体视层析速度场

薄层层析展开的速度跟哪些因素有关

想请教各位一个问题，请大家多多指点。 在做薄层层析的时候，用的是商品薄层层析板GF254，按照药典上的方法配的展开剂，结果展开的时间特别长，甚至要4小时左右，虽然展开的结果还是能把主成分与杂质斑点区别开，但据说展开的时间太长，对结果不准确，而且这展开的时间也太长了，太慢了。 想问一下大家：1、可否微调下药典上的展开剂的比例？若可以，大概往哪个方向调？2、用的薄层板ph值是6.2-6.8，这应该是属于中性板吧？

关于柱层析和TLC之我的体会(转载)层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。 上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。 接下来谈TLC，需要切记的是： 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。 第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷己烷苯乙醚THF乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇 使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleumether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether,Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ethyl acetate 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleum ether/THF这类不常见的混合溶剂。 一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。 对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。当然，选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。

层析技术的原理和分类（一）层析技术的原理 　　层析法是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。　　层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。　　（二）层析法分类见表　　（三）层析法的特点与应用表按两相所处状态分类 流动相液体气体 液体液-液层析法气-液层析法固定相 固体液-固层析法气-固层析法

找了很久，确实没发现有硅胶柱层析的版块，于是就到了最为相近的薄层色谱来求助了。今天主要想咨询下大家几个经验性的问题：1.硅胶在柱层析使用前，一定要活化吗？这样做有什么作用啊？2.硅胶还有所谓的吸附溶胀的现象吗？或者1g硅胶在有机溶剂中的体积大概多少？好像这叫视密度吧？3.湿法装柱一定要加压吗？因为没有加压泵，本来就会在常压下洗脱.4.洗脱的流速大概多少？比如2个柱体积每小时啊，或者线速度之类的具有一定量化标准的参考值（我准备使用15cm*1.7cm的柱子），这个对于分离影响大吗？.5.对于几个比较相近的物质，可以通过几次柱层析来实现分离吗？比如一次去掉1-2种，那么多次之后就能把杂质去掉了？不好意思，刚接触这个，问题比较多，大家多多指教！想到几个就回答几个，先谢谢大家了！

柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。 上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。 接下来谈TLC，需要切记的是： 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。 第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个较好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油醚己烷苯乙醚THF乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇 使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ethyl acetate 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleum ether/THF这类不常见的混合溶剂。 一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。 对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。当然，选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。 这里要特别强调的一点是：分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系。不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度对分离效果影响也很明显。我们实验室没有空调，我在实验过程发现，在夏天分离相同的产品，所需的淋洗剂极性要比在冬天小很多，这一点大家也是可以理解的。 鉴于此，使用的硅胶，不用时一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面，或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。 在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示： A X B C D 这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。 利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H NMR可鉴别的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。但是自己以前的样品，则可以只通过点板来判断纯度。补充一下层析柱硅胶的用量一般是每分离1g产品使用30-100g硅胶柱子的形状比例一般是内径:高度=1:8~10展开剂尽量使用能够分开的极性最低的溶剂还有，湿法装柱子的时候本人认为最好是先在底部装有石英砂的柱子中预加溶剂再按湿法加料这样能保证一开始加入的填料处于全湿状态,杜绝气泡刚装的柱子在一段时间内可能会有长度变短的现象,所以可以给它一个稳定时间后再投入使用.作者：南开大学Asymmetrical

上世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代，首先是层析介质有了飞速的发展，各种人工合成的介质出现，如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶的出现，极大地拓展了层析技术的应用领域和范围，基于不同介质的层析方法也如雨后春笋般不断涌现。如Bio-Rad公司于上世纪50年初推出的分析级离子交换树脂AG系列，广泛用于各种分子物质的分离纯化，包括无机离子、有机酸、核酸以及糖类等。值得一提的是，上世纪4、50年代正是DNA、RNA研究如火如 荼的时期，而Bio-Rad推出的AG系列树脂在核酸纯化方面具有极其出色表现，受到众多研究人员的欢迎与好评。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734846.JPG_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734847.JPG_small.jpg Bio-Rad AG系列树脂 此外，因为马丁（Martin）和辛格（Synge）的钻研与畅想，他们的预言分别在1952年及20世纪60年代被人们所应证。而马丁（Martin）和辛格（Synge）两人也于1952年被授予诺贝尔化学奖。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734849.JPG_small.jpg Bio-Rad专家介绍：其中设想1“流动相可用气体代替液体，因为与液体相比，分离时候，物质间作用力更小，对分离也就更有好处”也就是气相色谱仪(GC)，即以气体作为流动相的色谱法，1952年诞生，目前，该法已被广泛应用于分离和分析复杂的多组分混合物。特别是挥发性物质，我们都知道挥发性物质在实验或分离时会受到干扰，而气相色谱仪的产生给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变单。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734850.JPG_small.jpg 设想2“若能够使用非常细的颗粒填料，并在色谱柱两端施加较大的压差，从而增加了理论培板数，这将会大大提高分离效率。”也就是高效液相色谱HPLC，20世纪60年代末诞生，现在高效液相色谱HPLC已成为化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可少的工具。高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：不能很好地兼容生物缓冲系统，因为HPLC系统通常采用不锈钢材质，因此具有良好的有机溶剂耐受性以及高压力承受。但是生物缓冲系统往往涉及到各种不同浓度的盐溶液，比如最常用的磷酸盐缓冲液等，而不锈钢系统不能耐受盐腐蚀，因此为了满足生物研究中样品的快速分析、分离，蛋白质快速层析技术应运而生。蛋白质快速液相层析（Fast Protein Liquid Chromatography），基于HPLC技术，但又有别于HPLC，它的主要液体接触部件均采用生物盐溶液耐受的塑料或者橡胶，这样能够极大地降低缓冲盐对系统的腐蚀，如Bio-Rad最早一代层析系统Biological LP，正是为了满足70-80年代间快速发展的生命科学领域内对未知组分、物质的分离、纯化的需求应运而生。在其诞生之初，风靡北美。下期，伯乐生命bio-rad专家将为大家带来21世纪层析法特点及先进层析系统，敬请关注！如今的色层分析法经常用于分析、分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义，但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734851.JPG_small.jpg 现在我们简称为色谱法、层析法或色谱技术、层析技术。

层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。如图3－1 所示： 当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]的产生，并在1952年诞生了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱仪[/url]，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。 层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。层析的基本理论 层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。 对于一个层析柱来说，可作如下基本假设： 1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以Vm表示。 2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。 3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。 4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:n = 5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。层析的基本概念1. 固定相： 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 2. 流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。3. 分配系数及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。（Rf大于或等于1）可以看出：K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加。 实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。 分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式： lnK = －(DG0/RT) 式中： K为分配系数（或平衡常数） DG0为标准自由能变化 R为气体常数 T为绝对温度 这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的DG0为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20°C, K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。 4. 分辨率（或分离度） 分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。图3－2 是计算分辨率的示意图。 分辨率： 由上式可见，Rs值越大，两种组分分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有教好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。 为了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法： ⑴ 使理论塔板数N增大，则Rs上升。 ① 增加柱长，N可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗脱液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的办法。 ② 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100mm；而HPLC柱子的固定相颗粒为10mm以下，且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分离的效率大大提高了。 ③ 采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]，流速影响相当大。 ⑵ 改变容量因子D（固定相与流动相中溶质量的分布比）。一般是加大D，但D的数值通常不超过10，再大对提高Rs不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D限制在1 ￡ D ￡ 10，最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温（一般降低温度），改变流动相的性质及组成（如改变pH值，离子强度，盐浓度，有机溶剂比例等），或改变固定相体积与流动相体积之比（如用细颗粒固定相，填充的紧密与均匀些），提高D值，使分离度增大。 ⑶ 增大a（分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D之比），使Rs变大。实际上，使 a 增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使 a 发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，a 的变化对Rs影响最明显。 总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。5. 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。

中文名称：层析 英文名称：chromatography 定义1：基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义2：利用某种类型的固定介质，根据混合物分子的电荷大小和分子量不同等性质，在流动相和固定相之间进行分离的一种生物化学技术。

根据多年来使用柱层析的操作经验，本文总结了在使用柱层析时的几个技巧：1、 硅胶的使用初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了，有时还会有大量的硅胶剩余，浪费硅胶，这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有掌握。柱层析用的硅胶一般是 100-200 目，100 毫升硅胶的质量在47 克左右，如果装一个直径是 2.8 厘米的柱子，可以装 18 厘高。为了避免浪费硅胶和溶剂，最初学习装柱时最好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单：用量筒量出 100 毫升干硅胶， 直接倒入各种规格的柱子中，敲实，用刻度尺量出硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数了。一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没有必要的浪费。称量硅胶时一般称30~70倍于上样量， 如果极难分， 也可以用100 倍量以上的硅胶。2、 洗脱剂的使用洗脱剂的极性可用薄层层析来确定，一般以待分离样品 Rf 值为 0.2-0.3 为宜。选择的洗脱剂应该使两相邻物质 Rf 值之差最大化。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好，如果 Rf 在 0.6，即使相差 0.2 也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的过程，可以通过公式的比较：0.6/0.8 一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3） 的三次方或四次方大。有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以分离效果好。解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时， 可用采梯度洗脱的方法， 即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。在同样能洗脱的情况下，尽量使用毒性小的洗脱剂。例如，乙酸乙酯：石油醚系统和二氯甲烷：石油醚系统， 在同样都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯：石油醚系统。另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化， 一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。3、 装柱子的技巧柱层析的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。湿法装柱很简单，使用也最普遍， 就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆，柱子底部先用脱脂棉塞紧， 然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。用漏斗将活好的固定相倒入柱子中， 打开底部活塞， 将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打， 将固定相敲实， 做到密实均匀无气泡即可。很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子，而且在柱子中没有气泡产生。干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中， 然后用油泵抽柱子底部， 相当于减压过柱， 直到柱子变得很结实， 再用淋洗剂“走柱子” 。干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后， 由于溶剂和固定相之间的吸附放热， 所以柱子容易变花，影响分离效果。解决的方法是：（1）固定相一定要添加结实；（2）一定要用较多的溶剂“走柱子”，直到柱子的下端不再发烫， 恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱，最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。4、 上样的技巧上样也有湿法和干法之分：湿法一般用淋洗剂溶解样品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等， 但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。在不用海沙的情况下， 尽量不要破坏硅胶面。加样后， 打开柱底活塞， 让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂， 而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的， 一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现， 是因为硅胶对样品的吸附饱和， 而样品本身又是比较好的固体才会析出， 这就需要先重结晶样品， 得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。如果不能重结晶也没关系，直接过柱就行， 样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解， 最后随着洗脱剂流出。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如 DMF，DMSO等， 会随着溶剂一起走， 显色是一个很长的脱尾） ， 这时就必须用干法上柱了。 干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶， 拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按 1：1 的量混合， 硅胶使用的量也可以少一些， 但是要保证在旋干后， 不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中， 加入洗脱剂洗脱。5、 过柱的技巧柱层析按过柱时的压力可以分为：加压， 常压， 减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度， 减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的， 但是时间也最长， 例如一些天然化合物的分离，有时一个柱子过几个月也有可能。减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发， 有时会在柱子外面有水汽凝结， 另外有些比较易分解的东西可能得不到， 而且还必须同时使用水泵抽气， 噪音大， 时间长， 所以减压过柱用得比较少。加压过柱是一种比较好的方法， 与常压柱类似， 但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵 （用鱼缸供气的加压泵就行）。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。一般压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高， 分离效果较好， 所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡， 使柱子变花， 利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题， 而且可以使柱子很快装实。随着科技的发展， 色谱法的技术也日新月异， 但柱层析实验技术还是比较简单和实用的， 每个科研工作者在使用柱层析时， 可以根据自己的实际情况来不断地摸索，不断地总结和提高柱层析的实验技术。

经过任一反应所合成的有机化合物，一般总是与许多其它物质（其中包括进行反应的原料、副产物、溶剂等）共存于反应体系中，因此在有机制备中，常需要从复杂的混合物中分离出所需的物质。本人从事实验小试多年，总结经验如下：1、 重结晶技术：重结晶是提纯固体有机化合物常用的方法之一。众所周知，固体有机物在任何一溶剂中的溶解度，均随温度的升高而增加，所以将一个有机化合物在某溶剂中，在较高温度时制备成饱和溶液，然后使其冷却到室温或降至室温一下，即会有部分成结晶析出。利用溶剂与被提纯物和杂质的溶解度不同，让杂质全部留在溶液或大部分留在溶液；当然，有时一开始析出的结晶也可能是杂质，而需要的组分则在溶液中。通过，上述我们知道影响重结晶纯化的重要因素是：溶剂的选择；热溶液的制备；冷却析晶（1） 溶剂的选择溶剂选择的条件：a 不与被提纯物发生化学反应；b 溶剂沸点较低，易除去（常压、减压蒸馏除去）；c 对所需组分在高温和低温条件下溶解度差异尽量大，而对杂质的溶解度要么很大，要么很小；d 溶剂价格便宜、毒性小，容易回收，操作安全。（2） 热溶液的制备很多人认为，制备热溶液就是将溶液加热至一定温度，然后将要结晶的混合物溶解其中。其实，热溶液的制备还是有很多的讲究的。根据经验我认为首先，必须先了解选用的溶剂的沸点，热溶液的温度应同其沸点有一段距离，否则溶剂挥发量太大，不仅影响重结晶效果，还会危害身体健康；其次，热溶并不是一口气加入混合物使其溶解，最好的操作应该是在升温的过程中不断的搅拌加入混合物，使其饱和。（3） 冷却析晶通常可分为常温（室温）、低温析晶两种。至于采用哪种方法则决定于结晶速度的快慢，晶形要求等因素。如果，结晶速度快，一般采用常温（室温，自然冷却）结晶，而对于一些有特殊要求（如，不易结晶，结晶慢等）可采用低温结晶方式（先自然冷却至室温，至于冰箱保鲜层缓慢降温）。一般来说，我们希望在最短的时间里得到结晶，常采用非常手段（如，至于冷水中，冷却过程中加以振摇），这要是可以加快结晶速度，但是它也带来很大的弊端。因为，快速冷却，振摇得到的结晶大多较细，表面积大，吸附母液多，且容易夹有杂质（快速结晶中杂质包裹在晶体中）。所以，最好是采用自然冷却。当然，加快结晶的办法也是有的：用玻璃棒摩擦瓶壁；加入少量晶种引晶。（4） 结晶的过滤和洗涤将析出的结晶的冷溶液和结晶的混合物，用抽滤法分出结晶；瓶中残留的结晶，可用少量滤液冲洗几次，一并转移至布氏漏斗，把母液尽量抽干；用刮刀、空心塞把结晶压紧，以便抽干结晶吸附的含杂质的母液；用适量的洗涤液清洗2～3次，可用玻璃棒或刮刀轻轻搅动。（5） 结晶的干燥若重结晶的溶剂是石油醚等低沸点溶剂可放于通风厨中自然凉干（不吸水的前提下），如果是乙醇等沸点较高的溶剂一定要在高于其沸点10℃的烘箱中放置1～2小时（低于结晶熔点20℃以上）。干燥至恒重后，及时至于干燥器中保存待用。（6） 操作案例取1.00g 4－羟基脯氨酸，在升温条件下（升温至55～60℃）加入到乙醇（95％）中，边用玻棒搅拌溶解，室温放置，自然冷却（可用玻棒轻轻摩擦瓶壁），有结晶析出，冷却至室温，布氏漏斗抽滤，空心塞压紧，水少量洗涤，压紧抽干，烘箱升温至100℃，干燥1小时至恒重，测熔点（熔距短），干燥器中存放。2、 柱层析技术：柱层析通常可分为：干柱色谱和湿柱色谱两种。这里我将介绍最常用的湿柱色谱以下习惯称柱层析。化学反应中得到的产物中通常混有反应物、副产物、溶剂（统称杂质）的，为进行数据测试或则杂质在对下一步反应有影响，这时我们就得尽量的除去这些杂质。固体结晶可通过上述的重结晶方法进行纯化，但对在要求较高时通过重结晶得到的纯度显然无法满足要求；而且对于液体（油状物）这一类产物时又不可能通过柱层析进行实现。这时，就需要采用柱层析的方法进行纯化处理以期获得合格的化合物。将白了，柱层析就是利用不同物质在洗脱剂中的展开速度不同（跑的快慢曾读）而进行分离。目前，我们最常用的就是以硅胶、氧化铝两种物质为填充剂的色谱柱，常称为：硅胶柱和氧化铝柱。这里我们重点介绍便宜且工业化应用广泛的硅胶柱。首先，就是确定选用哪种直径的柱子进行柱层析操作。通常实验室采用直径在0.5～10cm的柱子，柱高50～70cm。这时就得根据你要过柱的量来选择了，通常5g的混合物。其次，选择好要用的柱子后就得考虑采用的填料，一般实验室内都采用硅胶填料。硅胶用量差不多为分离物质量的40倍左右，当然，这也不是绝对的。如果只是用来普通的过滤用用量就可以少下来。一般用度来算的话，就是装柱量在25～30cm为宜（纯属本人经过几百根柱子下来的经验），太长则分离时间太久，短了分离效果不好。接下来就是考虑如何装柱了，通常一般实验室内很少碰上无水、无氧柱，大家接触多的是普通柱。本人觉得湿装柱屡试不爽，具体操作就是，先往柱中放入少量棉花，加入少量沙子（普通，清洗干净）加入一定量的洗脱剂，把硅胶溶解于洗脱剂中装柱，用吸气球加快硅胶沉淀，再在硅胶上层加入少量沙子形成沙层（1cm左右），这样一根柱子就装好了。然后就是上样（你的样品需要先浓缩蒸掉大部分溶剂剩下少量刚好成溶液有一定的流动性，用胶头滴管上样），上样完就可以开始洗脱了，（如果你的样品是有荧光的那你可以先用薄层板展开，知道所要的产物点的Rf值及杂质点的Rf值这样就能够很好的配制洗脱剂的极性程度，因为薄层板跟硅胶色谱柱的原理一样可以在薄层板展开剂的基础上稍微的调整一下极性比例），刚开始洗脱时可以采用石油醚等极性小的溶剂先进行冲洗然后再用配好的洗脱剂进行洗脱，可以用吸气球进行人工加压，加快洗脱速度。溶液接收及检测：一般采用几个三角瓶（锥形瓶）进行收集，通过薄层板（有荧光时，若没有荧光看一下有没有色带收集色带，如果二者都没有那你有点麻烦）判断要的产物下来没有，下来后开始可以少量收集，接下来收集量大一点，快没荧光时收集量小一些，对收集的几瓶子洗脱液进行薄层展开，合并同一高度的溶液，浓缩，经过这样的掐头去尾就可以得到符合要求的样品了。再给大家一个本人操作的案例一个：取某样品3.80g柱层析；柱子：φ35×260硅胶（300～400目）200ml，石油醚装柱，少量二氯甲烷溶解，上样。洗脱，石油醚150ml+洗脱剂（石油醚:丙酮＝4:1）60ml×8。薄层板展开显示3、4、5样品为所需样品，合并，浓缩得黄色油状物1.22g。

柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、 一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量 芗 洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。 上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀 释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。 接下来谈TLC，需要切记的是： 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。 第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷己烷苯乙醚THF乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇 使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleum ether/THF这类不常见的混合溶剂。 一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。 对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。当然，选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。 这里要特别强调的一点是：分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系。不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度对分离效果影响也很明显。我们实验室没有空调，我在 实验过程发现，在夏天分离相同的产品，所需的淋洗剂极性要比在冬天小很多，这一点 大家也是可以理解的。 鉴于此，使用的硅胶，不用时一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存 在干燥器里面，或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。 在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种 难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点 一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示： A X B C D 这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的 点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为 有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。 利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只 显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H NMR可鉴别 的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。但是自己以前的样品，则可以只通过点板来判断纯度。

层析技术层析技术的应用与发展，对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素，分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究，发现除丹参酮Ⅰ为纯品外，Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法，迄今已发现15种单体（其中有4种为我国首次发现）。目前新的层析技术不断发展，随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用，层析技术已日趋完善。　　一．层析法的基本原理：层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和寓子交换，分子的大小（排阻层析）而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析，流动相为液体的称为液相层析。　　一、 吸附层析法（AdsorptionChromatography）　　（一）吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系：液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。 　　1． 吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。　　（1） 硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅胶加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。　　硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱注化台物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。　　（2）氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性，称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子，从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝，用于拄层析的，其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目，分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向。　　在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每半～1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适。　　（3）活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。　　2．溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。　　在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。　　3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。 　　当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。 　　又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

[color=#dc143c]最近版里原创热风呼呼的刮~~于是我也特来跟风积极参与！近来一直在做包涵体的复性与纯化，就特来与大家分享，希望大家多多支持、指点[em09511][/color][b]1.包涵体的分离纯化[/b] 蛋白质的纯化是基因工程下游的关键内容，以包涵体形式表达的重组蛋白质的纯化研究一直是重组基因工程药物研究中的热点和难点。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系，都可形成包涵体。蛋白表达后的分离纯化对蛋白的规模化生产也是至关重要的，所以本实验通过采用稀释复性、透析复性、离子交换层析、凝胶过滤层析等实验方法，研究探讨对分离纯化以及蛋白复性的最佳方法和条件。[b]1.2.1包涵体的复性[/b] 重组蛋白质在分离纯化的过程中, 必须维持一定的浓度和生物活性形式, 以及防止被降解。从包涵体中获得有生物活性的蛋白，需要寻找一种简单而有效的复性方法。在小规模的蛋白复性研究及其进一步的纯化中，稀释复性是最常用的方法。但是稀释复性在商业规模生产中具有一定的缺陷，如需要较大体积的复性液，以及需要附加的浓缩步骤。许多其他方法也已发展起来，例如：透析、渗透、低分子量辅助物添加复性、离子和无离子表面活性剂辅助复性、聚乙烯乙二醇辅助复性等方法。 在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠 一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肤链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。[b]1.2.2包涵体离子交换层析纯化[/b] 为了获得高纯度的活性蛋白, 需要对复性的蛋白质进行进一步纯化。根据分离目标蛋白的特点(如P I、疏水性、氨基酸组成, 分子量大小、表面电荷的分布状况) , 然后确定分离方法, 从而正确选择最有效的分离介质,本实验采用SP Sepharose F.F 阳离子交换层析分离纯化重组蛋白 离子交换层析是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH 离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换又分为阴离子交换和阳离子交换。离子交换剂又有强弱之分,强的离子交换剂在整个pH 范围内都是离子化的,而弱的离子交换剂通常仅在pH6～9 之间是离子化状态,因而后者对所适用的pH 范围又有了进一步的限制。 在洗脱方式上,阳离子交换主要是改变pH ,它主要应用于等电点大于5 的蛋白质。20 种氨基酸中,大部分带正电或负电,这是IEC 应用范围广的原因。离子交换层析处理量大,附载系数高,一步缩小样品体积很多。离子交换层析去除杂质能力强,如对热原质,核酸、及电荷性有差别的蛋白均可去除。它还有一个特点,利用蛋白质在不同pH 和盐浓度下带电性的不同,通过不同条件下应用同种类型或不同类型介质,分步使目标蛋白质达到提纯目的,这是除亲和柱层析外,别的柱层析达不到的分离能力。离子交换层析原则上可放在纯化工艺的任何一步,它属吸附型层析,单步损失也较大。

[font=宋体]免疫层析法和胶体金法是两种常用的生物检测技术，它们在原理、应用和优缺点等方面存在显著差异。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]①原理区别：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]免疫层析法是一种基于抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体反应的生物检测技术，利用标记有荧光物质、酶、胶体金等物质的抗体或抗原，检测样品中是否存在相应的抗原或抗体。当样品中的抗原与标记的抗体结合后，可以通过层析作用将结合物分离并检测。[/font][/font][font=宋体]而胶体金法则是利用胶体金作为标记物，通过免疫学方法检测样品中的生物分子。胶体金是一种由氯金酸水溶液在还原剂作用下形成的金颗粒，这些金颗粒分散在溶液中形成胶体溶液。当生物分子与胶体金结合后，可以通过显色反应判断是否存在该生物分子。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]②应用区别：[/font][/b][font=宋体]免疫层析法主要应用于医学诊断、食品安全、环境监测等领域。例如，用于检测尿液、血液、组织液等生物样品中的病毒、细菌、蛋白质等物质。[/font][font=宋体]胶体金法则主要应用于免疫分析、生物传感器等领域。由于胶体金法操作简便、灵敏度高、[/font][font=宋体]特异性好等特点，被广泛应用于临床诊断、生物制品质量控制等方面。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]③优缺点区别：[/font][/b][font=宋体]免疫层析法和胶体金法在优缺点方面也存在差异。[/font][font=宋体]免疫层析法的优点在于其高特异性、高灵敏度、高重复性等特点，能够快速准确地检测出样品中的目标物质。但是免疫层析法的操作较为繁琐，需要经过多个步骤才能完成检测，而且成本较高。[/font][font=宋体]胶体金法的优点在于其操作简便、快速、无需特殊设备等特点，能够在短时间内完成大量样品的检测。但是胶体金法的缺点在于其灵敏度相对较低，对于低浓度目标物质的检测可能会出现假阳性或假阴性的情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总的来说，免疫层析法和胶体金法各有其优缺点，具体应用应根据实际情况选择。在某些情况下，可以将两种方法结合使用，以获得更好的检测效果。例如，在检测病毒抗原时，可以先使用免疫层析法进行初筛，然后再用胶体金法进行确认，以提高检测的准确性和特异性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，免疫层析法和胶体金法是两种常用的生物检测技术，它们在原理、应用和优缺点等方面存在显著差异。在实际应用中，应根据具体情况选择合适的方法，以达到最佳的检测效果。同时，随着技术的不断发展，相信这两种方法将会在未来的生物检测领域发挥更加重要的作用。[/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白层析纯化[/b][/url]详情：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

亲和层析过程中的注意事项1.上样亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常10cm左右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待非特异性洗脱。2.洗脱亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。（1）特异性洗脱特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。（2）非特异性洗脱非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。当待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。当待分离物质和配体结合较强时，可以通过选择适当的pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力，具体的条件需要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度一次快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。但选择洗脱液的pH、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质丧失活性。对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。

薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。　　吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。　　物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。　　例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

本厂生产下列科研用硅胶系列产品，如有需求，敬请联系。（1）柱层层析硅胶【40～400目，粒度均匀、下料匀速通畅、阻力小、分离效果好、规格等级齐全，厂家直销，价格优惠】（2）薄层层析硅胶和高效薄层层析硅胶【H、G、GF254、HF254】（3）活化硅胶【30～60目，气体鉴定剂的载体，或用于分离提纯有机混合物中活性有效成分。是一种高纯、高活性硅胶】（4）啤酒硅胶【具有适宜的孔容、孔径和比表面积，易于吸附除去啤酒中的混浊的蛋白质和混浊的多酚聚合体，起到除杂质去异味的作用，提高啤酒的品质，延长啤酒的保质期和贮存期，有效地提高和保证成品啤酒的质量】（5）耐水硅胶【具有良好的耐水性、再生破碎率低和使用寿命长等优点】热诚欢迎广大用户咨询、订购，同时诚招各地代理商。

在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。 一、 吸附层析 1、 吸附柱层析 　　吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、 薄层层析 　　薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。 3、 聚酰胺薄膜层析 　　聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

[转帖]关于TLC和柱层析柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过 TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂 “走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。 上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。 接下来谈TLC，需要切记的是： 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。 第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷己烷苯乙醚THF乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇 使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleum ether/THF这类不常见的混合溶剂。 一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。 对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。当然，选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。 这里要特别强调的一点是：分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系。不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度对分离效果影响也很明显。我们实验室没有空调，我在实验过程发现，在夏天分离相同的产品，所需的淋洗剂极性要比在冬天小很多，这一点大家也是可以理解的。 鉴于此，使用的硅胶，不用时一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面，或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。 在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示： A X B C D 这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。 利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H NMR可鉴别的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。但是自己以前的样品，则可以只通过点板来判断纯度。 补充一下层析柱硅胶的用量一般是每分离1g产品使用30-100g硅胶柱子的形状比例一般是内径:高度=1:8~10 展开剂尽量使用能够分开的极性最低的溶剂还有，湿法装柱子的时候本人认为最好是先在底部装有石英砂的柱子中预加溶剂再按湿法加料这样能保证一开始加入的填料处于全湿状态,杜绝气泡刚装的柱子在一段时间内可能会有长度变短的现象所以可以给它一个稳定时间后再投入使用 作者：南开大学Asymmetrical

[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析，离子交换层析或者疏水层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签，第一步可以选择标签蛋白亲和层析；如果样品不带有标签，可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大，杂质较多，所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素，可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加 稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]

本厂生产下列科研用硅胶系列产品，如有需求，敬请联系。（1）柱层层析硅胶【40～400目，粒度均匀、下料匀速通畅、阻力小、分离效果好、规格等级齐全，厂家直销，价格优惠】（2）薄层层析硅胶和高效薄层层析硅胶【H、G、GF254、HF254】（3）啤酒硅胶【具有适宜的孔容、孔径和比表面积，易于吸附除去啤酒中的混浊的蛋白质和混浊的多酚聚合体，起到除杂质去异味的作用，提高啤酒的品质，延长啤酒的保质期和贮存期，有效地提高和保证成品啤酒的质量】（4）活化硅胶【30～60目，气体鉴定剂的载体，或用于分离提纯有机混合物中活性有效成分, 是一种高纯、高活性硅胶】（5）耐水硅胶【具有良好的耐水性、再生破碎率低和使用寿命长等优点】厂家:*安徽良臣硅源材料有限公司联系电话：0564－5033328、13505647362；传真：0564－5023598；联系人：赵震。E-mail：wxhsgy@hotmail.com, huangran@mail.hf.ah.cn网址：http://www.wxhsgy.com

转贴：柱层析浅谈极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统极性较大的用甲醇：氯仿系统极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 硅胶柱层析下面介绍惯用的方法：匀浆法。1。称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。2。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。3。装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。7。检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。8。送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化2.将柱子必须装平整、均匀3.考虑有限柱填料的吸附量4.可考虑用剃度法分开并洗脱关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。真空液相层析即vacuum liquid chromatography(VLC),即用真空代替压力进行层析，具体方法可见Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222-干法上样，一般用于固体或粘度大的液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解，加入1-3倍的粗硅胶，晾干或旋干，干燥的标准是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好的柱子上留一段溶剂，把吸附了样品的硅胶慢慢到进去，震动柱子或再加一些溶剂，把粘在柱壁上的硅胶洗下常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。柱子可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。

常用的层析分析方法coolautumn 　　在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。　　一、 吸附层析　　1、 吸附柱层析　　吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 　　2、 薄层层析　　薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。 　　3、 聚酰胺薄膜层析　　聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 　　二、 离子交换层析　　离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。` 　　三、 凝胶过滤　　凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 　　四、 亲和层析 　　亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物（S'）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E－S'）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰（见图6－2）。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。 　　上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 　　五、 聚焦层析　　聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为　多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。 　　聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 　　1、PH梯度溶液的形成　　在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室（这层析柱者）中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液（配方见表了一2）平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。 　　2．蛋白质的行为　　蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。 　　不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

（1）柱层层析硅胶【40～400目，粒度均匀、下料匀速通畅、阻力小、分离效果好、规格等级齐全，厂家直销，价格优惠】（2）高效薄层层析硅胶板【G、H、GF254、HF254平整光滑、荧光翆亮、无任何斑点、常用于照相】（3）硅胶制备板【0.5～1.5mm，板面光洁、牢固、载样量大、可替代小量级层析柱，H、G、GF254、HF254】（4）薄层层析硅胶和高效薄层层析硅胶【H、G、GF254、HF254】（5）微晶纤维素薄层层析板【特定有机物质的分析、分离、提纯，H、G、GF254、HF254】（6）活化硅胶【30～60目，气体鉴定剂的载体，或用于分离提纯有机混合物中活性有效成分。是一种高纯、高活性硅胶】厂家:*安徽良臣硅源材料有限公司联系电话：0564－5033328、3131877、3131977、13505647362；传真：0564－5023598；联系人：赵震。E-mail：wxhsgy@hotmail.com, huangran@mail.hf.ah.cn网址：http://www.wxhsgy.com

[转贴]凝胶层析法技术简介凝胶层析法技术凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。　　1. 凝胶的选择 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。　　2. 柱的直径与长度 根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。　　3. 凝胶柱的制备 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。　　凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。　　4. 加样和洗脱 凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。　　5. 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。　　如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。　　6. 凝胶层析的应用　　⑴ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。　　⑵ 用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。　　⑶ 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。⑷ 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

◆[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析 属于分配层析或吸附层析，仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体，如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20％。分析时操作温度范围，一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析分离的区带十分清晰，是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡，所需分析时间大为缩短，一般为数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果，因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析也能用于分离制备样品，但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。

有没有高手用过大孔树脂吸附层析法来净化样品的，我想尝试，却不知道具体的层析方法，请指点一二。非常感谢各位！