酮类化合物

维权声明：本文为xiaodu2007693原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。黄酮类化合物的分离体会 【黄酮类化合物简介】 黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方起着重要的作用。【本人研究内容】 我做的是某中药的化学成分研究，该中药中主要为黄酮类成分，遵循传统用药原则，我采取水煎煮，之后水提液浓缩至一定体积，过大孔吸附树脂，乙醇水梯度洗脱，梯度：水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇。每个梯度做为一个流分，再进行细分。下一步主要是运用聚酰胺柱色谱，中低压ODS，Sephadex LH20进一步分离，最后制备液相得到单体化合物。【经验分享】 主要和大家分享我使用聚酰胺柱的经验，我一般是聚酰胺薄膜结合聚酰胺柱，类似于硅胶板结合硅胶柱。所用的聚酰胺为30-60目，聚酰胺薄膜一盒50片，规格为8cm x 8cm，70块钱左右，可以根据需要剪成条状使用。聚酰胺薄膜常用的溶剂系统说明书上有，我常用甲醇-水，因为黄酮类化合物有一定的酸性，展开剂要加点酸，甲酸乙酸都可以，抑制其解离，保持游离状态的话，样品成点性好，否则拖尾很严重。在此需要指出的是，聚酰胺可以用反相溶剂系统，如甲醇水；也可以用正相溶剂系统，如二氯甲烷甲醇。要根据自己样品的极性来定。以我的80%乙醇洗脱物为例，进行详细的叙述。此部分极性较小。我用二氯甲烷溶解，拌样，挥干。洗脱系统为甲醇水，聚酰胺柱起始用水装柱，上样，上面要放一块棉花，然后用玻璃塞子压住（聚酰胺比较轻，防止加溶剂时冲起来），甲醇水梯度洗脱。之前点板显示，50%甲醇水刚刚展开一点，因此起始用50%甲醇水洗脱，然后梯度设为55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、最后甲醇冲柱。过程中每100mL一接，蒸干转移至小瓶。最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。【部分聚酰胺薄层谱图展示】http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/09/201009211940_245940_2160661_3.jpg http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/09/201009211940_245941_2160661_3.jpg左图：展开剂：（甲醇：水90：10）+2滴乙酸； 右图：展开剂：（甲醇：水80：10）+2滴乙酸，最右边的点为总样显色剂为：三氯化铁乙醇溶液【体会和教训】 黄酮类化合物用聚酰胺分离效果非常好，但是死吸附较严重，样品比较多时可以使用，少就算了。凝胶Sephadex LH20效果也非常好，建议多使用。黄酮类成分溶解性比较折磨人，但提醒一点在进行制备液相时，样品一定要用流动相溶解，或接近流动相，多加点总会溶解的，然后用0.45μm滤膜过滤。不用流动相溶解很容易把柱子弄裂分。原因在于，进样之后，样品析出，堵了柱塞板，导致局部流速过快，冲塌固定相。我就把老师的预柱整裂分了，多亏了预柱啊，保护了柱子，要不然老师肯定疯了，但是后来寄出去修预柱，别人检测又很神奇地自动好了，这有点解释不了，呵呵，这事也不是常能碰到的，最好按规矩来，否则耽误别人实验不太好。先就写这么多，实验也不是那么成功，但拿出来和大家交流，不对的地方请批评指正。【样品导致预柱裂分的后果-色谱图展示】http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/09/201009212004_245944_2160661_3.jpg http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/09/201009212007_245946_2160661_3.jpg左图为：样品制备时色谱图，当时已裂分右图为：预柱用纯品检测色谱图，连续进样2针，可见预柱裂分严重。

醛酮类化合物是城市大气中主要的污染物之一，具有慢性毒性，对人体产生重大危害。因此检测醛酮类化合物在大气、室内，车内以及其他场所的含量是十分重要的。 迪马科技针对醛酮类化合物检测做了一个专题，涵盖了DNPH采样管、液相色谱柱、标准品等色谱消耗品，欢迎大家积极选购。[color=#ff0000][b]一、原理[/b][/color] 一般情况下，挥发性有机物(VOCs)可以用GC-MS分析检测，但醛酮类化合物比较“另类”，更适合液相色谱检测。同时由于这些物质很容易挥发，可能造成结果的稳定性不好。 因此，需要提前对这些化合物进行衍生化处理，反应生成稳定的有颜色的腙类化合物，这样就可以让这些化合物安安静静地被液相色谱分离检测出来。[align=center][img=,640,285]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/03/201803231825124411_1442_1610895_3.jpg!w640x285.jpg[/img][/align][align=center]醛酮衍生化学反应原理图[/align][color=#ff0000][b]二、醛酮类样品采样管[/b][/color] 迪马科技根据HJ/T 400-2007、HJ 683-2014、HJ 759-2015、EPA Method TO-11A等标准方法，推出ProElut DNPH-Silica气体样品采集管，用于大气中醛酮类化合物检测。[color=#0000ff][b]特点：[/b][/color] 具有回收率高，方法重现性优异，产品稳定性好等特点。 本产品生产过程中，采用特殊的生产工艺，保证产品背景值低于行业标准，并且乙醛含量低于同行其他品牌产品。[table=351][tr][td][b]编号[/b][/td][td][b]产品描述[/b][/td][td][b]货号[/b][/td][/tr][tr][td]1[/td][td]ProElut DNPH-Silica 400mg 20/pk[/td][td]65913[/td][/tr][tr][td]2[/td][td]ProElut DNPH-Silica 400mg DAUL 20/pk[/td][td]65922[/td][/tr][tr][td]3[/td][td]ProElut DNPH-Silica 1000mg 20/pk[/td][td]65930[/td][/tr][tr][td]4[/td][td]ProElut KI (臭氧去除柱) 20/pk[/td][td]65931[/td][/tr][/table][align=center] [img=,200,201]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/03/201803231825319181_1130_1610895_3.jpg!w640x646.jpg[/img] [img=,200,200]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/03/201803231825494998_8078_1610895_3.jpg!w640x641.jpg[/img][/align][b]三、液相色谱柱[/b][color=#0000ff][b]【1】13种醛酮类化合物[/b][/color][b]1.1 HJ 683-2014标准实验方法[/b]色谱柱: Diamonsil C18 (2) 250x4.6mm, 5μm (Cat#:99603)流动相: 乙腈/水 梯度流 速: 1.0mL/min柱 温: 30℃检测器: 360nm进样量: 20μL[img=,503,232]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/03/201803231826167891_1843_1610895_3.jpg!w503x232.jpg[/img][b]1.2 迪马实验方法[/b]色谱柱: Platisil ODS 150x4.6mm, 5μm (Cat#：99501)流动相: A: 60%乙腈水 B: 水:乙腈:四氢呋喃=45:35:20 梯度流 速: 1.0mL/min柱 温: 30℃检测器: 360nm进样量: 20μL[img=,498,239]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/03/201803231826345581_3818_1610895_3.jpg!w498x239.jpg[/img][color=#0000ff][b]【2】15种醛酮类化合物[/b][/color]色谱柱: Diamonsil C18 (2) 250x4.6mm, 5μm (Cat#:99603)流动相: 甲醇/水 梯度流 速: 1.0mL/min柱 温: 35℃检测器: 360nm进样量: 20μL[img=,640,379]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/03/201803231826513691_9979_1610895_3.jpg!w640x379.jpg[/img][color=#ff0000][b]四、醛酮-DNPH标准品[/b][/color][color=#0000ff][b]【1】单标[/b][/color][table=477][tr][td][b]编号[/b][/td][td][b]产品描述[/b][/td][td][b]CAS[/b][/td][td][b]货号[/b][/td][/tr][tr][td]1[/td][td]甲醛-DNPH 100μg/mL溶于乙腈, 1mL[/td][td]1081-15-8[/td][td]47124[/td][/tr][tr][td]2[/td][td]乙醛-DNPH 100μg/mL溶于乙腈, 1mL[/td][td]1019-57-4[/td][td]47125[/td][/tr][tr][td]3[/td][td]丙烯醛-DNPH 100μg/mL溶于乙腈, 1mL[/td][td]888-54-0[/td][td]47126[/td][/tr][tr][td]4[/td][td]丙酮-DNPH 100μg/mL溶于乙腈, 1mL[/td][td]1567-89-1[/td][td]47127[/td][/tr][tr][td]5[/td][td]丁酮-DNPH 100μg/mL溶于乙腈, 1mL[/td][td]958-60-1[/td][td]47128[/td][/tr][tr][td]6[/td][td]异戊醛-DNPH 100μg/mL溶于乙腈, 1mL[/td][td]2556-01-1[/td][td]47129[/td][/tr][tr][td]7[/td][td]2,5-二甲基苯甲醛-DNPH 100μg/mL溶于乙腈, 1mL[/td][td]152477-96-8[/td][td]47130[/td][/tr][/table][color=#0000ff][b]【2】混标[/b][/color][b]2.1 15种醛酮-DNPH混标[/b]适用于EPA 8315方法，100μg/mL 溶于乙腈中，1mL/安瓿，Cat. No.: 47028[table=556][tr][td][b]序号[/b][/td][td][b]中文名称[/b][/td][td][b]英文名称[/b][/td][td][b]CAS[/b][/td][/tr][tr][td]1[/td][td]乙醛-DNPH[/td][td]Acetaldehyde-DNPH[/td][td]1019-57-4[/td][/tr][tr][td]2[/td][td]丙酮-DNPH[/td][td]Acetone-DNPH[/td][td]1567-89-1[/td][/tr][tr][td]3[/td][td]丙烯醛-DNPH[/td][td]Acrolein-DNPH[/td][td]888-54-0[/td][/tr][tr][td]4[/td][td]苯甲醛-DNPH[/td][td]Benzaldehyde-DNPH[/td][td]1157-84-2 [/td][/tr][tr][td]5[/td][td]正丁醛-DNPH[/td][td]Butanal-DNPH[/td][td]1527-98-6[/td][/tr][tr][td]6[/td][td]丁烯醛-DNPH（巴豆醛-DNPH）[/td][td]Crotonaldehyde-DNPH[/td][td]1527-96-4[/td][/tr][tr][td]7[/td][td]2,5-二甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]2,5-Dimethylbenzaldehyde-DNPH[/td][td]152477-96-8[/td][/tr][tr][td]8[/td][td]甲醛-DNPH[/td][td]Formaldehyde-DNPH [/td][td]1081-15-8[/td][/tr][tr][td]9[/td][td]己醛-DNPH[/td][td]Hexanal-DNPH[/td][td]1527-97-5[/td][/tr][tr][td]10[/td][td]异戊醛-DNPH[/td][td]Isovaleraldehyde-DNPH[/td][td]2256-01-1[/td][/tr][tr][td]11[/td][td]戊醛-DNPH[/td][td]Valeraldehyde-DNPH[/td][td]2057-84-3[/td][/tr][tr][td]12[/td][td]丙醛-DNPH[/td][td]Propionaldehyde-DNPH[/td][td]725-00-8[/td][/tr][tr][td]13[/td][td]间甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]m-Tolualdehyde-DNPH[/td][td]2880-05-9 [/td][/tr][tr][td]14[/td][td]邻甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]o-Tolualdehyde-DNPH[/td][td]1773-44-0[/td][/tr][tr][td]15[/td][td]对甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]p-Tolualdehyde-DNPH[/td][td]2571-00-8[/td][/tr][/table][b]2.2 13种醛酮-DNPH混标[/b]适用于HJ 683-2014 空气 醛、酮类化合物的测定 高效液相色谱法、HJ 759-2015 环境空气 挥发性有机物的测定罐采样 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]-质谱法，100μg/mL 溶于乙腈中，1mL/安瓿，Cat. No.: 47029[table=517][tr][td][b]序号[/b][/td][td][b]中文名称[/b][/td][td][b]英文名称[/b][/td][td][b]CAS[/b][/td][/tr][tr][td]1[/td][td]甲醛-DNPH[/td][td]Formaldehyde-DNPH [/td][td]1081-15-8[/td][/tr][tr][td]2[/td][td]乙醛-DNPH[/td][td]Acetaldehyde-DNPH[/td][td]1019-57-4[/td][/tr][tr][td]3[/td][td]丙酮-DNPH[/td][td]Acetone-DNPH[/td][td]1567-89-1[/td][/tr][tr][td]4[/td][td]丙醛-DNPH[/td][td]Propionaldehyde-DNPH[/td][td]725-00-8[/td][/tr][tr][td]5[/td][td]丁烯醛-DNPH（巴豆醛-DNPH）[/td][td]Crotonaldehyde-DNPH[/td][td]1527-96-4[/td][/tr][tr][td]6[/td][td]丁酮-DNPH[/td][td]Butanone-DNPH[/td][td]958-60-1[/td][/tr][tr][td]7[/td][td]正丁醛-DNPH[/td][td]Butanal-DNPH[/td][td]1527-98-6[/td][/tr][tr][td]8[/td][td]甲基丙烯醛-DNPH[/td][td]Methacrolein-DNPH[/td][td]5077-73-6[/td][/tr][tr][td]9[/td][td]苯甲醛-DNPH[/td][td]Benzaldehyde-DNPH[/td][td]1157-84-2 [/td][/tr][tr][td]10[/td][td]戊醛-DNPH[/td][td]Valeraldehyde-DNPH[/td][td]2057-84-3[/td][/tr][tr][td]11[/td][td]间甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]m-Tolualdehyde-DNPH[/td][td]2880-05-9 [/td][/tr][tr][td]12[/td][td]己醛-DNPH[/td][td]Hexanal-DNPH[/td][td]1527-97-5[/td][/tr][tr][td]13[/td][td]丙烯醛-DNPH[/td][td]Acrolein-DNPH[/td][td]888-54-0[/td][/tr][/table][b]2.3 16种醛酮-DNPH混标[/b]适用于HJ/T 400-2007 车内挥发性有机物和醛酮类物质采样测定方法，100μg/mL 溶于乙腈中，1mL/安瓿，Cat. No.: 47030[table=517][tr][td][b]序号[/b][/td][td][b]中文名称[/b][/td][td][b]英文名称[/b][/td][td][b]CAS[/b][/td][/tr][tr][td]1[/td][td]甲醛-DNPH[/td][td]Formaldehyde-DNPH [/td][td]1081-15-8[/td][/tr][tr][td]2[/td][td]乙醛-DNPH[/td][td]Acetaldehyde-DNPH[/td][td]1019-57-4[/td][/tr][tr][td]3[/td][td]丙酮-DNPH[/td][td]Acetone-DNPH[/td][td]1567-89-1[/td][/tr][tr][td]4[/td][td]丙醛-DNPH[/td][td]Propionaldehyde-DNPH[/td][td]725-00-8[/td][/tr][tr][td]5[/td][td]丁烯醛-DNPH（巴豆醛-DNPH）[/td][td]Crotonaldehyde-DNPH[/td][td]1527-96-4[/td][/tr][tr][td]6[/td][td]丁酮-DNPH[/td][td]Butanone-DNPH[/td][td]958-60-1[/td][/tr][tr][td]7[/td][td]正丁醛-DNPH[/td][td]Butanal-DNPH[/td][td]1527-98-6[/td][/tr][tr][td]8[/td][td]甲基丙烯醛-DNPH[/td][td]Methacrolein-DNPH[/td][td]5077-73-6[/td][/tr][tr][td]9[/td][td]苯甲醛-DNPH[/td][td]Benzaldehyde-DNPH[/td][td]1157-84-2 [/td][/tr][tr][td]10[/td][td]戊醛-DNPH[/td][td]Valeraldehyde-DNPH[/td][td]2057-84-3[/td][/tr][tr][td]11[/td][td]邻甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]o-Tolualdehyde-DNPH[/td][td]1773-44-0[/td][/tr][tr][td]12[/td][td]间甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]m-Tolualdehyde-DNPH[/td][td]2880-05-9 [/td][/tr][tr][td]13[/td][td]对甲基苯甲醛-DNPH[/td][td]p-Tolualdehyde-DNPH[/td][td]2571-00-8[/td][/tr][tr][td]14[/td][td]环己酮-DNPH[/td][td]Cyclohexanone-DNPH[/td][td]1589-62-4[/td][/tr][tr][td]15[/td][td]己醛-DNPH[/td][td]Hexanal-DNPH[/td][td]1527-97-5[/td][/tr][tr][td]16[/td][td]丙烯醛-DNPH[/td][td]Acrolein-DNPH[/td][td]888-54-0[/td][/tr][/table]

[align=center][b][/b][/align][align=center][b][/b][/align][align=center][b]液相色谱泵及色谱柱对丹参酮类化合物分离度影响[/b][/align]1. [b]色谱条件与系统适用性试验[/b] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.02% 磷酸溶液为流动相B ，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为20°C 检测波长为270 nm。理论板数按丹参酮II A峰计算应不低于60000。表1 梯度洗脱程序表[img=,598,240]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041605406100_5206_2613952_3.jpg!w598x240.jpg[/img]2. [b]对照品溶液的制备[/b] 取丹参酮II A对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成25.2 μg/mL溶液，即得。3. [b]供试品溶液的制备 [/b] 取本品粉末（过三号筛）约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率140W，频率42kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。4. [b]测定法 [/b] 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL, 注入液相色谱仪测定。以丹参酮IIA对照品为参照, 以其相应的峰为S 峰，计算隐丹参酮、丹参酮I的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的± 5 %范围之内。相对保留时间及校正因子见下表：表2 药典丹参酮类化合物相对保留时间及校正因子[align=left][img=,523,200]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041606235938_8876_2613952_3.png!w523x200.jpg[/img][/align]5. [b]结果与讨论[/b]5.1 二元高压泵色谱峰定位 依次将隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA对照品溶液在配置有二元高压泵的液相色谱仪上机分析，在依据保留时间对隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA进行色谱峰定位。隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA色谱图及保留时间见下图。[img=,690,308]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041641467848_7200_2613952_3.jpg!w690x308.jpg[/img] 图1 丹参酮I色谱图[img=,690,308]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041642177002_7482_2613952_3.jpg!w690x308.jpg[/img] 图2 隐丹参酮色谱图[img=,690,308]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041642305674_9673_2613952_3.jpg!w690x308.jpg[/img] 图3 丹参酮IIA色谱图5.2 四元泵色谱峰定位 依次将隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA对照品溶液在配置有四元泵的液相色谱仪上机分析，在依据保留时间对隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA进行色谱峰定位。隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA色谱图及保留时间见下图。[img=,690,219]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041646050499_4164_2613952_3.png!w690x219.jpg[/img] 图4 四元泵隐丹参酮色谱图[img=,690,232]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041646211305_4912_2613952_3.png!w690x232.jpg[/img] 图5 四元泵丹参酮I色谱图[img=,690,220]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041646454301_6774_2613952_3.png!w690x220.jpg[/img] 图6 四元泵丹参酮IIA色谱图5.3不同色谱柱对丹参酮类化合物分离度影响（二元高压泵） 在配置有二元高压泵的液相色谱仪上，分别以XDB C18、SB C18色谱柱分析同一丹参药材供试品溶液，色谱图见图7、图8。[img=,690,308]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041647134017_3086_2613952_3.jpg!w690x308.jpg[/img] 图7 XDB C18色谱柱药材色谱图[img=,690,307]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041647453361_5976_2613952_3.jpg!w690x307.jpg[/img] 图8 SB C18色谱柱丹参药材色谱图5.4 不同泵对丹参酮类化合物分离度影响 分别在在配置有二元高压泵、四元泵的液相色谱仪上，SB C18色谱柱分析同一丹参药材供试品溶液，色谱图见图9、图10。[align=left][img=,690,307]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041649350009_4280_2613952_3.jpg!w690x307.jpg[/img][/align][align=left] 图9 SB C18色谱柱丹参药材色谱图（二元高压泵）[/align][align=left][img=,690,220]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907041650042149_4182_2613952_3.png!w690x220.jpg[/img][/align][align=left] 图10 SB C18色谱柱丹参药材色谱图（四元泵）[/align][b]6 讨论[/b]6.1 丹参中丹参酮类化合物含量测定时不同色谱柱、不同类型的泵对隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA分离度影响较大。6.2 丹参酮类化合物在同一厂家二元泵的分离度优于四元泵，二元泵仪器上隐丹参酮、丹参酮I分开，隐丹参酮、丹参酮I在四元泵仪器采集色谱图上是一个对称性良好的一个色谱峰，未见分开趋势。6.3 不同类型的C18色谱柱对于丹参酮类化合物分离度也有影响，本实验中二元泵仪器上XDB色谱柱分离丹参酮类化合物效果优于SB色谱柱。 综上，建议测定丹参中丹参酮类化合物时选择合适的仪器、色谱柱，丹参酮类化合物才能更好分离，进而准确定位及含量计算。

[font=&][size=16px]方法依据为《空气与废气监测分析方法》第四版 增补版—2,4-DNPH吸附管吸附高效液相色谱法 P679。该方法为C类方法，采样介质为2,4-DNPH管，前处理方法为溶剂洗脱，溶剂为乙腈。[/size][/font][size=18px] [/size][size=16px]除去采样管两端密封帽，将采样管出口端连接到一支干净的10mL注射器，采样管另一端连接一支干净容量瓶中。在注射器内加入5mL乙腈淋洗，乙腈定容到10mL。[/size][size=18px] [/size][size=16px]1. 样品密封性[/size]样品溶剂洗脱前，需查看样品的密封情况，无密封措施的样品编号须记录在案，处理数据时如有异常可采取措施。2. 乙腈用量标准用量为5mL，后定容10mL。实际应用中可直接定量加入5mL乙腈洗脱，取1-2mL洗脱液用针式过滤器过滤到进样瓶中。忽略后续定容过程。当样品量较大时，可使用固相萃取装置搭建高通量前处理装置，见附图1。将2,4-DNPH采样管插入SPE柱接口，取5mL注射器，拔出推杆，套接上2,4-DNPH采样管。用聚四氟乙烯导管连接SPE柱接口下方，导管末端放入收集管中。以5mL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]向5mL注射器中定量加入5mL乙腈，依靠重力自动洗脱样品。每批可处理12个样品，基本第12个样品乙腈加完，第1个样品已洗脱完毕。[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/09/202009171621558237_9434_3191395_3.jpg[/img][size=18px] [/size][size=16px]1. 一般样品管中硅胶涂渍的2,4-DNPH试剂为过量，在色谱图上可见一过量2,4-DNPH的色谱峰，其峰高与醛酮类化合物浓度成反比。如果该色谱峰消失，则需考虑该样品管是否有穿透的可能。[/size]2. 每批DNPH管均需验证其空白背景情况，与厂家提供的出厂报告对比，不合格时立即退回。3. 醛酮类的DNPH衍生产物均在360nm有强吸收，故14种醛酮类DNPH的紫外吸收光谱十分类似。因此定性过程中，保留时间更为重要。4. 14种醛酮类标准品均为DNPH衍生物，定量时必须将每种化合物的折算系数考量在内。折算系数=，如乙醛分子量44，乙醛-DNPH分子量224，折算系数为0.196.5. 14种醛酮类有证标准品浓度仅为2μg/mL，不适合测试高浓度工业废气。在测试工业废气时可能会出现需要多次稀释样品的情况。因此，根据在醛酮类化合物中的分析频次，测试较多的为乙醛、丁酮、丙醛和丙烯醛，实验室均备有单标，可考虑配制单标或自行混合混标制作标准曲线，提高效率。

本实验分别提取两年生、三年生无腺毛甘草主根、侧根、水平根及茎中的黄酮，并测定其含量，初步找出消长规律。以甲醇为提取溶剂，索氏提取法提取黄酮，分光光度法测定总黄酮含量。结果表明两年生无腺毛中主根、侧根、水平根及茎中的黄酮含量分别为1.28%、1.28%、1.56%、0.73%；三年生无腺毛中主根、侧根、水平根及茎中的黄酮含量分别为1.75%、1.46%、1.81%、0.41%。随着年限的增大，无腺毛甘草中根部的黄酮含量逐渐增大。同龄期无腺毛甘草中黄酮含量：水平根最高，主根和侧根次之，茎最小。 无腺毛甘草 黄酮 含量测定 消长规律1.前 言无腺毛甘草（Glycyrrhiza eglandulosa X.Y.Li）是石河子大学李学禹教授在新疆发现、1993年命名的新种，也是我国的特有种。它生长的环境条件比乌拉尔甘草（G. uralensis）更恶劣，因而更加耐干旱、耐盐碱，而且是很适合于低产地、弃耕地等恶劣环境条件下生长的抗逆性极强的甘草物种。这个种在形态分类系统学、细胞学、生态学都有研究，根据细胞染色体组型分析与形态数值分析，都证实它与乌拉尔甘草、光果甘草亲缘关系较近，但在化学成分方面未进行系统研究。根据资料报导，产于新疆的胀果甘草(G.inflata)、黄甘草(G.eurycarpa)及云南的云南甘草(G.yunnanensis)都发现过大量的具有生理活性的新的化学成分。由此可知：一个形态性状特异、分布于逆境条件下能正常生长的新物种，肯定具有抗逆性较强的基因所决定的代谢产物，肯定有特殊性。为此，我们拟从应用开发的角度，提取无腺毛甘草中黄酮类化合物，对其进行含量测定，并进一步研究其在不同龄期、不同部位黄酮类化合物的消长规律，为进一步研究其化学组成和结构打下基础，并且为退耕还草大面积栽培无腺毛甘草提供科学依据。2.实验部分2.1实验仪器、样品与试剂2.1.1实验仪器：紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司），索氏提取器（自治区化玻站提供），烘干箱（湖北省黄石医疗器材厂），电光分析天平（上海棱光技术有限公司），精密PH计(上海雷磁仪器厂)。2.1.2实验样品：两年生、三年生的无腺毛甘草（石河子大学甘草栽培基地李学禹教授提供）。2.1.3实验试剂：柚皮苷对照品（中国药品生物制品检定所），10%的氢氧化钾溶液，甲醇(AR)。2.2黄酮类化合物的提取分别称取3份两年生无腺毛甘草的主根粉碎后放入索氏提取器中，加入甲醇回流2h,冷却后分别将回流液转移至容量瓶中，提取两次，提取液合并，用甲醇定容。用同样的方法分别提取两年生无腺毛甘草的水平根、侧根和茎以及三年生无腺毛甘草中主根、侧根、水平根、茎中的黄酮。2.3黄酮类化合物的含量测定2.3.1对照品溶液的制备准确称取柚皮苷对照品适量，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，制得浓度约为1.0mg.mL-1的对照品溶液。2.3.2最大吸收峰的确定精确吸取柚皮苷对照品溶液0.5ml，加入5ml甲醇，再加入10%KOH溶液2.5ml，室温放置5min，用甲醇稀释至50ml[

[align=center]从黄芩中提取黄酮类化合物的工艺研究[/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]食品事业部：李灿[/align][b]摘要：[/b]探讨超声波辅助法提取黄芩中总黄酮的最佳提取条件及对提取物的抗氧化性活性研究，这为黄芩作为天然抗氧化剂和功能性食品的开发利用提供理论基础和实验依据。[b][/b] 通过设计正交试验，采用超声波辅助法提取黄芩中总黄酮的最佳工艺条件条件，并通过对羟自由基、超氧自由基和DPPH自由基的清除效果研究其抗氧化活性。[b][/b]超声波辅助提取黄芩中总黄酮的最佳条件为：乙醇浓度为50%，时间为25min，料液比为1∶10，温度为30℃，黄芩总黄酮的提取率为3.25%。并且研究了黄芩提取物中的黄酮类物质对O[sub]2[/sub]-• 、• OH和DPPH自由基的抗氧化性能。研究结果表明洋葱提取物中黄酮类物质的抗氧化性较VC强。在浓度为0.0125mg/ml下，对羟基自由基的清除率为88.30%，对超氧基自由基的清除率为90.01%，对DPPH自由基的清除率为93.87%。[b]关键词[/b]：黄芩；超声波提取；总黄酮；抗氧化活性 [align=center][b] Study on extraction technology of flavonoids from Scutellaria[/b][/align][align=center]Li Can[/align][align=center] (Department of Chemistry and Chemical Engineering, Xi′an University of [/align][align=center]Arts and Science, Xi′an 710065)[/align][b]Abstract: [/b]To investigate the ultrasonic assisted extraction optimum extraction conditions of total flavonoids from Scutellaria and to extract antioxidant activity, which is a skullcap as a natural antioxidant and functional food development and utilization of theoretical and experimental evidence provided . [b][/b] Through orthogonal experiment, the optimum conditions using ultrasonic assisted extraction conditions of total flavonoids from Scutellaria, and to study its antioxidant activity by hydroxyl radicals, superoxide radicals and DPPH radical scavenging effect. Optimal conditions . [b] [/b]Ultrasonic assisted extraction of total flavonoids from Scutellaria: ethanol concentration of 50%, the time is 25min, solid-liquid ratio of 1:10, the temperature is 30 ℃, extraction of total flavonoids was 3.25%. And studied the extract of Scutellaria flavonoids on O2-• , • OH and DPPH radical antioxidant properties. The results show that the onion extract antioxidant flavonoids than VC strong. At a concentration of under 0.0125mg/ml, hydroxyl radical scavenging rate of 88.30% for super-group was 90.01% scavenging of DPPH radical scavenging rate was 93.87%.[b][color=#2b2b2b]Key Words[/color][/b][color=#2b2b2b]:[/color][color=#2b2b2b] [/color][color=#2b2b2b]Skullcap [/color][color=#2b2b2b]U[/color][color=#2b2b2b]ltrasonic extraction [/color][color=#2b2b2b]T[/color][color=#2b2b2b]otal flavonoids [/color][color=#2b2b2b]A[/color][color=#2b2b2b]ntioxidant activity[/color][b]1 前言[/b]黄岑主要生长在陕西秦岭，为常用中草药之一，性寒，味苦。具有清热燥湿，泻火解毒，止血安胎[sup][/sup]等功效，它的主要成分为黄酮类化合物[sup][/sup]，黄酮类化合物主要存在于双子叶及裸子植物的叶、果、实、根、皮中，在植物中主要与糖结合成苷的形式存在[sup][/sup]。目前从黄酮类物质有很多种，黄酮类化合物的结构特点是具有 C[sub]6[/sub]- C[sub]3[/sub]- C[sub]6[/sub]的基本骨架，根据中间三碳链的氧化程度、B 环( 苯基) 连接位置( 2-或3-位) 以及三碳链是否呈环状等特点，主要有黄酮醇，二氢黄酮，二氢黄酮醇，黄烷，黄烷醇，异黄酮等，被广泛应用在医药、功能食品添加剂、兽药和农药等领域。在医药方面，根据其在心血管系统、内分泌系统、抗肿瘤方面的药理作用，很多以黄酮类成分为主的制剂已作为成药上市[sup][/sup]。在食品中它们应用于功能性食品添加剂，如天然甜味剂、天然抗氧化剂、天然色素等；应用于功能食品，如生物类黄酮口香糖、银杏叶袋泡茶等防衰、抗癌、提高免疫力食品；在兽药、农药等领域，现已开发出些具有特效功能的含有黄酮类化合物药品和驱虫、杀虫剂等[sup][/sup]。目前国内侧重于对黄酮类化合物的研究，但他们常被当作残渣而扔掉，因而就造成了黄芩的浪费，没有使黄芩得到充分利用，本文主要针对黄芩总黄酮的提取方法及其抗氧化能力测定方法进行研究，以期为黄芩黄酮类成分的进一步开发利用从黄岑中提取黄酮类化合物的方法有很多种，传统提取方法有煎煮法[sup][/sup]、有机溶剂提取法[sup][/sup]、浸渍法、渗漉法、回流提取法[sup][/sup]、水提法等，新的提取方法有超声波提取法、微波提取法、索氏提取法、超临界萃取法、大孔树脂吸附法、酶解法提取[sup][/sup]。黄芩黄酮的提取主要为溶剂萃取法，包括无机溶剂萃取法和有机溶剂萃取法。其主要原理是利用黄芩黄酮能溶于碱水或甲醇等有机溶剂的特性来提取黄芩中的黄酮[sup][/sup]，考虑到该法提取时间长，提取率较低的缺点，我们采用超声波辅助提取法。因为超声波提取法是一种新型方法，它具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点，在低温下可以强化水浸提效率，达到省时高效节能的目的，而且是目前广泛使用的方法。超声提取的主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用。当大能量的超声波作用于介质时，介质被撕裂成许多小空穴，这些小空穴瞬时闭合，并产生高达几千个大气压的瞬间压力，即空化现象。超声空化中微小气泡的爆裂会产生极大的压力，使植物细胞壁及整个生物体的破裂在瞬间完成，缩短了破碎时间，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率。因此本实验拟决定用超声波提取法来提取黄酮类化合物。黄酮类化合物的测定方法也多种多样，目前有薄层扫描法、紫外分光光度法、液相色谱法等[sup][/sup]。但是以上方法测定黄芩提取液中总黄酮的含量都比较繁琐，非黄酮类物质干扰比较大。由于Al[sup]3+[/sup]仅与黄酮类物质有特征反应,使用这种显色方法可以使黄酮类化合物溶液在510nm左右出现吸收峰，采用紫外分光光度法测定黄芩提取液中总黄酮含量,方法简单快速[sup][/sup]。对于黄酮类化合物的抗氧化性研究，国内外所做研究也比较多。方法可分为体外抗氧化与体内抗氧化，其中体外抗氧化运用较为广泛，体外抗氧化还可分为直接清除活性氧自由基、抑制油脂过氧化反应[sup][/sup]等；体内抗氧化是用受试物连续喂饲大鼠或小鼠1个月～3个月，然后处死动物，测定其血或组织（如肝、脑）中各物质的含量，同对照组进行比较，间接地说明受试物的抗氧化活性。采用体外抗氧化性研究，常用到的自由基有OH[sup] [/sup]，O[sub]2[/sub][sup]-[/sup]， DPPH等，由于直接清除活性自由基的方法易行且效果直观，本次实验采用该种方法。本实验将从两个方面研究黄芩黄酮类化合物。第一部分为黄芩总黄酮最佳提取方法的研究。本环节采取超声辅助提取法，采用料液比（A），乙醇浓度(B), 超声时间（C），超声温度（D）作为研究因素，采用四因素三水平，选择L[sub]9[/sub]（3[sup]4[/sup]）设计正交试验。用芦丁做标准曲线测定黄芩提取液中总黄酮的含量。第二部分为总黄酮类化合物抗氧化性的研究，采用对OH，O[sub]2[/sub][sup]-[/sup]自由基和DPPH自由基的清除作用研究其抗氧化性。[b]2 实验部分2.1 材料与仪器2.1.1 材料和试剂[/b] 黄芩（购于西安同仁堂大药房），芦丁（分析纯，上海试剂药品厂），亚硝酸钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），硝酸铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），氢氧化钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），邻苯三酚（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），盐酸（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司），双氧水（天津市天力化学试剂有限公司），硫酸亚铁（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），水杨酸（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司），无水乙醇（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司），三羟基甲基氨基甲烷（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），邻二氮菲（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），DPPH（购于阿拉丁试剂）。[b]2.1.2 仪器[/b] 高速粉碎机（FW80型，北京中兴伟业仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（722N，上海精密科学仪器有限公司） 电子天平（YP202W，上海精密科学仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司）；超声波清洗机（11—1404，宁波新芝生物科技股份有限公司）；智能型恒温鼓风干燥箱（CMD-20X型，上海琅轩试验设备有限公司）；玻璃仪器气流烘干器（TH48SYBQ-1型，北京中兴伟业仪器有限公司）。[b]2.2实验方法2.2.1黄芩样品的制备[/b] 将黄芩在烘箱中60℃干燥8h，干燥后的黄芩用粉碎机粉碎成粉末，用分样筛（40目）筛分黄芩粉末，保证粉末均匀一致，密封保存，待用。[b]2.2.2 总黄酮的测定方法2.2.2.1 芦丁标准曲线的绘制[/b] 准确称取干燥至恒重的芦丁4.0mg 于小烧杯中，用50%乙醇溶解，并定容于25ml的容量瓶，摇匀，得浓度0.16mg/ml的标准液。准确吸取标准应用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 于6 个10ml容量瓶中，与上述容量瓶中分别加入5% NaNO[sub]2[/sub]0.3ml，摇匀，放置6min后，分别加入10% Al(NO[sub]3[/sub])[sub]3[/sub] 溶液0.3ml，摇匀，放置6min后，再分别加入4% NaOH 溶液4ml，加50%乙醇定容至10ml，摇匀，以试剂空白为参比，放置10～15min，用紫外可见分光光度计进行全波长扫描，在最大吸收波长510nm处测定吸光度，得到吸光度Y与芦丁浓度X(mg/ml)间标准曲线回归方程。[b]2.2.2.2 提取液总黄酮含量的测定 [/b]准确称取1.00g黄芩粉末，在不同的提取条件下提取黄芩总黄酮，提取液用乙醇稀释定容至50ml。准确吸取提取液1.0ml于25ml容量瓶，按上述方法显色后测定吸光度，代入标准曲线回归方程中可以得到黄芩中黄酮类物质的含量（mg/ml），从而计算出黄芩中黄酮类物质的提取率，即：黄芩中黄酮类物质的提取率= ×100%[b]2.2.3 单因素试验[/b] 主要研究料液比、乙醇浓度、超声波时间、超声波温度4个因素，在保持其他因素相同的条件下分别进行单因素试验，研究各因素对黄芩总黄酮提取效果的影响，筛选最佳的提取条件。 准确称取黄芩粉末，在不同的条件下进行超声提取，提取液冷却后用乙醇定容，按照2.2.2的测定方法，计算黄芩中总黄酮的含量。[b]2.2.4 正交试验[/b]在单因素试验基础上，选择料液比、乙醇浓度、超声时间、超声温度4因素，设计L[sub]9[/sub]（3[sup]4[/sup]）正交试验，以总黄酮的含量为评价指标，确定黄芩总黄酮超声辅助法的最佳提取工艺。[b]2.2.5 总黄酮体外抗氧化性的研究2.2.5.1 对羟自由基清除作用的研究[sup][/sup][/b]原理：通过反应所产生的羟基自由基可将Fe[sup]2+[/sup]氧化为Fe[sup]3+[/sup], Fe[sup]2+[/sup]和邻二氮菲反应可产生有色络合物,向有色沉淀加入抗氧化剂后,其反应效果会相对减弱。羟基自由基对二价铁离子的氧化作用,会导致吸光值不断变化,从而评价样液消除羟基自由基的能力。步骤:取0.75 mmoL/L邻二氮菲溶液1 mL,加入不同浓度的样液，再加0.75 mmoL/L硫酸亚铁1 mL混匀,加0.75mmol/l的过氧化氢1 mL,于37 ℃ 水浴下，水浴60 min后，在536 nm处测其吸光度,所得吸光度A[sub]b[/sub]。 反应方程式：H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub] + Fe[sup]2+[/sup]=OH[sup]-[/sup] +OH + Fe[sup]3+ [/sup]清除率S(%)=「Ax- A[sub]b[/sub]]/[As- A[sub]b[/sub]] ×100% 其中 A[sub]b[/sub]：标准体系的吸光度 Ax：不含黄芩提取液的吸光度As：不含过氧化氢的标准体系吸光度本底吸光度[b]2.2.5.2 对超氧自由基清除作用的研究 [sup][/sup][/b] 原理：在碱性条件下，邻苯三酚能迅速发生自氧化反应，生成超氧阴离子自由和有色中间产物，且邻苯三酚自氧化速率与生成超氧阴离子自由基的浓度呈正相关，该有色中间产物在300nm处有一特征吸收峰。当加入抗氧化剂能催化超氧阴离子自由基与H[sup]+[/sup]结合生成O[sub]2[/sub]和H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub] ,从而阻止了中间有色产物积累，溶液在320nm 处的吸收减弱。因此可通过测定添加试样前后吸光度[i]A[/i]的变化来表示抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除效果。步骤：取0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（pH =8.2）4.5mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入0.1mL试样和0.4mL2.5mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应4min，加入8mol/L HCl溶液两滴终止反应，于波长299nm处测定吸光度As，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品,并计算清除率。 清除率计算公式： S(%)=[(1-(As-A[sub]0[/sub] )/A[sub]b[/sub]]×100%其中 A[sub]b[/sub]：不含黄芩提取物的标准体系吸光度 As：标准体系的吸光度值 Ao：不含邻苯三酚的标准体系吸光度[b]2.2.5.3 对DPPH自由基清除作用的研究[sup][/sup] [/b]原理：DPPH 在有机溶液中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，当 DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对，溶液颜色变浅，可由此来检测自由基的清楚状况，从而评价物质的抗氧化能力。步骤：将样品储备液适当稀释得到不同浓度的黄芩黄酮溶液。 向一系列 10 mL比色管中加入 3.5 mL 1.0×10[sup]-4[/sup]mol/L 的 DPPH 溶液和 0.5 mL 样品液，摇匀避光反应30 min，与波长517 nm下测定吸光度 A s。空白对照组以无水乙醇代替样品，并计算清除率。清除率计算公式： 清除率S(%)=[(1-(As-A[sub]0[/sub] )/A[sub]b[/sub]]×100% 其中 A[sub]b[/sub]：不含黄芩提取物的标准体系吸光度 A[sub]s[/sub]：标准体系的吸光度值 A[sub]0[/sub]：不含DPPH的标准体系吸光度[b]3. 结果与分析 3.1 芦丁标准曲线[/b]由图可得，芦丁在0.02—0.10mg/ml浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系，R[sup]2[/sup]= 0.9998。回归方程为Y= 11.47X+ 0.0554 [align=center]表1 芦丁浓度与吸光度的关系[/align][table][tr][td][align=center]序号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]芦丁浓度/(mg/ml)[/align][/td][td][align=center]0.02[/align][/td][td][align=center]0.04[/align][/td][td][align=center]0.06[/align][/td][td][align=center]0.08[/align][/td][td][align=center]0.10[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]吸光度（A）[/align][/td][td][align=center]0.288[/align][/td][td][align=center]0.514[/align][/td][td][align=center]0.736[/align][/td][td][align=center]0.976[/align][/td][td][align=center]1.204[/align][/td][/tr][/table][align=center] [/align][align=center] [/align][align=center] [/align][align=center][img=,463,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807091813421003_7187_2904018_3.png!w463x249.jpg[/img] [/align][align=center]图1 芦丁标准曲[/align]Fig.1 Standard curve of rutin[b]3.2 总黄酮提取条件的优化3.2.1 料液比对黄酮类化合物提取效果的影响[/b]在料液比为1:6，1:8，1:10，1:12，1:14时，50%乙醇作为提取剂，超声波时间为20min，超声波温度为60℃，冷却后采用超声波提取法提取黄芩中黄酮类化合物含量，研究料液比对提取效果的影响。[align=center]表2 料液比与提取率的关系[/align][align=center][img=,394,250]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807091815178933_5515_2904018_3.png!w394x250.jpg[/img][/align][align=center] 图2 料液比对黄芩黄酮提取的影响[/align][align=center]Fig.2 Solid-liquid ratio on the extraction of flavonoids from Scutellaria impact[/align]由图2可见，随着料液比的增加，黄酮类化合物的提取率也逐渐升高，当料液比为1:10时，黄酮类化合物的提取率达到最高值，继续增加料液比，提取率会有一定的降低。在一定范围内料液比的增加有利于物料中黄酮类物质的溶出，但料液比过大的时候，会导致溶液浓度太小，从而影响到黄酮类物质对超声波能的吸收，导致黄酮得率下降。因此选定料液比在1:10的条件下进行实验。[b]3.2.2 乙醇浓度对黄酮类化合物提取效果的影响[/b]当乙醇浓度为30%，40%，50%，60%，70%时作为提取剂，超声波时间为20min，超声波温度为60℃，料液比为1:10的条件下，冷却后采用超声波提取法提取液中总黄酮含量，研究料液比对提取效果的影响。结果如图2所示[align=center]表3 乙醇浓度与提取率的关系[/align][table][tr][td][align=center]序号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]乙醇浓度（%）[/align][/td][td][align=center]30[/align][/td][td][align=center]40[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]60[/align][/td][td][align=center]70[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]提取率（%）[/align][/td][td][align=center]2.08[/align][/td][td][align=center]2.44[/align][/td][td][align=center]3.18[/align][/td][td][align=center]2.15[/align][/td][td][align=center]1.28[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,457,289]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807091815413326_3128_2904018_3.png!w457x289.jpg[/img][/align]图3 乙醇浓度对黄芩总黄酮提取的影响[align=center] Fig.3 The effect of ethanol concentration on the extraction of flavonoids from Scutellaria[/align]由图3可见，随着乙醇浓度的增加，黄酮类化合物的提取率逐渐升高，在乙醇浓度为50%时提取率最高，再增加乙醇浓度，提取率逐渐降低。这主要是随着乙醇浓度的增加导致溶液极性的改变，使提取液中杂质含量增加，因此选择50%的乙醇溶液作为提取剂。[b]3.2.3 超声波时间对黄酮类化合物提取效果的影响[/b]当超声波时间为5min，10min，15min，20min，25min，料液比为1:10，乙醇浓度为50%，超声波温度为60℃的条件下，冷却后采用超声波提取法提取液中总黄酮含量，研究料液比对提取效果的影响。[align=center]表4 超声波时间与提取率的关系[/align][table][tr][td][align=center]序号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]超声波时间（min）[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]15[/align][/td][td][align=center]20[/align][/td][td][align=center]25[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]提取率（%）[/align][/td][td][align=center]1.67[/align][/td][td][align=center]1.82[/align][/td][td][align=center]1.93[/align][/td][td][align=center]2.19[/align][/td][td][align=center]2.08[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,420,258]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807091815572952_9256_2904018_3.png!w420x258.jpg[/img][/align]图4 超声时间对黄芩总黄酮提取的影响[align=center]Fig.4 Ultrasonic time of total flavonoids extracted[/align]由图4可见，随着超声波时间的延长，黄酮类化合物提取率逐渐升高，在20min时提取率最高，继续延长超声波提取时间提取率几乎不变，主要是因为在初期，黄芩中黄酮类化合物没有完全浸提到溶剂中，而随着时间的增加，黄酮类化合物逐渐完全溶于提取剂中，因此提取率几乎不变。所以选择超声波时间为20min时进行实验。[b]3.2.4 超声波温度对黄酮类化合物提取效果的影响[/b]当超声波温度为20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，料液比为1:10，乙醇浓度为50%，超声波时间为20min的条件下，冷却后采用超声波提取法提取液中总黄酮含，研究料液比对提取效果的影响。[align=center]表5 超声波温度与提取率的关系[/align][table][tr][td][align=center]序号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]超声波温度（℃）[/align][/td][td][align=center]20[/align][/td][td][align=center]30[/align][/td][td][align=center]40[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][td][align=center]60[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]提取率（%）[/align][/td][td][align=center]1.87[/align][/td][td][align=center]2.34[/align][/td][td][align=center]2.44[/align][/td][td][align=center]2.25[/align][/td][td][align=center]2.31[color=#ff0000] [/color][/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,360,256]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807091816171242_5784_2904018_3.png!w360x256.jpg[/img][/align][align=center] [/align][align=center] [/align]图5 超声温度对黄芩黄酮提取的影响[align=center]Fig.5 Skullcap ultrasonic extraction temperature on impact[/align] 由图5可见，随着超声波温度的升高，黄酮类化合物提取率逐渐升高，在40℃时提取率最高，继续升高超声波提取温度，提取率反而略有下降。高温提取的过程是先使物料升温,保持一定时间后,利用温度使细胞壁破碎，乙醇溶剂溶入细胞内部，黄酮充分溶解，再继续升高温度，反而使更多的杂质释放出来，导致黄酮提取率不再上升。所以选择超声波温度为40℃进行实验。[b]3.3 正交试验确定最佳工艺3.3.1 正交试验结果[/b]通过上述单因素试验，得出各个单因素的最佳条件，其中料液比为1:10，乙醇浓度为50%，超声时间为20min，超声温度为40℃。选择料液比、乙醇浓度、超声波时间、超声波温度4因素3水平，设计L[sub]9[/sub]（3[sup]4[/sup]）正交试验，因素与水平见表1，试验结果见表2为了进一步判断上述4类因素对试验结果的影响是否存在，将以正交试验数据进行方差分析，找出这些因素中起主导作用的来源。表1 正交试验因素及水平表Tab 1 Factors and levels of the orthogonal tests[table][tr][td=1,2]水平[/td][td] 因素[/td][/tr][tr][td]A B C D料液比(g/ml) 乙醇浓度（%） 超声时间(s) 超声温度（℃）[/td][/tr][tr][td=2,1]1 1:8 40 15 302 1:10 50 20 403 1:12 60 25 50[/td][/tr][/table]表2 正交试验结果及分析 Tab 2 The results and analysis of orthogonal tests [table][tr][td=1,2]试验号[/td][td] 因素[/td][td=1,2]提取量（%）[/td][/tr][tr][td]A B C D料液比(g/ml) 乙醇浓度（%） 超声时间(s) 超声温度（℃）[/td][/tr][tr][td=3,1]1 1:8 40 15 30 2.622 1:8 50 20 40 2.903 1:8 60 25 50 2.764 1:10 50 25 30 3.255 1:10 60 15 40 2.626 1:10 40 20 50 2.507 1:12 60 20 30 2.408 1:12 40 25 40 2.589 1:12 50 15 50 2.85K[sub]1[/sub]/3 2.76 2.57 2.70 2.76K[sub]2[/sub]/3 2.79 3.00 2.60 2.70K[sub]3[/sub]/3 2.61 2.59 2.86 2.70R 0.18 0.43 0.26 0.06[/td][/tr][/table]由表1、2可知，主次因素由极差大小确定：B＞C＞A＞D，即影响黄芩总黄酮提取效率的因素贡献率为乙醇浓度＞超声时间＞料液比＞超声温度。以总黄酮含量为评价指标，得最佳提取工艺条件为A[sub]2[/sub]B[sub]2[/sub]C[sub]3[/sub] D[sub]1[/sub]，即乙醇浓度为50%、超声时间为25min、料液比为1∶10、超声温度为30℃。最佳条件为正交表中的第四组，因此测抗氧化性实验选择此组数据。[b]3.4 总黄酮的抗氧化性3.4.1 对羟自由基的清除作用[/b][align=center]表6 提取液浓度对羟基自由基清除率[/align][table][tr][td][align=center]序号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]提取液浓度/(mg/ml)[/align][/td][td][align=center]0.0025[/align][/td][td][align=center]0.0050[/align][/td][td][align=center]0.0075[/align][/td][td][align=center]0.0100[/align][/td][td][align=center]0.0125[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]VC清除率（%）[/align][/td][td][align=center]20.54[/align][/td][td][align=center]42.88[/align][/td][td][align=center]59.39[/align][/td][td][align=center]74.44[/align][/td][td][align=center]79.09[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]黄酮清除率（%）[/align][/td][td][align=center]40.39[/align][/td][td][align=center]67.21[/align][/td][td][align=center]78.42[/align][/td][td][align=center]85.29[/align][/td][td][align=center]88.30[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,360,256]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807091816376703_5430_2904018_3.png!w360x256.jpg[/img][/align]图6 黄芩总黄酮对羟自由基的清除Fig.6 Scutellaria Flavonoids on Scavenging of Hydroxyl Radicals黄芩总黄酮对羟自由基的清除作用，结果见图6。由图6可知，黄芩总黄酮对羟基自由基具有一定的清除作用。在相同的浓度范围下，清除能力大小为：提取物VC溶液。在0.0025—0.0125mg/ml浓度下，各溶液的清除能力都随浓度的增大而增大。当提取液浓度为0.0125mg/ml下，黄芩提取液的清除率达到了88.30%。3.4.2 [b]对超氧自由基的清除作用[/b][align=center]表7 提取液浓度对超氧基自由基清除率[/align][table][tr][td][align=center]序号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]提取液浓度/(mg/ml)[/align][/td][td][align=center]0.0025[/align][/td][td][align=center]0.0050[/align][/td][td][align=center]0.0075[/align][/td][td][align=center]0.0100[/align][/td][td][align=center]0.0125[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]VC清除率（%）[/align][/td][td][align=center]26.77[/align][/td][td][align=center]43.09[/align][/td][td][align=center]61.73[/align][/td][td][align=center]78.69[/align][/td][td][align=center]80.20[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]黄酮清除率（%）[/align][/td][td][align=center]49.81[/align][/td][td][align=center]75.29[/align][/td][td][align=center]84.38[/align][/td][td][align=center]89.21[/align][/td][td][align=center]90.01[/align][/td][/tr][/table]黄芩总黄酮对超氧自由基的清除作用，结果见图7。由图7可知，黄芩总黄酮对邻苯三酚自氧化产生的超氧自由基有一定的清除作用，其清除率随浓度的增大而增大。在相同的浓度范围下，清除能力大小为：提取物VC溶液。各溶液的清除能力都随浓度的增大而增大。当提取液浓度为0.0125mg/ml下，黄芩提取液的清除率达到了90.01%。3.4.3 [b]对DPPH自由基的清除作用[/b][align=center]表8 提取液浓度对DPPH自由基清除率[/align][table][tr][td][align=center]序号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]提取液浓度/(mg/ml)[/align][/td][td][align=center]0.0025[/align][/td][td][align=center]0.0050[/align][/td][td][align=center]0.0075[/align][/td][td][align=center]0.0100[/align][/td][td][align=center]0.0125[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Vc清除率（%）[/align][/td][td][align=center]27.36[/align][/td][td][align=center]52.41[/align][/td][td][align=center]79.98[/align][/td][td][align=center]80.49[/align][/td][td][align=center]81.31[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]黄酮清除率（%）[/align][/td][td][align=center]55.7[/align][/td][td][align=center]82.3[/align][/td][td][align=center]89.78[/align][/td][td][align=center]93.74[/align][/td][td][align=center]93.81[/align][/td][/tr][/table][b] [/b]黄芩总黄酮对DPPH的清除作用，结果见图8。由图8可知，黄芩总黄酮对DPPH有一定的清除作用，其清除率随浓度的增大而增大。相同的浓度范围下，清除能力大小为：提取物VC溶液。各溶液的清除能力都随浓度的增大而增大。当提取液浓度为0.0125mg/ml下，黄芩提取液的清除率达到了93.81%。[b]4.总结[/b]1.通过单因素实验，得出各个单因素的最佳条件，其中料液比为1:10，乙醇浓度为50%，超声时间为20min，超声温度为40℃，为正交试验奠定了基础。然后用设计正交试验，确定了超声辅助法提取黄芩总黄酮的最佳工艺条件：乙醇浓度为50%、超声时间为25min、料液比为1∶10、超声温度为30℃。黄芩总黄酮的提取率为3.25%。2.本实验分别就黄芩提取物对羟基自由基，超氧阴离子自由基和DPPH自由基的抗氧化性进行了测定，并与VC进行了对比实验，得到如下结论：在0.0025—0.0125mg/ml浓度下，提取物对各自由基清除能力为：DPPH O[sub]2[/sub][sup]-[/sup]• • OH ，同浓度黄芩提取物清除能力普遍高于VC溶液，黄芩黄酮提取液和VC溶液对自由基清除率随其浓度的增大而增大。在浓度为0.0125mg/ml下，对羟基自由基的清除率为88.30%，对超氧基自由基的清除率为90.01%，对DPPH自由基的清除率为93.87%，由此可知黄芩总黄酮是一种天然有效的自由基清除剂。黄芩中黄酮类化合物的利用已经有一定的规模，但黄芩中黄酮化合物的提取方法和工艺尚未成熟，所以充分利用黄芩资源是我国药用研究的科学发展方向。基于提取率、成本等因素的影响，通过对各种因素的比较分析，从而探索开发出适合工业化生产应用的方案，提高黄芩利用率，仍是研究工作的重点之一。随着人们对健康的日渐重视，因黄芩中的黄酮化合物有着极高的药用营养及良好的保健作用，具有极为广阔的市场前景[b]。[/b]本文旨在研究黄芩中黄酮类物质的提取工艺及其体外抗氧化活性，为黄芩中黄酮类化合物作为天然抗氧化剂和功能性药品得到开发利用提供理论基础和实验依据。[align=center][b] [/b][/align] 刘雄，高建德.黄芩研究进展.甘肃中医学院，2007,24（2）：46-50. 罗小文.黄芩中黄酮类成分提取工艺研究进展.中国现代中药.2010,12（7）：5-8. 张睿,徐雅琴,时阳.黄酮类化合物提取工艺研究.食品与机械.2003,15(1):21-22. 梁丹,张保东.黄酮类化合物提取和分离方法研究进展.周口师范学院学报,2007,24(5):87-89. 龙春，高志强，陈凤鸣，等.黄酮类化合物的结构-抗氧化活性研究进展.重庆文理学院学报.2006,5(2):13-15. 刘雄，高建德.黄岑研究进展.甘肃中医学院学报，2007,24（2）：46-50. 郭雪峰, 岳永德. 黄酮类化合物的提取-分离纯化和含量测定方法的研究进展. 安徽农业科学. 2007, 35(26): 8083- 8086.. 唐德智.黄酮类化合物的提取、分离、纯化研究进展.中药与天然产物,2009,21(12):101-104.. 张岩, 曹国杰, 张燕,等. 黄酮类化合物的提取以及检测方法的研究进展.天食品研究与开发,2008,29(1):154-157. 韩雅慧，陶宁萍.甘草黄酮提取及其抗氧化能力测定方法研究进展.山西农业科学，2010, 38(11):89- 93. 崔永明，余龙江，等. 甘草总黄酮的提取技术及其抑菌活性研究.中药材，2006, 29(8): 838-840. 孙墨珑, 宋湛谦, 方桂珍. 核桃楸总黄酮的提取工艺.东北林业大学学报, 2006, 34 (1) : 38 - 39. 徐清萍，钟桂，芳孟君. 抗氧化剂抗氧化方法研究进展.食品工程，2007,6(7):23-25. 安卓，贾昌喜.苦苣菜总黄酮提取、纯化工艺优化抗氧化活性研究.食品科学. 赵新淮.大黄醇提取物对三种自由基的清除能力的研究.东北农业大学学报.1998,29(3):284-288 杨立琛，李荣.花椒叶黄酮的微波提取及其成分分析.食品科学. CHI Ru-an，ZHOU Fang，HUANG Kun，ZHANG Yue-fei.Separation of baicalin form Scutellaria Baicalensis Georgi with polyamide.Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education.2008,15(1):606-611.

Introduction 黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A环和B环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。黄酮类小部分以游离态（苷元）的形式存在，多数与糖结合成苷。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方起着重要的作用。 本实验研究对象为某中药中一个黄酮类化合物的代谢，本次发表的为代谢产物某流分的定性分析，该流分含有3个代谢产物，我们用Ultimate XB-C18柱和国外某名牌色谱柱对该流分进行了定性分析比较。1.Chemical and reagents 甲醇(色谱纯，天津大茂)，水(哇哈哈纯净水，杭州)，三氟乙酸(TFA, Dikma, USA)，其它试剂均为分析纯。2.HPLC analysis of an unknown sample Waters 高效液相色谱系统，由Waters Model 600 controller液相色谱，Millennium 32 工作站，Model Delta 600 泵，以及Waters 996 DAD检测器组成。 色谱柱：Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm)和国外某品牌色谱柱(5μm, 4.6x250mm)(用column X表示，投入使用约半年) 流动相：A通道：甲醇，B通道：水(0.05%TFA)=(45:55, v/v)或A通道：甲醇，B通道：水(0.05%TFA)=(40:60, v/v) 流 速：0.6mL/min 柱 温：35℃ 检测波长：190-400nm扫描 进样量：20μL3.Sample preparation 因为涉及保密内容，此部分略去。4.Results and discussionhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105181521_294755_2160661_3.jpgFig.1 Chromatogram of sample solution analyzed by column Xhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105181522_294756_2160661_3.jpgFig.2 Chromatogram of sample solution analyzed by Ultimate XB-C18 columnhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105181523_294757_2160661_3.jpgFig.3 Chromatogram of sample solution analyzed by column X(Fig.1的局部放大图)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105181524_294758_2160661_3.jpgFig.4 Chromatogram of sample solution analyzed by Ultimate XB-C18 column(Fig.2的局部放大图)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105181525_294759_2160661_3.jpgFig.5 Chromatogram of sample solution analyzed by Ultimate XB-C18 column(流动相比例降低后) 从图1和图2比较结果可以看出，该样品共含有3种黄酮类成分，DAD检测器给出其最大紫外吸收~270nm，~310nm，从紫外吸收还可以看出，这3种成分结构相似，其保留时间也很近。我们可以看出Ultimate XB-C18柱表现出了更好的分离度，而且展现了更好的峰形。 图3和图4是图1和图2的局部放大图，可以观察到色谱峰的保留时间，图5是将流动相比例降低后用Ultimate XB-C18柱再次分析的结果，虽然没有完全达到基线分离，但结果也是不错的。 该实验只是对代谢产物某流分中的3种黄酮类化合物进行定性分析，没有进行其它条件的考察，比如流动相加不同的酸，加酸的量(pH)，以及在乙腈水系统下进行考察，这些将在后续实验中补充。5.Conclusions 我们通过一个简单的定性实验，即中药某成分代谢产物的分析，比较了2种色谱柱对该流分中3种黄酮类化合物分离能力的研究，结果显示Ultimate XB-C18柱丝毫不落下风，反而表现出了神勇的分离能力。在未来的实验中，Ultimate色谱柱会一直伴随该项目的研究，我们会有更加精彩的结果发表出来，供大家分析讨论。

CAPCELL CORE C18 S2.7色谱柱填充了核壳型（表面多孔型）填料，具有与Sub 2 μm全多孔型填料柱同等水平的色谱性能，且柱压与3 μm填料色谱柱的压力相当，因此，该款色谱柱适用于使用常规液相色谱仪器在高流速条件下进行的快速分析。　　本次，使用CAPCELLCORE C18 S2.7色谱柱对10种类黄酮类化合物进行快速分析。由于类黄酮类化合物具有相似的化学结构，若想得到充分的分离，通常需要延长分析时间。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/02/201702091019_01_2222981_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/02/201702091019_02_2222981_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/02/201702091019_03_2222981_3.png图1为将流速设定为常规流速的3倍（0.6 mL/min）时得到的结果。对于这10种具有配位性的类黄酮类化合物，可以在6分钟内完成分析，并能得到良好峰形。如需在梯度条件下提高分离度，可将梯度变缓，但这会使分析时间变长。为解决这一问题，同样使用CAPCELL CORE C18 S2.7色谱柱，对于流速与分离度的关系进行了探究。如图2，将流速由0.2 mL/min开始，每次提高0.1 mL/min，一直提高至0.6 mL/min，可以看到，峰2（甘草苷）与峰3（芦丁）的出峰顺序在流速为0.4 mL/min时发生了翻转，并且随着流速的提高，其分离度亦得到了进一步的改善。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/02/201702091019_04_2222981_3.png