细胞克隆

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

[size=16px]克隆形成实验[/size][size=16px]及划痕实验[/size][size=16px]、[/size][size=16px]流式细胞术[/size][size=16px]操作步骤[/size]软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力软琼脂克隆形成实验适用于悬浮生长的细胞。1. 配胶液：用蒸馏水和琼脂糖粉配制浓度为 0.3% 的琼脂糖液，高压灭菌，置于42℃ 水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。2. 配制含 20% FBS 的 2×1640 培养基，用 0.22 ?m 的滤器过滤除菌。3. 铺下层胶：将 0.6% 的琼脂糖胶液与 2×1640 培养基等体积混合，以每孔 1.5mL 加至 6 孔板中，室温等其凝固。4. 细胞计数：将细胞用 PBS 洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，计数。H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 均以 1×104/孔铺入 6 孔板。5. 铺上层胶：将 0.3% 的琼脂糖胶液与 2× 培养基 1：1 混合，加入 100 μL 细胞悬液，混匀后，每孔加入 1.5 mL 混合液。6. 放入 37℃，5%CO2 培养箱培养，约 2-3 周后终止培养。7. 比较细胞克隆形成能力的差异，利用 Graphpad prism5 作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。平板克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力平板克隆形成实验适用于贴壁生长的细胞。1. 细胞处理：将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞，用 PBS洗一遍，用胰酶消化并计数。2. 接种细胞： 将细胞接种于 6 孔板中， SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1 、SW1271-shMSI1-2 接种密度为 3×103/孔，注意一定让细胞均匀分布。于 37℃，隔离CO2 静置培养 2-3 周（终止培养时间以不小于 2 周且克隆之间不发生融合为标准）。3. 出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去旧培养基， 用 PBS 清洗 2 次，用 4% 多聚甲醛固定液固定 20 min，吸除固定液，用蒸馏水清洗 2 次后加适量结晶紫染色15-20 min，用蒸馏水洗去结晶紫，自然风干，用扫描仪扫描成图片。4. 在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。5. 计算克隆形成率。细胞划痕实验1. 用记号笔在 12 孔板底部划两条平行线做为标记。2. 将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞接种至 6 孔板。3. 待细胞汇合度为 90% 左右时，用 10μL 枪头垂直于两条平行标记线进行划痕。4. 吸除培养基，1xPBS 漂洗 2 次，并换用无血清培养基培养。5. 分别在划痕后培养 0h，12h，24h，48h，72h 观察细胞迁移情况并拍照。流式细胞术1. 收集 H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞)，收集 1 - 10 ×105 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5 ×Binding Buffer为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。2. 每管加入 5 μl Annexin V-APC 和 10 μl 7-AAD。3. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。4. 上机进行分析。

[size=4]人类体细胞克隆胚胎是福还是祸？！进行人类治疗性克隆研究，造福人类呢？还是制造克隆人的时代到来？福兮？祸兮？[/size]

显微镜下西达本胺抑制SCLC H446 细胞克隆 - 2

显微镜下西达本胺抑制SCLC H526 细胞克隆3)

显微镜下西达本胺抑制SCLC H69 细胞克隆

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。一、有限稀释法1．材料① 微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。② HT培养基2．操作方法① 取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。② 用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。③ 用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。④ 5％CO2饱和湿度，37℃培养。⑤ 每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。⑥ 克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。⑦ 抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。二、软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。5．DMEM中的细胞与DMEM―琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。8．用3ml琼脂糖―羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。三、显微镜操作法在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108 细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104 饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。四、荧光激活分离法用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。

[size=18px]流式细胞术[/size][size=18px]及平板克隆[/size][size=16px]（[/size][size=16px]1[/size][size=16px]）铺板[/size][size=16px] [/size][size=16px]取[/size][size=16px]对数生长期[/size][size=16px] H446[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]69[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]526[/size][size=16px]、[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MS114[/size][size=16px]细胞，[/size][size=16px]计数，分别接种等量细胞至[/size][size=16px]6[/size][size=16px]孔板，[/size][size=16px]“[/size][size=16px]十字形[/size][size=16px]”[/size][size=16px]晃动，使细胞分布均匀，[/size][size=16px]继续[/size][size=16px]培养。[/size][size=16px] [/size][size=16px]（[/size][size=16px]2[/size][size=16px]）药物处理[/size][size=16px] [/size][size=16px]待细胞融合率约[/size][size=16px]80%[/size][size=16px]，[/size][size=16px]加入[/size][size=16px]不同浓度（[/size][size=16px]0[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC20[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC50[/size][size=16px]）[/size][size=16px]西达本胺处理[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]。每组均设置[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MSO[/size][size=16px]对照组。继续培养[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]后采用[/size][size=16px]Annexin V-FITC /PI[/size][size=16px]双染法对细胞进行染色。[/size][size=16px]（[/size][size=16px]3[/size][size=16px]）准备：[/size][size=16px]冰[/size][size=16px]PBS[/size][size=16px]、流式细胞术专用试管、凋亡试剂盒（[/size][size=16px]10[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px] [/size][size=16px]Annexin V[/size][size=16px]结合缓冲液用[/size][size=16px]DD[/size][size=16px]水稀释[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]）[/size][size=16px]（[/size][size=16px]4[/size][size=16px]）对照组的设置：阴性对照（[/size][size=16px]未染色细胞[/size][size=16px]）、[/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px]（[/size][size=16px]无[/size][size=16px]PI[/size][size=16px]）单[/size][size=16px]染细胞[/size][size=16px]、[/size][size=16px]PI[/size][size=16px]单[/size][size=16px]染[/size][size=16px]（[/size][size=16px]不含[/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px]）细胞。[/size][size=16px]（[/size][size=16px]5[/size][size=16px]）染色：[/size][size=16px]a[/size][size=16px].[/size][size=16px]将细胞[/size][size=16px]用冷[/size][size=16px]PBS[/size][size=16px]洗涤[/size][size=16px]3[/size][size=16px]次，然后[/size][size=16px]重悬细胞[/size][size=16px]在[/size][size=16px]密[/size][size=16px]度为[/size][size=16px]1.5[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]10[/size][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][size=16px]/[/size][size=16px]mL[/size][size=16px]的[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]结合缓冲液中。[/size][size=16px]b[/size][size=16px].[/size][size=16px]将[/size][size=16px]100[/size][size=16px] 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roman'][size=16px]d[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在低倍镜[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]下[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数大于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]50[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]个细胞的克隆数。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]e.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计算克隆形成率。[/size][/font][size=16px]（[/size][size=16px]4[/size][size=16px]）[/size][size=16px]软琼脂[/size][size=16px]克隆形成实验[/size][font='times new roman'][size=16px]适用于悬浮生长的细胞以及繁殖较快的贴壁细胞。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]a[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]配胶液：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]用蒸馏水[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和琼脂糖粉配制浓度为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.6%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.3%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]琼脂糖液，高压灭菌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]置于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]42[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]b[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]配制含[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]20%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]FBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]双抗的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1640[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基，用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.22[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]m[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的滤器过滤除菌。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]c[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]铺下层胶：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]将[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.6%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的琼脂糖胶[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1640[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等体积[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]每孔[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]加[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板中，室温[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等其[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]凝固。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]d.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞计数：将细胞用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]69[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]/[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔铺入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]526[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]/[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔铺入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]e.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]铺上层胶：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]将[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.3%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的琼脂糖胶[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合，加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]100[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞悬液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混匀后，每孔加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]f.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]放入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5%CO[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养箱培养，约[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]周后[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]终止培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]g.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数比较对照组与实验组的细胞数量，计算克隆形成率。[/size][/font]

自从1996年世界上第一只体细胞克隆羊“多利”在英国诞生以来，克隆技术似乎变得越来越普及，各国很多科学家都掌握了这种技术，更有许多科学家雄心勃勃，朝着克隆动物产品产业化的目标进发。　　在中国，已经有数家科研机构有能力克隆动物，并让不少的克隆动物存活下来。中国科学院动物所首席研究员陈大元、2007年12月刚当选为中国工程院院士的中国农业大学李宁教授等，都已经成功培养出克隆牛，中国工程院院士、上海医学遗传研究所所长曾溢滔也在克隆牛和羊的工作上稳步前进。　　药物也好，牛排也好，克隆技术最终的目标，都是制造产品送进人的身体里，所以，“克隆离餐桌有多远”这个问题，永远吸引人们的关心。美国FDA认可了部分克隆动物食品的安全性以后，中国大众也开始讨论克隆食品能不能吃的问题。　　关于克隆食品的安全性，中国农业大学李宁教授介绍说，目前国内还没有相关的标准出台，有关部门领导碰面时会提及标准问题，但距离正式的探讨还有距离。“中国与美国的情况不同，美国的产业部门会向FDA提出制定克隆动物食品标准的要求。”李宁教授说，产业部门的呼吁已有五六年之久，FDA关于安全性的标准和认可姗姗来迟。为此，产业部门极为不满。他在国外参加学术会议时，常常听到国外专家的抱怨。但在国内，动物产品生产的各个环节分属不同部门管理，很难有部门主动“应战”。　　但李宁教授认为，目前中国克隆动物产品距离产业化还有“漫长的道路”，原因并不在于缺乏安全性审查的标准，因为安全性标准完全可以参照国外既有的标准。他认为，真正的距离在于技术。“个别的科研团体能够克隆，是不可能实现产业化的。”　　陈大元教授同样不够“乐观”。他自己带领的克隆牛研究，就还没有达到理想的“效率”。2002年陈大元的团队培养出第一批克隆牛，14头成功克隆的牛最后只存活下5头牛犊，第一头克隆牛在出生不久以后夭折。2003年在新疆成功的31头克隆牛，也只有12头存活。不久前，中科院一个研究小组培育的克隆牛，全部存活，这几乎是克隆实验中的“奇迹”，陈大元介绍说，这次“例外”的原因，科研人员正在研究当中。　　尽管有“例外”发生，克隆动物存活率低的问题，仍然是目前克隆技术产业化的瓶颈，如果没有新的方法解决，对产业化的期待，也许还为时尚早。不过，陈大元认为，最近日本和美国实现了“诱导多能干细胞”技术，如果尽快把这一技术应用到克隆中，那么产业化也许可以早点到来。“只要是健康存活下来的克隆动物，作为食物就跟传统动物没有两样，是安全的，问题在于我们的技术还没有能力批量地生产克隆动物产品。”陈大元说。　　“1980年初，外国哺乳动物克隆研究走得很快，中国科学界直到1990年才追上克隆技术的步伐。”陈大元说。不过，上世纪90年代以后，中国克隆技术的进步，立即进入加速度，兔、鼠、猪、牛、羊等等动物的克隆，都被中国的科学家实现。陈大元把这个时期形容为“登峰造极”。2000年以后，随着克隆技术的成熟，世界各地的科学家开始探索克隆产业化，中国的科研工作者也加入了实现产业化的努力当中。在很多国外研究者看来，中国人的智慧和勇气，常常能制造轰动性的成果，在克隆动物产品产业化的领域，中国的表现也值得期待。

[font='calibri'][size=13px]单克隆抗体的制备过程及原理是什么？[/size][/font][font='宋体'][size=13px]义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]针对定制单克隆抗体，义翘神州提供了一套全面的解决方案。我们将与您通力合作，完成从抗原设计、纯化和抗体验证的完整过程。义翘神州拥有包括杂交瘤、噬菌体抗体库和单B细胞在内的抗体发现平台， 我们可根据您感兴趣的靶点、抗体应用和时间表等，来选择最合适的技术平台。 此外，义翘神州还提供ELISA、WB、流式细胞术、IHC、基于细胞的筛选、亲和力检测等多种表征和筛选技术，确保最终鉴定到最佳的抗体，以满足研究、诊断和治疗领域等应用。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备原理：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体(MAb)是针专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，由G.K?hler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备过程：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。[/size][/font][font='宋体'][size=13px][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]推荐：https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/size][/font]

[font=宋体][b]单克隆抗体技术的基本原理[/b][/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody, mAb[/font][font=宋体]）是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体在生物医学研究、疾病诊断和某些疾病治疗（如传染病和癌症）中是十分重要的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的[b][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology]单克隆抗体制备技术[/url][/b]主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州拥有四大单克隆抗体开发平台，为客户提供多样化的抗体制备服务套餐，覆盖从抗原设计与制备、动物免疫到获得纯化抗体的完整流程，满足您的研究需求。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、杂交瘤技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体抗体库技术也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]三、单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]文章来源：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font]

我是门外汉了。前几天跟朋友聊天，说起乔布斯死于肝病。器官现在能从病患体内提取细胞并克隆生长吗？想想嘛，这个好像是可能的，现在不能的原因是什么呢？听听专家们的教诲！

[font=宋体][font=宋体]抗体具备与特定抗原结合的独特能力，在生物学、医学及生物医学研究中发挥着举足轻重的作用。[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体（[/b][/url][/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b][font=Calibri]MAbs[/font][font=宋体]）[/font][/b][/url][/font][font=宋体]和[/font][font=宋体][font=宋体]多克隆抗体（[/font][font=Calibri]PAbs[/font][font=宋体]）已成为免疫学研究、诊断及疫苗质量控制中不可或缺的工具。本文将[/font][/font][font=宋体]简单介绍[/font][font=宋体]这两种抗体生产[/font][font=宋体]的[/font][font=宋体]关键步骤及其优化策略。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、多克隆抗体的生产与应用[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]多克隆抗体的制备涉及抗原制备、动物选择、佐剂配置[/font][font=宋体]和[/font][font=宋体]注射方案等多个环节。在抗原制备时，应确保其质量与数量，以保证免疫反应的特异性。动物种类的选择则需考虑所需抗体量[/font][font=宋体]和[/font][font=宋体]血液样本获取的难易程度等因素。注射方案应根据动物种类和佐剂特性制定，并在注射后密切监测动物的反应，确保免疫过程的顺利进行。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]多克隆抗体因其制备周期短、成本相对较低，广泛应用于[/font][font=宋体]基础[/font][font=宋体][font=宋体]研究。然而，由于其来源于多种[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，特异性相对较低，因此在某些需要高度特异性的应用场景中，其应用受到一定限制。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、单克隆抗体的生产与应用[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体则是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的，具有高度特异性。[/font][/font][font=宋体]通过杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体的[/font][font=宋体][font=宋体]生产过程涉及[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的生成、与骨髓瘤细胞的融合、杂交瘤细胞的克隆与选择以及抗体的扩大生产等步骤。其中，[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的生成和通过腹水诱导法生产抗体是基于实验动物的关键[/font][/font][font=宋体]步骤[/font][font=宋体]。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]单克隆抗体因其高度的特异性和可重复性，广泛应用[/font][font=宋体]于[/font][font=宋体]基础研究、诊断[/font][font=宋体]检测[/font][font=宋体]和医疗领域。例如，在疾病诊断中，单克隆抗体可以精确地识别并定位病原体，为疾病的早期发现和治疗提供有力支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]为优化免疫反应，建议在抗原制备时[/font][font=宋体]确保[/font][font=宋体]其质量与纯度，注射前进行充分的质量控制。在选择动物种类时，应综合考虑抗体需求量、血液样本获取的难易程度以及抗原与动物间的系统发育关系。此外，佐剂的选择和制备也至关重要，需确保混合物的稳定性和质量，谨慎选择注射途径和注射量。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]多克隆抗体与单克隆抗体各具特色，分别适用于不同的研究场景。通过优化生产过程中的各个环节，我们可以提高抗体的质量和产量，为生物医学研究和临床应用提供更加精准、有效的工具。未来，随着技术的不断进步，这两种抗体将在更多领域展现其独特的价值。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]本篇文章由义翘神州进行整理，同时提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services]单克隆定制服务[/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services]多克隆抗体制备服务[/url]，详情可点击了解！[/b]参考文献：[/font][font='Segoe UI'][color=#212121]Leenaars M, Hendriksen CF. Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendations.[/color][/font][font='Segoe UI'][color=#212121] [/color][/font][i][font='Segoe UI'][color=#212121]ILAR J[/color][/font][/i][font='Segoe UI'][color=#212121]. 2005 46(3):269-279. doi:10.1093/ilar.46.3.269[/color][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（[/font][font=Calibri]hybridoma[/font][font=宋体]）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞杂交瘤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]年分子生物学家[/font][font=Calibri]G.J.F.[/font][font=宋体]克勒和[/font][font=Calibri]C.[/font][font=宋体]米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的优势和局限性[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．单克隆抗体的优点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如[/font][font=Calibri]IRMA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．单克隆抗体的局限性[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高 。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的应用[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．检验医学诊断试剂[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．蛋白质的提纯[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如[/font][font=Calibri]Speharose 2B[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]4B[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]6B[/font][font=宋体]等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]． 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]，有需求可查看详情[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology][b]单克隆抗体技术[/b][/url]详情：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology][b]单克隆抗体技术[/b][/url]的基本原理是利用单一的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆培养出具有高度一致性的抗体组织。通过将能产生特定抗体的单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓肿瘤细胞进行融合，生成一种既能产生所需抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞。这种技术所得到的抗体仅来自一种类型的细胞，这与多克隆抗体或由多种类型细胞产生的多株抗体形成了鲜明对比。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的单克隆抗体制备技术主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体技术流程[/b][/font][font=宋体]①杂交瘤技术制备单克隆抗体[/font][font=宋体]杂交瘤技术是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。（点击了解杂交瘤技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体抗体库技术[/b][/url]也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。（点击了解噬菌体抗体库技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]③单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。（点击了解单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[size=3]近日，记者在内蒙古自治区鄂托克旗召开的“转基因克隆绒山羊培育成果通报会”上获悉，不久前，位于鄂托克旗的“内蒙古白绒山羊种羊场”诞生了目前国际上规模最大的一批转基因克隆绒山羊，这标志着中国绒山羊现代生物育种技术又有了新的突破。 　　这项研究为国家转基因生物新品种培育重大专项课题，由内蒙古大学生命科学学院实验动物研究中心研究员刘东军带领的研究团队，在中国工程院院士旭日干的指导下取得的一项具有国际先进水平的科研成果。 　　此研究团队成功构建了对绒毛生长有促进作用的转胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因载体，利用该载体成功转染了绒山羊胎儿成纤维细胞，建立起转基因细胞系。再利用转基因细胞进行体细胞克隆，从而获得的转基因绒山羊。 　　2009年9月至10月，这个研究团队在位于鄂托克旗草原上的内蒙古白绒山羊种羊场开展绒山羊转基因克隆胚胎的生产和移植工作。今年2月至3月陆续获得羔羊17只，其中转基因克隆羔羊14只、体细胞克隆羔羊3只。 [/size]

来自中科院广州生物医药与健康研究院，浙江大学，深圳华大基因研究所等多处国内研究机构组成的研究组获得了诱导多能干细胞iPSCs研究的最新突破性机制：成功培养出了四头iPS克隆猪。这是首次在世界上获得成活的iPS克隆猪，有助于在大动物上应用iPS技术的发展。相关成果以letter的形式公布在Cell Research杂志上，目前论文免费。　　文章的通讯作者分别为广州生物医药与健康研究院赖良学研究员，浙江大学干细胞与转基因动物实验室肖磊教授，以及华大基因研究所杜玉涛研究员。　　去年诺贝尔生理/医学奖花落重编程培养研究领域，其中诱导多能干细胞研究尤为受人瞩目，这一技术具有和胚胎干细胞(ESC)类似的特征和功能，却极大程度避免了ESC研究和应用中面临的伦理和排斥等诸多障碍，因此给基于干细胞的个性化治疗和再生医学带来了光明的前景。　　2009年周琪和高绍荣等人首次利用iPS细胞克隆出活体实验小鼠，从而证实了iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性，是iPS研究领域的一大突破，由此也入选了《时代周刊

[font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是由单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、特异性针对某一抗原表位的抗体。通过使用杂交瘤技术，科学家们将具有分泌特异性抗体能力的致敏[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成了独特的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞杂交瘤。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]年分子生物学家[/font][font=Calibri]G.J.F.[/font][font=宋体]克勒和[/font][font=Calibri]C.[/font][font=宋体]米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体[/b][/url][b]的优势和局限性[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．单克隆抗体的优点[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如[/font][font=Calibri]IRMA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．单克隆抗体的局限性[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高 。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的应用[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]如今，单克隆抗体广泛应用于癌症治疗、医疗诊断和基础研究等方面。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①癌症治疗应用[/font][font=宋体][font=宋体]用于癌症治疗的单克隆抗体旨在结合癌症细胞表面的抗原，相比于健康细胞，这种抗原通常在癌细胞过表达。通过[/font][font=宋体]“瞄准”这些抗原，抗体可以锁定癌细胞，并在免疫系统中充当其他免疫战士的“战斗号令”。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]美国食品和药物管理局（[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]）已经批准了[/font][font=Calibri]100[/font][font=宋体]多种单克隆抗体用于治疗不同类型的癌症，包括乳腺癌、头颈癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、黑色素瘤以及霍奇金淋巴瘤等。有报道称，单克隆抗体首次用于晚期黑色素瘤，将部分患者的生存延长了[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]年之久。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②医疗诊断应用[/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体的出现，已经变革了多种疾病的实验室诊断。它们可作为生物化学分析的诊断试剂，也可作为疾病诊断影像的工具。基于单抗试剂的诊断检测一般可用于实验室中的放射免疫测定（[/font][font=Calibri]RIA[/font][font=宋体]）和酶联免疫吸附测定（[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]）。[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体已用于例如妊娠、激素紊乱、传染病和癌症等疾病的早期诊断。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③基础研究应用[/font][font=宋体][font=宋体]在基础研究中，研究人员可以使用单克隆抗体通过蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组化（[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]）、酶联免疫吸附测定（[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]）等多种方法来识别目标分子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-development][b]单克隆抗体开发[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-development[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology][b]单克隆抗体[/b][/url]是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（[/font][font=Calibri]hybridoma[/font][font=宋体]）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞杂交瘤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]年分子生物学家[/font][font=Calibri]G.J.F.[/font][font=宋体]克勒和[/font][font=Calibri]C.[/font][font=宋体]米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的优势和局限性[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．单克隆抗体的优点[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如[/font][font=Calibri]IRMA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．单克隆抗体的局限性[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的应用[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．检验医学诊断试剂[/font][/font][font=宋体]作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。[/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．蛋白质的提纯[/font][/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如[/font][font=Calibri]Speharose 2B[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]4B[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]6B[/font][font=宋体]等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]．肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术[/font][/font][font=宋体][font=宋体]将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供多种单克隆抗体、多克隆抗体、一抗、二抗、抗体蛋白等生物试剂、抗体试剂应用于细胞学、免疫蛋白质组化、[url=https://cn.sinobiological.com/services/molecular-biology-service][b]分子生物学技术服务[/b][/url][/font][font=宋体]……。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]本文主要介绍了单克隆抗体与多克隆抗体的定义，并介绍单抗、多抗在制备流程、特点及应用上的区别。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单抗与多抗的定义：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构叫做抗原决定簇，也称为抗原表位。一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇，因此，机体也可以产生多种不同的抗体。由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体（单抗）。而由多个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体（多抗）。从某种角度而言，多抗是多种单抗的混合物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单抗和多抗制备上的区别：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]经过特定抗原处理过的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞通过细胞融合的方法得到杂交瘤细胞，经[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测效价后就得到阳性克隆株，最后进行细胞培养或将细胞注入到动物（一般为[/font][font=Calibri]balb/c[/font][font=宋体]小鼠）腹腔中用腹水培养，收集上清[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]腹水纯化后就能得到单克隆抗体。而制备多克隆抗体就没有单克隆抗体繁琐，只需将抗原（纯度越高越好）直接注入到动物体内进行免疫，经过[/font][font=Calibri]3~4[/font][font=宋体]次免疫，[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]测其效价合格后，收集血液离心得到上清，纯化后即能得到多克隆抗体。因此多抗制备周期比单抗的短，多抗首次制备价格也比单抗要低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单抗多抗应用上的区别：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]单抗和多抗都有各自鲜明的特点与优势。单克隆抗体的特异性高，一旦制备成功就可以永续的生产完全一致的单克隆抗体，因此可以对其特异性进行全面、系统地验证。但如果所识别的抗原表位被破坏，实验的结果将会受到很大的影响，这也是单抗的缺点之一。而多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫检测时，更容易造成背景，例如在[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]中有杂带，在[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]中背景较深等等。虽然还存在着交叉反应[/font][font=Calibri]*[/font][font=宋体]的问题，但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多（[/font][font=Calibri]WB/IP/IF/ICC[/font][font=宋体]等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]，可以选择制备单克隆抗体。若对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测，可以选择制备多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。目前提供单克隆抗体定制服务和多克隆抗体定制服务。想了解更多关于单抗和多抗区别详情可以查看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=宋体]多克隆抗体定制服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体制备：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体[/b][/url]（[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]）源于单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，具有高度的均一性和特异性，仅针对某一特定抗原表位。在生物医学研究、疾病诊断以及某些疾病治疗（如传染病和癌症）中单克隆抗体发挥着至关重要的作用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前，制备单克隆抗体的主流技术包括[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]、[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体抗体库技术[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]单个[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]B[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]细胞技术[/b][/url]。杂交瘤技术通过融合免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞，筛选出能够特异性分泌抗体的杂交瘤细胞，进而生产并纯化得到单克隆抗体。噬菌体抗体库技术则利用基因工程技术，将抗体基因与噬菌体基因相连接，使抗体以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面，通过与靶蛋白的结合，筛选出具有特定亲和力的噬菌体展示抗体。而单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术则基于每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅产生一种特异性抗体的特性，直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因，从而获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]制备单克隆抗体的基本流程：[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）抗原制备[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一般来说，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重组蛋白）、多肽、小分子等。依据需求选择和制备合适的免疫原对于抗体开发至关重要。义翘神州在蛋白抗原、多肽抗原制备积累了丰富的经验，可提供专业的抗原制备服务。另外，义翘神州还成功制备出[/font][font=Calibri]6000[/font][font=宋体]多种重组蛋白产品，可作为抗原用于动物免疫和抗体筛选，欢迎订购。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫[/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常选用[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠作为免疫动物，根据抗原的特性制定免疫方案，包括免疫抗原纯度、抗原量、免疫方法和途径等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫方法一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等，免疫途径主要有皮下注射、腹腔注射和静脉注射。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常规免疫周期如下：第一次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏完全佐剂，皮下注射）、第二次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏不完全佐剂，皮下注射）、第三次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，皮下或静脉注射）、第四次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，静脉注射）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）细胞融合[/font][/font][font=宋体]细胞融合前准备：[/font][font=宋体][font=宋体]脾淋巴细胞制备：取已经免疫的[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠的脾脏，制备淋巴细胞，通常每只小鼠可得[/font][font=Calibri]1x10^8-2.5x10^8[/font][font=宋体]个脾细胞；同时摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞制备：骨髓瘤细胞应该和免疫动物属于同一品系，便于细胞融合以及产生大量[/font][font=Calibri]Ab[/font][font=宋体]。融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功得到杂交瘤非常重要。目的是使骨髓瘤细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前不能少于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]周；冻存的细胞在复苏后要生长[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]周才能处于适合于融合的状态。[/font][/font][font=宋体]饲养细胞：常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。饲养细胞促进杂交瘤细胞增殖的机制可能是释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合：细胞融合方法有病毒介导的细胞融合、聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]）介导细胞融合、电融合。[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合相邻骨髓瘤和[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]或抗体分泌细胞的质膜，形成具有两个或更多核的单细胞。异核体保留这些核，直到核膜在有丝分裂前溶解。电融合通过施加脉冲电场连接相邻细胞的膜。电融合比[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]更加有效，结果具有重现性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）杂交瘤筛选以及单克隆鉴定[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞和脾细胞融合之后，由于细胞融合是随机的，因此要利用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选杂交瘤细胞。骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]），对氨蝶呤钠敏感，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中不能生长；免疫脾细胞虽然有[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]，但不能在体外无限繁殖。因此只有融合的杂交瘤细胞，才能在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中无限繁殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]得到融合的杂交瘤细胞后，需要进一步筛选特异性抗体。将融合的细胞进行充分有限稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]至数个细胞之间（[/font][font=Calibri]30%[/font][font=宋体]的孔为[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清液用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法选出抗体高分泌性的细胞，这一过程常被称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹水培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备[/font][/font][font=宋体]利用杂交瘤细胞大规模制备单克隆抗体主要有两种方式：体外培养法和腹水制备法。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。单层细胞培养法是各个实验室最常用的，是将杂交瘤细胞加入培养瓶中，用完全培养基培养，细胞浓度以[/font][font=Calibri]1.0X10^6~2.0X10^6[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/mL[/font][font=宋体]为宜，然后收集培养上清液。如果想在体外高效率地大量制备单克隆抗体，就必须高密度培养杂交瘤细胞，充分利用培养基的立体空间。单位体积内细胞数量越多，产生的单克隆抗体就越多，浓度就越高，产量就越大。义翘神州提供杂交瘤体外培养抗体生产服务，成功率[/font][font=Calibri]99%[/font][font=宋体]，可采用低血清或无血清培养基进行高密度悬浮培养，生产规模从毫克级到克级不等，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]腹水制备法是通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，并产生腹水，可得到大量的腹水单抗。这种方式能够在相对短的时间内获得大量高浓度的抗体，而且成本低、操作相对简单以及不需要复杂的培养条件。然而，这种方法也有一些限制，比如腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括[/font][font=Calibri]Ig[/font][font=宋体]），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体][b]单克隆抗体技术的基本原理[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody, mAb[/font][font=宋体]）是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体在生物医学研究、疾病诊断和某些疾病治疗（如传染病和癌症）中是十分重要的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的单克隆抗体制备技术主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]单克隆抗体技术流程[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一、杂交瘤技术制备单克隆抗体[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体抗体库技术也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][b][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/beacon-b-cell-screening][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][/url][/b][font=宋体][b][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/beacon-b-cell-screening]细胞[/url][/b]两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多单克隆抗体技术详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font]

鉴于本人还是零蛋一个,特发此贴,虽然得分不是最主要目的,但零分确实很让人难受啊!单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术（一） 杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。（二） 基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。1、动物免疫(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

[align=center]抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[/align][align=center] [/align][align=center]摘　　要[/align][align=center] [/align]　通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。这类药物的特异性强，疗效显著。本文主要就近年来抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展进行了综述，并对抗肿瘤单克隆抗体药物的发展前景进行了展望。[align=left] [/align][align=left]关键词：抗肿瘤；单克隆抗体；研究进展[/align][align=center] [/align][align=center] [/align][b]一 引言[/b]抗肿瘤单抗药物因与烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物药等抗肿瘤药物相比,具有高效价、高特异性、血清交叉反应少等特点与优点,在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。单抗药物是当前生物技术药物领域甚为活跃的部分。针对特定的分子靶点(抗原),单抗有高度特异性。针对各种不同的抗原,可以制备为数众多的、各不相同的单抗；因此,作为药物来源,单抗又具有高度多样性。由于其特异性和多样性,研制单抗药物有巨大的潜力。单克隆抗体药物治疗恶性瘤主要机制有两种[sup][/sup]:一是利用单克隆抗体本身来阻断癌细胞生长的信号,单克隆抗体在癌细胞膜外与生长因子竞争结合受体,阻断信号传递过程,从而阻止癌细胞的生长和扩散,诱导细胞凋亡或者间接激活宿主的抗肿瘤免疫反应；二是利用单克隆抗体作为药物载体的靶向治疗,如将有细胞毒性的药物或有放射性的药物靶向性的运送到肿瘤细胞,从而杀伤肿瘤细胞。目前,国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞,利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。此外，研究表明静脉内注射抗肿瘤单抗,在肿瘤部位的浓度较高,显示特异性定位；单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征,在靶肿瘤的浓度较高[sup][/sup]。[align=center]二　　单克隆抗体药物作用靶点[/align]特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20分子作为靶点的人鼠嵌合抗体,对非霍奇金氏B细胞淋巴瘤有疗效,是第一个获美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤的单抗。Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的单抗,临床研究对乳腺癌有效,与化疗药物联合有更显著的疗效。Mylotarg是由抗CD33单抗与calicheamicin构成的偶联物,已获批准用于治疗急性复发性髓性白血病[sup][/sup]。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人的鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道,抗EGFr单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验,显示良好的抗癌效果。抗EGFr的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道,抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用,对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效[sup][/sup]。[b]三 单抗诱发肿瘤细胞凋亡[/b][align=left] 3.1 通过免疫细胞表面抗原的交联作用而诱导恶性肿瘤细胞的凋亡[/align]用于治疗血液系统恶性肿瘤的单克隆抗体药物大多是通过免疫细胞表面抗原的交联作用诱导恶性肿瘤细胞凋亡而起作用的,如目前用的抗-CD20的单克隆抗体——美罗华。其单克隆抗体的作用机制是通过诱导CD20分子在B细胞膜上的脂筏区聚集,再在一系列激酶的作用下使脂筏信号传导区域的CD20分子亲和性增强,从而形成CD20交联形式；交联的CD20分子启动了细胞内凋亡信号的传导通路,使线粒体释放出细胞色素C,激活下游的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[sup][/sup]。3.2 作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体而诱导细胞凋亡许多生长因子及其受体通过作用于细胞的存活途径、刺激细胞的有丝分裂、促进细胞的生长增殖来阻止细胞凋亡。与正常细胞中生长因子信号传导的严格调控相比,肿瘤细胞中的失控则导致细胞的恶性增殖,从而使恶性细胞获得“永生”。单克隆抗体通过作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体可阻断存活信号传导通路,从而导致其凋亡,同时还能对化疗和放疗有正协同作用。目前主要集中在对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、表皮生长因子受体(EGFR)等的研究。美国FDA于2006年批准了第一个用于治疗头颈部鳞状细胞癌的单克隆抗体药物——Cetuximab,它为一种IgG1单克隆抗体,主要通过干扰癌细胞表面EGFR的生长,从而减少癌细胞进入正常组织的概率,控制癌细胞的转移,达到抗癌目的[sup][/sup]。最初想到制备针对恶性肿瘤凋亡相关分子的单克隆抗体药物时,虽然从理论上来说无疑是给人们注入了一针兴奋剂,但在实际应用中则并不然,所以在通过单克隆抗体药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡的研究和治疗中,还有待进一步开发新的、更经济、更有效地药物。[b]四　 单克隆抗体耦联物[/b]4.1 抗体与化疗药物耦联目前,国内外研究较多的与单克隆抗体耦联的化学药物有平阳霉素、柔红霉素、丝裂霉素、多柔比星(阿霉素)、顺铂以及长春碱类衍生物等。同时还可以通过脂质体靶向制剂作为化疗药靶向治疗肿瘤,利用脂质体制剂将药物导向靶标进行有选择性地杀伤癌细胞和抑制癌细胞的繁殖,以达到提高疗效和高度定向作用。目前已上市的脂质体有复方氟脲嘧多相脂质体、喜树碱多相脂质体、阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体等。4.2 抗体导向酶耦联利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合,将前体药物的专一性活化酶与单抗耦联,导向输入到靶细胞部分,再注入前体药物,使其在酶的作用下转化为活性药物,进而杀伤肿瘤细胞[sup][/sup]。目前这种用作前体药物的抗癌药有苦杏仁苷、氮芥、鬼臼乙叉苷、阿霉素、丝裂霉素等。而作为活化前体药物的导向酶有碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酶肽、胸腺嘧啶核苷酶、β葡萄苷酶等。临床研究表明，单抗耦联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对由于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞,单抗氨甲蝶呤耦联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗药性(MDR)的肿瘤细胞,抗P-170糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用[sup][/sup]。这说明,单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。[b]五　　单克隆抗体靶向药物[/b]单抗靶向药物是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物的疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。研究表明,单抗靶向药物具有很好的疗效,在免疫偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。免疫偶联物与相应的游离物比较,具有更高更好的疗效和较低的细胞毒性[sup][/sup]。单克隆抗体体积小,能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后,可较快被清除 循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障[sup][/sup],因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物,把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位,利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。近年来,随着医学、药学和生物工程学及技术的进步,临床对肿瘤的根治和对癌细胞的攻击锁定于表皮生长因子和血管内皮生长因子等靶位,使药物治疗的切入点由细胞水平提升到分子和抗体水平,从而提高了肿瘤综合治疗的效果。[align=center]六　　人源化单克隆抗体[/align]单克隆抗体是近年竞相开发的品种,自1997年第1个单克隆抗体rituximab通过食品与药物管理局(FDA)批准应用于临床以来,目前已经上市的单克隆抗体靶向药物的疗效令人瞩目,在抗肿瘤、类风湿性关节炎和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广,其以独特的作用优势,在肿瘤的治疗中不但能够选择性杀伤癌细胞,且在体内表现出特异的分布特性,具有高效、低毒的特点,从而在生物技术产品领域中占据了1/3的市场[sup][/sup]。目前用于治疗肿瘤的单克隆抗体药已有多个,包括伊珠单抗奥加米星、帕尼单抗、曲妥珠单抗等。伊珠单抗奥加米星又名CMC-544，是以人源化抗CD22的抗体伊珠单抗与 CalichDMH偶联形成的ADC药物，用来治疗复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell-NHL）和急性淋巴细胞白血病（ALL），目前已经进入临床 III期试验[sup][/sup]。帕尼单抗是一种IgG2单克隆抗体完全人源化可以与EGFR高度特异性地结合，进而阻断配体诱导的信号激活，从而抑制肿瘤生长。有临床研究选择既往未治疗过的ⅢB或Ⅳ期非小细胞肺癌患者比较卡铂(AUC=6，每3周)，加紫杉醇(200mg/m21次/3周) 联合或不联合帕尼单抗(2.5 mg/m2，1次/周) 化疗的疗效及其安全性。研究结果显示，单纯化疗组与帕尼单抗联合化疗组之间在PFS(5.3个月对比4.2个月、P=0.55)和总生存( Overall survival，OS)(8.0个月对比8.5个月，P =0.81)上均无显著差异。结果提示帕尼单抗联合一线化疗方案可能对晚期非小细胞肺癌无明显疗效[sup][/sup]。曲妥珠单抗是一种抗Her2的单克隆抗体，他可以和肿瘤细胞的HER2/neu特异性地结合，从而阻断细胞内生长信号的转导，同时曲妥珠单抗还可以诱导体内巨噬细胞以及自然杀伤细胞攻击肿瘤细胞，以达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。比较用或不用曲妥珠单抗联合一线化疗方案用以治疗ⅡB/Ⅲ期HER2/neu阳性的 NSCLC患者差异的两项大型的随机Ⅱ期临床试验，其结果显示两个试验结论相似，曲妥珠单抗不能提高化疗的疗效,但也不加重化疗的不良反应。试验中HER2/neu值为3+的患者对曲妥珠单抗治疗的反应性较好，提示曲妥珠单抗对这一较少见类型的NSCLC效果要更好[sup][/sup]。在临床治疗中使用鼠派生单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,通过基因工程技术制备嵌合抗体的I-IPdVIA反应率较鼠源性单抗低,但完全的人源抗体才是单抗药物的发展目标。噬茵体抗体库技术和转基因小鼠技术是制备完全人源单抗的两种方法[sup][/sup]。因此,只有不断地完善单克隆抗体人源化的技术,才能更好地将完全人源化的单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗中,从而使医学界迈向更高的台阶。[b]七　　问题与对策[/b]在限制单克隆抗体临床治疗效果的因素有:(l)循环免疫复合物导致的肝肾功能损害。(2)可溶性肿瘤抗原释放造成的体液中的封闭作用。(3)异种蛋白反应。(4)特异性还不够专一,引起了正常细胞的伤害。(5)天然免疫功能低下(如补体介异的细胞毒,网状内皮系统清除和ADCC作用等)。(6)主要的问题还在这种免疫疗法会导致靶细胞(肿瘤细胞)上抗原的转换。为了解决这些问题,今后的研究应着重:(1)制备对肿瘤抗原有高度特异性的单克隆抗体。(2)选择不易诱导抗原转换的单克隆抗体。(3)研究副作用较少,既安全疗效又高的偶联制剂。单抗（Mab）药物存在的一个最关键问题就是人抗鼠抗体反应（HAMA）。由于用于临床研究的Mab药物一般使用鼠源Mab,这不可避免地会引起HAMA反应,所以尽量避免HAMA反应这一副作用才是Mab药物能否真正适合治疗肿瘤性疾病的重点[sup][/sup]。近些年来,Mab药物的研究主要是向减轻宿主对外源抗体的排斥,促进抗体人源化,改变抗体的氨基酸序列而增加或降低该抗体的生物学效应,加抗体的亲和力,制备双特异性抗体,改造抗体重链恒定区以增强抗体功能,以及寻找新的分子靶点(相对特异的肿瘤抗原)等方向发展[sup][/sup]。Mab药物的不断更新,必将为全球的肿瘤患者带来更大的希望。[align=center]八　　总结与展望[/align]目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法,其毒副作用较大。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起,利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以,如何研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗肿瘤,将成为肿瘤治疗研究中的又一艰巨任务。同时,生物技术以及抗肿瘤化学药物的发展也必将推动单抗药物的发展与进步,单克隆抗体药物将在各种肿瘤的治疗中发挥越来越重要的作用。在未来10年内,单克隆抗体药将成为国内、外生物药品发展的主旋律。此外，利用与肿瘤细胞相关抗原的特异结合力,相应的单克隆抗体可以用于肿瘤早期诊断和预后判定。例如用放射标记抗体能够确定肿瘤存在的位置,扩散的部位和范围,以便确定手术时机和化疗方案。通过测定抗体结合白血病细胞的增减,可以检查白血病的化疗效果[sup][/sup]。利用单克隆抗体检测某些癌的特异性产物,如前列腺癌产生的酸性磷酸酶,绒毛膜上皮癌产生的促性腺激素,结肠癌产生的癌胚抗原及肝癌产生的甲胎蛋白等,有助于癌肿的早期诊断[sup][/sup]。单克隆抗体在肿瘤的治疗中的作用功不可没，但同时也面临着巨大的挑战，例如如何选择优势人群、进一步提高疗效、降低不良反应的发生都是需要进一步解决的。如贝伐单抗的突出不良反应是出血，在NCCN指南中特别指出贝伐单抗仅适用非鳞癌的[sup][/sup]，既往无咯血史的患者，限制了贝伐单抗的临床应用。而其他大部分单克隆抗体均需与其他化疗药物联用，单独应用的疗效仍有限，选择合适的指标以及合适人群应用单克隆抗体仍任重而道远。[b]参考文献[/b] 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[font=宋体][font=Calibri]wb[/font][font=宋体]抗体选择单克隆还是多克隆抗体呢？首先要看你做的是什么物种，根据物种特异与否选择单抗或者多抗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般小鼠、大鼠等常用模式动物可以选择鼠源单克隆抗体，其特异性较好，如果是不常见动物模型，建议选择多克隆抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当然，单抗或者多抗也不是一定的，需要去查询抗原决定簇的归属，一般是找到抗体所对应的特异氨基酸序列，到数据库与你要做的物种进行比对，如果匹配度较高（[/font][font=Calibri]85%[/font][font=宋体]以上），则建议购买尝试。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二抗的选择相对就简单了，根据一抗的种属特异性进行二抗选择即可。[/font][font=宋体][font=宋体]如一抗选用鼠源（[/font][font=Calibri]Mouse[/font][font=宋体]）抗体，则二抗选用抗小鼠抗体即可（[/font][font=Calibri]e.g. Goat Anti-Mouse[/font][font=宋体]），注意二抗的反应特性（荧光、生物素或[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]偶联等）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]其次就是多查阅文献，查看和[/font] [font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]实验相关的 [/font][font=Calibri]SCI [/font][font=宋体]文献，查看要做的种属和指标关联度高的文献。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]实验应该如何选择一抗和二抗[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为[/font] [font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgA[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgD[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgE [/font][font=宋体]五类，它们的重链分别为 [/font][font=Calibri]mu, gamma, alpha, delta, epsilon [/font][font=宋体]链。在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]可分为 [/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG3[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG4 [/font][font=宋体]四个亚类。 轻链分为两种类型，[/font][font=Calibri]kappa[/font][font=宋体]链和[/font][font=Calibri]lambda[/font][font=宋体]链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如[/font] [font=Calibri]western blot[/font][font=宋体]（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]如何选择二抗[/font][font=宋体]——根据一抗种属及类型选择合适的二抗[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，上海信帆生物科技有限公司为您的科研工作提供适合和全面的二抗产品。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]，那么相应的二抗就应当是抗小鼠 [/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]。如果单克隆一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]的某一亚类（[/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2a[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2b[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG3[/font][font=宋体]），那么几乎所有的抗小鼠 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，那么你可以选择抗[/font][font=Calibri]IgG1 [/font][font=宋体]的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]亚类的情况下，可以选用抗相应物种 [/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。【二抗的耦联标记】[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶[/font] [font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]和碱性磷酸酶 [/font][font=Calibri]AP [/font][font=宋体]或其衍生物，[/font][font=Calibri]PAP[/font][font=宋体]），荧光基团（[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]、 [/font][font=Calibri]Rhodamine[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Texas Red[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]PE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Rhodamine[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Dylight [/font][font=宋体]等）、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于 [/font][font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]和 [/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]，常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用 [/font][font=Calibri]Biotin/Avidin[/font][font=宋体]检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供单抗和多抗制备服务，同时有[/font][font=Calibri]Western Blot[/font][font=宋体]检测服务，详情可以关注[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services][b]多克隆抗体制备服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[url=http://www.f-lab.cn/electroporation/pipectrode.html][b]克隆枪电穿孔室[/b][/url]是[b]电穿孔仪[/b]器的一项重大的技术进步，具有最高转化效率,有效降低[b]电穿孔过程[/b]中样品的低毒性，温度控制，及[b]电穿孔[/b]后样品的迅速恢复。[img=克隆枪电穿孔室]http://www.f-lab.cn/Upload/CG-PP-1.jpg[/img][url=http://www.f-lab.cn/electroporation/pipectrode.html]克隆枪电穿孔室[/url]在电穿孔过程中，由水冰温度稳定剂支持的薄外科不锈钢电极为细胞的提供优越环境。我们利用水融合的潜热（融化1克冰或加热1克水到80℃，需要相同的热量！），保持样本的低温是非常重要的，这样可以避免电弧。由于Pipectrode是一个试管，可以喷射出您的样品并立即放入回收缓冲区。更多电穿孔系统请浏览官网：[url]http://www.f-lab.cn/electroporation.html[/url]

[align=center]抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[/align][align=center] [/align][align=center]摘　　要[/align][align=center] [/align]　通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。这类药物的特异性强，疗效显著。本文主要就近年来抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展进行了综述，并对抗肿瘤单克隆抗体药物的发展前景进行了展望。[align=left] [/align][align=left]关键词：抗肿瘤；单克隆抗体；研究进展[/align][align=center] [/align][align=center] [/align][b]一 引言[/b]抗肿瘤单抗药物因与烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物药等抗肿瘤药物相比,具有高效价、高特异性、血清交叉反应少等特点与优点,在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。单抗药物是当前生物技术药物领域甚为活跃的部分。针对特定的分子靶点(抗原),单抗有高度特异性。针对各种不同的抗原,可以制备为数众多的、各不相同的单抗；因此,作为药物来源,单抗又具有高度多样性。由于其特异性和多样性,研制单抗药物有巨大的潜力。单克隆抗体药物治疗恶性瘤主要机制有两种[sup][/sup]:一是利用单克隆抗体本身来阻断癌细胞生长的信号,单克隆抗体在癌细胞膜外与生长因子竞争结合受体,阻断信号传递过程,从而阻止癌细胞的生长和扩散,诱导细胞凋亡或者间接激活宿主的抗肿瘤免疫反应；二是利用单克隆抗体作为药物载体的靶向治疗,如将有细胞毒性的药物或有放射性的药物靶向性的运送到肿瘤细胞,从而杀伤肿瘤细胞。目前,国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞,利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。此外，研究表明静脉内注射抗肿瘤单抗,在肿瘤部位的浓度较高,显示特异性定位；单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征,在靶肿瘤的浓度较高[sup][/sup]。[align=center]二　　单克隆抗体药物作用靶点[/align]特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20分子作为靶点的人鼠嵌合抗体,对非霍奇金氏B细胞淋巴瘤有疗效,是第一个获美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤的单抗。Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的单抗,临床研究对乳腺癌有效,与化疗药物联合有更显著的疗效。Mylotarg是由抗CD33单抗与calicheamicin构成的偶联物,已获批准用于治疗急性复发性髓性白血病[sup][/sup]。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人的鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道,抗EGFr单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验,显示良好的抗癌效果。抗EGFr的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道,抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用,对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效[sup][/sup]。[b]三 单抗诱发肿瘤细胞凋亡[/b][align=left] 3.1 通过免疫细胞表面抗原的交联作用而诱导恶性肿瘤细胞的凋亡[/align]用于治疗血液系统恶性肿瘤的单克隆抗体药物大多是通过免疫细胞表面抗原的交联作用诱导恶性肿瘤细胞凋亡而起作用的,如目前用的抗-CD20的单克隆抗体——美罗华。其单克隆抗体的作用机制是通过诱导CD20分子在B细胞膜上的脂筏区聚集,再在一系列激酶的作用下使脂筏信号传导区域的CD20分子亲和性增强,从而形成CD20交联形式；交联的CD20分子启动了细胞内凋亡信号的传导通路,使线粒体释放出细胞色素C,激活下游的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[sup][/sup]。3.2 作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体而诱导细胞凋亡许多生长因子及其受体通过作用于细胞的存活途径、刺激细胞的有丝分裂、促进细胞的生长增殖来阻止细胞凋亡。与正常细胞中生长因子信号传导的严格调控相比,肿瘤细胞中的失控则导致细胞的恶性增殖,从而使恶性细胞获得“永生”。单克隆抗体通过作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体可阻断存活信号传导通路,从而导致其凋亡,同时还能对化疗和放疗有正协同作用。目前主要集中在对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、表皮生长因子受体(EGFR)等的研究。美国FDA于2006年批准了第一个用于治疗头颈部鳞状细胞癌的单克隆抗体药物——Cetuximab,它为一种IgG1单克隆抗体,主要通过干扰癌细胞表面EGFR的生长,从而减少癌细胞进入正常组织的概率,控制癌细胞的转移,达到抗癌目的[sup][/sup]。最初想到制备针对恶性肿瘤凋亡相关分子的单克隆抗体药物时,虽然从理论上来说无疑是给人们注入了一针兴奋剂,但在实际应用中则并不然,所以在通过单克隆抗体药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡的研究和治疗中,还有待进一步开发新的、更经济、更有效地药物。[b]四　 单克隆抗体耦联物[/b]4.1 抗体与化疗药物耦联目前,国内外研究较多的与单克隆抗体耦联的化学药物有平阳霉素、柔红霉素、丝裂霉素、多柔比星(阿霉素)、顺铂以及长春碱类衍生物等。同时还可以通过脂质体靶向制剂作为化疗药靶向治疗肿瘤,利用脂质体制剂将药物导向靶标进行有选择性地杀伤癌细胞和抑制癌细胞的繁殖,以达到提高疗效和高度定向作用。目前已上市的脂质体有复方氟脲嘧多相脂质体、喜树碱多相脂质体、阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体等。4.2 抗体导向酶耦联利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合,将前体药物的专一性活化酶与单抗耦联,导向输入到靶细胞部分,再注入前体药物,使其在酶的作用下转化为活性药物,进而杀伤肿瘤细胞[sup][/sup]。目前这种用作前体药物的抗癌药有苦杏仁苷、氮芥、鬼臼乙叉苷、阿霉素、丝裂霉素等。而作为活化前体药物的导向酶有碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酶肽、胸腺嘧啶核苷酶、β葡萄苷酶等。临床研究表明，单抗耦联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对由于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞,单抗氨甲蝶呤耦联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗药性(MDR)的肿瘤细胞,抗P-170糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用[sup][/sup]。这说明,单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。[b]五　　单克隆抗体靶向药物[/b]单抗靶向药物是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物的疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。研究表明,单抗靶向药物具有很好的疗效,在免疫偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。免疫偶联物与相应的游离物比较,具有更高更好的疗效和较低的细胞毒性[sup][/sup]。单克隆抗体体积小,能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后,可较快被清除 循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障[sup][/sup],因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物,把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位,利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。近年来,随着医学、药学和生物工程学及技术的进步,临床对肿瘤的根治和对癌细胞的攻击锁定于表皮生长因子和血管内皮生长因子等靶位,使药物治疗的切入点由细胞水平提升到分子和抗体水平,从而提高了肿瘤综合治疗的效果。[align=center]六　　人源化单克隆抗体[/align]单克隆抗体是近年竞相开发的品种,自1997年第1个单克隆抗体rituximab通过食品与药物管理局(FDA)批准应用于临床以来,目前已经上市的单克隆抗体靶向药物的疗效令人瞩目,在抗肿瘤、类风湿性关节炎和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广,其以独特的作用优势,在肿瘤的治疗中不但能够选择性杀伤癌细胞,且在体内表现出特异的分布特性,具有高效、低毒的特点,从而在生物技术产品领域中占据了1/3的市场[sup][/sup]。目前用于治疗肿瘤的单克隆抗体药已有多个,包括伊珠单抗奥加米星、帕尼单抗、曲妥珠单抗等。伊珠单抗奥加米星又名CMC-544，是以人源化抗CD22的抗体伊珠单抗与 CalichDMH偶联形成的ADC药物，用来治疗复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell-NHL）和急性淋巴细胞白血病（ALL），目前已经进入临床 III期试验[sup][/sup]。帕尼单抗是一种IgG2单克隆抗体完全人源化可以与EGFR高度特异性地结合，进而阻断配体诱导的信号激活，从而抑制肿瘤生长。有临床研究选择既往未治疗过的ⅢB或Ⅳ期非小细胞肺癌患者比较卡铂(AUC=6，每3周)，加紫杉醇(200mg/m21次/3周) 联合或不联合帕尼单抗(2.5 mg/m2，1次/周) 化疗的疗效及其安全性。研究结果显示，单纯化疗组与帕尼单抗联合化疗组之间在PFS(5.3个月对比4.2个月、P=0.55)和总生存( Overall survival，OS)(8.0个月对比8.5个月，P =0.81)上均无显著差异。结果提示帕尼单抗联合一线化疗方案可能对晚期非小细胞肺癌无明显疗效[sup][/sup]。曲妥珠单抗是一种抗Her2的单克隆抗体，他可以和肿瘤细胞的HER2/neu特异性地结合，从而阻断细胞内生长信号的转导，同时曲妥珠单抗还可以诱导体内巨噬细胞以及自然杀伤细胞攻击肿瘤细胞，以达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。比较用或不用曲妥珠单抗联合一线化疗方案用以治疗ⅡB/Ⅲ期HER2/neu阳性的 NSCLC患者差异的两项大型的随机Ⅱ期临床试验，其结果显示两个试验结论相似，曲妥珠单抗不能提高化疗的疗效,但也不加重化疗的不良反应。试验中HER2/neu值为3+的患者对曲妥珠单抗治疗的反应性较好，提示曲妥珠单抗对这一较少见类型的NSCLC效果要更好[sup][/sup]。在临床治疗中使用鼠派生单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,通过基因工程技术制备嵌合抗体的I-IPdVIA反应率较鼠源性单抗低,但完全的人源抗体才是单抗药物的发展目标。噬茵体抗体库技术和转基因小鼠技术是制备完全人源单抗的两种方法[sup][/sup]。因此,只有不断地完善单克隆抗体人源化的技术,才能更好地将完全人源化的单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗中,从而使医学界迈向更高的台阶。[b]七　　问题与对策[/b]在限制单克隆抗体临床治疗效果的因素有:(l)循环免疫复合物导致的肝肾功能损害。(2)可溶性肿瘤抗原释放造成的体液中的封闭作用。(3)异种蛋白反应。(4)特异性还不够专一,引起了正常细胞的伤害。(5)天然免疫功能低下(如补体介异的细胞毒,网状内皮系统清除和ADCC作用等)。(6)主要的问题还在这种免疫疗法会导致靶细胞(肿瘤细胞)上抗原的转换。为了解决这些问题,今后的研究应着重:(1)制备对肿瘤抗原有高度特异性的单克隆抗体。(2)选择不易诱导抗原转换的单克隆抗体。(3)研究副作用较少,既安全疗效又高的偶联制剂。单抗（Mab）药物存在的一个最关键问题就是人抗鼠抗体反应（HAMA）。由于用于临床研究的Mab药物一般使用鼠源Mab,这不可避免地会引起HAMA反应,所以尽量避免HAMA反应这一副作用才是Mab药物能否真正适合治疗肿瘤性疾病的重点[sup][/sup]。近些年来,Mab药物的研究主要是向减轻宿主对外源抗体的排斥,促进抗体人源化,改变抗体的氨基酸序列而增加或降低该抗体的生物学效应,加抗体的亲和力,制备双特异性抗体,改造抗体重链恒定区以增强抗体功能,以及寻找新的分子靶点(相对特异的肿瘤抗原)等方向发展[sup][/sup]。Mab药物的不断更新,必将为全球的肿瘤患者带来更大的希望。[align=center]八　　总结与展望[/align]目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法,其毒副作用较大。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起,利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以,如何研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗肿瘤,将成为肿瘤治疗研究中的又一艰巨任务。同时,生物技术以及抗肿瘤化学药物的发展也必将推动单抗药物的发展与进步,单克隆抗体药物将在各种肿瘤的治疗中发挥越来越重要的作用。在未来10年内,单克隆抗体药将成为国内、外生物药品发展的主旋律。此外，利用与肿瘤细胞相关抗原的特异结合力,相应的单克隆抗体可以用于肿瘤早期诊断和预后判定。例如用放射标记抗体能够确定肿瘤存在的位置,扩散的部位和范围,以便确定手术时机和化疗方案。通过测定抗体结合白血病细胞的增减,可以检查白血病的化疗效果[sup][/sup]。利用单克隆抗体检测某些癌的特异性产物,如前列腺癌产生的酸性磷酸酶,绒毛膜上皮癌产生的促性腺激素,结肠癌产生的癌胚抗原及肝癌产生的甲胎蛋白等,有助于癌肿的早期诊断[sup][/sup]。单克隆抗体在肿瘤的治疗中的作用功不可没，但同时也面临着巨大的挑战，例如如何选择优势人群、进一步提高疗效、降低不良反应的发生都是需要进一步解决的。如贝伐单抗的突出不良反应是出血，在NCCN指南中特别指出贝伐单抗仅适用非鳞癌的[sup][/sup]，既往无咯血史的患者，限制了贝伐单抗的临床应用。而其他大部分单克隆抗体均需与其他化疗药物联用，单独应用的疗效仍有限，选择合适的指标以及合适人群应用单克隆抗体仍任重而道远。[b]参考文献[/b] 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[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是一种将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生永生化杂交瘤细胞系，然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆，并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体][b]利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为[/b]：抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。（详细实验流程：杂交瘤单克隆抗体制备[/font][font=Calibri]SOP[/font][font=宋体]）在单克隆抗体制备过程中，常常会遇到细胞污染，细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题，本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、微生物污染[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子，如果操作不当，或者是未能及时到位的消杀，就有可能会引入污染。除此之外，还须注意平时使用的一些消毒剂，比如[/font][font=Calibri]84[/font][font=宋体]消毒液或者[/font][font=Calibri]75%[/font][font=宋体]酒精，要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导致的消毒不到位，是非常不容易发现的。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的[/font][font=Calibri]SP2/0[/font][font=宋体]细胞圆润透亮，当被支原体污染后，短期内细胞没有明显的变化，当污染严重后，细胞生长会变得极为缓慢，生长周期变长，细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂，或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔，待产生实体瘤后或产生腹水后，无菌分离重新获得杂交瘤细胞。[/font][/font][font=宋体]③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫，污染后会陆续出现多少不等的小黑点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、融合后细胞不生长[/font][font=宋体][font=宋体]①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性，部分毒性试剂作用时间过长引起的。如[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]10%~60%[/font][font=宋体]都可以进行融合，但浓度越高毒性越大。[/font][/font][font=宋体]②也有可能是使用血清质量比较差，推荐使用胎牛血清。[/font][font=宋体][font=宋体]③还有可能是因为添加的[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）含量过高或[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷）含量过低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞不分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]抗原免疫原性弱，免疫效果不好，可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]操作过程中脾细胞损伤较多，抗原特异性淋巴母细胞大量死亡；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞前期有抗体分泌，后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）失效，骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]未及时克隆，不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]c.[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞返祖化，抵抗氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）的选择；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]d.[/font][font=宋体]梁色体丢失（突变）[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=Calibri]e.[/font][font=宋体]支原体污染。[/font][/font][font=宋体]解决方法有三种：第一，及时进行细胞建库；第二，高频次检查细胞状态和是否污染；第三，定期进行抗原筛选。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]四、杂交瘤细胞难以克隆化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞，就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体，反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化，可以尝试以下解决方法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选，确定最佳批次的血清和使用浓度；[/font][font=宋体][font=宋体]②融合后第一次克隆（一亚）仍需采用含[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]的条件培养；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③在培养体系中加入白细胞介素[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]），一般商品化的杂交瘤因子都含有[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供杂交瘤测序服务和杂交瘤细胞培养及抗体生产服务，具体关于杂交瘤相关问题详情可以参看[/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤测序服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font]