梯度分析

1 .梯度洗脱等于无限个等度洗脱http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512131829_577712_3047134_3.jpgfigure 1a所示，条件是60%B的等度洗脱，我们会发现，在色谱的前端，峰并没有很好地分离，而在色谱的尾端，虽然峰分离的很好，但峰变的很宽。如果降低B的比例，前面的峰的可以得到分离，而后端的峰宽将会变的更宽；如果提高B的比例，后端的峰可以快速流出，峰宽也会窄一些，但前端的峰会更加难以分离，所以，遇到这种情况，很难用等度洗脱得到很好的分离。为什么会出现这种情况？通过计算，发现1a中样品的保留因子范围是0.934(34/0.9 ≈ 38),样品的极性差别很大，而通常等度洗脱的保留因子范围是120(20/1=20), 1a中保留因子的范围38远远大于20，所以是不适合用等度洗脱的。figure 1b,梯度洗脱的条件是 50-100% in 5 min，会发现不论是前端还是后端，峰都得到了很好的分离，并且峰宽几乎是一样的Figure 1c做了一个试验，将figure 1中分析的15种物质分成了5组，每组都是等度洗脱，B的比例分别是49%，61%，72%，80%和88%，每组的保留因子大概都是k等于3，峰宽也几乎一样，是不是和figure 1b很相似？如果将c中的等度洗脱的条件叠加，就是一个梯度洗脱，也就是说梯度洗脱可以理解为是有无数个比例变化很小的等度洗脱的叠加。2.梯度洗脱的窄峰宽和等峰宽梯度洗脱的最大好处就是能够窄的峰宽，并且同一梯度内的峰宽都是一样的，为什么呢？http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512131830_577713_3047134_3.jpg如Figure 2b所示，梯度条件是 5-100% B ，梯度时间是20min，2a显示了梯度变化时，保留因子k（虚线）的变化以及峰宽（实线）的变化。在梯度开始时，有机相比例低，保留因子k最大，峰还停留在柱头，峰宽为0，随着有机相比例的增加，物质开始柱子内移动，有机相比例不断增加，k值也一直下降，物质在柱子中不断移动直到流出。峰1和峰2的保留时间虽然不一样，但其移动的模式是一样的，并且k的变化曲线也是一样的，所以在梯度洗脱条件下，其峰宽也是一样的。1梯度洗脱等于无限个等度洗脱figure 1a所示，条件是60%B的等度洗脱，我们会发现，在色谱的前端，峰并没有很好地分离，而在色谱的尾端，虽然峰分离的很好，但峰变的很宽。如果降低B的比例，前面的峰的可以得到分离，而后端的峰宽将会变的更宽；如果提高B的比例，后端的峰可以快速流出，峰宽也会窄一些，但前端的峰会更加难以分离，所以，遇到这种情况，很难用等度洗脱得到很好的分离。为什么会出现这种情况？通过计算，发现1a中样品的保留因子范围是0.934(34/0.9 ≈ 38),样品的极性差别很大，而通常等度洗脱的保留因子范围是120(20/1=20), 1a中保留因子的范围38远远大于20，所以是不适合用等度洗脱的。figure 1b,梯度洗脱的条件是 50-100% in 5 min，会发现不论是前端还是后端，峰都得到了很好的分离，并且峰宽几乎是一样的Figure 1c做了一个试验，将figure 1中分析的15种物质分成了5组，每组都是等度洗脱，B的比例分别是49%，61%，72%，80%和88%，每组的保留因子大概都是k等于3，峰宽也几乎一样，是不是和figure 1b很相似？如果将c中的等度洗脱的条件叠加，就是一个梯度洗脱，也就是说梯度洗脱可以理解为是有无数个比例变化很小的等度洗脱的叠加。2梯度洗脱的窄峰宽和等峰宽梯度洗脱的最大好处就是能够窄的峰宽，并且同一梯度内的峰宽都是一样的，为什么呢？如Figure 2b所示，梯度条件是 5-100% B ，梯度时间是20min，2a显示了梯度变化时，保留因子k（虚线）的变化以及峰宽（实线）的变化。在梯度开始时，有机相比例低，保留因子k最大，峰还停留在柱头，峰宽为0，随着有机相比例的增加，物质开始柱子内移动，有机相比例不断增加，k值也一直下降，物质在柱子中不断移动直到流出。峰1和峰2的保留时间虽然不一样，但其移动的模式是一样的，并且k的变化曲线也是一样的，所以在梯度洗脱条件下，其峰宽也是一样的。

http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105171737_294639_2248398_3.jpg先上了一张谱图，下面请听我慢慢道来。现在我正在分析一种名叫阿昔洛韦的药物，按照药典要求分析过程中发现在主峰出来的后的一段时间后出现了如上图所示的一个峰，次峰和主峰的峰高差不多（10mv左右），现在的情况是领导觉得这个峰在后面不好看，要求我想办法去掉（其实和主峰的分离度比较大，我认为不用去计较，这不过是梯度变化过程后的一个基线的波动），于是我试着空走了几次流动相，结果就出现上面图上所看到的小峰，这个峰经过分析是在梯度变化完成之后出现的。梯度程序如下：time A (水) B(甲醇)0 94% 6%15 94% 6%40 65% 35%41 94% 6%51 94% 6%线性梯度我试着分析了几个原因：1.静态混合器的混合问题造成流动相里的杂质在变化较大的梯度过程中出现的波动。2. 流动相中的弱极性杂质在6%甲醇洗脱过程中保留在柱子里，在由6%到35%梯度变化的过程中这些在前面保留的杂质被洗脱下来，梯度结束之后流出柱子形成了峰现在经过拆掉混合器和更换柱子的操作后这个峰依然存在，不知道各位有没有遇到过这样的情况，讨论一下啊！

[align=center]等度淋洗还是梯度淋洗[/align]本篇从[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]等度淋洗与梯度淋洗的区别、优势、操作难易、谱图分析等角度介绍两种淋洗模式，用真实的分析数据说话，无论有无使用经验都能毫无阻碍的阅读。阅读的同时可带着这两个问题思考：为什么要选择梯度？梯度会让操作更麻烦吗？以阴离子分析为例做具体说明，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]分析阴离子时常采用氢氧根淋洗液或碳酸根/碳酸氢根淋洗液，顾名思义等度淋洗为在分析过程中淋洗液组成和浓度都不变，采取手动配置淋洗液时只需要配制一种，只需要一个高压泵即可完成，对仪器管路简单，能满足大部分分析需求。但对一些样品存在难以解决的问题，例如同时分离强弱保留组分共存的样品，使用低浓度淋洗液，强保留组分洗脱时间很长甚至不能被洗脱，若提高淋洗液浓度将强保留组分快速洗出，则很大可能会影响或干扰弱保留组分的分离；这个合适的“度”并不好掌握，于是梯度淋洗应运而生。梯度淋洗则可以设置梯度程序，常使用的是浓度梯度，即在不同时间设置不同的淋洗液浓度。在起始阶段选择较低的淋洗液浓度，将弱保留组分洗脱后即可升至高浓度，将强保留组分快速洗出，实现强弱保留组分的同时分析。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209281530495069_9000_5638282_3.jpg[/img][/align]梯度曲线以红色虚线表示，根据谱图可知，梯度淋洗在起始浓度使用10mM氢氧化钾淋洗液，10-30min浓度线性增加到30mM，30-40min维持30mM的浓度，在最后阶段回到起始浓度10mM。不但大大缩短了磷酸根的洗脱时间，峰形变得更尖锐对称。并且将弱保留的组分的分离度提高。不同样品选择合适的梯度程序可以改善分离条件，提高分离度，减少分析时间，提高分析效率。在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]中保留时间越长，峰形越宽，使用梯度淋洗能保持峰形的尖锐，提高峰的对称性有利于定量分析。因此有更高的分析需求，复杂的分析样品或需要摸索最佳分离条件的用户，或等度淋洗无法解决的情况下，配备淋洗液发生器并使用梯度淋洗将是不二之选，先进的淋洗模式将助力科研的速度。下面以青岛睿谱INTELLIC工作站的浓度梯度设置界面为例：在左侧梯度程序设置中用鼠标任意建立和修改相应梯度程序（支持20行），同时在右侧会实时根据设置的梯度程序生成更直观的梯度曲线；并且在进行分析时的实时曲线中也叠加显示此梯度曲线。将淋洗液信息一目了然，可根据谱图对梯度曲线及时进行优化。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209281530502377_5311_5638282_3.png[/img][/align]实现梯度淋洗的最简单方法是使用淋洗液发生器，仪器上方的淋洗液瓶只加入脱气之后的超纯水，只需用鼠标点击即可设置相应的淋洗液浓度，在线产生纯净的浓度精准的淋洗液。一方面操作简便省去了配制溶液的手动步骤，自动化程度大大增加。另一方面整个流程避免了使用化学试剂带来的误差和危害，使分析结果的重复性大大提高，实现了只使用水进行分析的绿色化学。下面是几张梯度程序应用的实际案例谱图：[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209281530505053_5413_5638282_3.png[/img][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209281530502803_843_5638282_3.png[/img][/align]细心的人除了能从这两张不同的谱图中看出应用的场景外，第二张图能明显的看出因淋洗液浓度变化而导致的基线漂移，那为什么第一张图使用梯度浓度更高而基线漂移却不那么明显呢？先说原因，梯度淋洗时开启CR-TC并施加合适电流即可大大降低基线漂移和噪声，并能使背景电导进一步降低。这里先简单介绍部件，下篇将详细介绍其原理与应用。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209281530504102_7148_5638282_3.jpg[/img][/align][align=center][font='等线 light'][size=13px]淋洗液发生器实拍图（未接C[/size][/font][font='等线 light'][size=13px]R-TC[/size][/font][font='等线 light'][size=13px]）[/size][/font][/align]使用梯度淋洗的三要素：氢氧根体系色谱柱、淋洗液发生器、自动再生电解抑制器，在青岛睿谱已经实现国产化自主化，在提升国产[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱仪[/color][/url]器性能的路上不断前进。青岛睿谱分析仪器有限公司研发生产的淋洗液发生器将淋洗液罐、CR-TC、脱气盒单独设立一个机箱，与[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱仪[/color][/url]主机连接方便，可轻松实现氢氧根淋洗液的梯度淋洗，经过验证，搭配自家WLK-12A抑制器可有效抑制70mM氢氧根淋洗液而不发生明显基线漂移。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209281530505782_3893_5638282_3.png[/img][/align]知识拓展：氢氧根体系色谱柱与碳酸盐体系色谱柱的区别固定相：碳酸盐体系色谱柱功能基为烷基季铵盐，对碳酸盐的亲和力较强，对氢氧根的亲和力弱；相应的氢氧根体系色谱柱使用的是对氢氧根亲和力更高的固定相。分离和检测角度看氢氧根做淋洗离子经过抑制器抑制后的背景电导更低，噪声更小，非常适合进行痕量分析，还可使用高浓度淋洗液分离强保留组分。而某些特定领域碳酸盐体系也具有一定优势，如测定磷酸盐；对上述内容若有疑问或建议，欢迎大家留言讨论现在您已经对等度淋洗和梯度淋洗有了初步的了解，如果需要更深一步的了解梯度淋洗，请看下篇：梯度淋洗进阶篇——CR-TC（连续再生捕获柱）

从极性到疏水性化合物的广泛分析中，最常使用C18色谱柱进行分析，但有时C18色谱柱对含有多种极性化合物样品的分离效果并不好。对于这种情况，一个解决方法是使用“反反相色谱柱”进行分析；但是，在不改变流动相条件的前提下使用反相色谱柱，尤其是使用具有高表面极性填料的色谱柱也是有效的解决方法。由于ADME色谱柱键和的官能团不是直链型烷基，而是立体笼状结构的金刚烷基，因此它具有与常规C18填料完全不同的独特保留分析能力。本次，在UPLC系统下，使用2μm粒径、最大耐压值为100MPa的CAPCELL PAK ADME S2色谱柱，在梯度条件下对极性化合物核苷进行分析，并与2μm粒径的C18色谱柱分析结果进行了对比。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/08/201608111426_604446_2222981_3.jpg http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/08/201608111426_604447_2222981_3.jpg在此，使用CAPCELL PAK ADME S2（上段红）、CAPCELL PAK C18 IF2 S2（中段黑）和Sub 2 μm C18色谱柱（下段黑） 3款色谱柱，通过改变梯度条件，即改变B相（乙腈）的初始比例，对相应的分离模式进行了比较。梯度方法的分离，除了填料表面的相互作用之外，也会受到流动相组成变化的影响，因此分离的可能性也有所增加。如图2，改变B相初始比例得到不同分析结果：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/08/201608111426_604448_2222981_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/08/201608111427_604449_2222981_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/08/201608111427_604450_2222981_3.jpg本分析例说明，即使同样是导入C18基团的色谱柱，根据其导入方式、导入量和材料的不同，其填料表面特性也有所不同，对于分离模式的影响也有不同作用。另外，在本次分析中，因键和独特官能团而具有独特表面特性的CAPCELL PAK ADME S2色谱柱，在B相初始比例为0%时，尿嘧啶核苷（峰2）和脱氧胞苷（峰3）得到了良好分离。ADME色谱柱键合的是金刚烷基而非直链型烷基，因此具有独特的分离特性，与梯度条件中流动相比例对分离的影响相结合，使得目前分离较为困难的极性化合物能够拥有更多的分离可能性。