填充因子曲线(内置图，电阻随温度变化图）。图3. a: 温度1.65K，WSe2/WS2超晶格圆偏振反射光谱随磁场变化。b: 不同填充因子情况下反射光谱塞曼分裂结果。c-d: g因子随温度变化结果。在半填充状态下，左旋圆偏振与右旋圆偏振测量的WSe2/WS2超晶格反射光谱在磁场下具有不同峰位（图3a）。该峰位差即是反应了磁场引入的塞曼分裂现象。通过分析g因子随温度变化的结果，确认温度高于4K时，WSe2/WS2超晶格的磁化率与温度关系符合居里-韦斯定律（Curie–Weiss law）。对以上磁化率与温度结果的进一步分析可以证实在WSe2/WS2超晶格中Hubbard模型完全适用。文章中，作者使用了德国attocube公司的attoDRY2100低温恒温器来实现器件在低温度1.65K下通过电场与磁场调控的低温光学实验。该工作成功地表明莫尔超晶格是很好的研究强关联物理并适用Hubbard模型的平台。图4：低振动无液氦磁体与恒温器—attoDRY系列，超低振动是提供高分辨率与长时间稳定光谱的关键因素。 attoDRY2100+CFM I主要技术特点：+ 应用范围广泛: PL/EL/ Raman等光谱测量+ 变温范围：1.5K - 300K+ 空间分辨率： 1 μm+ 无液氦闭环恒温器+ 工作磁场范围：0...9T (12T, 9T-3T，9T-1T-1T矢量磁体可选)+ 低温消色差物镜NA=0.82+ 精细定位范围： 5mm X 5mm X 5mm @4K+ 精细扫描范围：30 μm X 30 μm @4K+ 可进行电学测量，配备标准chip carrier+ 可升到AFM/MFM、PFM、ct-AFM、KPFM、SHPM等功能 参考文献：[1]. Yanhao Tang et al, Simulation of Hubbard model physics in WSe2/WS2 moiré superlattices, Nature, 579, 353–358(2020)

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　蛋白质大多都是通过组装成蛋白复合物来执行特定的生物功能，因而表征内源性蛋白复合物的结构和动力学将有助于生命过程的理解。蛋白复合物在其组装、翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)和非共价结合等方面是高度动态的，在native状态下通常以低丰度存在，这给研究其结构和动态性的传统结构生物学技术(如X-ray和NMR)带来了巨大的挑战。非变性Top-down质谱(nTDMS)结合了非变性质谱和Top-down蛋白组学的优势，目前已发展成蛋白复合物结构表征的有力工具，可以保留蛋白质亚基-配体间的非共价作用和PTMs等重要信息。然而，由于内源性蛋白复合物自身的低丰度特性，导致对其的分离纯化和检测非常困难，所以nTDMS目前仅限用于过表达的重组或高丰度蛋白质的表征。在本研究中，作者开发了一种非变性纳米蛋白质组学(Native nanoproteomics)技术平台，通过使用表面功能化的超顺磁性纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)直接富集组织中的蛋白复合物，然后再利用高分辨质谱表征其结构和动态性。这里选用心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)异源三聚体复合物(~77 kDa)作为研究对象。cTn三聚体复合物是调节横纹肌肌动蛋白收缩的Ca2+离子调节蛋白，由TnC、cTnI和cTnT这3个亚基组成。其中，TnC是Ca2+结合亚基，cTnI是抑制肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的亚基，而cTnT细丝锚定亚基。TnC与Ca2+的结合，以及cTnI 亚基的磷酸化，会共同引起细丝上的分子级联事件，诱导心肌收缩所必需的肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的形成。传统结构生物学技术不能有效捕获cTn复合物高度动态的构象变化，并且先前研究用的cTn复合物是由原核细胞表达的，缺乏PTMs的信息。因此，作者开发了native纳米蛋白组学的方法，以实现对人内源性cTn复合物结构和动力学的全面表征。作者首先使用肽功能化的超顺磁性氧化铁NPs富集了人心脏的内源性cTn复合物，同时优化了非变性蛋白提取缓冲液(高离子强度LiCl溶液，生理pH)。富集到的cTn复合物中的3种亚基的含量比例为1:1:1，真实反应了肌节cTn异源三聚体复合物的组成。作者也发现含有750 mM L-Arg，750 mM咪唑和50 mM L-Glu(pH 7.5)的溶液对蛋白复合物的洗脱效果最好，并且不会破坏亚基间的相互作用。该富集方法具有很好的重现性，proteoforms信息得到很好保留，且可以直接用于化学计量分析。总的实验流程如图1所示，洗脱后的cTn复合物经体积排阻色谱(Sze-exclusion chromatography，SEC)除盐和交换至醋酸铵溶液中，随后对cTn复合物进行多种nTDMS分析：1)在线SEC监测复合物 2)超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)表征复合物的化学计量比和proteoforms 3)捕获离子淌度质谱(TIMS-MS)解析调控复合物构象变化中的非共价作用的结构动态性。　　图1. 用于表征人心脏中内源性cTn复合物的native纳米蛋白组学平台。　　为了全面表征内源性cTn复合物，作者使用FTICR-MS进行proteoforms测序和复合物表征。图2展示了native状态下检测丰度最高的cTn复合物的电荷态(19+)，其中包含了4种独特的proteoforms，这些复合物主要带有单磷酸化的cTnT、单磷酸化和双磷酸化的cTnI，以及结合了3个Ca2+的TnC。这些结果表明人cTn复合物在肌节中以结构多样化的分子组成存在，具有高度异质的共价和非共价修饰，可产生一系列不同的完整复合物。　　图2. FTICR-MS分析展示的cTn复合物状态。红色方框中是最高丰度电荷态(19+)的放大谱图，理论同位素分布(红色圆圈)可以与谱图很好叠加，说明结果具有高质量精度(质量偏差在2 ppm 以内)。　　作者接着对cTn复合物进行complex-up分析，以研究复合物的化学计量比及其组成。图3a~3b分别显示的是完整cTn三聚体复合物，以及经CAD碎裂后的蛋白亚基谱图。但这里没有检测到cTnI单体，可能是因为cTnI和TnC在native状态下的亲和力很强，且cTnI单体带的电荷不多，导致其在高m/z区域出峰，所以不易被检测到.随后，作者又对解离出的亚基进行complex-down分析。图3c展示了检测到的cTnT的多种proteoforms：未磷酸化的 cTnT、单磷酸化的cTnT(p cTnT)和 C 端 Lys 截断的磷酸化cTnT(pcTnT [aa 1-286])，CAD碎裂谱图也发现cTnT的C端较N端更易暴露在外界溶剂中。图3e则是cTn(I-C)二聚体的谱图，共检测到6种具有不同数量Ca2+结合和磷酸化的proteoforms。二级谱图可将cTnI的两个磷酸化位点准确定位在Ser22和Ser23，同时发现cTnI序列两端都较内部区域更易暴露于溶剂中。但还无法通过nTDMS准确推断Ca2+结合和磷酸化是如何影响cTn复合物的稳定性。作者在此也没有优化FTICR-MS在非常高m/z范围的离子检测，所以也会遗漏带少量电荷的cTn复合物信息。　　图3.nTDMS表征人心脏来源的cTn复合物。(a~b)完整cTn复合物和经CAD碎裂后的亚基谱图 (c~d)cTnT单体及其代表性的CAD碎裂谱图 (e~f)cTn(I-C)二聚体及其代表性的CAD碎裂谱图。　　人TnC蛋白含有3个钙结合EF-hand基序(结构域 II~IV)。结构域 II与Ca2+结合的亲和力较低，是触发心肌收缩的调控域。结构域 III 和 IV则与Ca2+具有强的亲和力，在心肌舒张和收缩时均始终保持与Ca2+充分结合，但结构域 II只有在收缩时才被Ca2+占据。这里观察到了TnC分别与0、1、2和3个Ca2+结合的情况，通过CAD碎裂也进一步定位了TnC与Ca2+结合的具体氨基酸序列(图4)。研究发现结构域 II的骨架最容易发生碎裂，而结构域 III的骨架最难碎裂。目前结构域 II~IV的序列在UniprotKb中分别对应65DEDGSGTVDFDE76、105DKNADGYIDLDE116和141DKNNDGRIDY152。这里分别将与1、2和3个Ca2+结合的TnC隔离出来进行CAD碎裂(m/z分别为2312、2316和2321)，可以更准确地将结构域 III、II和IV的序列分别定位到113DLD115、141DKNND145和73DFDE76(图4c)，表明非变性纳米蛋白组学方法在定位非共价金属结合方面具有高分辨能力。　　图4.nTDMS定位 TnC与Ca2+结合的结构域。(a)FTICR-MS隔离与不同数量Ca2+结合的TnC单体 (b~c)与两个Ca2+结合的TnC的CAD碎裂谱图，蓝色、红色和黄色方框分别对应结构域 II 、III和IV。　　Ca2+与TnC的结合会对cTn复合物的功能和构象有着很大影响。cTn复合物的核心区维持着构象的稳定，但当Ca2+与TnC发生结合时，其柔性区会经历广泛的构象变化，复合物结构会从“closed”状态转变成“opened”状态，这会促进肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用，最终导致心肌收缩。然而，传统结构生物学技术很难捕获cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化。因此，作者使用离子淌度质谱来分析cTn复合物的构象变化。TnC亚基和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体的淌度分离谱图如图5所示。与0~3个Ca2+结合的TnC的碰撞截面(Collision Cross-Section，CCS)值分别为1853、1849、1829和1844 Å2(图5a~5b)，TnC构象比IMPACT预测的更为紧凑，但cTn(I-C)二聚体的CCS值与预测的非常接近(图5c~5d)。作者推测TnC与两个Ca2+结合会形成更致密的构象，是因为在静息舒张时Ca2+与结构域 III 和 IV充分结合。当第三个 Ca2+与结构域II结合时，TnC转变为“opened”构象，使其N端与cTnI的C端相结合，进而引发心肌收缩(图5e)。cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化也是如此(图5f)。　　图5.TnC单体(a~b)和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体(c~d)的离子淌度分离谱图 (e~f)TnC和cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化。　　最后，作者通过添加EGTA来剥离cTn复合物中的Ca2+，以进一步研究Ca2+在维持复合物结构稳定性上的作用。图6b~6c是没有EGTA孵育时的cTn复合物的TIMS-MS谱图。cTn复合物的CCS值与理论预测值非常符合。随着EGTA孵育浓度的增加(25、50和100mM)，Ca2+逐渐被螯合，cTn复合物的结构也越来越舒展，体现在平均电荷态逐渐增加，以及逐渐在较低m/z范围内出峰，这表明cTn复合物构象的稳定性丢失与EGTA浓度的增加相关(图6d~6f)。虽然100mM EGTA孵育也不敢保证Ca2+的完全剥离，并且cTnI的存在又会增强TnC与Ca2+的结合，但TIMS-MS为我们研究cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化提供了一种切实可行的分析手段。　　图6.cTn复合物与EGTA孵育时的构象变化。(a)cTn复合物的构象随EGTA孵育浓度的增加发生改变 (b~c)cTn复合物的TIMS-MS谱图 (d~f)cTn复合物与不同浓度EGTA(25、50和100mM)孵育的谱图和CCS分析。　　总的来说，本研究开发了一种可用于内源性蛋白复合物富集和结构表征的非变性纳米蛋白组学方法，以获取其组装、proteoforms异质性和动态非共价结合等方面的生物信息。本文采用的功能化NPs可被灵活设计成选择性结合特定的靶蛋白，在富集和洗脱过程中可以很好保持其近似生理条件下的存在状态。更为重要的是，功能化NPs与nTDMS的整合可以作为一种强有力的结构生物学工具，可以作为传统技术的补充，用于内源性蛋白复合物的表征。　　撰稿：陈昌明 编辑：李惠琳文章引用：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics　　参考文献　　Chapman EA, Roberts DS, Tiambeng TN, et al. Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics. Nat Commun. 2023 14(1):8400. Published 2023 Dec 18. doi:10.1038/s41467-023-43321-z

p style="text-indent: 2em "近日，日本科学家研制出两种新材料，它们都是三层石墨烯结构，但由于堆叠方式不同，却各具独特的电学性能，这项研究对于光传感器等新型电子器件的发展具有重要意义。/pp style="text-indent: 2em "自从2004年，两位科学家首次利用清洁石墨晶体的透明胶带分离出了单层碳原子，石墨烯就因其迷人的特质吸引了无数研究者蜂拥而至。它的强度是钢的200倍，不仅非常柔韧，而且是一种极为优良的电导体。/pp style="text-indent: 2em "石墨烯的碳原子呈六边形排列，构成了蜂窝状晶格。在单层石墨烯上再堆叠另一单层石墨烯，就可以形成双层石墨烯结构。有两种堆叠方法：让每层石墨烯结构的碳六边形中心彼此正对在一起，就构成了AA堆叠结构；而将其中一层向前移位，使得其碳原子六边形中心位于另一层石墨烯的碳原子之上，就构成了AB堆叠。AB堆叠的双层石墨烯材料在施加外部电场时，具有半导体的性质。/pp style="text-indent: 2em "刻意堆叠三层石墨烯结构是非常困难的，但是这样做却可以帮助科学家们研究三层材料的物理性质是怎样随层与层间堆叠方式的不同而变化的，并从而对新型电学仪器设备的发展具有促进作用。现在，日本东京大学和名古屋大学的研究者已成功研制出两种具有不同电学性能的三层石墨烯结构。/pp style="text-indent: 2em "他们采用了两种不同的方式加热碳化硅，一种是在加压氩气环境下将碳化硅加热到1510摄氏度，另一种是在高真空环境将碳化硅加热至1300摄氏度。随后用共价键已被破坏成单个氢原子的氢气喷涂两种材料，两种不同的三层石墨烯结构就大功告成了。在加压氩气下加热的碳化硅形成了ABA堆叠结构的三层石墨烯，其顶部和底层的碳原子六边形精确对齐，中间层稍有移位。高真空环境下加热的碳化硅则形成了ABC堆叠结构的三层石墨烯，每一层碳原子六边形都比其下面一层稍稍向前移位。/pp style="text-indent: 0em text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/fda047f2-d0aa-4cca-894b-6475b2f605a5.jpg" title="同是三层石墨烯结构 电学性质因何大相径庭？.jpg"//pp/pp style="text-indent: 2em text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) font-size: 14px "ABA堆叠状三层石墨烯（图a）与ABC堆叠状三层石墨烯（图b）的晶体结构示意图/span/pp style="text-indent: 2em "科学家们检测了这两种三层石墨烯结构的物理性质，发现他们电学性能差异显著。ABA型石墨烯与单层石墨烯类似，是十分优良的电导体，而ABC型石墨烯却更像AB型双层石墨烯结构，具有半导体的性质。/pp style="text-indent: 2em "“ABA型和ABC型两种不同三层石墨烯结构的成功制备，将从堆叠层数和堆叠序列的角度，拓宽石墨烯基纳米电子器件的研发可行性。” 相关研究人员在NPG Asia Materials杂志上发表的论文中这样总结道。/p

北京东方德菲仪器有限公司SVT20N视频旋转滴张力仪使用 &ldquo 旋转滴方法研究界面扩张流变性质&rdquo 的文章 在物理化学学报上发表 我公司代理的德国Dataphysics公司生产的SVT20N视频旋转滴张力仪是使用旋转滴方法研究界面扩张流变性质的仪器，相对于普遍应用的Langmuir槽法和悬挂滴方法，它增加了转速振荡的功能，可以更精确地测量超低界面张力体系的扩张流变性质。 中国科学院理化技术研究所利用我公司SVT20N视频旋转滴张力仪，采用旋转滴方法，研究2-丙基-4,5-二庚烷基苯磺酸钠(DHPBS)在癸烷-水界面上的扩张流变性质的文章在物理化学学报上发表。有关文章的信息如下： 旋转滴方法研究界面扩张流变性质 张磊1 宫清涛1 周朝辉1 王武宁2 张路1 赵濉1 余稼镛1 （1中国科学院理化技术研究所，北京 100080；2 北京东方德菲仪器有限公司，北京 100089） 摘要：采用旋转滴方法，对2-丙基-4,5-二庚烷基苯磺酸钠(DHPBS)在癸烷-水界面上的扩张流变性质进行了研究，较为详细地介绍了SVT20N视频旋转滴张力仪的装置和实验方法，考察了油滴注入体积、基础转速及振荡振幅等试验条件对扩张模量的影响。研究结果表明，旋转滴方法是一种研究扩张流变性质的新型手段，在涉及低界面张力现象的领域具有良好的应用前景. 关键词：旋转滴方法； 烷基苯磺酸盐； 界面扩张性质； 扩张模量 Study of Interfacial Dilational Properties by the Spinning Drop Technique ZHANG Lei1 GONG Qing-Tao1 ZHOU Zhao-Hui1 WANG Wu-Ning2 ZHANG Lu1 ZHAO Sui1 YU Jia-Yong1 (1 Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Science, Beijing 100080, p.R.China 2 Beijing Eastern-Dataphy Instruments Co.,Ltd.,Beijing 100089, p.R.China) Abstract: The dilational viscoelastic properties of 4,5-dihepty-2-propylbenzene sulfonate (DHPBS) at the decane/water interface were investigated with a spinning drop tensiometer. The instrument of the spinning drop tensiometer SVT20N and the corrrlative experimental method were discussed in detail. The influence of oil drop volume, rotational speed, and oscillating amplitude on the interfacial dilational modulus were expounded. Experimental results show that spinning drop analysis is a novel method for probing interfacial dilational properties and has good prospects for application in the measurement of low interfacial tension phenomena. Key word: Spinning drop analysis Sodium alkyl benzene sulfonate Interfacial dilational property Dilational modilus

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上文章，High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是美国基因泰克公司的Wendy Sandoval研究员。　　癌症疫苗是通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统。常见的策略是通过对病人的肿瘤细胞样本进行基因测序来寻找特征性抗原肽，该抗原肽会与I类主要组织相容复合体(MHCI)相结合并呈递至CD8+细胞表面，通过与CD8+细胞表面受体相结合从而诱导免疫反应。为了实现整个过程，研究人员通常会结合基因测序和计算机预测结果设计多个候选抗原肽，每个候选肽都需要通过实验测试来确认它与MHCI分子的结合能力以及相关免疫原性。此外，考虑到编码MHCI的基因具有多态性，候选抗原肽还需要与不同等位基因编码的MHCI分子进行测试。因此，本文开发了一种高通量方法，利用非变形质谱快速筛选候选抗原肽并表征形成的肽-MHCI复合物(pMHCI)。　　pMHCI复合物中抗原肽的体外载入一直以来都是难点，因为MHCI复合物(包括HLA和β2M亚基)本身并不稳定，需要长度为8~10的多肽链载入到MHCI的凹槽以保持完整。本文则通过利用紫外光裂解肽-MHCI复合物(UV-MHCI)的肽交换实现抗原肽的载入，具体步骤如图1A所示，通过紫外光照，UV-MHCI中的高亲和肽被切割转为低亲和肽段，该低亲和力肽段极易发生肽交换，通过监测新的pMHCI复合物的形成实现对候选肽的评估。目前常用的检测pMHCI形成的工具包括ELISA、TR-FRET以及2D-LC-MS。然而这些方法仅能提供有限的信息关于肽交换、pMHCI分子质量，对形成的pMHCI复合物无法进一步的表征。事实上，pMHCI复合物对后续诱导免疫反应至关重要。　　图1. 癌症疫苗的免疫监测的示意图：A) 筛选流程，B检测方法。　　为了确认非变性质谱(nMS)能否用于pMHCI复合物表征以及肽交换率的检测，作者对UV-MHCI以及6个标准肽段进行了考察(图2)。未经UV照射的UV-MHCI MS谱图(图2A)可以观察完整的UV-MHCI复合物以及丢掉紫外光裂解肽的MHCI。MHCI复合物被认为是气相解离产生的，因为没有活性肽的稳定作用，MHCI很难存在于溶液相中，溶液中没有MHCI，“空壳”的MHCI只有可能是质谱中UV-MHCI的气相裂解产生的。图2B证实了这一观点，经紫外光照射后，紫外光裂解肽由高亲和力转为低亲和力，从MHCI上脱落，MHCI解离成HLA和β2M亚基，谱图中能观察到HLA和β2M亚基信号。确认了MHCI是由peptide-bound population产生的信号，作者开始用该方法去定量标准肽的肽交换率。如图2C为UV-MHCI与标准肽孵育并过夜UV照射得到的谱图，仅观察到完整的pMHCI以及“空壳”MHCI的信号，说明实现了100%的完全肽交换。如图2D，肽交换率随孵育时间改变，2小时孵育时间足以实现最大肽交换。　　图2. nMS表征UV光照A)前B)后的UV-MHCI复合物，C)nMS测定UV-MHCI与标准肽的肽交换率，D)标准肽肽交换率随时间的变换情况。　　为了提高分析通量，减少样本消耗，作者在nMS基础上开发了SEC-nMS和CZE-nMS系统。作者用SEC-nMS系统测定了50个候选肽的交换率，说明该系统能够进行中或大规模的数据采集。相比较SEC-nMS而言，CZE-nMS系统具有更高的灵敏度和通量，样品体积消耗从微升减少至纳升，分析时间也缩短为2 min(图3A)。检测信号与进样量呈线性关系，注射体积为3 nL时，最低检测限为6 ng(图3BCD)。作者测定了67个候选肽跨越4种等位基因编码的MHCI分子的肽交换率(图3E)。此外，通过将UV-MHCI复合物同时与四种以上的候选肽进行孵育可在单个实验中同时检测它们的相对肽交换率以及与MHCI结合的亲和力(图3F)。作者还提出Vc50这个概念，即导致50%的pMHCI复合物发生解离的碰撞电压，可作为评估pMHCI复合物稳定性的重要参数。　　图3. 使用CZE-MS系统高通量分析pMHCI复合物　　除了检测pMHCI复合物的形成，测定肽交换率，nMS还可以对形成的复合物进行进一步的结构表征。如图4所示，native top-down的分析策略可获得多层次的结构信息。本文使用的Orbitrap Eclipse “Tribrid” 质谱，图4A为完整pMHCI的MS1谱图，图4B为施加源内电压(SID)促使蛋白解离为亚基，图4C是将14+ pMHC单独分离出，为后续HCD活化做准备。图4D为pMHCI复合物经HCD解离后的MS2谱图。图4E和图4F则分别为对肽段以及HLA亚基进行top-down测序的结果。这些多层次的结构信息能够帮助区分HLA亚型、阐明候选肽的序列，包括一些PTMs、二硫键信息。这些结构细节可能会影响候选肽与MHCI分子间的亲和力甚至是后续T细胞受体的识别。　　图4. Native top-down分析策略获得pMHCI复合物的多层结构信息　　总之，本文将非变性质谱(nMS)与分子排阻(SEC)或毛细管电泳(CZE)分离技术相结合用于高通量筛选pMHCI复合物中的候选肽。该方法能够直观确认pMHCI的完整性，Vc50可作为评估复合物气相稳定性的重要指标，通过native top-down分析策略可获得多层次的结构信息。以上所有确保了后续临床T-细胞实验的正常进行。　　撰稿：刘蕊洁　　编辑：李惠琳　　原文：High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Schachner LF, Phung W, Han G, et al. High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 10.1021/acs.analchem.2c02423. doi:10.1021/acs.analchem.2c02423

胰蛋白酶消化，质谱法轻松鉴定蛋白质，已经是非常成熟的工作流程。即使是刚接触MS的使用者也可以很快掌握。在质谱法鉴定蛋白的工作流程中，蛋白质鉴定是通过使用搜索引擎，例如 Mascot或Matrix Science进行简单的数据库搜索来实现的。然而，对于数据库中未列出的蛋白质鉴定需求，或需要进行蛋白质末端序列分析的这两种情况，通常采用更昂贵的高端仪器和更复杂的工作流程，需要熟练的操作员。此外，蛋白质测序仪也通常用作蛋白质末端序列分析的方法，但遇到 N 端封闭的蛋白质，去封闭是必要的。作为样品序列分析前的预处理，预处理效果取决于蛋白质类型，可能效果不佳，对操作人员有一定要求，需要一定程度的技能和经验，这些可能会限制其使用。 近年来，利用MALDI-TOF离子源（ISD：In-Source Decay）中发生的蛋白质碎裂离子，可以分析N末端被封闭或未在数据库中登记的蛋白质序列MS图谱。此外，ISD理论上不受每个样品质量的限制，因此无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质进行测序。结合电泳胶提取蛋白和岛津台式机MALDI-8020，通过N端封闭蛋白的分子量测定和序列分析的例子，让我们来了解下大蛋白分子直接测序技术MALDI-ISD。 将模型样品N 端被乙酰化的牛碳酸酐酶 (Sigma-Aldrich)溶解在缓冲溶液中进行电泳， 95 °C 下加热 5 分钟，然后在聚丙烯酰胺凝胶（ATTO 12.5 %，预制 e-PAGEL）上进行电泳。所得聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色以检测蛋白质斑点。使用含有表面活性剂的提取缓冲溶液，我们从凝胶分离的碳酸酐酶的条带中提取蛋白质。使用氯仿/甲醇在提取缓冲溶液中沉淀蛋白质以去除表面活性剂和盐，并使用 MALDI-TOF 质谱仪进行测量。芥子酸用作 MALDI 基质用于蛋白质分子量测量，1,5-二氨基萘 (DAN) 用于 ISD 的序列分析。 图1、碳酸酐酶电泳图图2、从凝胶中提取的碳酸酐酶MS图（基质芥子酸） 接下来，从25 pmol凝胶蛋白条带中提取碳酸酐酶，与基质DAN混合，MALDI-8020线性模式进一步分析。结果如图3所示，主要检测到c离子（从蛋白质N段产生的片段）质量一致的峰。通过使用免费软件Mass++ TM和蛋白质氨基酸序列比对工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，我们对从检测到的峰中获得的氨基酸序列进行了同源性搜索。 图3、MALDI-ISD鉴定结果 鉴定结果显示匹配结果最高的是碳酸酐酶。通过检测到的c离子片段质量和数据库中已有的碳酸酐酶氨基酸序列，我们可以推断出N段序列是SHHWGYGKH...，并且是N-乙酰化的。 MALDI-8020线性模式MALDI-ISD技术，无需复杂的工作流程，无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质（如本文所述m/z 29030示例）进行N端测序。 该方法在岛津应用专家与美国佛罗里达州立大学、日本爱媛大学高级研究支持中心生物医学分析部、利物浦大学生化与系统生物学系等共同发表的一篇文献中也有应用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝胶的预分馏，实现质谱法鉴定完整蛋白或蛋白复合物。凝胶分离回收14种人血清蛋白，提取后，用MALDI-8020的MALDI-ISD产生的产物离子鉴定人血清白蛋白N端氨基酸序列。 MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧，性能卓越的特色产品。荣获2018 IBO工业设计大奖银奖。 主要特点：● 线性台式MALDI-TOF● 200Hz固态激光器，355nm波长● 进样速度快● TrueClean™ 自动源清洁功能。配备大口径离子光学系统，使仪器长期使用中源的污染风险降到最低。配备基于紫外激光器的源清洁功能，可自动快速实现源自清洁。● 静音（55dB）● 可视化工作状态 参考文献：岛津应用新闻 No.B83J. Proteome Res. 2020, 19, 3779−3791

日本理化学研究所6月8日宣布，一个国际联合研究小组利用RI射束工厂的放射性同位素射束加速器，在4天之内发现了从锰(25号元素)到钡(56号元素)的45种新放射性同位素。新发现的同位素数量高于世界上约40种年平均发现的同位素数量。对破解长期以来元素的合成以及中子过剩原子核之谜打开了一扇窗口。　　新放射性同位素是把铀238(92号元素，质量数238)通过超导环形回旋加速器以光速的70%速度加速后，冲击标靶铍和铅的原子核，利用其引发的飞行裂变而生成的。研究小组把生成的同位素，用超导光束分离生成装置(BigRIPS)进行收集和分析，发现了中子过剩的新同位素。此次发现的新放射性同位素中，特别值得注目的是中子数为82的钯128。 该研究成果将发表在《日本物理学会杂志》(Physical Society of Japan)上。　　原子核由质子和中子组成，其性质由质子数和中子数决定。地球上约有300个金、铁等天然存在的稳定性原子核，但理论上认为有10000个原子核，其中大部分为放射性同位素这样的不稳定原子核。比稳定原子核中子数少的原子核称为质子过剩核，比稳定原子核中子数多的原子核称为中子过剩核。　　约100年前科学家发现了放射性同位素，同时创建了原子核物理学。自此，科学家开始了对天然存在的稳定原子核和半衰期较长的不稳定核的研究。之后，科学家利用加速器人工生成同位素，原子核物理学与加速器技术以及同位素分离技术同时发展、成长，直至目前可以对半衰期极短的不稳定核进行研究。　　该国际联合研究小组把稳定的原子核重离子射束通过高能加速，对标靶进行照射。利用“弹丸碎裂反应”和“铀238的飞行裂变”产生放射性同位素射束。特别是铀238的飞行裂变，能够从质量数50至150的范围内高效生成中子过剩同位素。　　研究小组在超导环形回旋加速器、理研环形回旋加速器和固定周波型环形回旋加速器、中段环形回旋加速器构成的加速器系统中，用铀射束撞击标靶，飞行裂变后生成放射性同位素。通过增强铀射束强度，从20号元素至60号元素范围内生成中子过剩的新放射性同位素可能性大为提高。　　之后，研究小组把生成的同位素通过超导放射性同位素分离生成装置(BigRIPS)的第一步，选别和分离中子过剩同位素。然后，分离后的中子过剩同位素通过BigRIPS第二步，进行新同位素的粒子识别。粒子识别是根据生成的同位素的飞行时间、能量损失和到达检测器的位置信息磁钢度测定得出。　　这些新发现的同位素可能在宇宙中参与了从铁至铀的元素合成过程。特别是硒95、溴98、氪101、铷103、锶106、锶107、钇109、钯128、碲143，是在元素合成过程中具有重要位置的原子核。今后通过对铀射束增加强度，期待大量生成新的同位素，并对其半衰期和质量的测定，解破宇宙中元素合成过程之谜。

近日，中国科学院上海光学精密机械研究所高功率激光单元技术实验室胡丽丽研究员团队采用了一种将实验、分子动力学模拟和定量结构性质关系分析(QSPR)相结合的方法研究磷酸铝玻璃，相关研究成果发表于《美国陶瓷》(Journal of the American Ceramic Society)。目前，磷酸铝玻璃在许多领域都有广泛的应用，包括生物医学材料、光学元件、密封材料和核废料固化等。通过实验技术手段对磷酸铝玻璃的短程结构已有较多的研究，但其性质与中程结构之间的关系尚不清楚。而分子动力学模拟已成为了研究的有效工具，在揭示玻璃性质的结构起源方面发挥着越来越重要的作用。 　　在本项研究中，研究人员结合了实验、分子动力学模拟方法研究Al2O3对磷酸铝玻璃的短程及中程结构的影响，并通过QSPR方法建立其结构性质模型。通过拉曼、同步辐射等实验结果验证了模拟的准确性。模拟结果表明，玻璃网络中存在的P-O-P键随Al2O3含量变化逐渐被P-O-Al键替代，对玻璃的性能变化起着重要的作用。同时，磷酸铝玻璃中的长链易形成环状结构，并集中在4~20元环。此外，利用三个不同的结构描述符来建立QSPR模型，并成功地将实验数据与模拟结果相关联，表现出良好的模型预测性。这一方法为预测玻璃性质及设计玻璃组分提供新思路。图1以磷酸铝玻璃的(a)配位数(CN)、(b) Qn、(c)环尺寸作为结构输入所建立的定量结构-性能关系模型。从左到右列为结构描述符Fnet分别与实验密度、硬度、玻璃化转变温度和热膨胀系数的关系。

点击蓝字关注我们表面张力分为静态（平衡）表面张力和动态表面张力(dynamic surface tension, DST)。静态表面张力是指表面活性剂在界面达到吸附平衡时的最低表面张力，而DST是指表面活性剂在达到平衡吸附前某一时刻的表面张力，是一个变化的值。当研究的液体吸附过程在快速、持续进行, 且短时间内无法达到平衡时, 对液体DST的研究比静态表面张力更有意义。如在农药喷洒、喷墨印刷、织物快速润湿, 以及摄影用薄胶片制备中。图1对比了近10年 (2008～2018年) 国内外发表的以DST为主要考察项的论文数。数据显示国内在DST方面的研究较少且总体波动不大，而国外则呈持续上升趋势。图1 2008～2018 年国内外发表的DST 文章数量对比图研究液体在药物制剂过程中的DST, 可挖掘DST与制剂过程、制剂产品之间的关系, 进而优化制剂过程、改进工艺参数。一、动态表面张力的测定由于对DST时间范围界定的不同，可运用的测量手段也有所不同。王建坤等认为，在达到静态表面张力前的表面张力变化都可算是DST，这个时间范围以几毫秒到几小时计。可用Wilhelmy吊片法、DuNouy吊环法、滴重法、滴体积法、悬滴法、最大气泡压力法测定DST。图2 不同的DST 测定方法的适用时间范围示意图根据Rosen描述的动态吸附过程可知在新表面形成后1 s内，是表面吸附的关键期，体系的DST变化迅速。中药水提液的表面张力在5~100 ms内具有较大变化，大多数在1 s内都已达到平衡。因此，用于测量DST的方法应具有连续、精确、快速测量1 s内数据能力。二、最大气泡压力法通过毛细管将气体注入到待测液体中时，在毛细管的端部重复形成气泡，根据气泡压力的最大值和毛细管半径，计算得到表面张力。通过改变气流流速控制气泡的年龄，可测量不同时间尺度的表面张力。目前实验室中多用KRüSS公司的BP100气泡压力张力仪测定1 s内DST。三、DST 在药物制剂领域的潜在应用价值近10年，DST已受到化工、涂料、印染等领域的广泛关注。药物制剂领域也有很多液体瞬时运动的过程，如喷雾干燥雾化，流化床制粒的粘合剂雾化，关注DST在液体雾化及扩散润湿过程中的作用，是精细控制制剂工艺的手段之一。1DST在雾化过程中的作用雾化是将液体通过雾化器(在一定压力下)喷射进入气体介质中，使之分散并碎裂成小液滴(雾滴)的过程。赵辉等考察了相同条件下，农药药液在不同时间点(0.023、0.124、0.483和0.998 s)的DST与雾滴体积中径(D50)的关系；发现D50随着喷雾液的DST值的降低而降低，二者呈线性相关，但二者的相关系数k 随DST 测定时间的延后而变差。0.023 s时的DST与D50相关系数高达0.9848，时间＞1 s后，只有0.7135。利用动态表面张力仪测试了66种常见中药的水提液，发现所有提取液的DST在1 s内均有下降，但下降程度不同，且提取液雾滴粒径D50与94 ms时测得的DST存在一定相关关系，该结论还在进一步实验确证中。2DST在扩散润湿过程中的作用DST不仅影响药物制剂领域的雾化过程，对扩散润湿过程同样有显著的影响。喷雾干燥与流化床制粒过程中，液体雾化后雾滴在接触相表面的扩散润湿受两大因素影响：一是雾滴的性质，二是接触相的性质。在喷雾干燥黏壁问题中，从DST角度分析，半湿性黏壁现象是由于雾滴与干燥塔壁接触后迅速出现自发润湿，经塔壁的高温干燥后出现黏壁。因此，可从两方面促使雾滴与干燥塔接触后出现快速回缩以改善此黏壁现象。一是增大雾滴DST，二要选择合适的喷雾干燥塔内侧材料。从待喷液分析，应适当降低待测液浓度、进液温度，以增大雾滴DST，或添加疏水性辅料促使快速回缩的发生以改善干燥塔半湿性黏壁。四、 结语综上所述，DST作为一项重要的物理参数，在细微之处影响着药物制剂的品质与生产。关注DST对制剂过程的影响，拓展固有的药剂研究思路是十分必要的。参考文献施晓虹，李佳璇，洪燕龙，赵立杰，冯怡，王优杰. 动态表面张力在药剂学研究中的应用前景[J].国际药学研究杂志,2019.

药物粉体是固体制剂的主体。在固体制剂的研发及生产过程中，药物加工成型的工艺性及产品质量，极大的受到药物粉体技术的影响和制约，药物粉末的物理特性及其每一步工艺过程如粉碎、混合、制粒、压片等的工艺参数，都会对最终的制剂质量产生重要影响，而这些都与粉体表征息息相关。研究和掌握药物粉体技术对制备出高性能的药物至关重要。麦克仪器公司特主办两场针对“药物固体制剂中粉体性质表征”的网络会议，欢迎报名参与。讲座一主题：药物固体制剂中粉体性质表征：比表面及孔径讲师：谢雨时间：2020年4月2日 上午10：00-11：00费用：免费内容简介：现代医药学研究证明，药物的疗效不仅取决于药物的种类，而且很大程度上还取决于组成药剂的粉体的性能，包括尺寸、形状、表面特性等各类参数。药物粉体的比表面积和孔径关系到粉末颗粒的粒径、吸湿性、溶出度和压实度等性能，不仅如此，比表面在粉体的流动和粘结性能中，也具有举足轻重的作用，最终影响到药物的生物利用度及其疗效。此次会议旨在介绍药物粉体的比表面积及孔径表征的分析方法和原理，并通过几篇文献，与听众一起分享比表面和孔径的表征在药物担载、缓释及溶出方面的研究立即报名：https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_12918.html扫码&报名讲座二主题：药物固体制剂中粉体性质表征：密度及孔隙率讲师：林宇彤时间：2020年4月3日 上午10：00-11：00费用：免费内容简介：药物从研发、生产到产品质量控制都离不开粉体表征，其中，药物粉体的密度会影响粉体和颗粒的流动、分离和压缩等行为，而孔隙率则会影响药物的机械完整性，崩解度及溶出度等，这些因素都会影响工艺参数设置和最终药物的生物利用度及其疗效。本次讲座将结合麦克仪器相关产品介绍药物粉体的密度及孔隙率分析方法和原理，并就相关例子探讨密度和孔隙率在药物碾压、崩解等方面的研究。立即报名：https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_12920.html扫码&报名

超声波破碎仪破碎细胞液的操作流程破碎细胞液是超声波破碎仪在生物学、生物化学等领域中常见的应用之一。以下是使用超声波破碎仪进行细胞液破碎的基本操作流程：注意：在进行实验前，请根据实验的具体要求和样品的特性，合理选择超声波破碎仪的参数，并严格按照仪器和试剂的使用说明进行操作。 操作流程准备工作： 准备需要破碎的细胞液样品，将其放入合适的管或容器中。确保使用的容器和超声波破碎仪的处理装置（破碎杵、破碎管等）是洁净的。确保超声波破碎仪的电源连接正常，仪器处于正常工作状态。设置超声波破碎仪参数： 打开超声波破碎仪的控制面板，设置合适的参数，包括超声波功率、工作时间、工作模式等。这些参数的设置需根据细胞液的性质和实验要求进行调整。选择合适的处理装置： 根据样品性质选择合适的处理装置，例如破碎杵、破碎管或破碎尖。不同的处理装置适用于不同类型和量的样品。装载样品： 将装有细胞液的管或容器放置到超声波破碎仪的处理装置中。注意确保样品的容器符合仪器要求，以避免因容器形状或材质不适配而影响破碎效果。进行超声波破碎： 启动超声波破碎仪，开始超声波破碎。根据实验要求，可以选择连续工作或脉冲工作模式。监控样品的温度，确保在破碎过程中不会产生过多的热量。监控破碎过程： 在破碎过程中，可以通过适当的时间间隔停止超声波破碎，检查样品的破碎程度。可以根据需要调整破碎时间，以确保达到理想的细胞破碎效果。结束破碎： 破碎完成后，停止超声波破碎仪的运行。取出样品，根据实验需要进行后续处理，如离心、分析等。清洗工作： 清洗超声波破碎仪的处理装置和样品容器，以防止交叉污染。按照仪器和容器的清洗要求进行操作。以上是一般超声波破碎仪破碎细胞液的基本操作流程。具体的操作步骤和参数设置应根据实验的具体要求和仪器的型号而定。

p　　何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件，使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这，有些小伙伴可能会一头雾水：师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候，第一步就是要变性啊，怎么现在又不要变性了?/pp　　在通常的蛋白质相关分析中，为了破坏蛋白质的三维立体空间结构，便于酶解等操作，会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等)，使蛋白质变性 另外，对于常用的分离手段——反相色谱来讲，其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时，为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏，则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵，pH=7的中性体系)进行研究 另外，对于组成较为复杂的蛋白样品，在非变性条件下分析时，由于体系中质子数减少，所以蛋白电荷态数目也会相应减少，电荷态之间的相互重叠度也会下降，进而减少复杂组分之间的相互影响，从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图1_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/56171fe8-be7c-4cc8-a672-814a9fe87e30.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　strong图1/strong 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图/pp　　目前，strong非变性质谱技术主要应用在两个方面/strong：一是strong生物制药领域/strong，通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此类药物的链间仅靠非共价力结合，故变性条件下各条链会分离，无法测得其完整状态的分子量 另一应用方向为strong研究蛋白质多聚体/strong，非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用，同时由于中性条件更接近生理状态，得到的结果更具意义。/pp　　现在，非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充，已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究，下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。/ppspan style="COLOR: #002060"strongOrbitrap超高分辨质谱：非变性质谱研究的理想平台/strong/span/pp　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求，我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化，包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上，在非变性质谱领域也能有出色表现。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图2_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/caeec8f3-896f-4e02-a44a-84aae9ecd287.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图2/strong Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析/pp　　上文中提到，在生物制药领域中，会通过分子工程设计，在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应，偶联上小分子治疗药物，通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放，达到精确给药、减少毒副作用的目的，这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在这类药物中，通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC，由于其链间仅靠非共价力结合，故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图3_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/270ff8dd-d5c1-442b-baf1-f287fcb557b9.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　strong　图3/strong Cys-ADC结构示意图/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现，使用体积排阻色谱(SEC)，可以将单克隆抗体与其他杂质分离开，而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后，可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征 解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，与之前报道过的DAR值相符。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图4_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/b494de8a-6ac5-42cf-ad12-d84637e32bef.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图4 /strong使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。/pp　　作为对照，在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5)，发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏，只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图5_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/46b85220-b769-47dc-b534-f92c93b56cff.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图5/strong 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。/pp　　对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC，虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合，但偶联上小分子药物后，ADC的复杂度大大增加，此时若在非变性条件下进行分子量测定，可以减少信号之间的干扰，得到更加准确的测量结果(图6)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图6_20170406090915_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/7c9e60f0-f01a-45eb-85eb-f9dceece9c46.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="非变性2_20170406090518_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/e634be51-bf68-49f2-b7be-e205227a7242.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图6 /strong使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。/pp　　strong小结/strong/pp　　本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍，并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用，不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用，各位看官走过路过不要错过，我们下期见!/pp　　参考文献/pp　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4 86 (21):10674-83./pp /p

p style="text-align: left "　　strong一、质谱成像技术简介/strong/pp　　成像质谱(IMS)是一种非常灵敏的分子成像技术，可提供组合的分子信息和空间分辨率。它允许从组织切片、单细胞或其他物质表面直接鉴定和定位化合物分子。成像质谱研究的核心特点是质谱仪的高灵敏度、技术的无标签性、对肽和蛋白质的成像能力，以及从个体水平(几百微米)到细胞水平(几十纳米)空间分辨率。成像质谱允许在单个实验中同时检测数千个不同分子的图像。因此，它是一种有效的多组分分子成像技术。科学家们已经开发了许多不同的成像质谱方案和仪器来研究生物内源性化合物，如脂质、肽和蛋白质，以及外源化合物，如聚合物，或者用于研究组织处理药物的分布。这些研究提供了从亚细胞层次到有机体层次生物过程的详细情况。/pp style="text-align: center "img title="00.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/023209d6-c059-4300-b7e9-75b5d86cff30.jpg"/　　/pp 当今，成像质谱主要是用于病理学离体组织研究的技术，并不具备MRI(磁共振成像)或PET(正电子发射断层摄影)扫描的体内诊断能力。然而，它可以作为体内成像的补充技术来验证生物分子的分布代谢规律或不同疾病阶段药物的递送方式。许多研究人员正在探究用这种补充成像方式来解决分子分布的具体问题。这种做法的理由很明显。没有其他单一的成像技术能够以适当的空间分辨率、时间分辨率及生物学状态提供分子结构和解剖信息的适当组合。与其他分子成像方法相比，如MRI，PET或免疫组织化学(IHC)，成像质谱有一个独特的特征：它可以使化合物分子可视化而又无需标记，这可以实现其他技术所不能实现的对新化合物分布规律的研究。通常，它是在使用影响色差的常规染色剂(例如通常用于组织染色的苏木精和曙红(H& E)情况下，可以做化合物分子鉴定的唯一工具。它可以用于常规组织学染色剂不可实现的化合物分子分布规律的研究。这是因为在病理学中使用的常规染色剂只提供一般组织分型，而不识别特定分子，不提供分子修饰及其组合信息等。不能被常见组织染色剂染色的几种药物和代谢物如表1所列。/pp style="text-align: center "img title="(MS@0{[%]6Q49XJ@3VDOVZA.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/4e4940a0-12c9-4169-b75e-f37f5d2ef818.jpg"//pp　　strong二、质谱成像的解吸和电离技术/strong/pp　　IMS需要从被研究物质的表面解离和离子化化合物分子。主要有两种物理方法：(1)用载能带电粒子碰撞分析物表面，(2)用来自脉冲相干光源的光子照射表面。/pp　　1. 带电粒子的解吸和电离/pp　　带电粒子主要用于二次离子质谱(SIMS)成像。在这种方法中，分析物表面暴露于高能聚焦的一次离子束下。离子撞击会导致表面上下分子的级联碰撞，从而引起表面分子的移动和电离。随后，碰撞产生的二次离子可以进入质量分析器分析以确定其性质。碰撞能量通常会保持较低，以确保一次离子可以与不同区域表面分子相作用，并且确保已碰撞区域不再进行二次碰撞分析。低于表面层分析碰撞能量的实验被称为静态SIMS实验。高于该碰撞能量的实验，被称为动态SIMS实验。在动态SIMS实验过程中，分析物表面会发生持续的变化。在静态SIMS实验中，被分析的表面通常在1%以内。/pp　　在SIMS实验过程中，大量的内部能量被转移到表面分子中。这会导致表层化合物分子产生大量的碎裂。这使得该方法不适合直接研究大分子物质，如肽和蛋白质等。该方法可以较好地观测待测物表面元素和小分子化合物分布规律。化合物碎裂模式与电子碰撞电离中观察到的碎裂模式相似。/pp　　最常用的一次离子种类是铟和镓。它们主要应用于半导体表面上的元素和有机杂质研究，以及薄层表面涂层的研究。受益于较大簇离子或分子离子的应用，切片组织等生物表面也可以被分析。较大的一次离子有Aun+、Binm+、C60+等。这些离子可以使完整次级分子离子的产率更高，并且减少了分子离子碎裂。此外，这些离子的应用还可以显著降低对表面下层分子的破坏，从而增加三维成像实验成功的可能性。/pp　　所有的SIMS实验与以上所述的离子光束均需要保持真空环境，否则初级离子会因为平均自由程太短而不能到达分析物表面。解吸电喷雾电离(DESI)是大气压下的解吸和电离技术。它会产生电喷雾液滴，然后在大气条件下被传送到待分析物表面。溶剂液滴吸附到表面分子上，从而产生与常规电喷雾质谱电离相似的二次离子。这种方式可以产生带多电荷的准分子离子。据报道，该方法适用于多种待测物的表面分析，包括药物片剂、血迹和组织切片等。研究显示，DESI技术用于组织成像可以可视化观察脑和肿瘤组织切片中的磷脂和脂质。/pp　　2. 光子解吸、电离/pp　　2.1 LDI和MALDI/pp　　能够从表面解离和电离分子的第二种方法是光子与表面分子产生相互作用。通常，脉冲激光束聚焦在分析物表面上。由表面层吸收的光子能量会导致表面材料的爆炸性去除或消融。/pp　　当使用红外(IR)或可见光时，光子能量主要转化为表面振转能量。在紫外线或真空紫外线(VUV)光下，光子能量增加可以引发大量的电子激发。如果积累在待分析化合物分子中的内部能量足以引起直接电离，该过程被称为激光解吸和电离(LDI)，如图1(a)所示。在激光解吸过程中积累的内部能量通常比较高，表面分子可以发生大量的碎裂。此外，有机化合物的低电离效率使得该技术不太适合于大分子质谱分析。这些情况下，可以应用激光解吸后电离(LDPI)策略来电离解吸过程中产生的中性粒子(图1(b))。后电离策略可以在真空条件下通过UV或VUV波长范围内的二次能量激光束照射实现。最近研究表明，激光解吸可以有效地与ESI离子源联用，从而在大气压力条件下可以进行激光烧蚀电喷雾电离(LAESI)(图1(c))。这种组合增加了可以用激光解吸策略分析的化合物类别，并能减少化合物碎裂。当与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)组合时，激光烧蚀可以成功地用于待测品表面元素的定量分析。烧蚀的组分被等离子体源雾化并离子化成构成元素和同位素离子，随后通过质谱仪进行分析。当与光发射光谱法结合时，使用从ICP发射的光可以获得更多定量基本信息。/pp　　由于存在大量碎裂，直接LDI策略不适用于分子量超过500Da的生物大分子分析。这时可以选择使用能量调节基质。分析物混合或被涂布在待分析物表面上(参见图1(d))可以克服这个限制。在20世纪80年代晚期，由Karas和Hillenkamp构想的这种技术被称为基质辅助激光解吸和电离(MALDI)。它是现代蛋白质组学研究中的关键技术，可以应用于生物大分子，如蛋白质和DNA分子的解吸和电离。在复杂待测物表面的MALDI分析中，基质辅助方案有更多的用途。/pp style="text-align: center "img title="2.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/44bc0e85-da34-4110-9c06-ae524e9d48ad.jpg"//pp　　首先，应用基质后，它可以将复合物样品中的待测分子重构在基质晶体中间或者表面。这些分析物掺杂基质晶体的形成，可以将待分析物与其他辅助因子如盐等分离，并可以将大分子分散在基质中。用脉冲激光对晶体表面的后续照射能够快速地使样品过热。这是作为激光能量强吸收体的基体受到电子激发(UV-MALDI)或振动激发(IR-MALDI)作用的直接结果。协同运动的过热基质与其夹带的分析物可以被引导到的真空中。这有助于分析物分子气相化的非破坏性转变。基质的最后一个目的是通过电荷转移促进分析物分子的电离。该方法通常会使[M+X]+型的阳离子转化成完整的准分子离子，其中X表示产生的阳离子的类型。最常见的阳离子是氢、钠和钾。为保证分析成功，分析物分子必须与固体基质材料共结晶，并且这些基质应该是过量的。最常用的基质与分子的比例在103：1至105：1的范围内。根据经验，研究的分析物的质量越高，完全解吸所需的基质剩余越多。/pp　　2.2 MALDI在敞开环境中的应用/pp　　近来敞开式解吸策略的发展已经产生了一些进步，该策略也需要使用基质。类似于LAESI方法，其基质、分析物混合物需要在基材上共结晶，这样可以有更多完整样品从表面移除。 MALDI离子会受质谱入口和样品表面之间电场的作用而发生偏转。从MALDI基质上产生的中性粒子含有大量在真空MALDI实验中丢失的分析物分子。它们可以被吸附在尚未完全雾化的电喷雾液滴表面。接下来是常规的产生多电荷离子的电喷雾电离过程。该过程又缩写MALDESI(基质辅助激光解吸电喷雾电离)，它可以将MALDI在敞开环境中的优点以及电喷雾电离的灵敏性结合起来。/pp　　2.3 MALDI和液相色谱/pp　　MALDI技术和液相色谱(LC)分离技术的成功联用，提高了复杂混合物的分离检测效率。分析复杂混合物时，MALDI会受到显著的离子抑制。不同物化性质的化合物分子共存通常会导致一种或几种组分优先于其他组分离子化。离子抑制效应是许多分析学科量化研究的主要障碍。对MALDI质谱强度差异的解释本质上是定性的。克服该问题的一个方法是进行色谱分离以降低混合物的复杂性。许多nano-LC-MALDI方法已经实现了将分离时间尺度转换为空间分布尺度。自动点样技术可以将一系列二维纳升液相洗脱液滴(通常每滴为150纳升)沉积到MALDI基质预涂层上。也可以采用其他方法将基质溶液与LC洗脱液混合，并将该混合物液滴有序沉积在干净的基质靶板上用于质谱分析。/pp　　3. SIMS中基质的使用/pp　　使用能量调节基质材料的优点并非仅限于光子解吸和电离技术。MALDI质谱技术的成功使MALDI基质在SIMS(二次粒子质谱分析法)样品制备中的应用成为可能。分析物与MALDI基质(2,5-二羟基苯甲酸/DHB)的共结晶，更加方便了采用基质增强型SIMS(ME-SIMS)方法对质量超过10kDa的大分子离子进行检测。因此，这种仅基于SIMS电离方法产生完整大分子离子(肽，蛋白质，寡核苷酸)的技术是成功的。有人提出，基质在ME-SIMS中的作用与在MALDI中的作用相似：都是为分析物分子提供了一个嵌套环境，并提供了质子来增强电离。以DHB为基质可以获得最佳结果，可能解释是DHB提高了样品表面区域中分析物的浓度。由于ME-SIMS(与MALDI相比)仅检测表面50nm之内，所以分析物的定位在样品制备中至关重要。分析物分子必须存在于晶体的表面，因为在静态SIMS条件下不能检测到基质共结晶的较深层次。/pp　　strong三、成像质谱的空间分辨率/strong/pp　　IMS的一个关键参数是可实现的空间分辨率。空间分辨率决定细胞和组织表面可观察到的细节。获得质量分辨率图像的最常见方法是使用微探针或扫描模式。微探针模式质谱成像通过SIMS扫描样品上的电离探针束或移动样品通过MALDI对焦进行。对于每个特定位置，带电离子束与样品相互作用，存储坐标，并获得位置相关离子产生的质谱数据。以这种方式构建光栅，光栅中的每个点都具有与其相关联的质谱数据。使用专用软件，可以从这些数据集中构建质量分辨的离子图像。微探针成像实验中最大的可实现空间分辨率由微探针的尺寸决定。在技术上，光栅中每个点的精度是控制分辨率的另一个因素，但是对于SIMS和MALDI成像，通常这不是一个问题。此外，实验实现的空间分辨率受样品制备(基质)和灵敏度(信噪比)相关因素的影响。/pp　　1. 二次离子质谱(SIMS)和解吸电喷雾电离质谱(DESI)成像质谱的空间分辨率/pp　　SIMS使用离子源的大多是由液体金属离子枪构成。 Ga +和In +主要用于表面元素和小分子分析。使用这些枪可以获得的空间分辨率由发射器的大小，离子柱中的静电光学元件和主光束电流决定。后者通常保持较低以防止光束的空间电荷膨胀和分辨率损失。当在低电流下进行调谐时，这两支枪可以提供50nm的焦点。金属簇光束Aun+、Bin+以及C60+可以在非常低的光束电流下提供100-200nm的光斑尺寸。低光束电流通常需要更长的实验时间。因此，为了应用更大的束电流增加分析速度，空间分辨率通常会受到一定损失并减小到大约1μm。 DESI使用指向表面的带电溶剂液滴喷射流。喷射流与表面的润湿相互作用中，作用区域大小决定了空间分辨率。研究表明，DESI成像的常规空间分辨率为1mm左右。/pp　　2. 激光直接成像(LDI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)成像质谱的空间分辨率/pp　　聚焦激光束的分辨率是波长决定的，并受阿贝衍射极限的限制。长波长的红外激光器难以聚焦在50μm以下。商业仪器中的UV激光光斑的物理尺寸限制在约10μm。在商业仪器上，大多数实验用激光光斑尺寸在50和250μm之间。这个选择是由灵敏度和完成实验所需的时间决定的。特殊的共焦目标可以将斑点尺寸减小到1μm，但是使用MALDI的这些小斑点所需的激光阈值通量对于组织中化合物的无损分析是不是太高仍存在实质性的争论。初步实验显示了其从分析物获取高分辨率图像的能力。替代方法是使用常规MALDI-ToF仪器的过采样方法增加空间分辨率。在这种方法中，激光探针点的移动增量小于光点直径。所有样品在第一个采样点完成后，每个采样增量都会从比激光焦点尺寸小得多的区域采集信息，从而达到增加空间分辨率的目的。这种方法的两个缺点是有限的质谱串联可能性和较大的总样品消耗量。/pp　　strong四、成像质谱仪：发展和改进领域/strong/pp　　使用上一节描述的解吸和电离技术，可以在复杂表面产生原子和分子离子。质谱图像的产生需要对这些产生的离子进行后续质量分析。现代质谱方法提供了一系列质量分析仪器来达到此目的。本文介绍三种类型的质量分析仪器，为生物表面的MALDI或SIMS质谱成像提供独特的分析能力。/pp　　1. 飞行时间成像质谱法/pp　　IMS中最常用的质量分析器是飞行时间分析仪。它需要产生脉冲离子，这一要求理想地与MALDI和SIMS要求兼容。所有离子都具有相同的加速电位。相同质荷比的离子将在其解吸过程产生的初始动能之上获得相同的动能。因此，它们的速度取决于它们的质荷比，并且离子可以通过在无场区域中的漂移而分离。离子检测是通过多通道板(MCP)类的粒子检测器实现的。ToF分析提供了非常宽的质量范围，该范围仅受大分子物质检测灵敏度的限制。MALDI-ToF-MS最多可以对数百万道尔顿的分子进行分析。微秒范围内的高传输效率和总飞行时间，为使用高重复率激光器进行高灵敏度表面检测提供了可能性。这使得高通量分析成为可能，而高通量分析正是大表面积样品分析的关键要求。分辨能力的提高可以通过补偿解吸过程产生的初始动能来实现。使用延迟提取，半球形静电扇形器件和反射镜等技术可以在m/z 1000下将半峰宽(FWHM)质量分辨率增加到m/△m = 30 000。用于化合物鉴定的串联质谱通常通过碰撞诱导解离(CID)或通过观察电离后亚稳离子的衰变实现。为此，两个独立的ToF系统可以以所谓的ToF / ToF配置串联。第一个ToF用于前体选择，第二个ToF用于产物离子分析。/pp　　2. 傅里叶变换离子回旋共振质谱法/pp　　傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)是一种离子捕获技术，它决定了强磁场中潘宁离子阱中捕获离子的回旋加速频率。在外部离子源产生离子后，离子被转移到潘宁离子阱中，直到进一步分析。使用宽带射频电激发，所有离子被激发到大的回旋加速轨道。它们的轨道半径不仅增加，而在潘宁离子阱中，相同质荷比的离子也相互连贯地在轨道绕行。在绕行期间，它们可以在一组双检测电极中引起振荡图像电荷。该时域信号被数字化并进行傅里叶变换以产生回旋加速频谱。质谱图可以通过对回旋加速器方程w=qB/m校准产生。/pp　　FT-ICR-MS的主要优点是具有无与伦比的质量分辨率和质量测量精度，可用于从MALDI图像分析中发现新的结构细节。此外，使用捕获离子技术不仅允许CID，而且允许红外多光子解离(IRMPD)和电子捕获解离用于串联质谱的结构测定。分析速度受观测时域信号的长度和相关质量分辨率的限制。质量分辨率取决于轨道离子的相干时间。典型的分析时间是每像素1 s，与所用的离子源无关。可以通过增加磁场强度来降低相同分辨率下的瞬态长度。MALDI组织成像实验可以在FT-ICR-MS系统上进行，FWHM分辨率范围从40000到400000。(图2)。/pp style="text-align: center "img width="450" height="616" title="3.png" style="width: 450px height: 616px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/91f3b7ae-f7c9-4edd-81d2-1fe8a264e388.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　3. MALDI离子迁移成像质谱法/pp　　通过MALDI生成离子的迁移分离，质谱图中可以得到更多附加信息。离子迁移谱是基于离子通过碰撞横截面面积的分离技术。在离子迁移质谱中，有充气的漂移池用于质谱分析之前的离子分离，这些离子由于构象或组成变化而具有不同碰撞截面。当用于质谱成像时，除了空间维度和质谱维度之外，还增加了时间漂移的气相分离维度。离子迁移光谱法在两个主要方面有利于MALDI成像质谱的研究。首先，增加额外的分离维度能够检测到更多的质谱峰。离子迁移有利于减小质谱分析复杂度，并有助于不同种类化合物的分离，例如肽和磷脂。第二，质量与漂移时间选择结合使得等压肽或其它类似物分解为分裂谱。/pp　　离子迁移、MALDI与用于IMS的ToF-MS组合，能够通过其相关的消化肽片段定位和鉴定蛋白质。离子迁移分离可以鉴定通过常规MALDI-ToF-MS无法鉴定的等压离子。与传统的MALDI-ToF相比，该方法每次测量的观察峰数量增加，能够产生质量和时间选择的离子图像，同时可以对单个离子进行鉴定。图3所示结果证明了离子迁移飞行时间成像质谱(IM-ToF-IMS)对来自组织的蛋白质鉴定的可行性。/pp style="text-align: center "img title="4.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/bfc037cb-3061-4ea0-b5a6-6c3b3bf23e09.jpg"//pp　　组织消化与MALDI-IM-ToF-IMS方法相结合，可以对不同种类组织蛋白质鉴定实行“自下向上”的策略。/pp　　strong五、MALDI成像策略/strong/pp　　1. 质谱成像流程/pp　　不同解吸电离方法与不同质量分析器组合，为在单个组织样品上进行互补实验提供了可能性。/pp　　需要仔细的实验设计来确保获得相关的互补分子图像信息。图4中显示的实验工作流程提供了从单个组织生成六个补充图像数据集的示例。在该示例中，通过外科手术获得一块组织。组织中的细胞表达荧光标记的蛋白质，因此成像工作流程中的步骤是产生荧光图像。这提供了一种特定蛋白质的详细位置。在将衬底表面上的10-20μm薄片进行组织切片和安装之后，进行SIMS分析。这提供了在高空间分辨率下的低分子量成像MS数据。静态SIMS除去表面材料的不到1%，因此残留的表面仍然可以进一步分析。SIMS研究完成后，可以用基质涂层覆盖组织表面(参见“基质涂层”一节)。根据感兴趣的分析物，表面可以或不能被洗涤。洗涤方案对所得结果有重要影响。在图4的实验工作流程中，在基质沉积之前不进行洗涤以允许小的水溶性分子成像。在基质沉积后，进行的第一次分析是ME-SIMS。再次只有少量化合物分子从表面去除，晶体表面保持可用于后续的MALDI分析。ME-SIMS数据集提供了更大的完整有机分子(如脂质和分子量小于2000 Da的小信号分子)的信息。进行的下一个分析是具有略高于解吸阈值的激光注量的MALDI-ToF分析。 MALDI-ToF数据集包含有关内源性肽和完整蛋白的信息(取决于使用的洗涤方案和基质)。可以获得的最后一个MS成像数据集是MALDI-FTICR-MS数据集(或离子迁移率图像数据集)。这些技术需要去除大多数基质材料。它们可以提供高质量分辨率和质量精度信息，有助于识别构成图像的分子。任何残留的基质材料都可以从多次分析的表面上洗去，以便进行最终的H& E染色。这提供了其他的组织学信息，可以与成像质谱数据集结合来鉴定特定区域或组织类型。/pp style="text-align: center "img title="5.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/6e50bb6c-daeb-4a23-895c-3da7452a8caa.jpg"//pp　　2. 基体涂层/pp　　在MALDI和ME-SIMS分析之前，必须将基质溶液涂布于组织表面。基质溶液由有机溶剂如甲醇或乙腈组成，添加剂为弱有机酸如芥子酸(SA)或2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和三氟乙酸(TFA)。加入TFA可增加分子的离子化质子的量。基质应用方法将强烈影响成像MS结果。应用方法将对灵敏度，表面扩散与空间完整性，空间分辨率，表面平坦度和分析速度产生影响。组织性质和环境参数影响组织中蛋白质的提取效率和基质的结晶。因此，控制基质沉积环境也是很重要。有几个实验室正在考虑创新的沉积方法，如基质升华。对于一般实验室，一般有两种基质沉积方法：点样和喷涂。/pp　　2.1基质点样/pp　　将基质溶液点样到组织部分时需要将分析物的扩散限制在斑点大小范围。已经开发了两种基质检测方法：手动或自动检测。手动点样产生微滴液滴，经常用于不需要生成图像的MALDI组织分析。自动点样使用更小的体积(pl)液滴，并产生约120-150μm的点样尺寸和约200μm的最小分辨率。两种不同类型的自动识别器用于基质沉积：喷墨式压电喷嘴和使用聚焦声波的液滴分配器。两个喷射器都可以释放100μl在组织上干燥成150μm直径的液滴。在这种情况下，成像MS分析的分辨率通常会受到大于分析光束直径的基质点样点的限制。/pp　　2.2 基质喷涂/pp　　基质喷涂使均匀小滴的基质溶液覆盖了样品的整个表面。气动、振动喷头或电喷雾可以使基质溶液变生液滴喷雾。喷涂可以手动和自动化的方式进行。手动喷涂采用手持气动喷枪或TLC喷雾器。通过喷雾装置与x-y机器人联用可以实现自动喷雾应用，也可以在较大的区域上进行基质沉积。使用振动喷雾器在较小的区域也可实现自动喷涂，其小型腔室主要控制湿度。喷涂后形成的晶体通常为10-20μm。为了获得更小的晶体，可以使用电喷雾，减小敏感度产生甚至小于1μm的晶体。当使用喷雾沉积时，激光束的直径限制了MALDI成像质谱的空间分辨率。/pp　　3. 鉴定策略/pp　　用于产生分子图像的质谱峰的识别是所有质谱图像策略中的关键步骤。选择时候，可以使用高质量分辨率以及准确的质量进行测量。通常需要结合其他策略，如使用MALDI串联质谱或其他分析策略来识别表面化合物种类。/pp　　3.1 MALDI串联质谱法/pp　　串联质谱使用是识别表面产生的不同化合物离子的合理选择。限制因素是前体离子选择的分辨率、裂解效率和方法灵敏度。在相同的位置，通常只能进行几个质谱实验。可以在单个位置进行的实验数量仍然取决于提供信号的激光照射的数量。在相邻位置执行串联实验的隔行扫描成像方法可部分克服此问题。一旦裂解模式已知，可以应用多重反应监测来确定化合物分布。/pp　　4. LC-MS / MS鉴定/pp　　研究可以使用互补组织匀浆和提取来产生组织成分的信息库。也可以使用LC-MALDI来解决混合物复杂性的问题，增加灵敏度，以及降低离子抑制效应。/pp　　在直接MALDI成像实验中观察到的MALDI图谱比较分析可以用作识别策略的一部分。在这些研究中，串联MS可用于识别在LC-MALDI靶上发现的各个化合物成分。/pp参考文献：/ppa title="" href="http://sci-hub.cc/10.1016/B978-0-08-043848-1.00028-6" target="_self"The Development of Imaging Mass Spectrometry./a/ppa title="" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123744135000087" target="_self"MALDI Techniques in Mass Spectrometry Imaging. /a/pp /p

在翻译后修饰和/或极碱肽的序列分析方面，电子转移裂解（ ETD ）线性离子阱质谱是很有优势的工具。传统的诱导活化裂解（CAD）常用来鉴定蛋白，并试图确定和找到他们修饰的位点，但这种技术有其本身固有的缺点，下面将详细叙述。与线性离子阱的结合使用的ETD是蛋白质组学研究的一个可靠的技术，可以很容易鉴定用CAD不能鉴定的多肽。ETD 是一个相对较新的肽/蛋白质碎裂的技术，能够大大推进质谱鉴定蛋白质这个领域的进步。 翻译后修饰 翻译后修饰（PTM）是翻译后的蛋白质进行的一种化学修饰，是蛋白质生物合成的后续步骤之一。蛋白的分析及其翻译后修饰的分析对于研究许多疾病是非常重要的，如癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病---阿尔茨海默病。这是因为在蛋白质的合成的过程中以及合成之后，可能发生各种蛋白修饰。对于正常细胞的功能，这些修饰是必须的，但调节这些修饰的变化可能会导致疾病的发生，如阿尔茨海默病，癌症和勃起功能障碍。蛋白质修饰可提高/降低蛋白质的活性，可以与其他蛋白质发生相互作用和将某一蛋白质定位到细胞的特定地方。 翻译后修饰，如磷酸化，乙酰化和甲基化被用作化学开关，激活/灭活组蛋白基因转录调控， DNA复制和DNA损伤修复。组蛋白是染色质的主要蛋白，DNA盘绕时，它们起到线轴的作用，而且在基因调控中发挥重要作用。因此，鉴定这种翻译后修饰是必需的，因为它在生物系统中对于某些蛋白的功能和作用至关重要。 用CAD鉴定蛋白 质谱在确定蛋白及其翻译后修饰上发挥了不可或缺的作用。CAD是一种常见的分析鉴定蛋白质的技术。一般用胰蛋白酶将蛋白质消化成较小的多肽，然后用反相色谱将其分离，并直接注入电喷雾质谱仪检测，通过串联质谱（ MS / MS法）获得序列信息。通过电喷雾电离这些多肽形成几种带电状态的肽离子，而较低带电状态的最适合CAD分析。低能量的CAD串联质谱一直是最常用的分析方法，通过裂解肽离子进行后续的序列分析。 翻译后修饰分析，如磷酸化，磺酸化和糖基化很难用CAD进行分析，因为这些修饰通常是不稳定且容易丢失肽骨架的碎裂信息，从而导致很少或几乎不能得到肽序列和磷酸化位点。利用常规的CAD质谱对于含多个碱性残基多肽测序也是极为困难。 根据不同的蛋白质序列，有时胰蛋白酶会产生过小或过大的肽段。在这种情况下，缺乏可信的序列分析手段。因此CAD对短的，低带电的多肽是最有效的。对于鉴定蛋白和了解蛋白的生物学功能，这是一种广泛使用的方法，然而，限制了研究者分析了所有的肽段，这也阻止多个翻译后修饰位点的检测和了解这些蛋白的生物学功能。 先进的碎裂方式：ETD ETD是基于离子/离子气相化学一种碎裂多肽的新方法。ETD通过从阴离子自由基到质子肽转移电子的化学能量将肽碎裂，这引起多肽骨干的分裂。 ETD产生的骨干肽序列和肽侧链的信息往往与CAD互补。 ETD已成功应用与线性离子阱以及其前身三维离子阱。虽然ETD在三维阱的执行价格具有竞争力且和CAD自身相比提供了独特好处 ，这样的组合并没有提供蛋白质组学分析所需的技术能力。非线性离子阱的ETD，它一直未能很好控制裂解过程，而且由于三维阱离子存储能力的有限不能处理大量的多肽。基于此，研究人员已经提出ETD功能应用于线性离子阱（Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer质谱仪） 。 相对于传统的CAD技术， ETD提供了更稳定的方法来定性PTMs，鉴定大型多肽或甚至整个蛋白质。 ETD能够将普通翻译后修饰的多肽，或者多个碱性残基的多肽甚至整个蛋白质生成离子。 ETD也可以轻易碎裂含有二硫键的的多肽。 ETD是为更复杂的FT-ICR仪器开发相似的裂解技术。使用电子转移试剂，而不是影响肽碎裂的自由电子使ETD在广泛使用的射频四极离子阱中得到应用。射频离子阱质谱仪具有低成本，低维护费用以及更易接受优点，相对于CAD碎裂方法，ETD碎裂技术能够产生更多的产物离子，利于肽段的解读。 ETD的线性离子阱提供了强有力的工具鉴定蛋白及其翻译后修饰 。LTQ XL线性离子阱质谱仪比其他任何离子阱提供更多的结构信息，ETD能够得到常规方法无法得到的序列信息。相比非线性离子阱，ETD的线性离子阱的显著特征在于离子和离子发生反应。虽然ETD功能是完全自动的且通常无需用户干预，但是当需要对离子数进行累积的时候，用户可通过软件完全控制线性离子阱的离子。线性离子阱质谱仪有能力处理大量的样品，并分析低浓度的大分子和小分子。与非线性离子阱的相比，该过程更为复杂和费时 应用实例 在最近的应用中，极碱的多肽和大量重要的翻译后修饰已经用含CAD和ETD线性离子阱质谱分析了。通常CAD碎裂方式产生的普通只显示有限的肽碎裂信息。然而，用ETD碎裂这些多肽的时候， 肽骨架碎裂信息能完全或几乎完全产生，因此得到更广泛的多肽序列的信息。 ETD的灵敏度和稳定性对于蛋白质组学分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解决方案，此方案具有用户友好性，几乎不需要日常维护，并提供高度准确的数据，而且ETD的数据分析有相应的软件支持，非常方便简单。 结论： 在蛋白质组学研究领域，ETD的应用对于研究疾病的机理，如癌症，药物开发研究以及细胞功能和信号转导有重大意义，ETD将扩大目前的分析，包括更多的碱性、非胰酶切肽段和蛋白质。它们能确定各种翻译后修饰以及鉴定新的蛋白亚型。 配备ETD的线性离子阱质谱可应用于蛋白质组学各个领域内。ETD的线性离子阱将继续推动蛋白质组学的发展，而且已被证明是替代CAD一种有效技术，而且ETD同样可以应用于非线性离子阱进行肽序列分析。在不久的将来，配备ETD的线性离子阱预计将成为碎裂技术的一种新选择。 参考文献 Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003关于 Thermo Fisher Scientific （赛默飞世尔科技，原热电公司） Thermo Fisher Scientific纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元，拥有员工约30000人，在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于ThermoScientific和FisherScientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。ThermoScientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。FisherScientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，

“从1969年10月1日北京地铁一号线试运行至今已经历50多年，我国地铁里程不断攀升。据中国城市轨道交通协会最新统计，2020年我国地铁运营总里程6200多公里，在建5000多公里，总历程达到超过一万公里。当前，我国北、上、广、深等特大城市，轨道交通里程处于世界前五的水平。”近日，北京交通大学副教授王耀东接受采访时说。　　而地铁隧道病害与表面状态检测则是保障安全运营的重要内容之一。“否则，地铁隧道一旦发生事故，将会给生命财产带来巨大损失。”在4月22日举行的聚焦2021年北京地区广受关注学术成果报告会上，王耀东说。随着隧道病害检测技术的快速发展，他和团队正在尝试将机器视觉、先进传感等技术引入相关检测，让这一过程变得更加高效、智能。　　隧道“体检”，从人工巡检到机器检视　　地铁交通极大方便了城市居民的出行，但是地铁隧道中出现的各种“病害”，如隧道裂缝、渗漏水、沉降、衬砌剥落、掉块等，给电客车安全运营带来挑战。　　以隧道裂缝为例，王耀东表示，其形成原因比较复杂，岩层性质、岩土压力、混凝土收缩、结构移位变形、侵蚀破坏、施工遗留等都是潜在诱因。别是南方的过江过河隧道或地下水较丰富区域的隧道，如果产生裂缝产生就会产生渗漏水，影响地铁运行的安全。因此需要定期巡检，及时养护、维修。　　王耀东还记得2012年回国之初跟随地铁巡检人员做现场数据采集的情形。“凌晨1点到4点，夜深人静，地铁停运，才会开始人工巡检，要用肉眼观察、手写记录。”　　他表示，尽管传统的超声波检测法、声发检测法、电磁波检测技术等不断提高检测精度，但速度低、效率慢，难以满足现代轨道交通快速发展的需求。而信息技术的发展，多维传感、机器视觉检测技术的使用则为这项检测工作的提速、高效提供了新的契机。　　“机器视觉的特点是效率高、可移动、非接触，特别是信息处理自动化、智能化、数字化，也是隧道巡检的发展方向。”王耀东说。他和同事在不断尝试把机器视觉技术、图像处理技术、多维感知、人工智能等技术，应用在隧道病害检测当中，这些智能巡检技术可以逐步代替人工，完成隧道基础设施的自动检测。　　裂缝识别，让机器拥有“人眼”和“大脑”　　“裂缝检测智能巡检技术主要分两个步骤，第一步是图像裂缝采集，利用高速相机和特制的辅助光源，保证采集到高质量的隧道图像 第二步是裂缝病害图像处理，对所有原始图像进行预处理，包括：匀光处理、连通区域分块化、噪声滤波等，提取纹理目标进行特征判断，最后识别裂缝区域，为后续速调维护提供技术支持。”王耀东介绍。　　这些听起来似乎很简单，但如何让机器像人眼一样，全面、精细采集图像，并像人脑一样准确地识别裂缝种类呢?每一步做起来都不简单，都需要精细化的算法研究和关键技术的攻克。　　例如，他们研发了图像采集系统样机引入了线阵相机(进行连续拍摄形成二维图像，避免图像重叠和数据冗余)、面阵相机(针对隧道中照明不佳，进行大面积强光源补光)、定向运动设备(对隧道进行扫描式图像采集降低漏检率)，来获得高质量的图像。他们还开发出一套表面裂缝图像的批量识别软件，设计出核心算法进行图像处理。　　经过近十年的“磨剑”，王耀东及团队成员克服各种挑战，2018年在发表于《铁道学报》的论文研究中，首次报告了基于局部图像纹理计算的隧道裂缝视觉检测技术。他们研发的一套图像采集系统实验样机，将线状激光光源、高速线阵相机、激光发生器、图像采集卡，安装在可调节移动式视觉检测平台上，可在隧道中进行巡检。然后将高分辨率裂缝图像分成子区域，针对性地进行算法研究，完成最后的检测。　　“这种智能巡检技术有助于解放人力，服务地铁运维。”王耀东说。他坦言，从综合指标看，目前这种技术对于背景简单的普通隧道裂缝识别率比较高，可以达到84%以上。但对于比较复杂环境下的裂缝，识别率还有待提高。”。　　2018年至今，随着深度学习卷积神经网络深入发展，对海量隧道图像的计算性能有了数十倍的提升，识别率也有较大提高。然而，王耀东表示，对于复杂恶劣环境下，肉眼难以观察的微小缺陷仍然很难检测到。　　增强自主创新，助力交通强国建设　　王耀东希望，在未来检测算法上，加强对不同类型纹理噪声的识别，提高图像处理的计算效率，进一步提高隧道病害检测效率。　　为此，他们建立了隧道病害样本库，基于深度学习，对隧道表面病害图像多分类智能识别。为了更好地采集图像，他们还对采集系统进行了模块化研发，并研制了隧道巡检机器人，对隧道裂缝、三维形变、沉降进行检测。　　目前，他们还在研制多种类、移动式隧道检测平台，如低速便携手推式(0-10公里/小时)检测平台，到中速紧凑自主行走式检测平台(0-30公里/小时)，再到高速车载式综合检测平台(0-100公里/小时)的，以及路轨两栖式综合平台(0-60公里/小时)。对隧道、轨道多维数据进行采集，并进行智能分析和大数据处理，最后生成区间报表提供给专业人员使用，用于隧道和轨道维护。　　“目前，我国轨道交通运营里程已经位居世界第一位，智能运维也处于世界前列。”王耀东说，但仍然亟需加强自主创新。他举例说，我国轨道交通智能数据采集设备、高精尖传感器还需要从国外进口，这些设备有的一套系统单一功能，但因为技术被国外垄断，报价却达到数百万元，甚至上千万元。　　“我们科技工作者还要继续努力，推动基础研究创新，将主动权掌握在自己手中。”他说，2035年我们国家要基本建成交通强国，这将推动我国城市轨道交通进一步向大数据、智能化、精准化方向去发展，让老百姓出行更安全、更便利，乘坐舒适性更高。

仪器信息网讯 近年来，我国女性科技人才队伍规模逐步扩大、结构不断优化、能力显著提升，在基础理论、应用技术、工程实践等各个方面做出杰出贡献，充分彰显出巾帼力量。但从总体上看，女性科技人才在科技创新中的作用尚未得到充分发挥。因此2021年7月，科技部会同全国妇联等12家部门印发《支持女性科技人才在科技创新中发挥更大作用的若干措施》，提出建立有利于女性科技人才发展的评价机制，为女性科技人才成长进步、施展才华、发挥作用创造更好的政策环境。　　当前，质谱技术在生物、医药、材料、食品、环境、公共安全等众多领域发挥着不可替代的作用。女性学者在质谱领域的占比也越来越高，并在其各自的岗位发挥着重要作用。质谱学领域中越来越多的女教授、女专家，还有资深女工程师… … 正在通过自己的思考与行动影响着该行业的发展。　　2021年7月22日仪器信息网携手Females in Mass Spectrometry(FeMS)成功举办了 “第一届女性质谱学者国际研讨会”。会议为期一天，共邀请了FeMS共同创始人Anne K Bendt教授、FeMS委员会成员Erin S Baker教授、FeMS科学顾问委员会成员/斯克里普斯研究所John R Yates III教授、FeMS成员/威斯康星大学李灵军、葛瑛教授、北京大学黄超兰教授、中国药科大学叶慧副教授以及复旦大学张莹教授和多位优秀的青年学者分享精彩的报告。学术内容聚焦质谱在多组学研究的技术应用进展，而与其他学术研讨会不同的地方是，多位报告嘉宾积极分享了自己是如何走上质谱研究之路，以及在科研道路上的心路历程，并且还特别对后浪科研工作者提出了一些平衡工作与生活等方面的建议。会议期间互动氛围热烈，共吸引了超过600位海内外质谱领域同行参与。　　报告嘉宾云合影　　北卡罗莱纳州立大学Erin S. Baker教授做了题为《基于多维特征分析实现高可信度质谱检测》的报告。Baker教授团队应用离子迁移谱与质谱 (IMS-MS)、多组学分析和大数据评估来推动创新的质谱技术、系统生物学评估、新的软件功能以及人类健康与环境之间的联系。报告介绍了该团队近期基于IMS-MS开展的研究进展以及接下来的研究计划。　　美国斯克利普斯研究所的John R. Yates III教授首先简要分享了他的科研历程，在20世纪90年代盛行基因组学的背景下，他开始思考“蛋白质生物化学和质谱技术在基因组学时代将扮演什么角色”这一话题，也借由此逐步开展了他在化学蛋白质组学领域的科研生涯。紧接着，Yates教授做了题为《单神经元蛋白组学》的报告，介绍了其团队利用蛋白组学研究阿尔兹海默症的最新进展。　　美国威斯康星大学李灵军教授表示她很幸运在2000年前后在Jonathan V. Sweedler 教授课题组开始利用MALDI质谱技术开展单细胞研究，也为其后来在该领域持续深耕打下坚实的基础。此后，她加入了西北太平洋国家实验室Richard D. Smith课题学习和应用了高分辨质谱技术。紧接着李教授做了题为《MALDI质谱成像结合原位化学反应实现空间分辨的生物组织多组学分析》的报告，介绍了课题组近期的研究进展。　　美国威斯康星大学葛瑛教授提到，她本科毕业于北京大学化学学院，毕业后赴美国康奈尔大学攻读博士学位。她基于top-down的蛋白质组学研究也起始于博士求学期间，师从Fred W. McLafferty教授和Tadhg Begley教授。她也从自身平衡工作和生活的经验中提到女性科研工作者互相帮助的重要性，也号召更多的质谱界女性工作者加入FeMS组织。紧接着葛教授做了题为《精准医学中的Topdown蛋白组学和代谢组学研究》的报告，分享了其课题组的最近进展。　　新加坡国立大学Anne K Bendt教授首先提到她创立females in Mass Spectrometry(FeMS)组织的其中一个目标就是，希望提高东方国家的科研工作者在FeMS中的声音，也希望扩大FeMS在中国的影响力，号召更多的质谱人加入FeMS，以帮助更多地学者更好地开展工作和生活。紧接着Bendt教授做了题为《搭建研究群体：血浆脂质组学》的报告，分享了其课题组的最新研究进展。　　北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰教授首先分享了她在平衡工作和生活以及育儿方面的经验和心得。关于对女性科研工作者开展工作和生活的建议，黄教授提出几个观点，包括不刻意区分工作和家庭，将其都视为生命的一部分；视养育18岁前的孩子为一个重要的课题；此外她也提到在这段生命旅程中，大家要学会寻找各种帮助，这些帮助可以来自伴侣、家人、朋友、亲戚甚至是专业人士。紧接着，黄教授做了题为《深度尿液和血清蛋白质组与新冠的免疫图谱》的报告，介绍了近期该课题组基于新冠病毒样本开展的研究进展。　　中国药科大学叶慧教授带来了题为《化学蛋白质组学：从药物靶标发现到解码糖酵解代谢靶标组》的报告。其课题组近期的研究重点是结合蛋白质组学和分子生物学技术，研究细胞中具有代谢调控能力的小分子的代谢靶标，从而进一步理解生物事件。最后，叶教授也为与会听众详细介绍了FeMS组织的职能以及能够为业内女性工作者提供的机会和平台，她也提到，希望国内的同行可以更多地关注FeMS，共同提高女质谱工作者在国内以及国际上的声音。　　复旦大学张莹教授带来了题为《蛋白质糖基化质谱分析新方法及应用》的报告。糖基化是蛋白质中最重要的翻译后修饰之一，同时蛋白质糖基化在机体健康的维持及疾病发生发展中起着关键的作用。报告介绍了张老师所在的复旦大学糖复合物重点实验室陆豪杰教授课题组开发的系列蛋白质糖基化的质谱定性和定量分析的新方法以及相关研究工作进展。　　安捷伦公司的LC-MS应用科学家胡楠博士带来了题为《安捷伦多组学分析方案及热点应用》的报告。报告主要介绍了代谢组学工作流程及分析方法以及机理机制的深入研究。报告最后，胡博士还特别介绍了安捷伦公司关于女性职业发展以及职场环境等方面的企业文化，充分体现了作为跨国公司的安捷伦，其员工拥有多元文化和多样的个人优势。　　中科院大连化学物理研究所刘健慧博士带来了题为《基于碎片离子的高精准蛋白质组动态分析新方法》的报告。刘博士目前在张玉奎院士和张丽华研究员的课题组下从事蛋白质组定量新方法的开发并将其开展到相应地应用研究中。　　国家蛋白质科学中心付玲博士带来了题为《氧化还原蛋白质组学》的报告。付博士目前在杨靖教授的课题组从事氧化还原蛋白质组学在生物学相关的研究工作。　　清华大学林巧红博士带来了题为《基于正交衍生的氨基磷脂组深度分析策略》的报告。林博士在瑕瑜教授的课题组从事化学衍生-串联质谱联用技术的脂质结构解析相关的研究工作。　　中国科学院大连化学物理研究所的吕佳纹博士带来了题为《基于微球辅助的蛋白质沉淀策略的药物靶点筛选研究》的报告。吕博士在叶明亮研究员课题组里开展了基于质谱的蛋白质组学技术，应用于配体-蛋白相互作用等的研究。

近日, 南方科技大学物理系、量子科学与工程研究院副教授林君浩课题组与国内外研究团队合作，围绕二维功能性材料的微观结构，在力学与磁学性质中的构效关系研究中取得系列研究进展，相关成果分别在Advanced Science, Nature Electronics和Advanced Materials期刊上发表。二维材料由于其独特的结构和丰富的性质，不仅为探索奇异的物理现象提供了理想的平台，也为下一代电学、光学器件的研发提供了坚实的基础。在原子尺度上理解二维材料的构效关系，是深入理解其理化性质，推动器件研发的关键，另外，还能够指导材料设计，通过结构调控实现材料物性转变或者性能提升。比如，研究人员在蓬勃发展的缺陷工程研究中发现，有目的的在二维材料中引入特殊的缺陷结构，能够实现对二维材料载流子浓度、光学带隙、偶极矩等的连续调节。受益于微纳加工技术的发展，离子束和电子束处理可以在一定范围内实现缺陷尺寸和浓度的连续调控。然而，在周期晶格中引入的缺陷结构会如何影响二维材料的宏观力学性能，尤其是在施加载荷和应力工作环境下的材料失效机制等方面的研究相对匮乏。因此，建立缺陷结构、浓度与二维材料力学行为之间的相关性具有重要的意义。有鉴于此，林君浩研究团队使用氦离子电镜的氦和镓离子刻蚀，在悬浮的单层MoS2中分别产生高密度的硫（S）空位和MoSn空位，协同AFM纳米压痕技术与STEM原子结构表征，揭示了不同类型和浓度的点缺陷对单层MoS2杨氏模量、断裂强度等力学性能和原子尺度的断裂行为的影响。研究人员通过分析裂纹原子结构发现引入的原子缺陷加剧了裂纹的偏转或分叉，缩短了裂纹传播距离，结合分子动力学模拟发现这种改变源于缺陷引起的晶格对称性破坏，改变了角刚度和局域应变分布，导致键能的各向异性在断裂过程中出现众多不同转向的微裂纹，最终提高了断裂过程中的能量释放率，提升了MoS2的断裂韧性。基于以上结果，研究团队最终提出了一种通过缺陷诱导裂纹钝化、抑制裂纹扩展的断裂增韧机制。相关论文以“Engineering the crack structure and fracture behavior in monolayer MoS2 by selective creation of point defects”为题，发表在期刊Advanced Science上。南科大物理系博士生王刚，中南大学副教授王云鹏为论文第一作者，林君浩为唯一通讯作者，南科大为论文第一单位。图1. 单层MoS2分子膜中不同缺陷结构导致的力学参数和断裂行为差异。 二维材料的结构除了可以通过后处理调控外，也能通过改变生长参数，在合成时实现调控或新的结构组装。南科大林君浩团队和新加坡南洋理工大学教授刘政、北京理工大学教授周家东以及哈尔滨工业大学教授李兴冀团队合作，使用化学气相沉积 (CVD) 法，通过调控反应温度和降温速率，实现了新型二维磁性材料Cr5Te8的相调控，成功合成出三方相和单斜相的Cr5Te8纳米片。通过选区电子衍射以及高分辨HAADF-STEM成像，精确确定出Cr原子层间因插层位置不同而引起的相结构变化，从而证实了Cr5Te8自插层体系相结构的可调性。与此同时，研究人员结合磁性测试及理论计算，揭示了相结构对磁有序的显著影响，通过控制相结构和厚度，可以获得高达200K的居里温度。另外，研究团队还发现结构更无序的单斜相Cr5Te8存在巨大的反常霍尔效应（σAHE ~ 650 Ω-1cm-1，θAHE ~ 5%）。该研究为二维磁性材料的可控和规模化合成提供了一条新途径，并揭示了Cr5Te8纳米片在磁电和自旋电子器件应用方面的巨大前景。相关论文以“Phase engineering of Cr5Te8 with colossal anomalous Hall effect”为题发表在学术期刊Nature Electronics上，南洋理工大学汤碧珺、王小伟博士，南科大博士后韩梦娇（现为松山湖国家实验室副研究员），哈工大徐晓东博士为论文共同第一作者，刘政、周家东、李兴冀、林君浩为论文共同通讯作者。图2：三方相与单斜相Cr5Te8纳米片的成分及结构确定。此外，另一种调控二维材料结构的思路是借助基底晶格的束缚实现外延生长调控。传统的共价异质外延，对生长材料和基底材料的晶格匹配度有严格要求，且工艺兼容性差。林君浩团队与纽约州立大学布法罗分校教授曾浩、北京大学教授侯仰龙团队合作，提出了一种由界面配位键驱动的外延生长机制，使用CVD在六方晶格的单层WSe2上外延生长了二维磁性单晶Cr5Te8，得到公度匹配的3×3 (Cr5Te8)/7×7 (WSe2) 摩尔超晶格，并在界面处形成束缚力较弱的超周期Cr截止结构。该晶体表现出了几乎没有缺陷钉扎位点的锐利方形磁滞回线。合作研究团队提出二维界面的“配位外延”手段，作为一种概念上独特的薄膜外延范例，不但具有与vdW外延相似的充分灵活性，规避了共价外延严格的晶格匹配性要求；而且具有与共价外延相似的晶体取向约束力，避免了vdW外延中取向难以控制的难题。相关结果以 “Dative Epitaxy of Commensurate Monocrystalline Covalent van der Waals Moiré Supercrystal”为题在期刊Advanced Materials上发表，北京大学博士后卞梦颖，南科大博士后朱亮为论文的共同第一作者，曾浩、侯仰龙和林君浩为论文的共同通讯作者。图3. Cr5Te8/WSe2摩尔超晶体的结构表征。以上研究的开展和完成得到国家自然科学基金、广东省科技厅国际合作创新领域、“珠江人才计划”创新创业团队、深圳市高层次人才团队、高校稳定支持等项目以及南方科技大学皮米中心的大力支持。论文链接：1、http://doi.org/10.1002/advs.202200700 2、https://www.nature.com/articles/s41928-022-00754-6 3、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adma.202200117

近日，由广东地质调查院承担的《广东阳江—茂名地区多目标地球化学调查》项目通过评审验收，这个项目调查总面积9100平方公里，新发现富硒富锗土壤6300多平方公里。其中，发现圈定富硒土壤区4409平方公里。随着重金属污染情况日益加重，人们对于重金属可以说是避之犹恐不及，因为它们对身体，对环境的危害极大。但硒却是一个例外，它在1973年，就被WHO和国际营养组织确认硒为人和动物体内必须的微量元素。硒的营养主要是通过蛋白质特别是与酶蛋白结合发挥抗氧化作用。它有着抗氧化,抗衰老,保护,修复细胞,提高免疫力。它不仅无毒，还有解毒,排毒,抗污染的功效。对于硒的检测，有很多适用的标准，如GB 5009.93-2010、GB/T 13883-2008、GB/T 21729-2008等，这些国家标准都将原子荧光法作为检测硒的第一法，可以看出原子荧光光度计在硒元素的检测方面有着很重要的作用。北京金索坤技术开发有限公司是市面上唯一一家只专注原子荧光光度计的研发、生产的高新技术企业，在应用原子荧光光度计检测重金属元素方面做了大量的实验探索。在这里金索坤就和检测行业的朋友分享一个使用金索坤原子荧光产品SK-乐析检测食品中的硒的分析测试条件：Se的推荐分析条件（以SK-乐析原子荧光光度计为例）基本物理参数：(1)Se的原子荧光光谱：波长（nm）196.09203.99206.28207.48能级（电子伏）0―6.3230.247―6.3230.314―6.3230―5.974203.99(nm)为直跃线荧光，具有最强的荧光强度。207.48(nm)为缔合共振线，只能得到很弱的荧光信号。(2)氢化物的物理性质：氢化物熔点(℃)沸点（℃）SeH4-65.7-41.3标准储备液的配制：称取1.0000g高纯Se粉，加入20mL1：1HNO3(v/v)溶液，微热溶解，移入1000mL容量瓶中，再加入200mLHCl，冷却，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，此溶液Sn浓度为1000μg/mL。标准系列配制：吸取1.00mL浓度为1000μg/mL的标准储备液的移入100mL容量瓶中，用20% HCl (v/v)稀释至100mL，摇匀，此溶液Se浓度为10.0μg/mL。吸取1.00mL浓度为10.0μg/mL的标准储备液的移入100mL容量瓶中，用20% HCl (v/v)稀释至100mL，摇匀，此溶液Se浓度为100ng/mL。用此溶液配制下表的标准系列：标准号加入100ng/mL 标准体积(mL)加入HCl体积 （mL）最终体积 (mL)标准浓度 ng/mL10.00201000.021.00201001.032.00201002.045.00201005.0510.002010010.0还原剂的配制： 称取1.0gKOH溶于200mL蒸馏水中，溶解后加入3.0gKBH4继续溶解，若有沉淀过滤后使用。测定条件：光源：空芯阴极灯，灯电流80mA 负高压：-300~-350V主气流量：为定值，在500mL/min左右 辅气流量：800~1000mL/min泵速：70~90转/min检出限(参考值)：0.02ng/mL注意事项：(1)一般分析纯硫酸或盐酸中有较高含量的硒，应采用优级纯硫酸或盐酸，并注意检查空白。(2)在配制标准贮备溶液时，应严格按规程采用水浴，低温进行溶解,若用盐酸溶解温度不宜太高，否则硒可能挥发而损失。(3)一般混合酸分解的试样,Se以六价状态存在于溶液中,Se(Ⅵ)在酸性溶液中不能与KBH4反应。为将Se（Ⅵ还原至Se（Ⅳ），样品分解后，在HCl介质中加热近沸2min即可使Se（Ⅵ）定量转化为Se(Ⅳ)。硒除了抗老化，提高免疫力之外对于清除体内垃圾，排除体内毒素，排除重金属毒物也有重要作用，此外硒还具有辅助防癌抗癌功能，所以补硒也就成了健康生活中的常见话题之一。但金索坤在这里还是要给给位朋友提个醒：人体本身的硒总含量约为15mg，食入过量硒会出现心律不整、溶血、肝脏坏死等中毒症状；慢性硒中毒也会出现诸如毛发、指甲易碎裂脱落、肠胃不适等症状。所以，补硒虽好，也要适可而止！金索坤SK-乐析原子荧光光度计

大家好，本周为大家分享一篇发表在Accounts of Chemical Research上的综述，Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics [1]，文章的通讯作者是美国西北大学的Neil L. Kelleher教授。生命活动由一系列生物大分子相互作用驱动，这些相互作用距今已进化了数十亿年。正如乙酰化和磷酸化等共价修饰可以改变蛋白质的功能一样，与金属、小分子和其他蛋白质的非共价相互作用也可以改变蛋白质的功能。然而，传统的蛋白质组学方法会分离非共价相互作用并使蛋白质变性，导致许多蛋白质水平的生物学信息尚未被发现或仅靠推断获取。就在过去的几年中，质谱(MS)技术不断发展，目前已具备维持内源性蛋白复合物完整组成并表征其特征的能力。采用非变性质谱(Native Top-Down MS, nTDMS)激活蛋白复合体，可以释放部分或全部亚基，通过与中性气体或固体表面碰撞，在进一步表征之前分离。亚单位质量、母离子质量和活化亚单位的碎片离子可以拼凑出复合物的精确分子组成，包括蛋白质修饰在内的相互作用也能被阐明，并与人类疾病状态下的功能障碍联系起来。在本综述中，作者详述了nTDMS技术目前的发展和未来在表征更大的生物复合体方面所面临的挑战。目前，nTDMS可以靶向内源性核小体复合物，而病毒颗粒、外泌体和高密度脂蛋白颗粒表征或将在未来几年内得到深度解析。为充分解决这类大小为兆到千兆道尔顿级别的复合物的表征，未来的工作将主要集中于非变性分离、单离子质谱(Single ion mass spectrometry)和新的数据类型。为了实现这一目标，Kelleher教授课题组近年来发展了一系列策略，概括为以下几个方面（1）靶向非变性质谱表征整个核小体（图1）；（2）非靶向蛋白质组学深度解析内源性蛋白质复合物；（3）单分子质谱(Single molecule MS)。其中提到，阻止对非变性蛋白质进行整体表征最大的障碍之一可能是分子量分布于100 kDa到1 MDa的复合物的分辨率较差。而电荷检测MS通过直接测量离子电荷提供大型复合物的分子分布。此外有研究表明，通过对单分辨离子进行centroiding和rebinning，Orbitrap仪器的有效分辨率可以在电荷检测工作流程之上大大提高。在这种被称为“单离子质谱法(Individual Ion Mass Spectrometry, I2MS)”的技术中，可以同时检测数千个单离子，并允许在复杂混合物中分配约500种proteoforms的质量（前提是它们先前已被表征并且在数据库中可查找）。I2MS可用于分析病毒样颗粒和AAVs（图2）。图1. 核小体表征图2. 病毒颗粒检测未来随着技术的发展和创新，nTDMS都将扩展到研究极其稀缺和高度异质的生物复合物，了解蛋白质间的相互作用以及它们是如何出错的（例如错误折叠，在功能失调的化学计量和组成中形成复合物）。这些将不仅为疾病治疗的发展提供信息，还将深化我们在分子水平上对生命的理解。撰稿：张颖编辑：李惠琳原文：Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics

抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC）是一类通过特定的连接子将靶向单克隆抗体与高杀伤性的细胞毒性小分子药物偶联起来的生物药，以单克隆抗体为载体将小分子细胞毒性药物高效地运输至目标肿瘤细胞中，起到治疗的目的。与传统抗体药相比，ADC药物的结构复杂度和异质性更高，因为添加了多变的有效载荷和连接子1。为确保药物安全性和有效性，ADC的深度表征在其开发过程中至关重要。这不仅包括对mAb的翻译后修饰（PTM）的鉴定和定位，还包括药物偶联的鉴定。由于质谱技术的飞速发展，质谱已经成为ADC药物表征中最广泛使用的方法。完整质量分析是用于确定小分子药物与抗体比率（DAR）的常规方法，而对结合位点的深入表征，通常依赖于bottom-up的方法。现在最广泛采用的碰撞诱导解离（CID）技术能够提供氨基酸序列确认，但是这种能量比较大的碎裂技术也将有效载荷碎裂为更小的片段，从这种方法获得的高度复杂的谱图可能很难解析。而能量更柔和的碎裂方法可以促进此类复杂样品的解析，一种基于电子活化裂解（EAD）2,3的创新、高度可重复的碎裂方法用于分析来自商业化ADC药物的偶联肽。使用10 Hz快速非靶向的数据依赖采集（DDA）方法采集数据，通过此工作流程，一次进样就可以应用基于EAD的碎片进行常规和高级表征。曲妥珠单抗美坦新偶联物（T-DM1）是最早的ADC治疗药物之一，于2013年获得FDA批准用于治疗人表皮生长因子受体2（HER2）阳性转移性乳腺癌。T-DM1是由单克隆抗体曲妥珠单抗和细胞毒素美坦新（DM1）通过不可裂解连接子共价偶联而成（图1）。将单克隆抗体（mAb）的靶标特异性与细胞毒性药物的高效率相结合，可充分利用两个方面的优势，最大限度地减少副作用3。T-DM1是与氨基连接，如连接在曲妥珠单抗的赖氨酸残基的侧链中。先前的完整质量研究表明，T-DM1的平均DAR约为3.5.1,4。但是曲妥珠单抗中有88个赖氨酸残基和4个N端基团，可能会出现450万个以上的不同分子形式1。有效载荷的位点和结构将直接影响药物的功效和安全性，因此将其归类为关键质量属性（CQA），并且需要在开发过程中进行全面表征和严格监控。图1. 细胞毒药物有效载荷和连接子与mAb偶联的示意图。T-DM1由DM1（黑色），靶向连接氨基残基的MCC连接子（linker，蓝色）和单克隆抗体组成。本研究选择了与Zeno&trade EAD相结合的DDA方法。采用这种方法，不仅可以执行常规的肽图分析，而且EAD可以在同一针分析中进行高级表征。此外，Zeno EAD增强了碎片离子的检测能力，从而正确鉴定了低丰度物质。图2展示了在偶联肽SCDK [DM1]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK上观察到的碎裂模式的例子。在分析中未观察到没有连接子和药物或其部分的肽，表明其完全偶联。获得了此肽段高质量的MS / MS谱图，从而使该特定肽段的MS / MS序列覆盖率达到96.6％。一个更占优势的碎片从 m/z大于500的有效载荷产生（请见图2中的标记）。观察到的有效载荷结构的主要裂解位点是DM1的COO-C键，这种碎裂模式与先前利用CID技术产生的一系列小碎片的数据不同1。较大分子量的药物碎片可以用作特征碎片，以更具体地确认有效载荷的存在，并可以用来确认有效载荷的结构。图2. 应用Zeno EAD得到的偶联肽SCDK [DM1] THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK（z =+4）的碎片数据。来自肽段主链指定偶联肽段离子的全扫描MS / MS数据，以及有效载荷中的碎离子信息。此外，通过将Zeno EAD技术用于增强的碎片离子检测，还可以很好地检测到来自肽段主链的片段信息，从而提供有关肽段的分子完整性的信息。由于酶的空间位阻，抗体上偶联药物的存在会导致样品制备酶解过程中的更多漏切位点。另外，赖氨酸残基和有效载荷之间的结合过程是随机反应，偶联的比率并不总是100％，这导致了多样性和低丰度物质存在。当一个肽段中存在多个潜在连接形式时，鉴定正确的连接位点可能是一个挑战。肽段ASQDVNTAVAWYQQKPGKAPK是这种具有挑战性的另一个例子（图3）。它包含一个漏切位点和一个脯氨酸相邻的N端赖氨酸，导致偶联位点的多种选择。但是，有了从EAD技术碎裂得到丰富、高质量的MS / MS质谱图，就可以实现药物定位的自动匹配（图3A）。由于有效载荷靠近肽的C端，因此检测到的C离子比Z离子丰富（图3A），而未结合的肽显示出来自C端和N端的丰富片段（图3B）。众所周知因为电子活化解离技术不会解离脯氨酸的N端，我们还检测到了除了C15以外的从C3到C17的全系列C片段7。这提供了确凿的证据表明K15未与细胞毒药物偶联。此外，z4，z5和z7表明K18（而非K21）是药物偶联的正确位点。图3. 应用Zeno EAD得到的来自偶联/非偶联肽ASQDVNTAVAWYQQKPGK [DM1] APK（z =+3）的碎片的数据。A：来自肽段主链指定偶联肽段离子的全扫描MS / MS数据，以及有效载荷中的碎离子信息。B：来自肽段主链指定非偶联肽的全扫描MS / MS数据。 连接子显示为蓝色，DM1药物显示为黑色。结论：通过EAD的新型碎裂模式，实现了具有多个潜在位点的多肽中药物偶联的准确定位与传统的MS / MS分析相比，EAD技术获得更丰富的MS/MS碎片信息。应用Zeno EAD技术，即使对于中等强度或极低强度的母离子（例如低丰度的偶联肽），也能获得令人信服的二级碎片和出色的数据质量SCIEX ZenoTOF&trade 7600系统强大、高重现性且易于使用的多重碎裂技术，使用户能够以简单的方式解决具有挑战性的分析问题(CN)Characterization of an antibody-drug-conjugate (ADC) using electron activated dissociation (EAD).PDF点击下载声明：版权为 SCIEX 所有。欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容须获得授权, 转载时须注明「来源：SCIEX」。申请授权转载请在该文章下“写留言”。

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry